Procédures sévères
Influence de la géométrie et du fractionnement temporel dans la réponse de nouvelles techniques de radiothérapie
- Recherche appliquée
- Cancers
1 232 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 106 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 126 un niveau modéré. Une tumeur cérébrale leur est implantée sous anesthésie puis irradiée, parfois deux fois, avec suivi par imagerie et tests comportementaux. Le porteur décrit après irradiation des pertes de poids, une mobilité réduite et des ulcérations du crâne pendant quelques jours. L'étude explore de nouvelles techniques de radiothérapie contre les gliomes, dont les retombées cliniques sont présentées comme lointaines.
Objectifs
La radiothérapie est l’une des méthodes les plus efficaces et les plus utilisées pour traiter les cancers. Pour certains types de tumeurs radiorésistantes comme les gliomes (tumeurs cérébrales), la radiothérapie ne peut être que palliative. Pour parvenir à une dose de radiation curative, le risque de dommages graves aux tissus sains est trop élevé pour pouvoir être considéré. L’alternative, moins délétère, est la nouvelle technique de radiotherapie que nous proposons. Aucun autre traitement (i.e. immunothérapie) a montré de l’efficacité dans ce types de tumeurs. Dans ce contexte, notre objectif principal s’inscrit dans l’amélioration des traitements de radiothérapie. Dans le cadre de ce projet, nous nous focaliserons sur des techniques innovantes qui ont montré un intérêt significatif dans la préservation des tissus sains (même à des doses très élevées) ainsi qu’un effet très efficace sur le contrôle de la croissance tumorale chez des rongeurs. Nous cherchons à améliorer encore l’indice thérapeutique de ces techniques innovatrices en explorant différentes géométries d’irradiation et schémas temporels de délivrance de la dose. Par ailleurs, nous évaluerons l’impact sur les tissus sains d’une re-irradiation, nécessaire de façon très fréquente dans le traitement des gliomes, à cause de son haut taux de récurrence. De plus, des études pilotes ont montré une mémoire immunitaire à long-terme que nous cherchons à confirmer avec plusieurs types tumoraux.
Bénéfices attendus
Ce projet pionnier a un fort impact sociétal. Il explore des techniques novatrices en radiothérapie (RT), moins agressives pour les tissus sains. Le gain en matière d'épargne/récupération tissulaire contribuera à l'élimination du principal obstacle dans les traitements de cancer par RT : les doses de tolérance des tissus normaux. A la fin du projet, nous disposerons d'études radiobiologiques complètes qui nous permettront de procéder à des essais cliniques pouvant bénéficier à l'oncologie pédiatrique (système nerveux central dont les traitements sont très limités en raison du risque de complications dans le développement des nourrissons) et pouvant également ouvrir une voie vers un traitement efficace des tumeurs très radiorésistantes, comme les gliomes. En outre, les connaissances biologiques acquises permettront d'améliorer d'autres techniques de RT et peut-être de changer certains des paradigmes de la RT conventionnelle. La preuve de concept de ces techniques innovantes existe déjà, le projet est sur la voie qui va de la conception de l'idée aux éventuels premiers essais cliniques.
Procédures
-Implantation tumorale sous anesthésie générale (45 minutes) 1056 animaux une fois. 264 animaux subiront une réimplantation sous anesthésie générale (45 minutes) -Irradiation sous anesthésie générale (30 minutes) sur 1182 animaux, une fois et 132 animaux recevront une re-irradiation. Chaque irradiation dure un maximum de 30 minutes. -Imagerie IVIS sous anesthésie générale, 2 fois, 1056 animaux. Durée anesthésie < 10 minutes -Tests de comportement sur animaux vigiles, 3 fois, 126 animaux, une durée de 2-3 heures. - Des prélèvements sanguins (3 à 4) sous anesthésie générale seront réalisés sur chaque animal. Durée de l’anesthésie (< 5 minutes)
Impact sur les animaux
Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité pendant quelques jours (3 à 5 jours). Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croutes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation pendant quelques jours (5 à 6 jours)
Devenir
Mis à mort des animaux pour analyses histologiques des cerveaux
Remplacement
Nos critères d’évaluation pour l’efficacité de la technique vont porter sur la préservation des tissus sains environnants la tumeur et sur le contrôle de la croissance des tumeurs irradiées. De même, les mécanismes inflammatoires, d’infiltration immunitaire et vasculaires induits par l’irradiation ne pourront être étudiés que dans la globalité d’un organisme vivant intégré. Ce n'est donc pas possible de faire nos d’études in vitro en utilisant des organoïdes. Les organoïdes en plus sont très petits en taille pour mettre en évidences l’effet des patrons d‘irradiation en pic et vallée caractérisques de nos techniques d’irradiation Aussi, le recours à des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans ce projet et il nous est indispensable de développer des modèles animaux.
Réduction
Nous avons déterminé le nombre d’animaux par groupe à l’aide du logiciel G*power. Pour mettre en évidence une différence de 25%, biologiquement significative, entre groupes traités et groupes témoins, il nous faudra inclure 15 animaux par groupe (t-test: p
Raffinement
Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Une étape de socialisation des rats sera mise en place avant toute expérimentation : les rats seront manipulés quotidiennement pour les habituer au manipulateur et à la préhension et permettre ainsi une réalisation plus aisée et moins stressante des procédures expérimentales par la suite. Dans un souci de raffinement, nous veillerons 5 fois par semaine au bien-être des animaux pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal-être (détail des points limites appliqués dans la description de chaque procédure). L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Suite à l’irradiation des signes de détresse ou de mal-être peuvent apparaître, suivis d’une perte de poids et d’une réduction de la mobilité. Pour y remédier, des aliments appétants (Dietgel recovery) sont ajoutés dans la cage. Les animaux peuvent présenter des dépilations voire des croutes et même des ulcérations sur le dessus de la tête, à l’endroit de l’irradiation : une crème, l’Ialuset sera administrée sur la peau pour permettre la cicatrisation (environ 1 semaine, application quotidienne) et / ou du PicriBaume (1 fois par jour).
Choix des espèces
Les rongeurs sont particulièrement utilisés en cancérologie et dans les études de radiothérapie car il s’agit d’espèces génétiquement caractérisées et pour lesquelles les références bibliographiques sont très nombreuses dans la littérature ayant trait au domaine de la radiothérapie. Notre projet va nécessiter de travailler sur des rats chez lesquels la taille plus importante du cerveau va être plus adaptée aux types d’irradiation proposés dans le cadre des procédures expérimentales. Les procédures seront réalisées sur des animaux adultes de 6-7 semaines, âge compatible avec un développement suffisant et la possibilité de garder les animaux assez longtemps pour permettre une étude des effets à long terme de l’irradiation.
Etude d’une potentielle radiosensibilisation par le propranolol sur des xenogreffes de lignées de neuroblastome chez la souris immunodéprimée.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des cellules de neuroblastome leur sont greffées sous la peau puis dans la glande surrénale par une chirurgie d'une heure, avant radiothérapie et administration de propranolol. Le porteur classe l'implantation orthotopique en gravité sévère et prévoit un hébergement isolé de cinq jours après la chirurgie. L'objectif est de tester un effet radiosensibilisant du propranolol, dans la perspective de traiter le neuroblastome de l'enfant.
Objectifs
Le propranolol a déjà été testé seul ou en association avec des chimiothérapies sur de nombreux cancers et a montré son efficacité sur des cultures cellulaires et in vivo (expérimentations sur rongeurs) sur les leucémies et différents carcinomes comme les mélanomes mais également chez l’Homme. L'utilisation de cette molécule est portée par l’effet bêtabloquants et l'inhibition de production des hormones de stress telles que les catécholamines et de leurs métabolites. L'efficacité du propranolol a été montrée sur 15 lignées de neuroblastomes (cancer du système nerveux) in vitro et in vivo. Plusieurs mécanismes d’action ont été décrits pour expliquer cette efficacité dont une action sur la mort cellulaire, une inhibition de la prolifération cellulaire, l’inhibition des métastases. Il a également été montré que le propanolol permettait d'obtenir une synergie d'action avec des chimiothérapies de référence telles que la vincristine et la doxorubicine. La radiothérapie est systématiquement utilisée chez les patients atteints de neuroblastome qui présentent des métastases mais son utilisation chez le jeune enfant est malheureusement régulièrement source de séquelles sur un organisme en croissance. Une radiosensibilisation par un médicament non toxique comme le propanolol permettrait potentiellement d'augmenter l'efficicacité de la radiothérapie sans augmenter les séquelles. L'objectif principal de ce projet est ainsi d'évaluer le potentiel radiosensibilisant du propanolol sur des lignées tumorales de neuroblastome après vérification de l’efficacité de l’association thérapeutique sur cultures cellulaires (réduction). Pour mener à bien cette étude 130 souris au total seront nécessaires. Dans un premier temps, 3 lignées tumorales de neuroblastome seront testées (32 souris par lignée, soit 96 souris au total) sur un modèle de greffe sous cutanée permettant de retenir la lignée tumorale la plus pertinente (celle dont les effets de l'administration du propanolol seront les plus marqués). Puis secondairement, l'efficacité du traitement au propanolol sera menée sur un modèle orthotopique (cellules injectées dans l'organe cible de la pathologie) sur 34 souris. Notre approche expérimentale permettra de réduire le nombre d'animaux utilisés en accord avec la règle des 3R.
Bénéfices attendus
Il a été montré que le propranolol permettait d'obtenir une synergie d'action avec des chimiothérapies telles que la vincristine et la doxorubicine, médicaments largement utilisés dans le traitement des cancers de l'enfant. Enfin, le propranolol étant hautement lipophile il passe la barrière hémato-encéphalique et permettrait de traiter des métastases ou des tumeurs primitives cérébrales. La radiothérapie est systématiquement utilisée chez les patients métastatiques associé à un mauvais pronostic. Son utilisation chez le jeune enfant peut être régulièrement source de séquelles sur un organisme en croissance. Une radiosensibilisation par un médicament non toxique comme le propranolol permettrait d’augmenter l’efficacité de la radiothérapie sans augmenter les séquelles. Cette radiosensibilisation interviendrait par un mécanisme d’interférence avec l’angiogenèse et la prolifération cellulaire, ainsi que par le potentiel blocage du cycle cellulaire dans une phase radiosensible.
Procédures
Procédure 2 : Implantation orthotopique de cellules de neuroblastomes exprimant la luciférase (Lignées cellulaires Luc : SK-N-BE(2) c-Luc ou SH-EP-Luc ou SK-N-SH-Luc) au niveau de la glande surrénale nécessitant une procédure chirurgicale (J0 : induction tumorale) plus invasive. Une analgésie sera administrée ( combinaison buprenorphine/meloxicam à J0 avec réitération du meloxicam seul à à J1 et J2) afin de réduire au maximum la souffrance des animaux La chirurgie dure environ 1h (J0) et ne sera pas réitérée au cours de l’étude. A noter qu’une attention toute particulière sera portée aux animaux suite à cette procédure (soins post-opératoires et suivi quotidien)
Impact sur les animaux
La procédure d’implantation des cellules tumorales en orthotopique dans le tissu des glandes surrénales est classée en gravité « sévère » mais l’utilisation d'analgésiques limitera la souffrance des animaux (cf procédure 2). Suite à cette chirurgie, l’hébergement sera en cage individuelle pendant 5 jours (le temps de la cicatrisation) après l’implantation des cellules (pour éviter que les animaux ne se rongent les fils) pouvant conduire à un stress des animaux (limitation des interactions sociales directes) mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes.
Devenir
-Procédure 1 : implantation hétérotopique (sous-cutanée) de cellules de neuroblastomes (Lignées cellulaires : SK-N-BE(2) c, SH-EP, SK-N-SH) : animaux gardés en vie car induction tumorale est le point de départ de l'étude -Procédure 2 : implantation orthotopique de cellules de neuroblastomes exprimant la luciférase (Lignées cellulaires Luc : SK-N-BE(2) c-Luc ou SH-EP-Luc ou SK-N-SH-Luc) au niveau de la glande surrénale : animaux gardés en vie car induction tumorale est le point de départ de l'étude -Procédure 3 : administration intraveineuse du propanolol (qui sera combinée ou non à la radiothérapie) : animaux gardés en vie car stratégie thérapeutique testée est un point clé de l'étude -Procédure 4 : traitement par radiothérapie (qui sera combiné ou non à une administration de propanolol) : animaux gardés en vie car stratégie thérapeutique testée est un point clé de l'étude -Procédure 5 : Suivi de la croissance tumorale par imagerie par bioluminescence (modèle orthotopique) : animaux gardés en vie car suivi indispensable pour estimer l'efficacité des traitements et l'atteinte des points limites. A l'issue du projet, tous les animaux de l'étude seront mis à mort selon la méthode en vigueur décrite précédemment : aucune animal ne sera réutilisé, replacé ou adopté.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de neuroblastomes dépend de phénomènes biologiques complexes (influence du microenvironnement tumoral, différentiation de cellules nerveuses immatures de types fibroblastes, maturation de ces dernières, angiogenèse, processus inflammatoires...). De plus, le développement de ce type de tumeurs dépend entièrement du système nerveux sympathique. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Dans le cadre de notre étude, 3 lignées tumorales sont étudiées pour le modèle hétérotopique (série 1). Cette étude préliminaire fait office de preuve de concept et permet de valider/invalider l’efficacité des traitements testés sur des modèles de première ligne (injection de cellules tumorales en sous-cutané). Il s’agira par la suite (série 2) de tester les composés sur un modèle orthotopique plus pertinent en ne gardant que la lignée dont les résultats auront été les plus prometteurs dans la série 1. Cette stratégie expérimentale permet d’éviter autant que possible d’utiliser des animaux dans des procédures de classe sévère (avec hirurgie opératoire) sans bénéfice évident et réduit le nombre d’animaux associés au modèle orthotopique. Une approche statistique (Mann-Whitney et Anova) sera menée afin d'évaluer l'efficacité des traitements.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part lors de la chirurgie orthotopique (série 2) d’implantation de la tumeur (anesthésie chimique, analgésie pré-opératoire avec réitération, maintien des conditions d’asepsie lors de la chirurgie, maintien de la température corporelle) mais également à travers des soins post-opératoires (désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Une observation quotidienne des animaux sera menée (pesée, observation du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation) conjointement à un suivi par imagerie par bioluminescence permettant de s’assurer que la tumeur a un volume éthiquement acceptable. De la même façon, les animaux concernés par l’injection hétérotopique (série 1) (sous anesthésie chimique et désinfection de la région d’implantation) feront l’objet d’une attention toute particulière (observation quotidienne du comportement, pesée, vérification de l’alimentation et de l’hydratation).Le suivi longitudinal par mesure de la tumeur au pied à coulisse permettra de s’assurer que la tumeur a un volume éthiquement acceptable. L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie (série 2), notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris athymiques, présentant une lymphopénie T, sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines du fait leur immunodéficience, il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Des souris âgés de 6 semaines sont utilisées en référence aux données antérieures issues de la littérature.
Rôle des ADN méthyltransférases dans les effets épigénétiques des opioïdes
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
950 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 830 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 120 un niveau modéré. Elles subissent une chirurgie sous anesthésie de deux heures, onze injections d'opioïdes en six jours puis des tests comportementaux, l'arrêt des injections provoquant un sevrage avec tremblements, diarrhées et signes d'anxiété. Le porteur indique que cet état de sevrage ne peut être atténué puisqu'il est l'objet même de l'étude. Les retombées pour la prise en charge de l'addiction humaine sont renvoyées au long terme.
Objectifs
Les opioïdes sont des drogues puissantes, qui représentent les traitements antalgiques les plus efficaces et les plus utilisés. Cependant, leur usage prolongé est associé à des effets indésirables sévères, tels que l’émergence d’un trouble de l’usage d’opioïdes (ou addiction). Ce trouble représente actuellement un problème de santé publique majeur, au point qu’on parle à ce sujet d’une ‘épidémie’, dont on pense qu’elle contribue à la diminution de l’espérance de vie constatée dans certains pays industrialisés. Les processus épigénétiques, notamment la méthylation de l’ADN, sont des mécanismes moléculaires capables de modifier à long terme l’expression des gènes. Il est possible de faire l’hypothèse que la méthylation de l’ADN pourrait contribuer aux conséquences chroniques et sévères des opioïdes, y compris l’addiction. Ainsi, notre objectif est de déterminer comment les modifications de la méthylation de l’ADN induites par la morphine contribuent aux effets comportementaux de cette drogue. En parallèle nous souhaitons approfondir les connaissances concernant les effets des opioïdes dans le cerveau sur les neurones ciblés par les opioïdes.
Bénéfices attendus
Ce projet est un projet de recherche fondamentale à visée préclinique, qui devrait permettre à court terme d’approfondir les connaissances sur les mécanismes moléculaires épigénétiques impliqués dans les effets comportementaux des opioïdes. A long terme, les résultats pourraient avoir des retombées positives sur la santé humaine, en ouvrant de nouvelles pistes thérapeutiques dans le contexte de la prise en charge de l’addiction aux opioïdes.
Procédures
Aucun prélèvement sur animal vigile ne sera réalisé. Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale (durée : 2 heures), des injections d’opioïdes (11 injections pendant 6 jours) ou de tamoxifène (3 injections pendant 3 jours), qui seront réalisées sur animal vigile, puis des tests comportementaux. Chaque animal ne sera utilisé que pour la réalisation d’un seul test comportemental. Lors de ces tests, les injections d’opioïdes induisent un sevrage, avec des signes physiques et émotionnels négatifs qui durent de 3 à 5 jours lors d’un sevrage spontané (test de sensibilisation au sevrage), et environ 30 minutes lors d’un sevrage précipité (test d’aversion de place conditionnée, durée : 20 minutes ; test de quantification du sevrage physique précipité, durée : 30 minutes). Les injections d’opioïdes induisent également une augmentation de l’activité de locomotion des animaux (dans tous les tests ; durée : environ 1 heure). Lors du test du champ ouvert (durée : 20 minutes), l’exploration d’un environnement nouveau induit un comportement apparenté à l’anxiété. Lors du test de réponse à des stimuli récompensant ou aversif (durée : 15 minutes environ), la consommation de sucrose a un effet hédonique bref, celle de quinine induit un inconfort transitoire (ces effets durant quelques secondes dans les 2 cas).
Impact sur les animaux
Les injections répétées de tamoxifène (3 injections pendant 3 jours) induisent un inconfort transitoire avec risque de réaction inflammatoire locale aux points d’injection. Les chirurgies réalisées sous anesthésie générale induisent une douleur post-opératoire qui sera soulagée par des antalgiques. Les injections répétées d’opioïdes (11 injections pendant 6 jours) induisent un inconfort transitoire avec risque de réaction inflammatoire locale aux points d’injection, et s’accompagnent d’une perte de poids. L’effet aigu des injections d’opioïdes correspond à une activation de la fonction de récompense, alors que l’interruption de ces injections induit un état de sevrage désagréable se manifestant par des signes physiques (piloérection, tremblements, diarrhées) et une modification des réponses émotionnelles (anxiété). Cet état de sevrage ne peut être atténué puisque c’est l’objet de notre étude. Les tests comportementaux réalisés visent à le caractériser.
Devenir
Tous les animaux dans l’ensemble des procédures seront mis à mort pour évaluer l’efficacité ou les résultats des différentes études réalisées.
Remplacement
Les effets moléculaires des opioïdes sur le cerveau ne peuvent pas être étudiés en utilisant des modèles cellulaires qui, par nature, ne récapitulent pas la complexité de l’organisation cérébrale. C’est pourquoi l’étude de ces effets nécessite l’analyse d’organismes vivan
Réduction
La comparaison de 2 stratégies génétique et virale pour la délétion des protéines responsables de la méthylation de l’ADN permettra de diminuer le nombre d’animaux nécessaire pour répondre à notre question biologique. Nous avons réalisé une étude de puissance statistique tenant compte du fait que les animaux utilisés sont consanguins et présentent une variabilité phénotypique limitée. Les groupes expérimentaux destinés à caractériser les effets comportementaux des opioïdes seront constitués d’un nombre d’animaux permettant de détecter des effets statistiquement significatifs au regard de la variabilité interindividuelle attendue,. Chaque expérience sera menée en parallèle chez des souris mâles et femelles. Alors qu’on sait peu de choses sur les effets neurobiologiques différents des opioïdes selon le sexe, cela nous permettra de maximiser la relevance des données obtenues pour la compréhension du trouble de l’usage d’opioïdes chez l’Homme et la Femme, tout en utilisant l’ensemble des animaux obtenus lors de la reproduction des lignées de souris.
Raffinement
Nous utilisons des protocoles expérimentaux qui minimisent l’inconfort des animaux. Les conditions d’hébergement sont optimisées en fonction des comportements naturels des rongeurs : les souris sont hébergées en groupe sociaux (3 à 5 animaux par cage), et chaque cage est enrichie avec un barreau à ronger et des papiers absorbants pour faire un nid. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie pré- et post-opératoire seront systématiquement utilisées. Nous avons établi des points limites pour soustraire les animaux à toute souffrance pour l’ensemble des procédures expérimentales.
Choix des espèces
Cette étude porte sur les effets épigénétiques et comportementaux des opioïdes sur le cerveau adulte. Elle nécessite l’utilisation de souris génétiquement modifiées pour supprimer à l’âge adulte les protéines impliqués dans les processus épigénétiques. Il n’existe pas à l’heure actuelle d’outils génétiques similaires disponibles dans une autre espèce animale, à notre connaissance. Afin de caractériser la contribution de ces protéines aux effets comportementaux des opioïdes, il est nécessaire d’utiliser des tests impliquant une réponse motrice et l’expression d’un état émotionnel. Pour ces raisons il n’est pas possible de travailler sur un modèle autre que l’animal vivant. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 30 semaines. Sachant que notre objectif est de caractériser le rôle de la méthylation de l’ADN dans les effets des opioïdes sur le cerveau adulte, il est nécessaire d’utiliser une approche expérimentale qui n’interfère pas avec l’accumulation de la méthylation de l’ADN au cours de la maturation cérébrale (jusqu’à 6 semaines après la naissance). C’est la raison pour laquelle les souris utilisées seront âgées de 8 à 30 semaines.
Ostéoradionécrose mandibulaire : exploration de la physiopathologie des lésions et évaluation de l’efficacité de traitements chez le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
564 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une irradiation de la mandibule puis une extraction dentaire, avec difficulté à s'alimenter et perte de poids, et une coupe des incisives toutes les trois semaines, avant d'être tués pour prélever la mandibule. Le porteur décrit une nécrose osseuse chronique et douloureuse reproduisant une complication de la radiothérapie sans traitement curatif connu. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative au modèle animal pour étudier cette maladie.
Objectifs
L’objectif de cette étude est : (1) de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’évolution de l’ostéoradionécrose (ORN) et (2) de mettre en place de nouvelles stratégies thérapeutiques afin de réduire, voire traiter la maladie en utilisant un modèle animal de rat développant des lésions osseuses radio-induites similaires à celles observées chez les patients
Bénéfices attendus
Suite à une radiothérapie pour traiter un cancer des Voies Aéro-Digestives Supérieures (VADS), une ostéoradionécrose (ORN) peut survenir chez certains patients (5%) principalement au niveau de la mandibule. Le développement de l’ORN, qui correspond à une mort de l’os causée par les irradiations est une complication tardive de la radiothérapie parmi les plus redoutée par les cliniciens car elle peut engager le pronostic vital du patient. Il s’agit d’un processus lent, qui ne guérit pas spontanément. Les différents processus cellulaires et moléculaires induisant une ORN ne sont pas complètement élucidés. Au niveau clinique, l’ORN se caractérise par une nécrose chronique et douloureuse associée à une perte et une déformation osseuse permanente. Aujourd’hui aucun traitement curatif n’est disponible. Le traitement de référence est la chirurgie avec une greffe osseuse autologue sur un site ectopique. Nous avons développé dans un projet précédent un modèle animal d’ORN mandibulaire chez le rat Lewis, induisant des lésions similaires à celles observées chez les patients. Les investigations menées sur ce modèle dans le cadre de ce projet nous permettront : - Le développement des connaissances de la physiopathologie de l’ORN et - La mise en place de nouveaux traitements et l’évaluation de leur efficacité. A terme ce projet permettra une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Tous les animaux sauf les témoins non irradiés subiront une irradiation localisée de la mandibule inférieure gauche sous anesthésie (durée 15 min) ; puis à une extraction dentaire (molaire médiane de la mandibule gauche), 3 semaines après sous anesthésie générale (durée 30 min). Les animaux témoins de subiront que l’extraction dentaire. Des scanners au micro-CT seront réalisés sous anesthésie isoflurane (durée environ 5 min). Les incisives supérieures seront coupées à l’aide d’une fraise de dentiste sous anesthésie gazeuse, toutes les 3 semaines (durée de la procédure environ 5 min en tout). En fin de procédure, les animaux seront anesthésiés, puis perfusés avec du sulfate de baryum (durée 15 min).
Impact sur les animaux
Suite à l’irradiation de la mandibule et l’extraction dentaire, les animaux auront du mal à s’alimenter et vont perdre du poids au cours des 3 premières semaines. Pour pallier ce déficit, les animaux seront nourris avec de l’aliment hyper-énergétique mou. Cependant cette alimentation molle ne permettra pas l’usure des incisives supérieures qui poussent continuellement chez les rongeurs. Pour cela les incisives seront coupées toutes les 3 semaines environ. Il est également possible que des lésions à la peau soient observées : dans ce cas de la vétédine sera appliquée pour éviter toute surinfection.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés, les mandibules seront prélevées pour des analyses histologiques ou moléculaires.
Remplacement
Le développement des lésions osseuses nécessite l’interaction entre différents compartiments tissulaires (vasculaire, muqueux, inflammatoire et osseux), conditions retrouvées chez le modèle animal vivant. A ce jour, il n’existe pas d’alternative au modèle animal pour étudier les processus physiopathologiques de l’ostéoradionécrose mandibulaire ni la mise en place de procédure de traitements.
Réduction
Les modèles d’expérimentation pour l’étude tardive des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Dans le but d’effectuer des tests statistiques paramétriques sur les analyses histologiques (mesure de volume osseux), vasculaires et d’expression génique, des groupes de 16 animaux pour chaque technique sont nécessaires. Des tests statistiques seront réalisés afin de comparer tous les groupes entre eux : one- way ANOVA suivi d’un test de Tukey. Afin d’avoir des résultats robustes, nous avons identifié 3 techniques d’analyses différentes et complémentaires pour étudier la physiopathologie et le bénéfice thérapeutique des traitements. L’utilisation du scanner in vivo nous permet d’utiliser le même groupe d’animaux pour l’analyse au cours du temps du volume osseux et l’histologie.
Raffinement
Différentes mesures spécifiques sont prises pour réduire au maximum l’impact sur le bien-être des animaux - Diminution de la dose d’irradiation afin d’avoir développement des lésions attendues - Hébergement en groupe (4 animaux par cage duplex « Double Decker ») avec enrichissement (bâtons de bois et tunnel rouge) - Alimentation : les animaux sont nourris avec un aliment mou et hyperproteiné et mise à disposition de croquettes directement dans la cage - Suivi des animaux : Observation des animaux tout au long de l’expérimentation, pesée 2 fois par semaine, coupe des incisives supérieures toutes les 3 semaines - Douleur : Traitement à la buprénorphine après l’irradiation, avant et après l’extraction dentaire - Soin des lésions cutanées à la vétédine - Chirurgie dentaire : Utilisation d’anesthésiques spécifiques pour l’extraction dentaire : myorelaxation et sédation profonde suivi d’une réversion permettant un réveil très rapide des animaux. - Utilisation d’une plaque chauffante et de de gel oculaire pendant la chirurgie - Utilisation d’enceintes de réveil chauffées pour les phases d’endormissement et de réveil, - Réalisation de la chirurgie par des personnes compétentes et formées, avec du matériel adapté aux gestes et aux animaux
Choix des espèces
Chez l’homme, l’extraction dentaire est un des facteurs qui favorise le développement de l’ostéoradionécrose mandibulaire. Le rat est un animal de taille suffisante pour permettre cette extraction et permettre des approches de médecine régénératrice par comblement local. Pour reproduire la pathologie humaine, des animaux au stade jeune adulte seront utilisés afin qu’ils aient un poids suffisant pour « résister » aux séquelles des irradiations.
Plasticité adaptative des réseaux corticaux somesthésiques et moteurs après ischémie corticale focale chez le rat.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
390 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une lésion ischémique du cortex moteur par chirurgie, des cartographies du cerveau de plusieurs heures, une restriction alimentaire et des tests comportementaux, avant d'être tués pour analyse du cerveau. Le porteur indique que le modèle provoque une paresthésie de la patte antérieure qu'il juge inévitable et affirme minimiser l'inconfort. Il conclut que ces approches invasives ne peuvent pas être menées chez l'homme et justifie le recours au rat par trente ans de travaux du laboratoire.
Objectifs
L’AVC constitue la première cause de handicap physique acquis de l’adulte, la deuxième cause de démence et la deuxième cause de mortalité, avec 20% des personnes qui décèdent dans l’année suivant l’AVC. En dépit d’importants progrès survenus depuis 50 ans, tant au plan diagnostique que thérapeutique, les AVC demeurent un véritable fléau, d’abord pour les patients, puis en termes de coût de santé publique et d’incidence socioprofessionnelle. Ils entraînent des dysfonctionnements cérébraux responsables de graves déficiences physiques et intellectuelles. Les symptômes des AVC dépendent de la localisation et du volume de la lésion, chaque région du cerveau étant spécialisée dans des fonctions particulières (mouvement, sensibilité somatique, vision, audition, langage…). Les séquelles les plus fréquentes et invalidantes sont l’hémiplégie et l’aphasie (troubles du langage oral et écrit, affectant l’expression et la compréhension). En cas d’atteinte motrice, la majorité des patients récupèrent partiellement leur capacité à marcher, mais le contrôle de la motricité du bras et de la main reste souvent altéré. Les troubles de la marche et de l’équilibre sont très fréquents après un AVC. Ils sont associés à un risque élevé de chute. Une prise en charge précoce après un AVC limite la gravité des séquelles. Une fois la phase d’urgence passée, le patient bénéficie d’une rééducation commencée le plus tôt possible et d’un traitement adapté à ses facteurs de risque. Notre projet de recherche fondamentale est centré sur une meilleure compréhension de la neuroplasticité corticale qui sous-tend la récupération comportementale après une lésion vasculaire ischémique du cortex moteur. Il inclut une composante translationnelle. En effet, il s’articule avec des préoccupations majeures dans les domaines médical et sociétal, et plus particulièrement celui des méthodes de rééducation fondées sur des connaissances neurophysiologies précises. Il existe des lacunes dans ce domaine et une meilleure connaissance des mécanismes neuronaux de la réadaptation doivent permettre d’optimiser et de standardiser les approches thérapeutiques au bénéfice des patients AVC, afin qu’ils retrouvent plus rapidement leur autonomie et qu’ils puissent renouer avec leur vie sociale antérieure. Ce projet est le prolongement d’une recherche qui a été évaluée positivement par l’HCERES dans le cadre du renouvellement du laboratoire accordé pour la période 2018-2022.
Bénéfices attendus
Le premier bénéfice attendu de cette étude originale est une meilleure compréhension des interactions neurophysiologiques dynamiques entre les réseaux sensorimoteurs corticaux au cours de la récupération post-AVC. Le remodelage des cartes somatotopiques du cortex est un témoin fiable des réorganisations cérébrales qui sous-tendent la récupération comportementale après lésion corticale, comme en atteste une littérature abondante. Par ailleurs, l'investigation immunohistochimique apportera un éclairage précis sur les mécanismes neurochimiques impliqués dans les réorganisations corticales. Le deuxième bénéfice attendu consiste en un étayage neuronal d'une pratique clinique (thérapie par mouvement contraint) dont les mécanismes cérébraux restent largement incompris. Cette méthode thérapeutique consiste en une immobilisation temporaire du membre sain chez les patients cérébrolésés, en vue d'encourager l’utilisation du membre parétique et réactiver ainsi les circuits neuronaux de suppléance dans l’hémisphère lésé. Les mécanismes neuronaux sous-jacents restent méconnus, ainsi que la période et la durée optimales d'application de cette thérapie, sachant qu'elle peut être compromise par des processus d'excitotoxicité si elle est initiée trop tôt et avec un régime trop intense. Une meilleure compréhension des mécanismes de neuroplasticité qui sous-tendent la thérapie induite par mouvement contraint permettra une meilleure standardisation de cette approche thérapeutique chez les patients cérébrolésés.
Procédures
Cette étude inclut différentes interventions (procédures de chirurgie, de cartographie corticale, d’évaluation comportementale, de réhabilitation fonctionnelle et d’immunohistochimie). Les interventions chirurgicales (durée d’environ 2h) constituent une étape préliminaire aux enregistrements corticaux réalisés en vue d’étudier la malléabilité des cartes somatotopiques du cortex somesthésique primaire (S1), consécutives à la lésion ischémique corticale dans le cortex moteur (M1), au cours du temps postlésionnel. Les cartographies électrophysiologiques et optiques seront réalisées après la lésion à différents délais. Elles dureront environ 5h. L’approche en cartographie électrophysiologique inclut, pour un sous-groupe d’animaux, une méthode d’inactivation temporaire de l’activité des neurones du cortex somesthésique par application de muscimol (agoniste du neuromédiateur inhibiteur GABA), en vue d’établir des relations causales entre les réorganisations corticales attendues et la récupération des déficits sensorimoteurs. La première méthode d’inactivation par injection ponctuelle de muscimol dure environ 2h. La seconde méthode consiste en une diffusion chronique de muscimol durant quelques jours au cours de la période de récupération postlésionnelle s’étalant sur 2 mois. Nous analyserons quantitativement, à l'aide de tests comportementaux, l’évolution postlésionnelle des déficits sensorimoteurs induits par la lésion ischémique. La durée des tests quotidiens est d’environ 2h par animal en début d'apprentissage, puis elle se réduit à 45-60 min après apprentissage, chez les animaux lésés. De plus, nous chercherons à améliorer les réorganisations corticales, ainsi que la récupération fonctionnelle, par deux méthodes de réadaptation sensorimotrice incitant l’animal à utiliser son membre parétique. L’application de chacune de ces méthodes ne dépasse pas 2h par séance. Au stade final de cette étude, une analyse immunohistochimique sera effectuée afin d'explorer des mécanismes neurochimiques du remodelage des aires corticales (étude de l’expression des récepteurs inhibiteurs GABAA et B, des récepteurs excitateurs glutamatergiques NMDA…). Cette procédure est réalisée en post-mortem, après une étape de perfusion du cerveau dont la durée est d’environ 1h.
Impact sur les animaux
Dans une exploration neurophysiologique et comportementale des conséquences d'une atteinte cérébrale, l’apparition de déficits fonctionnels (dans notre étude une paresthésie de la patte antérieure) est inévitable. Dans notre étude, toutes les précautions sont prises pour supprimer la douleur durant les approches invasives, et neutraliser les risques d'infection. De plus, notre approche vise à réduire au mieux l'impact du syndrome postlésionnel, qui régresse rapidement au cours du temps, sur les fonctions physiologiques, l'état psychologique et la vie relationnelle et des animaux. Les effets indésirables sont liés à l'état de l'animal cérébrolésé qui ne dispose pas de ses fonctions sensorimotrices normales pour maintenir une posture optimale et réguler correctement ses déplacements. Par ailleurs, comme indiqué, la méthode de contention est relativement contraignante pour l'animal, mais elle est temporaire et rapidement réversible selon la méthode que nous avons mise au point. Elle contraste avec les méthodes d'immobilisation par plâtrage du membre antérieur communément utilisée dans la littérature. De plus, le comportement de l'animal lorsqu'il est à nouveau libre de ses mouvements ne révèle aucun signe d'inconfort ou de souffrance, l'animal se déplaçant immédiatement avec sa mobilité habituelle, compte tenu de l'état d'avancement du processus de récupération fonctionnelle. Par ailleurs, la perte de poids liée à la restriction alimentaire reste dans les limites recommandées, car elle n'excède pas 10 % du poids mesuré en début d'étude, sur une période de 72h.
Devenir
Les animaux seront réveillés après les procédures de chirurgie et de première cartographie pour un suivi comportemental de l’évolution de leurs déficits sensorimoteurs. Ils seront mis à mort après la session finale de cartographie intervenant au terme de cette évaluation comportementale, avant ou après la procédure de perfusion en vue de l’étude en immunohistochimie. Les animaux de la procédure d'inactivation transitoire du cortex seront mis à mort à la fin des observations comportementales.
Remplacement
Les objectifs même de cette étude, axés sur la compréhension des mécanismes de plasticité mis en jeu après une atteinte ischémique et leur corrélation avec la récupération fonctionnelle nécessitent le recours à des animaux. En effet, nos questionnements impliquent des approches invasives in vivo (1 : cartographies électrophysiologiques ; 2 : optiques) qui permettent une résolution spatiale et temporelle (1: 100 microns; 2: 50 microns, 0,3 ms) qui ne peuvent être obtenues par une exploration fonctionnelle chez l’homme que cela soit en électrophysiologie ou en neuro-imagerie. Par ailleurs, l’étude des mécanismes neurochimiques nécessite une approche post-mortem sur coupes histologiques.
Réduction
Le nombre de rats par groupe expérimental sera limité à son strict minimum compte tenu des contraintes de chaque technique expérimentale, avec des analyses statistiques adaptées. Nous limiterons notre étude de la réorganisation corticale après lésion à des délais post-lésionnels cruciaux, que nous avons établis au regard de la littérature dans le domaine. Une médication adaptée (anesthésiques, analgésiques, anti-inflammatoires, antibiotiques) sera mise en œuvre pour éviter toute douleur ou souffrance des animaux. En ce qui concerne les conditions d’hébergement, et selon les nouvelles directives européennes, sera rajoutée dans les cages de la litière foisonnante à base de frisure de papier qui sera renouvelée lors de chaque change.
Raffinement
Au cours de l’expérimentation, le maintien d’un niveau d’anesthésie stable prévient la souffrance des animaux. L’efficacité de l’anesthésie sera vérifiée, à intervalles réguliers, par l’absence de réaction au pincement de la queue ou d’une patte ; la surveillance d’un éventuel mouvement des vibrisses, des modifications des rythmes cardiaque (enregistré lors des enregistrements optiques) et respiratoire sera également effectuée. Après son réveil, la douleur et/ou la détresse de l’animal sera évaluée par l’expérimentateur et les zootechniciens dès son réveil puis au minimum 2 fois par jour en observant son apparence (poil, propreté), son comportement spontané (posture, locomotion, alimentation, toilettage), ou son comportement provoqué après stimulation/incitation comportementale. Des mesures adaptées sont alors entreprises. Un traitement analgésique immédiat (carprofène, 5mg/kg; 0,1ml/100g ; SC) sera prodigué si des signes de douleur apparaissent ; Une euthanasie sera réalisée si des signes neurologiques anormaux sont constatés ou si un comportement apathique persiste pendant les 1ères 24h après le réveil de l’anesthésie.
Choix des espèces
Les études antérieures dans le domaine de la plasticité post-lésionnelle du système somesthésique ont été menées chez l’homme, le primate non humain et majoritairement chez le rat, surtout pour celles qui utilisent des approches en cartographie électrophysiologique, en imagerie optique et immunohistochimie. Par ailleurs, le système somesthésique et ses représentations corticales chez le rat sont particulièrement bien documentés dans la littérature scientifique. De plus, les études développées dans notre laboratoire dans ce domaine depuis plus de 30 ans, ont été réalisées sur la même espèce, constituant des travaux de référence pour l’avancée de notre projet. De même, les tests comportementaux visant à évaluer les déficits sensorimoteurs et leur récupération sont bien standardisés dans les études conduites chez le rat, et sont maîtrisés dans notre équipe de recherche. Cette étude sur la plasticité post-lésionnelle du cortex cérébral, en relation avec la récupération fonctionnelle après atteinte ischémique corticale sera réalisée sur des rats Long-Evans âgés de 3 mois (± 15 jours), chez qui le système nerveux est considéré comme mature.
Evaluation des conséquences de la surexpression de CYP46A1 dans le métabolisme striatal et sanguin dans un modèle murin de la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
146 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Issues d'une lignée transgénique qui reproduit la maladie de Huntington, elles présentent perte de poids, déficits moteurs et cognitifs et peuvent mourir spontanément vers trois mois, avant de recevoir une injection dans le cerveau par chirurgie stéréotaxique puis d'être tuées pour prélèvement. Le porteur indique que la craniotomie peut provoquer douleur, saignement et inflammation. Il affirme qu'aucune culture cellulaire ne reproduit la complexité du cerveau et présente la lignée comme bien caractérisée.
Objectifs
Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. Des nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir de la maladie. Selon la pathologie, cet objectif peut être atteint en délivrant aux cellules un gène sain qui prendra le relai du gène déficient. Un virus modifié (AAV) non pathogène nous permettra de délivrer cet ADN au cœur même des cellules. Nous avons déjà la preuve de concept de notre stratégie dans des modèles murins pour la maladie de Huntington : l’enzyme déficiente à l’origine de la pathologie est remplacée par cet ADN permettant la synthèse d’une enzyme assurant la fonction normale permettant de corriger les anomalies neuropathologiques et comportementales chez la souris malade. Le but principal de cette étude est d’investiguer quelles sont les conséquences générales de la surexpression de ce gène et donc de la quantité d’enzyme sur la restauration des paramètres biologiques attendus des souris du modèle murin pour la MH. Pour répondre à cette question différents biomarqueurs présents dans les tissus et dans le sang seront analysés.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra d’identifier un marqueur métabolique dont le profil pourrait être modifié après l'injection d’un AAV exprimant le gène thérapeutique CYP46A1 chez un model murin de la maladie d’huntington. Ce métabolite pourra être utilisé comme marqueur d’efficacité de ce traitement dans le cadre du futur essai clinique.
Procédures
A partir de 6 semaines d’âge, les animaux transgéniques issus des couples reproducteurs développeront un phénotype dommageable. Les souris utilisées recapitulent les atteintes patholgiques de la maladie d'Huntington, c'est a dire qu'ils présentent une perte de poids, des defauts moteurs et cognitifs et décedent spontanément apres 3 mois de vie. A 4 semaines d’âge, les animaux seront soumis à une injection stéréotaxique sous anesthésie générale (Durée 70 minutes), avec prise en charge analgésique avant et apres la chirurgie. A 10 semaines d’age, les animaux seront mis à jeun pendant 6 heures puis euthanasié avec prise en charge préalable d’analgésique avant l’intervention (euthanasie). Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir analyser les prélèvements de sang et de tissus.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées récapitulent les atteintes patholgiques de la maladie d'Huntington, la perte de poids, les défauts moteurs et cognitifs impactant la capacité de l'animal a s'alimenter et ils peuvent décédés spontanement apres 3 mois de vie. Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Un risque d’inflammation relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le striatum des souris. Une perte de poids dû a l’injection de AAV pourrait être observé (5 à 7% ) du poids total de l’animal, (selon nos précédentes études), bien que les concentrations des AAVs utilisées ont déjà été evaluées in vitro et dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris.
Devenir
Lors de la procédure n°1 qui correspond à l’élevage d’une lignée dommageable les animaux d’intérêt produits seront maintenus en vie et inclut dans la procédure n°2 qui est la procédure expérimentale à proprement parler. Pour la procédure n°2 et donc l’euthanasie des animaux, les animaux seront euthanasiés en fin procédure pour les prélèvements et leur analyse afin de pouvoir répondre à la question scientifique de ce projet.
Remplacement
Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, les souris Huntington sont bien caractérisées. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (146) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses. Afin de limiter le nombre total d’animaux essentiels au projet, les tests des analyses biochimiques post-mortem seront dans la mesure des possibles réalisés sur les mêmes animaux. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’information en utilisant un minimum d’animaux. Les distincts paramètres (biochimiques) seront analysés grâce à des essais appropriés en fonction des revendications expérimentales. De plus, un plan statistique complet a été rédigé et validé.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. L’application de critères d’arrêts standards en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. En cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. 6h après l’acte chirurgical, une injection d'analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. 24h après une deuxième injection d'analgésique est réalisée. 4h/5h après cette injection les animaux seront observés par l’expérimentateur et il sera vérifié qu’aucun signe de douleur est détecté. Si besoin, une injection d'analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. Le protocole d’analgésie post opératoire a été décidé avec l’accord du vétérinaire clinicien.
Choix des espèces
Le but principal de cette étude est d’investiguer quelles sont les conséquences générales, de la surexpression du CYP46A1 (le gène thérapeutique) et la restauration de la voie de synthèse du cholestérol dans la région cible du cerveau (striatum), sur le métabolisme cellulaire des souris du modèle murin pour la MH. Pour répondre à cette question différents biomarqueurs du métabolisme présents dans les tissus et dans le sang seront analysés. Nous commencerons par valider nos vecteurs dans des souris saines avant son utilisation future chez la souris modèle. Les souris qui seront utilisées sont des souris adultes (4-8 semaines), dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnés d’injection dans le cerveau. Ce protocole a déjà été validé dans notre laboratoire.
Dermatologie
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Rats : 1000
Cochons : 100
2 600 cochons, souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère, une partie des rongeurs (800) étant réutilisée et le reste tué. Ils subissent l'induction de maladies de peau comme le psoriasis, des biopsies cutanées et des évaluations de grattage sous anesthésies répétées, l'isolement prolongé classant certaines procédures en sévères. Le porteur indique que l'ingestion d'imiquimod par toilettage peut provoquer chez la souris une perte de poids, une déshydratation et une hypothermie. Sur le remplacement, il affirme que les tests in silico ou in vitro ne peuvent pas suppléer le modèle animal faute d'un environnement biologique intact.
Objectifs
Les origines des pathologies de la peau sont souvent multifactorielles. Le psoriasis, par exemple, est une maladie inflammatoire chronique de la peau qui touche 1 à 3% de la population mondiale et pour laquelle il existe souvent une prédisposition familiale héréditaire (30 % des cas). Un dérèglement du système immunitaire est aussi incriminé. De plus, des facteurs extérieurs, comme le stress, la fatigue, les infections, certains médicaments par exemple, peuvent favoriser la survenue de poussées de psoriasis. Le psoriasis ou l’hypersensibilité de contact, tout comme un grand nombre de pathologies de la peau sont souvent associés à des démangeaisons qui entrainent un besoin incontrôlable de se gratter. Le prurit peut aussi survenir sur une peau saine, sans raison apparente. Les causes des démangeaisons sont très variées : éruptions cutanées, peau sèche, piqûres, réactions allergiques, maladies affectant le système nerveux ou d’autres organes. Quel que soit la ou les causes, le fait de se gratter n’améliore pas la situation, au contraire, il contribue à son aggravation. Le projet concerne des tests d'évaluation de réactions ou d'affections cutanées chez le rongeur et le porc, de comportements de grattage chez le rongeur et de cicatrisation chez le rongeur. Les tests décrits dans ce projet ciblent l'évaluation des effets de substances dans le cadre de développement préclinique de produits pharmaceutiques. Ces modèles sont mis en place et utilisés afin de tester l'efficacité de médicaments à lutter contre certaines affections cutanées (psoriasis, allergie, dermatite atopique, démangeaisons) ou à améliorer la cicatrisation.
Bénéfices attendus
Ces différents modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter contre certaines affections cutanées (psoriasis, allergie, dermatite atopique, démangeaisons) ou à améliorer la cicatrisation. Par exemple, même si les corticoïdes, appliqués par voie topique ou orale, sont fréquemment utilisés pour traiter de nombreuses affections cutanées, ces derniers ne restaurent pas la barrière que constitue l’épiderme. Leur utilisation est de plus fréquemment accompagnée d’une immunosuppression, ce qui a pour conséquence de prolonger leur utilisation à des doses fortes entrainant ainsi de nombreux effets secondaires (atrophie de la peau, augmentation du risque d’infection). Pour ces raisons, de nouveaux traitements, sans effets secondaires majeurs, sont en développement.
Procédures
Dans la procédure d'évaluation de grattage, les rats et les souris sont rasés (sous anesthésie gazeuse). A la fin de la procédure (évaluation du grattage), des prélèvements de sang (sous anesthésie) et structures/organes après euthanasie (peau…) peuvent être nécessaires. Dans la procédure d’évaluation de la cicatrisation chez la souris, les souris sont rasées (sous anesthésie gazeuse) et une exérèse de la peau est réalisée (sous anesthésie gazeuse et sous traitement analgésique) à l’aide d’un punch à biopsie (2 biopsies d’un diamètre de 5 mm). Pour évaluer l’évolution de la cicatrisation (et appliquer les traitements topiques le cas échéant) les souris sont légèrement anesthésiées (anesthésie gazeuse) de façon régulière pendant 3 semaines maximum (généralement 1 fois maximum par jour). A la fin de la procédure, des prélèvements de sang (sous anesthésie) et structures/organes après euthanasie (peau…) peuvent être nécessaires. Dans les autres procédures chez le rongeur (rat et souris), les animaux sont anesthésiés (anesthésie gazeuse) et rasés/épilée (zones à traiter). Pour évaluer l’évolution des lésions cutanées et appliquer les traitements topiques, les animaux souris sont légèrement anesthésiées (anesthésie gazeuse) de façon régulière sur une période pouvant aller d’une à trois semaines maximum selon la procédure (généralement 1 fois maximum par jour, sauf 2 fois par jour pour le modèle de sécheresse de la peau). A la fin de la procédure, des prélèvements de sang (sous anesthésie) et structures/organes après euthanasie (peau…) peuvent être nécessaires. Dans la procédure chez le porc, les animaux sont placés sous sédation légère (injection de tranquillisants) pour la phase dite de sensibilisation, la phase dite de challenge, pour l’application des traitements topiques et pour les prélèvements sanguins (le cas échéant). Cette tranquillisation est réalisé en plusieurs occasions sur une période généralement de 9 jours maximum (généralement 1 fois maximum par jour). A la fin de la procédure, des prélèvements de sang (sous anesthésie) et structures/organes après euthanasie (peau…) peuvent être nécessaires.
Impact sur les animaux
Pour les procédures chez le rongeur, les animaux peuvent être isolés pendant plusieurs jours. Cet isolement est nécessaire pour éviter les morsures/griffures occasionnées par les congénères qui pourraient introduire un biais dans l'évolution et donc l'évaluation des lésions (aggravation des symptômes). De plus, l’isolement permet aussi d’éviter l’ingestion inter-individuelle des traitements appliqués de façon topique (traitements sous forme de pommade, de crème,…). Dans la procédure d'induction de psoriasis chez le rongeur, l’ingestion possible de l’imiquimode (par le toilettage) peut induire une toxicité (observée plus particulièrement chez la souris) dont la conséquence est une perte de poids (et éventuellement une déshydratation et une hypothermie). Pour les procédures chez le rongeur (sauf modèle de grattage et modèle de sécheresse de la peau), même si cela demeure extrêmement rare, une attention particulière sera apportée à l’apparition de lésions ulcératives et/ou infectées, ainsi qu'à l’infection/surinfection de la plaie induite par la biopsie (modèle de cicatrisation uniquement). Pour la procédure chez le porc, une contention est nécesaire pour appliquer les traitements. Pour minimiser le stress de cette contention, les aniamux sont placés sous sédatif
Devenir
A l'issue la procédure d'évaluation de grattage, les rats et les souris peuvent être réutilisés s'ils n'ont pas été soumis à un prélèvement terminal et s'ils n'ont pas reçu de substances dont les effets à long terme ne sont pas connus. Les autres procédures chez le rats et la souris sont classées sévères (du fait de la durée d'isolement des animaux). Ils sont euthanasiés à l'issue de la procédure. De plus, des prélèvements terminaux (ex: peau et/ou sang) sont souvent réalisés pour analyse à la fin de la procédure. Ils sont euthanasiés à l'issue de la procédure. De plus l'évolution corporelle importante du porc ne permet pas sa réutilisation dans une nouvelle procédure.
Remplacement
En amont des tests in vivo, des tests in silico ou in vitro peuvent être envisagés. Cependant, même si ces tests peuvent apporter des données préliminaires ou complémentaires (permettant ainsi un tri des substances à étudier, et donc réduisant de fait le nombre d'animaux utilisés), ils ne peuvent entièrement suppléer les modèles animaux car ils ne permettent pas d’évaluer les pathologies dans un environnement biologique et immunologique intact comme cela est possible chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude a été optimisé de façon à obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la relation dose-effet et la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement positif. Nos analyses statistiques (Student'st test) indiquent qu’un effectif de 8-10 animaux par groupe (nombre de groupes variable en fonction du nombre de doses et de produits à testés) est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test. Lorsque celà est possible, des prélèvements sanguins intermédiaires (autre que terminal) peuvent être envisagés sur un même animal, permettant ainsi de générer de données sur la cinétiques d'action de la molécule testés sans utiliser un plus grand nombre d'animaux..
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure), jouets (porcs). Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets.
Choix des espèces
L’impact de substances pharmacologiques sur les paramètres physiologiques des espèces choisies est prédictif de leurs effets chez l’Homme. De plus, le choix des espèces est basé sur la bibliographie scientifique, les modèles expérimentaux étant largement décrits chez le rat et la souris. L’utilisation du porc voit également son intérêt de par les caractéristiques de sa peau qui sont proches de celle de l’Homme. Principalement rongeurs sevrés, âge variant entre 3 semaines et 6 mois, conformément aux données historiques, à la bibliographie scientifique (Avci et al., 2013, Expert Opin Drug Discov. 8(3): 331-355). Principalement porcs sevrés, âge minimum de 4 semaines, conformément aux données historiques (manipulation encore aisée à cet age) et à la bibliographie scientifique (Mollison et al., 1998, Current Pharmaceutical Design. 4: 367-379).
Etude d’immunogénicité, protection et suivi en stabilité d’un vaccin universel contre la grippe chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent deux injections dans la patte sans anesthésie, et 30 % d'entre elles sont infectées par la grippe par voie nasale sous anesthésie, l'infection pouvant provoquer une perte de poids, les souris atteignant -20 % de leur poids étant alors mises à mort. Le projet vise à tester un candidat-vaccin ciblant la nucléoprotéine du virus et à contrôler des lots destinés au marché humain. Le porteur affirme qu'aucun test in vitro ne peut reproduire la réponse immunitaire et que le modèle souris est imposé par les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques.
Objectifs
La grippe est une maladie virale aiguëe, fréquente et très contagieuse causée par des virus grippaux qui circulent dans toutes les régions du monde. On estime à un milliard le nombre de cas, à 3-5 millions le nombre de cas graves et entre 290 000-650 000 le nombre de décès liés à la grippe dans le monde. Des pandémies de grippe surviennent occasionnellement en plus de la grippe saisonnière annuelle, avec un impact sanitaire et économique considérable. La vaccination est la stratégie la plus efficace pour protéger les populations. Elle fonctionne en induisant des anticorps spécifiques à la souche de grippe circulante, visant à cibler les protéines de surface du virus. Cependant ces vaccins sont partiellement efficaces : 32% pour les personne âgées et 43% sur les adultes en raison du fait que les souches virales en circulation mutent tous les ans. Pour pallier la mutation des protéines de surface, les vaccins sont reformulés chaque année. Cependant, le virus de la grippe possède également une protéine contenue à l’intérieur de l’enveloppe virale, la nucléoprotéine (NP), qui diffère peu d’une souche à l’autre, ce qui fait d’elle une cible pertinente pour l’efficacité des vaccins sur le long terme. Ainsi un vaccin qui induit une réponse protectrice contre une protéine peu sujette aux mutations pourrait donc conférer une protection plus durable non seulement contre la grippe saisonnière humaine, mais aussi contre une nouvelle pandémie et pourrait donc avoir améliorer l'efficacité du vaccin. Un candidat-vaccin, contenant la nucléoprotéine de la souche A de la grippe est capable d’induire une réponse immunitaire de type cellulaire permettant une protection contre différentes souches du virus de la grippe chez la souris. Ce projet a donc pour objectif d’améliorer les vaccins actuels contre la grippe, en ouvrant la voie vers le développement clinique d'un candidat-vaccin qui pourra être utilisé seul, avec un adjuvant ou en association avec les vaccins saisonniers actuellement sur le marché. Les lots de vaccins destinés aux études cliniques chez l’homme doivent subir des tests concernant leur efficacité et leur activité biologique chez la souris. Enfin il est nécessaire de procéder à des études de stabilité, afin de vérifier que le médicament expérimental sera stable pendant la période de stockage prévue de sa libération à son administration aux patients
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d’améliorer l’efficacité des vaccins antigrippaux saisonniers et pandémiques actuels. Ce candidat-vaccin produira, en plus de la réponse humorale habituellement observée à la suite d’une vaccination contre la grippe saisonnière ordinaire, une forte réponse des cellules T ainsi qu’une protection de longue durée contre l’antigène le plus conservé de la grippe : la nucléoprotéine NP. Afin d’obtenir une autorisation d’essai clinique chez l’homme (Phase IIA, III), il est nécessaire de réunir suffisamment de données concernant l’efficacité et l’innocuité de ce candidat-vaccin in vivo. Une preuve de concept de l’efficacité et de l’innocuité du candidat-vaccin seul ou coadministré avec un vaccin saisonnier ou avec un adjuvant sera effectuée dans un modèle physiopathologique infectieux, c'est-à-dire après inoculation de la grippe. La production et le contrôle qualité des vaccins répondent à des normes très strictes (réglementation européenne et bonnes pratiques de fabrication) qui doivent être respectées pour la libération des lots de vaccin, la surveillance de sa sécurité et son contrôle pour une utilisation chez l’homme. Un test chez la souris, comme contrôle de l’activité biologique est imposé à la libération des lots, et également dans les études de stabilité réalisées suivant les ICH pour contrôler une potentielle évolution des vaccins au cours du temps, et dans les conditions de stockage définies (température, humidité de l'air, lumière). Le suivi en stabilité permet de définir la date limite d’utilisation du vaccin.
Procédures
Tous les animaux du projet vont recevoir 2 injections dans le muscle de la patte sans anesthésie préalable. Ces injections sont espacées de 21. Pour 70% des animaux, seul un prélèvement de sang sera réalisé au jour de la mise à mort de l'animal. Avant chaque prélèvement de sang, une goutte d'un collyre anesthésique local (Tétracaïne). 30% des animaux seront infectés par voie intra-nasales sous anesthésie profonde (70 mg/kg de Kétamine et 9 mg/kg de Xylazine, par injection intra-péritonéale)
Impact sur les animaux
Pour les procédures (Comparaison de l’efficacité d’un candidat vaccin contre la Grippe, Etude de la co-admnistration avec un vaccin saisonnier grippe et le dernier etude d’activité biologique et stabilité de un candidat vaccin contre la Grippe) du projet aucune souffrance des animaux n'est attendue. Le geste de l'immunisation intramusculaire est très peu invasif pour l'animal. Également, les volumes injectés ne dépassent pas 50μl évitant au maximum tout type de douleur musculaire et aucune souffrance n'est attendue en réponse aux formulations vaccinales injectées. La procédure Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins, l'infection virale peut entraîner une perte de poids chez les animaux.
Devenir
L'ensemble des animaux du projet sont mise à mort lors de chaque procédure.
Remplacement
L'efficacité d'un vaccin dépend de sa capacité à induire une réponse immunitaire, avec un mécanisme d’action spécifique, un phénomène biologique complexe faisant intervenir différents types de cellules immunitaires et une organisation particulière qui rend impossible son étude dans des tests in vitro. De plus, les tests de protection contre une infection virale ne peuvent être menés que par des études in vivo. Pour la procédure: Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins, nous étudions et essayons de mettre en place un test in vitro qui puisse répondre aux exigences de la réglementation pour remplacer les études sur les animaux, mais cette étude est toujours en recherche.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit à minima sans compromettre les objectifs du projet. Pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, des groupes de 6 souris sont nécessaires dans les procédures (Comparaison de l’efficacité d’un candidat vaccin contre la Grippe, Etude de la co-admnistration avec un vaccin saisonnier grippe ). Des groupes de 10 souris sont nécessaires dans les procédures ( Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins ou pour l'etude d’activité biologique et stabilité de un candidat vaccin contre la Grippe) pour l’utilisation d’un test plus performant et une analyse statistique plus stricte pour la libération de lots vaccins. L’analyse et l’estimation du nombre d'animaux à utiliser se font en amont de l’expérimentation.
Raffinement
Les souris seront acclimatées durant une semaine au PBES. L’immunisation est réalisée par voie intra musculaire. C’est une voie permettant l’obtention d’une bonne réponse immunitaire et qui est peu invasive pour l’animal. Les animaux en expérimentation sont observés au moins une fois tous les 2 jours et ce pendant 7 jours après les immunisations. Enfin, avant chaque prélèvement de sang, un collyre anesthésique local sera appliqué. Pour la procédure Etude de protection contre une infection virale pour évaluer l’efficacité des candidat-vaccins, les infections virales intra-nasales sont réalisées sous anesthésie profonde. De jour 43 à jour 56 après infection les souris feront l’objet d’une surveillance régulière et seront pesées quotidiennement pendant 2 semaines, un point limite est fixé à une perte de 20% de poids du poids initial.
Choix des espèces
Une partie des réponses immunes médiées par les lymphocytes T sont initiées dans les ganglions lymphatiques, qui drainent le site de l’immunisation, et qui vont pouvoir circuler dans les divers organes lymphoïdes et certains tissus comme le parenchyme pulmonaire. Cependant, aucun modèle in vitro n’est actuellement capable de reproduire une telle dynamique de circulation. Egalement, de nombreuses études déjà réalisées sur le modèle souris avec ce pathogène permettent d'optimiser les essais en limitant au maximum le nombre d'animaux, ainsi que la souffrance de l'animal. Le choix du modèle souris est donc adapté, et également imposé par son utilisation dans les tests précliniques des compagnies pharmaceutiques. Nous allons utiliser des animaux sevrés de 6 semaines à 12 semaines. Le système immunitaire est décrit comme mature à partir de cet âge là et non vieillissant.
Utilisation d’animaux à des fins de production de virus et bactéries utilisés comme réactifs dans le cadre de contrôles réglementaires d’activité par épreuve sur les rongeurs ou pour la production de Principes Actifs.
- Production de routine
- Tests réglementaires
Hamsters dorés : 4489
8 535 animaux non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 4 046 souris et 4 489 hamsters dorés, une large part dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère (846 souris et 3 689 hamsters). Ils sont inoculés, souvent par voie intracérébrale sous anesthésie, avec les agents de la rage, de la leptospirose et de la rhinopneumonie équine, pour produire des souches virales et bactériennes servant à fabriquer et contrôler des vaccins. Le porteur décrit des symptômes installés avant le prélèvement, tremblements, paralysie et prostration, les animaux étant prélevés "au stade moribond" pour garantir la virulence des souches. Il affirme que la production est "irréalisable" in vitro et qu'il n'est "actuellement pas possible" de réduire le nombre d'animaux.
Objectifs
Afin d’être en adéquation avec les exigences réglementaires de la Pharmacopée Européenne et des pays tiers destinataires pour la fabrication d’un lot commercial, ce projet vise à produire des souches destinées à : - fabriquer des vaccins (lots de semences de travail) - réaliser des contrôles qualité permettant la libération de lots (souches d’épreuve) Ces tests sont réalisés pour les agents responsables de la rage, de la leptospirose, et de la rhinopneumonie équine. Il n’existe actuellement pas de modèle in vitro alternatif.
Bénéfices attendus
Les avantages de cette procédure sont qu’un cadre réglementaire est apporté par la pharmacopée, ce qui permet la libération de vaccins sans danger pour la santé animale. Le recours à des espèces alternatives permet de ne pas utiliser les espèces cibles, dans ce projet des chiens et des chevaux. Par ailleurs, la production de souches de virus de la rage représente un risque d’hygiène et sécurité majeur pour les manipulateurs (aucun traitement existant, il y a donc danger mortel en cas de contamination). Le prélèvement au stade moribond permet d’obtenir des quantités importantes de souches suffisamment virulentes, tout en manipulant le moins d’animaux possible. L’objectif est ici de limiter au maximum le nombre d’épisodes de production de souches virales pour ne pas exposer le personnel à des risques superflus.
Procédures
Après une durée minimale de deux jours d’acclimatation, les rongeurs sont inoculés avec la souche d’intérêt. Tous les animaux sont ensuite suivis au moins deux fois par jour (et au minimum toutes les 12 heures) jusqu’à la fin de l’épreuve. La démarche expérimentale est la même pour les trois procédures expérimentales. Une anesthésie est réalisée avant l’injection des souches par voie intracérébrale
Impact sur les animaux
Les dommages liés aux tests sont une souffrance pour les animaux et une augmentation du stress due aux injections et aux manipulations par l’homme. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé et compétent afin de limiter stress et souffrance. Il y a un développement de la pathologie pour les rongeurs. Les animaux montrent les symptômes liés aux maladies infectieuses testées : la prostration, le dos voussé, les reins creusés, des tremblements et l’absence de réactions aux stimuli. Pour les maladies virales avec un tropisme pour le système nerveux : les poils hérissés, la réduction des déplacements, des tremblements, des mouvements saccadés, la parésie, la paralysie, des flancs creusés, les yeux enfoncés, des convulsions. Les animaux sont prélevés quand les signes cliniques spécifiques sont installés, attestant ainsi de la bonne virulence de la souche.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés
Remplacement
La production de souches est actuellement irréalisable sur modèles in vitro. Il faut passer par des modèles in vivo. Ces souches servent à la fabrication des principes actifs des vaccins (lot de semence de travail), et à réaliser des contrôle qualité permettant la libération de lots (contrôles d’activité par épreuve).
Réduction
Le nombre de rongeurs utilisés correspond au nombre nécessaire pour la production des lots de semences primaires, des souches d’épreuves et des contrôles les validant. Il n’est actuellement pas possible de le réduire.
Raffinement
Des points limites spécifiques aux pathologies et les plus précoces possibles sont déterminés et appliqués. Le personnel vérifie régulièrement l’évolution de l’état général et si les points limites spécifiques sont atteints. Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages contenant des enrichissements, dans des locaux appropriés et conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé. Les conditions d’hébergement varient en fonction de l’espèce et de l’âge des animaux pour maximiser leur confort. Des copeaux pressés sont disposés dans la cage pour les hamsters, et pour les souris, l’enrichissement est limité à la litière et aliment afin d’éviter tout risque EHS de manipulation de l’enrichissement par l’opérateur lors des observations quotidiennes. La Structure du Bien-Etre Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.
Choix des espèces
Ces espèces ont été choisies car ce sont celles décrites pour les productions par la Pharmacopée. Pour l’épreuve rage sur souris : Il faut des souris de 14-16g pour la technique de titrage et de 4 à 5 semaines pour la production de souche et pour le test d'homogénéité-fidélité. Pour la leptospirose sur hamster : Il faut des hamsters de 40 à 49g, soit de 3 à 4 semaines. Pour la rhinopneumonie équine sur hamster : Il faut des hamsters de 40 à 49g, soit de 3 à 4 semaines. Ces stades de développement correspondent à l’âge ou au poids requis pour répondre au dossier déposé aux autorités.
Développement d’un nouveau système de régulation génique contrôlé par la nutrition. Application à un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
498 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 450 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une greffe de métastases hépatiques de cancer colorectal, des injections répétées d'un vecteur viral et de molécules anticancéreuses, un gavage trois fois par semaine et des prélèvements de sang jusqu'à une ponction intracardiaque terminale, pour valider un système de régulation génique appelé NUTRIREG. Le porteur renvoie le transfert vers l'homme à une échéance qu'il qualifie de "rapide", tandis que les atteintes infligées aux souris sont immédiates. Il indique avoir mené des expériences in vitro préliminaires mais juge "indispensable" de répéter les expériences sur les animaux.
Objectifs
ll est nécessaire de valider notre système de régulation génique NUTRIREG dans un modèle de pathologie pour pouvoir envisager des tests cliniques chez l'homme. Nous avons choisi le modèle des métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC), pour son intérêt médical, sa faisabilité et son transfert rapide en médecine humaine. En effet, le foie est le site privilégié des métastases du cancer colorectal puisqu'il concerne 50% des patients, avec seulement 25% de survivants à 5 ans. Par ailleurs, notre voie de régulation est très réactive dans le foie. Nous avons ainsi choisi d’utiliser NUTRIREG dans un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC) par induction contrôlée du gène apoptotique TRAIL associé ou non avec une molécule anti-cancéreuse (ONC-212 ou 5-Fu). Il a été démontré que ces 2 molécules sont capables d'améliorer l'action de TRAIL pour induire l'apoptose des cellules cancéreuses.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons maintenant valider l’approche NUTRIREG dans un modèle animal pour le traitement d’une pathologie de façon à pouvoir rapidement transférer cette technologie à l’homme. Nous avons choisi d’utiliser NUTRIREG dans un modèle murin de métastases hépatiques du cancer colorectal (MHCC) par induction contrôlée du gène apoptotique TRAIL.
Procédures
Les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie gazeuse pour implanter les métastases hépatiques (Procédure 1, 30 min par souris). Cette procédure inclut également une injection en sous-cutané de Torbugésic sur animal vigile 10 à 15 min avant la chirurgie). La luciférine sera injectée en IP sur animal vigile avant anesthésie gazeuse pour mesure de la bioluminescence 2 fois par semaine (Procédure 2, 15 min par souris). Un vecteur AAV sera injecté dans la veine de la queue au début de l'expérimentation, sur animal vigile maintenu en contention dans un tube, après dilatation des veines sous lampe chauffante (Procédure 3, 10 min par souris). L'anticorps MD5 sera injecté en IP sur animal vigile une fois par semaine (Procédure 5, 1 min par souris). La molécule ONC-212 sera administrée par gavage 3 fois par semaine sur animal vigile (Procédure 8, 3min par souris) et le 5-Fu sera injecté en IP une fois par jour sur animal vigile (Procédure 8, 1min par souris). Du sang sera prélevé chez ces souris, 2 fois au cours de l'expérimentation en sub-mandibulaire sur animal vigile (Procédure 6, 2 min par souris) et à la fin de l'expérimentation par ponction intra-cardiaque sous anesthésie gazeuse (Procédure 7, 2min par souris).
Impact sur les animaux
Durant l'étude, tout sera mis en oeuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition tube plastique rouge et/ou bille métallique). Pour chaque expérience, des points limites (perte de poids, prise alimentaire, comportement...) seront définis et des groupes "contrôles" adaptés au protocole seront constitués.
Devenir
Pour toutes les procédures sauf la n°7 : il n’y a pas de mise à mort avant la fin de la totalité de l'expérience. Procédure 1 --> "Génération du modèle murin de métastases hépatiques par injection de cellules murines de cancer colique dans la rate" : le comportement des souris est surveillé afin de leur administrer une nouvelle dose de Torbugésic en cas de signe de mal-être.. Procédure 2 --> "Mesure de la bioluminescence émise par l'expression du gène rapporteur luciférase dans les cellules murines de cancer colique" : Les souris regagnent leur cage après le retour de la mesure de bioluminescence. Procédure 3 --> "Injection du vecteur AAV dans la queue des souris" : Les souris sont hébergées dans des cages à filtre durant une semaine après l’injection des AAV. Procédure 4 --> "Protocole nutritionnel avec consommation de régimes carencés en acide aminés" : les souris sont, de manière alternée : mises à jeun, nourries avec du régime carencé pour activer la voie puis avec du régime contrôle pour éviter les effets néfastes d’une carence trop longue. Procédure 5 --> "Potentialisation de l’action de la protéine TRAIL avec un anticorps monoclonal MD5-1 dirigé contre le récepteur à TRAIL (DR5)" : les souris regagnent leur cage après injection IP. Procédure 6 --> "Prélèvements sanguins au niveau de la veine submandibulaire " : les souris regagnent leur cage après la prise de sang Procédure 7 --> "Prélèvements sanguins par voie intra-cardiaque" : les souris sont anesthésiées sans réveil pour réaliser cette prise de sang. Procédure 8 --> "Amélioration de l’action de la protéine TRAIL par administration d'une molécule anticancéreuse" : les souris regagnent leur cage après administration de ces molécules.
Remplacement
De nombreuses expériences préliminaires réalisées in vitro sur la lignée de carcinome colique MC38 ont permis d'abord de tester l'efficacité de TRAIL combinée avec l'anticorps MD5-1 puis ensuite de sélectionner 2 molécules (5-Fu et ONC-212) qui sont capables de faciliter l'action apoptotique de TRAIL. Ces expériences ont permis dans un premier temps d'éviter d'expérimenter sur des souris.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour chaque expérience est calculé au minimum en fonction du test statistique retenu. Cependant, étant donné l'hétérogénéité inter-animal notamment pour le développement des métastases hépatiques, il s'avère indispensable de répéter les expériences.
Raffinement
Durant l'étude, tout sera mis en oeuvre pour minimiser le stress auquel les animaux sont soumis. Des éléments d'enrichissement du milieu seront mis à disposition tube plastique rouge et/ou bille métallique). Pour chaque expérience, des points limites (perte de poids, prise alimentaire, comportement...) seront définis et des groupes "contrôles" adaptés au protocole seront constitués. Si un animal présentait un état douleureux inacceptable ou des signes de mal-être important, il sera examiné par un responsable de la mise en oeuvre du projet, et si nécessaire, anesthésié puis euthanasié. Par ailleurs, l'utilisation de cellules exprimant la luciférase pour générer les métastases hépatiques nous permettra de suivre leur évolution à l'aide d'une méthode non invasive (bioluminescence).
Choix des espèces
La souris est l'animal de référence dans ce type d'étude. Les souris utilisées dans ce projet sont de fond génétique C57 Bl/6. Des souris mâles jeunes adultes de 3-4 mois sont utilisées pour le modèle murin de MHCC. Le stade adulte (3-4 mois) permet de s’affranchir des effets liés au développement de l’animal ou par la suite de ceux liés au vieillissement.
Imagerie non invasive de l’inflammation myocardique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une ouverture du thorax provoquant une ischémie du cœur, une prise de sang à la queue puis des injections d'un agent d'imagerie sous anesthésie à deux et sept jours, pour vérifier si cet agent visualise l'inflammation cardiaque après infarctus. Le porteur indique une mortalité chirurgicale d'environ 20 %, qu'il place dans la fourchette basse de la littérature. Les animaux sont tués pour des analyses post-mortem, le porteur affirmant que la réponse inflammatoire ne peut être évaluée qu'in vivo.
Objectifs
L’infarctus du myocarde induit une réponse inflammatoire qui est nécessaire à la cicatrisation. Cette inflammation peut cependant parfois avoir un effet délétère. C’est le cas lors de la reperfusion du territoire ischémique qui s’accompagne d’une forte production de radicaux libres, de l’activation du complément, de neutrophiles et de macrophages. Ce phénomène est dénommé en anglais « ischaemia-reperfusion-injury » et il peut avoir pour conséquence une augmentation de la taille du territoire infarcie. Des thérapies visant à moduler la réponse inflammatoire, soit en la stimulant soit en l’inhibant selon le contexte et la fenêtre temporelle, sont donc à l’étude. Un agent d’imagerie permettant de visualiser de manière non invasive la réponse inflammatoire dans le post infarctus permettrait de mieux appréhender sa cinétique, et d’évaluer des thérapies ciblant celle-ci. L’agent d’imagerie de l’inflammation qui va être évalué dans ce contexte a déjà fait ses preuves chez la souris pour l’imagerie des plaques d’athéromes qui se développent dans la paroi des artères, ainsi que pour l’évaluation de l’inflammation hépatique. Il est en cours d’évaluation clinique pour l’imagerie de l’athérosclérose. L’objectif ici est donc de déterminer s’il est suffisamment spécifique et sensible pour permettre la visualisation de l’inflammation du muscle cardiaque dans le contexte du post-infarctus. Si oui, il pourra être utilisé dans le cadre de la recherche ou de la pratique clinique pour évaluer cette inflammation et pour tester de nouvelles thérapies. Cela ouvrira également la voie à l’exploration d’autres pathologies caractérisées par de l’inflammation du muscle cardiaque telles que l’endocardite, la myocardite, ou le rejet de greffe.
Bénéfices attendus
L’agent d’imagerie étudié fait a déjà fait ses preuves pour l’imagerie de l’athérosclérose et il fait actuellement l’objet d’un essai clinique pour cette application. La cible de cet agent d’imagerie (VCAM-1) est exprimée dans d’autres pathologies caractérisées par des phénomènes inflammatoires. Evaluer le potentiel de cet agent d’imagerie dans d’autres contextes physiopathologiques tels que le post-infarctus du myocarde permettra donc potentiellement d’étendre son champ d’applications diagnostiques. Cela permettra également de disposer d’un outil de recherche pour tester de manière non invasive des traitements ciblant la réponse inflammatoire.
Procédures
Les animaux subiront une unique procédure chirurgicale (
Impact sur les animaux
La procédure a été classée en sévère du fait de la chirurgie et de l’induction d’une ischémie myocardique. Toutefois, le modèle est bien maitrisé par le laboratoire en charge de sa réalisation. Ainsi, la taille de l’infarctus est bien contrôlée, et le vide pleural correctement réalisé. De ce fait la mortalité associée à la procédure chirurgicale se trouve dans la fourchette basse de ce qui est classiquement reporté dans la littérature (20%). Une médication et des points limite adaptés permettent de prendre en charge efficacement la douleur et le stress.
Devenir
A l’issu de la procédure les animaux seront mis à mort. En effet, des analyses post-mortem seront nécessaires pour caractériser la réponse inflammatoire et la distribution de l’agent d’imagerie à une échelle cellulaire et tissulaire.
Remplacement
La réponse inflammatoire dans le post-infarctus ne peut être évaluée qu’in vivo. Toutefois, l’agent d’imagerie a été préalablement entièrement caractérisé et validé in vitro sur protéine recombinante et sur cellules. Sa spécificité et sensibilité pour lier sa cible exprimée par des cellules endothéliales ont ainsi été préalablement démontrées in vitro.
Réduction
Le design de l’étude a été conçu de sorte à réduire le nombre d’animaux. En effet un faible effectif sera utilisé pour évaluer la faisabilité de la méthode lors d’une étude pilote, et l’étude principale ne sera réalisée que si cette première étude est concluante. Par ailleurs l’imagerie non invasive permet de suivre la réponse inflammatoire sur un même animal au cours du temps, est ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe avec enrichissement du milieu de vie adapté à l’espèce. Une médication et des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie volatile.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence, avec le rat, pour l’étude du post-infarctus chez le petit animal. L’agent d’imagerie évalué est un fragment d’anticorps reconnaissant la protéine de souris et la protéine humaine, mais pas la protéine de rat. De ce fait l’espèce retenue est la souris, et plus particulièrement la souche c57Bl/6J fréquemment utilisée dans la recherche cardiovasculaire. Des souris c57Bl/6J adultes seront utilisées afin de se rapprocher du contexte clinique.
Imagerie non invasive de l’inflammation myocardique
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
42 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie d'ouverture du thorax provoquant un infarctus du cœur, puis des injections d'un agent d'imagerie sous anesthésie à deux et sept jours, pour vérifier si cet agent visualise l'inflammation cardiaque. Le porteur indique une mortalité liée à la chirurgie d'environ 20 %, qu'il situe dans la fourchette basse de la littérature. Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem, et le porteur affirme que la réponse inflammatoire ne peut être évaluée qu'in vivo.
Objectifs
L’infarctus du myocarde (muscle cardiaque) induit une réponse inflammatoire qui est nécessaire à la cicatrisation. Cette inflammation peut cependant parfois avoir un effet délétère. Des thérapies visant à moduler la réponse inflammatoire, soit en la stimulant soit en l’inhibant selon le contexte et la fenêtre temporelle, sont donc à l’étude. Un agent d’imagerie permettant de visualiser de manière non invasive la réponse inflammatoire permettrait de mieux appréhender sa cinétique, et d’évaluer des thérapies ciblant celle-ci. L’agent d’imagerie de l’inflammation qui va être évalué dans ce contexte a déjà fait ses preuves chez la souris pour l’imagerie de lésions qui se développent dans la paroi des artères, ainsi que pour l’évaluation de l’inflammation du foie. Il est en cours d’évaluation clinique. L’objectif ici est donc de déterminer s’il est suffisamment spécifique et sensible pour permettre la visualisation de l’inflammation du muscle cardiaque dans le contexte du post-infarctus. Si oui, il pourra être utilisé dans le cadre de la recherche ou de la pratique clinique pour évaluer cette inflammation et pour tester de nouvelles thérapies. Cela ouvrira également la voie à l’exploration d’autres pathologies caractérisées par de l’inflammation du muscle cardiaque telles que le rejet de greffe.
Bénéfices attendus
L’agent d’imagerie étudié fait a déjà fait ses preuves pour l’imagerie de lésions des artères et il fait actuellement l’objet d’un essai clinique pour cette application. La cible de cet agent d’imagerie est exprimée dans d’autres pathologies caractérisées par des phénomènes inflammatoires. Evaluer le potentiel de cet agent d’imagerie dans d’autres contextes physiopathologiques tels que le post-infarctus du myocarde permettra donc potentiellement d’étendre son champ d’applications diagnostiques. Cela permettra également de disposer d’un outil de recherche pour tester de manière non invasive des traitements ciblant la réponse inflammatoire.
Procédures
Les animaux subiront les conséquences de la chirurgie. A J2 et J7 les animaux recevront une injection intraveineuse d’un agent d’imagerie suivi d’une anesthésie volatile de courte durée (
Impact sur les animaux
La procédure a été classée en sévère du fait de la chirurgie et de l’induction d’une ischémie myocardique. Toutefois, le modèle est bien maitrisé par le laboratoire en charge de sa réalisation. Ainsi, la taille de l’infarctus est bien contrôlée, et le vide pleural correctement réalisé. De ce fait la mortalité associée à la procédure chirurgicale se trouve dans la fourchette basse de ce qui est classiquement reporté dans la littérature (20%). Une médication et des points limite adaptés permettent de prendre en charge efficacement la douleur et le stress.
Devenir
A l’issue de la procédure les animaux seront mis à mort. En effet, des analyses post-mortem seront nécessaires pour caractériser la réponse inflammatoire et la distribution de l’agent d’imagerie à une échelle cellulaire et tissulaire.
Remplacement
La réponse inflammatoire dans le post-infarctus ne peut être évaluée qu’in vivo. Toutefois, l’agent d’imagerie a été préalablement entièrement caractérisé et validé in vitro sur protéine recombinante et sur cellules. Sa spécificité et sensibilité pour lier sa cible exprimée par des cellules endothéliales ont ainsi été préalablement démontrées in vitro.
Réduction
Le design de l’étude a été conçu de sorte à réduire le nombre d’animaux. En effet un faible effectif sera utilisé pour évaluer la faisabilité de la méthode lors d’une étude pilote, et l’étude principale ne sera réalisée que si cette première étude est concluante. Par ailleurs l’imagerie non invasive permet de suivre la réponse inflammatoire sur un même animal au cours du temps, est ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe avec enrichissement du milieu de vie adapté à l’espèce. Une médication et des points limites adaptés au modèle permettront de réduire le stress et la souffrance. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie volatile.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle de référence, avec le rat, pour l’étude du post-infarctus chez le petit animal. L’agent d’imagerie évalué est un fragment d’anticorps reconnaissant la protéine de souris et la protéine humaine, mais pas la protéine de rat. De ce fait l’espèce retenue est la souris.