Procédures sévères

4 368 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Elles sont irradiées aux rayons X, greffées de cellules de mélanome humain, soumises à des prélèvements sanguins répétés et à des traitements quotidiens par immunothérapie. Le porteur écrit pourtant qu'"aucun effet indésirable n'est attendu", en contradiction avec la gravité sévère qu'il déclare pour la totalité des animaux. Il justifie cet effectif de plus de quatre mille souris par la répétition d'expériences et qualifie le recours à la souris d'"indispensable".

Objectifs

Le traitement du mélanome a beaucoup progressé grâce aux immunothérapies. Les résultats étants encore insuffisants (50 à 70 % des patients ne répondent pas, et d’autres mettent en place des résistances), il est donc nécessaire de comprendre comment cette résistance se met en place afin de proposer des alternatives thérapeutiques efficaces. La régulation de la traduction des ARNm en protéines est impliquée dans la résistance aux immunothérapies. Nous souhaitons donc explorer les adaptations du métabolisme des cellules tumorales responsables du développement de cette résistance. Nos résultats préliminaires et les données de la littérature indiquent que des altérations de la synthèse de certains acides aminés sont associées au développement de la résistance. Ces résultats ont été obtenus in vitro et in vivo en utilisant des lignées de mélanome murin greffées dans des souris C57BL/6J. Il faut maintenant, valider nos résultats en utilisant des cellules de mélanomes directement issues de patients. Pour cela, nous utiliserons un protocole « d’humanisation » de souris NSG afin de reproduire le plus fidèlement possible la complexité d’un système immunitaire humain et d’évaluer l’effet des immunothérapies combinées ou non à un ciblage du métabolisme des acides aminés. Dans ce projet, 4368 souris seront réparties en 2 procédures et utilisées à 4 semaines (âge où la prise de greffe est optimale), mâles ou femelles indifféremment. Remplacement : Des expériences in vitro ont démontrer l’importance du métabolisme cellulaire dans les mécanismes de résistance à l’immunothérapie et ont permis de déterminer les doses optimales de molécules ciblant le métabolisme des acides aminés. Aucun modèle alternatif pertinent ne permet l’étude des interactions tumeur-système immunitaire. Il est donc indispensable de confirmer ces résultats chez la souris. Réduction : Nous avons choisi d'utiliser un nombre minimum de souris par groupe (8) nous permettant d'obtenir des résultats relevant. Si après 2 expériences indépendantes, les résultats s’avèrent statistiquement significatifs, nous ne réaliserons pas la 3 ème. Raffinement : Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et tigettes pour permettre la réalisation d’un nid), hébergées en portoirs ventilés (5 souris maximum/cage de 500cm2). Les animaux seront surveillés en continu (état général, pesée, taille et aspect des tumeurs) permettant l'arrêt de l'expérience avant tout début de mal- être ou de souffrance.

Bénéfices attendus

Malgré les progrès du traitement du mélanome, avec les immunothérapies, la majorité des patients ne répondent pas à ces traitements ou bien, après une réponse, des résistances secondaires se mettent en place. Il est donc nécessaire de mieux comprendre comment la résistance à ces traitements se met en place et aussi de mieux identifier les patients susceptibles de répondre afin de proposer des alternatives thérapeutiques efficaces en cas de résistance à l’immunothérapie.

Procédures

-1 Irradiation Rayons X des animaux pendant environ 5 minutes - 4 Prélèvements sanguin (100 microl par prélèvement) espacés d'une semaine. Le prélèvement dure environ 1 minute. - 1 Injection de cellules tumorales en sous-cutanée. Injection dure environ 30 secondes. - Traitements en Intra-péritonéale quotidien qui dure environ 5 secondes. - 4 Traitements en Intra-périnonéale avec les immunothérapies qui durent environ 5 secondes.

Impact sur les animaux

Aucun effet indésirable n'est attendu sur les animaux

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale.

Remplacement

Le remplacement des animaux est effectué chaque fois que cela est possible, par des modèles in vitro : des expériences préliminaires in vitro ont été menées et ont permis de mettre en évidence l’importance du métabolisme dans les cellules tumorales pour la mise en place de mécanismes de résistance à l’immunothérapie. Cependant ces expériences in vitro ne permettent pas de prendre en compte toute la complexité des interactions qui existe entre une tumeur et le système immunitaire. A l’heure actuelle et à notre connaissance, il n’existe pas de modèle alternatif pertinent permettant l’étude des interactions tumeur-système immunitaire. Il est donc maintenant indispensable de confirmer ces résultats chez la souris

Réduction

Des statistiques prédictives ont été faites avec G-Power. En fonction de nos précédentes expériences, nous avons choisi le t Test. Le logiciel préconise des groupes de 26 souris. Nous choisissons de faire des groupes de 8 souris et de faire 3 expériences indépendantes. Ceci nous permettra d’éviter de réaliser la 3ème expérience si, après 2 expérimentations, les résultats s’avèrent statistiquement significatifs, dans le but de réduire le nombre de souris. Dans notre laboratoire, nous réalisons depuis de nombreuses années des expériences de prise de tumeurs sur les souris. L’expérience nous a montré qu’il était plus pertinent de faire des groupes de souris moins importants et de faire des expériences indépendantes. Dans plusieurs de nos protocoles, seules 2 expériences ont été nécessaires pour avoir des résultats significatifs, ce qui nous a permis de réduire le nombre d’animaux. Par exemple, dans notre PEA324 « Etude des antidiabétiques et de leurs dérivés dans le traitement du mélanome », 1200 animaux avaient été demandés lors du dépôt du dossier, et 820 ont été utilisés.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un milieu enrichi (igloo et tigettes qui permettent aux souris de réaliser un nid) et celles-ci seront hébergées en portoirs ventilés à raison de 5 souris maximum/cage (500cm2). Nous réaliserons aussi un suivi quotidien des animaux, qui permettra l'arrêt de l'expérience dès que les souris présenteront un mal- être ou une souffrance.

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes génétiques avec l’homme. Elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien établi ainsi qu’une faible taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Par ailleurs, la souris est un modèle reconnu et déjà validé pour l'étude de la réponse aux inhibiteurs d'immune checkpoint ce qui représente dans le cadre de notre projet et des thérapies ciblées que nous voulons tester, un atout très important. Les souris seront irradiées et greffées vers l'age de 4 semaines. Elles seront laissées au repos pendant 3 à 6 semaines (condition à définir dans la P1) puis injectées par des cellules de mélanome et traitées pendant maximun 8 semaines après l'apparition de la tumeur. Il a été montré que la prise tumorale est optimale chez des animaux de 6 à 10 semaines. En les irradiant à 4 semaines, elles auront entre 8 et 10 semaines au moment de la greffe de cellules tumorales.

187 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit deux chirurgies du crâne, une greffe de tumeur cérébrale puis une résection, avec administration locale d'un gel de nanomédicaments dérivés d'un anticancéreux. Le porteur décrit une craniotomie sous anesthésie, un risque d'hémorragie pendant la résection et un suivi jusqu'à l'atteinte de points limites, les souris sans signe à 120 jours étant considérées comme "guéries". Il affirme qu'aucune alternative ne reproduit les interactions entre l'organisme et la tumeur, et retient la souris pour comparer ses résultats à la littérature.

Objectifs

Le glioblastome est une tumeur cérébrale dont le pronostic est très péjoratif avec une survie médiane de 15 mois malgré un traitement combinant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie, ce qui nécessite de trouver rapidement de nouvelles solutions thérapeutiques. Deux facteurs importants limitant l’efficacité des agents anti-cancéreux dans le cadre de la prise en charge du glioblastome sont : (i) la barrière hémato-encéphalique (BHE), qui limite l’accès des molécules thérapeutiques au niveau de la tumeur, et (ii) la présence de cellules tumorales infiltrantes et chimiorésistantes. Après résection chirurgicale et traitement, la totalité des patients développe des récidives tumorales très agressives qui se forment, dans le 90% des cas, à quelques centimètres des bords de la résection chirurgicale. Il a été récemment émis l’hypothèse que les réponses physiologiques du cerveau après résection chirurgicale peuvent créer un microenvironnement qui favorise la formation des récidives tumorales locales. Parmi les stratégies qui ont été développées pour contrecarrer les effets dévastateurs du GBM, deux sont particulièrement prometteuses : la délivrance locale d'agents chimiothérapeutiques (grâce aux implants, gels, pâtes) et l'utilisation des nanomédicaments. La première approche permet d'obtenir des concentrations thérapeutiques au site d'action en contournant les barrières du système nerveux central et de libérer le médicament de manière contrôlée pendant une longue période. La deuxième approche utilise des vecteurs de médicaments de dimensions nanométriques afin de protéger la molécule active, de cibler les cellules tumorales, de contourner les mécanismes de résistance et de réduire les effets secondaires.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de vérifier l’efficacité anticancéreuse d’un nouveau traitement local à base de nanomédicaments véhiculant des dérivées de l’agent chimiothérapeutique Doxorubicine et de la vitamine E pour le glioblastome. L'étape de validation in vivo est indispensable avant toute évaluation clinique chez le patient. Il n’existe à l’heure actuelle, aucune autre méthode qui pourrait se substituer à l’expérimentation animale dans ce domaine.

Procédures

Les animaux seront soumis à deux chirurgies (1) greffe tumorale ; 2) résection tumorale/ou de tissu sain et administration locale d'un traitement). Certains d'entre eux (lot 2) subiront des prélévements sanguins (max 150 µl par semaine) en retro-orbitaire à l’aide des micro-tubes à hématocrite (64 µl ; Vitrex Medical) sous anesthésie halogénée isoflurane (induction en cage à induction à 5%, phase de maintien à 1.5%) juste avant leur mise à mort.

Impact sur les animaux

Les nuisances anticipées dans ce projet concernent la greffe intracérébrale et la résection chirurgicale. Les animaux seront soumis à une craniotomie, sous anesthésie générale. Les sources de stress potentielles avant/pendant l’acte chirurgical sont l’induction anesthésique, la mise en place sur cadre stéréotaxique, l’incision de la peau et le réveil. Un anesthétique local sera administré en sous-cutanée au point d’incision. Une surveillance anesthésique continue sera effectuée : fréquence respiratoire, type de respiration, réflexes, réponse à un stimulus douloureux. La résection peut induire des hémorragies locales, qui seront contrôlés par l'insertion de triangles hémostatiques dans la cavité de résection jusqu'à ce que le saignement s'arrête. La durée de la procédure n’excèdera pas les 30 minutes et le crâne sera maintenu humide avec du sérum physiologique stérile pendant l'opération. A la suite de l’intervention chirurgicale, chaque animal restera sous lampe chauffante infrarouge jusqu’à son réveil pour éviter l’hypothermie induite par l’anesthésie. La limitation partielle des mouvements de la tête à cause des points de suture peut créer une nuisance aux animaux en post-opératoire et jusqu’à la cicatrisation, mais ne limite pas généralement leur accès à l’eau et à la nourriture. Tous les animaux seront suivis quotidiennement (week-end compris) avant, durant et après les chirurgies pour s'assurer de leur bien-être et de l'absence de souffrance (en regardant, par exemple, leur consommation d'eau et de nourriture, la locomotion et la construction de nids suite à la chirurgie).

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Les souris du lot 1 sont soit gardés en vie jusqu’à que l'un des points limites sera atteint (normalement quelques semaines/mois après la résection). S'ils n'auront pas atteint les points limites au jour 120 post-greffe tumorale, ils seront considérés comme guéri et leur mise à mort sera effectuée par dislocation cervicale. Les souris du lots 2 et 3 seront mis à mort à des temps prédéfinis (lot 2 : avant greffe ; 15 jours post-greffe avant ou après résection chirurgicale ; 72h, 7 jours ou 14 jours après résection et traitement. lot 3 : 1 semaine, 2 mois et 6 mois après chirurgie et traitement). Les temps de la mise à mort ont été sélectionnés grâce à des études précédentes qui ont permis de définir les temps clés pour le recrutement des cellules immunitaires et la formation des récidives tumorales sur ce modèle expérimentale (lot 2) et qui ont evalué la tolérabilité des gels à base de nanomédicaments similaires a celui presenté dans cette étude (lot 3). Les animaux du lot 2 seront utilisés pour des prélèvements sanguins (numération de la formule sanguine, évaluation des cytokines du sérum) et euthanasiés au temps établis pour les études post-mortem (cytométrie en flux ou immunohistochimie).

Remplacement

Les équipes impliquées dans le projet ont établi les différentes étapes expérimentales sur la base des résultats in vitro et in vivo obtenus préalablement. Cette étude ne peut être conduite que chez l'animal, aucune alternative ne pouvant remplacer les interactions complexes entre l'organisme hôte et la tumeur.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour l’étude de l’efficacité des différentes formulations a été déterminé selon des protocoles précédemment décrits. Nous avons utilisé une méthode statistique pour réaliser le calcul d'effectif permettant d’obtenir une différence statistiquement significative entre les groupes étudiés. Le risque de première espèce a été fixé à 5% et la puissance à 80%. Le nombre de 10 animaux par groupe tiens aussi compte de l'hétérogénéité de la réponse à la greffe tumorale des cellules GL261 et des éventuelles pertes. La méthode de Kaplan-Meier sera appliquée afin de comparer la survie des animaux des différents groupes.

Raffinement

Cinq souris seront hébergées dans chaque cage avec un enrichissement. Après 7 jours d’acclimatation, les animaux seront anesthésiés avant la chirurgie (lidocaine en site d’incision ; mix d'anésthetiques pour craniotomies) et en péri- et post-opératoire une analgésie est prévue (buprenorphine).

Choix des espèces

Le modèle souris (avec le modèle rat) représente le modèle le plus étudié dans le traitement des tumeurs cérébrales. Le modèle de tumeur que nous étudions (cellules de glioblastome GL261 sur souris C57BL/6) est un des modèles syngéniques les plus utilisés dans la littérature pour des études des mécanismes immunitaires et la délivrance des médicaments pour le traitement du glioblastome. Les différents travaux scientifiques dans ce domaine ont utilisé très majoritairement des souris C57BL/6 de 5 à 8 semaines : afin de pouvoir confronter nos résultats avec la littérature nous avons choisi d’utiliser des souris de 7 semaines.

2 304 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, le plus lourd bilan du lot. Des souris immunodéficientes reçoivent une greffe de cellules d'ostéosarcome ou de sarcome d'Ewing, avec des tumeurs pouvant atteindre 1 500 à 2 000 mm³, pour tester des molécules candidates. Les rubriques du résumé restent très succinctes, les bénéfices tenant en une ligne ("application thérapeutique chez l'homme de nouvelles molécules") et les procédures en une phrase. Le porteur affirme que les expériences in vitro ne miment pas le microenvironnement tumoral osseux et limite chaque groupe à huit animaux.

Objectifs

Le projet porte sur l’étude de molécules capables d’inhiber le développement et la progression des tumeurs osseuses primitives et/ou le développement des lésions osseuses associées. Des études préliminaires ont été réalisées in vitro sur différents types de cellules d’ostéosarcome (humaines et murines) et de sarcome d’Ewing. Suite aux résultats les plus significatifs, des modèles animaux seront utilisés pour tester l’efficacité de ces molécules thérapeutiques dans un environnement in vivo complexe (os, tumeur…) pour une application thérapeutique potentielle chez l’homme.

Bénéfices attendus

Application thérapeutique chez l'homme de nouvelles molécules

Procédures

Procédure chirurgiclae modérée (une seul par animal), prélèvement sanguin.

Impact sur les animaux

Développement de tumeur pouvant atteindre un maximum de 1500-2000mm3

Devenir

Mise a mort pour prélèvement des tumeurs et réalisation d'une autopsie complète.

Remplacement

Les expériences in vitro ne permettent pas de mimer un micro environnement tumoral complexe (os et tumeur). Le nombre d’animaux utilisés pour répondre à ces questions est limité au strict minimum afin d’avoir des résultats statistiques significatifs (soit 8 animaux par condition).

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au struct minimum de façon à obtenir des résultats statistiquement significatifs

Raffinement

Les souris seront hébergées en cage ventilée, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Les souris recevront une période d’acclimatation de 5 jours, avant l’entrée en projet. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle jour –nuit de 12h-12h. Les souris seront monitorées tous les jours pour vérifier l’absence de mal-être.

Choix des espèces

Comme indiqué au point 3.3.2, l’utilisation de souris immunodéprimées est choisie afin d’étudier le développement de nouvelles thérapies sur des tumeurs humaines dans un environnement in vivo complexe (os et tumeur). La souris est choisie par rapport au rat afin d’injecter une quantité minimale de molécule à tester. Nous utilisons de jeunes souris afin de mimer au mieux les tumeurs osseuses qui se développent chez l’enfant, l’adolescent ou le jeune adulte chez les patients. Réception de souris âgées de 4 semaines, utilisation après une semaine d’acclimatation (âgées de 5 semaines).

740 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Le porteur les soumet à une suspension par la queue simulant l'apesanteur pendant trois à sept jours, avec gavage d'une molécule trois fois par semaine et injection d'une autre avant la mise à mort par dislocation cervicale. Il indique que la suspension provoque des bouchons urinaires et un stress lié à l'immobilisation, ainsi qu'une baisse de la prise alimentaire et du poids les premiers jours. Il affirme que l'inactivité physique ne peut être reproduite sur des modèles plus simples et qu'il serait "éthiquement difficile" de mener ce type d'expérimentation chez l'humain.

Objectifs

L’objectif est de valider la preuve de concept que l’activation préalable de la réponse intégrée au stress (ISR) par une sollicitation maîtrisée permet de limiter la diminution de la masse et la fonction musculaire en situation d’inactivité physique. De récents travaux indiquent que l’activation de l’ISR avant un stress permet de préserver la fonction tissulaire dans des modèles d’ischémie/reperfusion. De plus, une activation modérée de l’ISR avant une situation catabolique pourrait optimiser le renouvellement des mitochondries. Cependant, si l’ISR peut promouvoir une réponse adaptative efficace des cellules au stress, sa sur activation peut avoir des effets délétères sur le muscle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer l'intérêt d'un préconditionnement de la réponse intégrée au stress en amont d'une situation catabolique pour préserver la masse musculaire. Dans ce cas, ce projet précisera les conséquences musculaires du préconditionnement et ses modalités.

Procédures

Hébergement en cage individuelle si nécessaire pendant toute la durée de l'expérrimentation; Administration d'une molécule pharmacologique (Halofuginone) par gavage 3 fois par semaines pendant 4 semaines au maximum; Administration d'une molécule pharmacologique par injection intrapéritonéale (Puromycine) 1 fois 30 minutes avant l'euthanasie; Suspension anti-orthostatique pendant 3 et 7 jours; Désuspension : 1 fois puis les animaux sont laissés en récupération pendant 14 jours au maximum.

Impact sur les animaux

Du fait de la procédure de suspension anti-orthostatique, les animaux peuvent présenter des bouchons urinaires surtout au début de la suspension: les animaux sont donc observés au moins deux fois par jour tout au long de l’expérimentation. Si un bouchon est observé, l’expérimentateur l’élimine à l’aide d’une compresse imbibée d’une solution désinfectante (Chlorhexidine/Hibitane 5% diluée au 1/100ème). La suspension des animaux entraine de fait un stress lié à la restriction de leur mobilité. Cependant, les effets sur la prise alimentaire et sur le poids corporel qui sont tous deux réduits les 2-3 premiers jours sont normalisés ensuite.

Devenir

Procédure n°1 (Suspension anti-orhtostatique) : Tous les animaux utilisés dans les Tâches 2.1, 2.2 et 4 sont mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l'Isoflurane. Dans la Tâche 3, les animaux des groupes HF-CT, HF-HS, NaCl-CT et NaCl-HS sont mis à mort. Les animaux des groupes HF-RHS (7 ou 14) et NaCl-RHS (7 ou 14) seront désuspendus (Procédure n°2) et placés en récupération pendant 7 jours (ou 14 jours si nécessaires) et seront mis à mort au terme de cette période. 2). Procédure n°2 (Désuspension et placement en récupération) : Tous les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l'isoflurane. Procédure n°3 (Hébergement en cage individuelle) : Tous les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l'isoflurane. Procédure n°4 (Administration d'halofuginone) : Tous les animaux sont gardés en vie et soumis à la suspension anti-orhtostatique ou non. Procédure n°4 (Adminsitration d'halofuginone) : Les animaux de la tâche 1 seront mis à mort. Ceux des tâches 2.2, 3 et 4 seront gardés en vie.

Remplacement

Les fontes musculaires lors de pathologies sont caractérisées par une atteinte simultanée de plusieurs tissus et/ou fonctions. Cette complexité des interactions entre tissus et organes n’existe que chez les animaux vivants. L’inactivité physique est impossible à reproduire sur des modèles expérimentaux plus simples (culture de tissus ou de cellules). Les situations d’inactivité physique chez l’Homme sont retrouvées lors de maladies ou de grande fatigue rendant éthiquement difficile ce type d’expérimentation chez l’Homme. L’utilisation d’animaux vivants placés en situation d’inactivité physique est la seule option possible. Nous avons choisi le modèle de suspension car i) il induit des altérations musculaires en réponse à l’inactivité physique indépendamment de pathologies ou de processus inflammatoires et ii) il est réversible permettant d’évaluer la capacité de récupération des animaux après dé-suspension.

Réduction

Pour nos expérimentation, nous avons prévu le nombre nécessaire d'animaux, à la fois pour garder une puissance statistique dans le traitement de nos résultats, et pour palier l'exclusion de certaines souris de l'expérimentation. Nous avons défini plusieurs têches progressives permettant de définir le protocole de préconditionnement, de le valider avant de tester sur un nombre d'animaux plus importants les conséquences physiologiques au niveau musculaires. Si les premières étapes ne permettent pas de trouver les modalités de préconditionnnement adéquates, le projet serait arrêté et les souris prévues dans les tâches ultérieures ne seraient pas utilisées.

Raffinement

Comme développé pour chacun de nos protocoles expérimentaux, nous allons porter une attention particulière au bien-être des animaux. Le suivi quotidien des animaux permettra d'identifier des signes de souffrance caractérisés par l'état du pelage, le comportement de la souris (agressivité/apathie), cris, mobilité, alimentaiton... Le poids corporel et la prise alimentaires seront donc mesurés tous les jours. Dans le cas où un animal présenterait des signes manifestes de souffrance ou de perte de poids excessive (>20% du poids initial), il sera sorti des protécures expérimentales. Les animaux auront à leur disposition un enrichissement

Choix des espèces

Les animaux utilisés sont des souris C57BL6 âgées de 6-12 semaines. L’expérimentation a pour objectif d’utiliser un modèle animal se rapprochant le plus possible du métabolisme de l’homme soumis à une situation d’inactivité physique. Les animaux utilisés sont non transgéniques. Les animaux seront utilisés sont des souris matures âgées de 8-12 semaines. Elles sont matures d’un point de vue sexuel ce qui permet d’éviter les modifications hormonales observées durant la croissance. De plus, la croissance musculaire est stabilisée ce qui permet d’observer les pertes de masse musculaire per se en réponse à la suspension, indépendamment d’un effet éventuel lié à un retard de croissance.

16 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Le porteur leur inflige un traumatisme crânien par percussion fluide après une craniectomie sous anesthésie, puis un unique examen IRM quatre semaines plus tard, avant l'euthanasie et l'analyse histologique du cerveau. Il indique que l'induction du traumatisme s'accompagne d'une mortalité pouvant atteindre 15 pour cent et d'une perte de poids d'environ 13 pour cent, et présente l'étude comme une faisabilité préalable à des projets de plus grande ampleur. Il conclut au recours au rat, dont il juge la structure cérébrale proche de celle de l'humain.

Objectifs

Chaque année, rien qu’en France métropolitaine, plusieurs centaines de milliers de personnes sont exposées à un traumatisme crânien (TC). Selon les estimations, 25 à 40 % des cas sont des TC avec des signes fonctionnels et/ou des séquelles neurologiques chroniques. La grande majorité des TC diagnostiqués sont des TC légers à modérés Il n’existe malheureusement pas, à ce jour de marqueurs, permettant de prédire et de suivre l’évolution des séquelles cérébrales de manière fiable pour ces types de TC, principalement par manque de moyens d’investigation suffisamment précis pour déceler les micro-lésions et micro-dysfonctionnements cérébraux post-traumatiques. La prise en charge des patients affectés ne peut donc pas être optimale. De nouvelles méthodes d’imagerie par résonnance magnétique (IRM) sont actuellement testées dans le domaine médical pour essayer de déceler les micro-déficits cérébraux produits par un TC léger-modéré. Malgré des résultats encourageants, les conclusions de ces études sont limitées par l’impossibilité de comparer les résultats d’imagerie avec des mesures réalisées dans le tissu cérébral des patients. Ainsi, le projet proposé vise à évaluer si des méthodes d’IRM récentes, similaires à celles testées en clinique, permettent de détecter des lésions cérébrales chez des animaux après exposition à un TC léger-modéré. Si c’est le cas, nous pourrons comparer les résultats IRM avec des mesures tissulaires, qui sont accessibles chez les animaux, et compléter les études d’imagerie réalisées chez les patients. Ce projet représente ainsi une étude de faisabilité préalable à la mise en place de projets de plus grande ampleur. Les mesures IRM seront réalisées chez des rats adultes exposés préalablement à une procédure chirurgicale et un TC sous anesthésie générale par percussion fluide et comparées à celles réalisées chez des animaux contrôles. Cette technique d’induction du TC est utilisée et maitrisée par notre laboratoire depuis environ 10 ans. Le fonctionnement du cerveau repose sur de nombreux mécanismes cellulaires et moléculaires intégrés qui ne peuvent pas à l’heure actuelle être modélisés de manière fiable, ni par le biais de cultures cellulaires, ni par des outils mathématiques et informatiques. Par ailleurs, l’imagerie IRM nécessite d’étudier le cerveau dans son intégralité. Ainsi, le recours au modèle animal ne peut pas être évité.

Bénéfices attendus

Si les résultats obtenus dans ce projet s’avèrent être favorables, nous serons à même de pouvoir mesurer par IRM les déficits cérébraux produits par un TC léger-modéré chez un modèle expérimental de TC léger-modéré. Nous pourrons pour chaque anomalie détectée par IRM évaluer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués, ce qui n’est actuellement pas possible dans le domaine médical. Nos futures expérimentations animales pourront potentiellement permettre de découvrir de nouveaux biomarqueurs pathologiques basés sur des mesures IRM, dont la validité et la pertinence pourront par la suite être évaluées chez des patients. L’utilisation de l’IRM permettra également d’évaluer expérimentalement chez l’animal l’efficacité de nouvelles thérapies pressenties pour la prise en charge des patients traumatisés crâniens. Par ailleurs, nous pourrons évaluer de manière non-invasive des modifications cérébrales dans des paradigmes de TC pertinents restant à étudier (poly-trauma, répétition de TC, interaction entre TC et stress, …). D’un point de vue purement éthique, nous pourrons dans le futur utiliser l’IRM pour évaluer l’intégrité du cerveau chez les animaux traumatisés de manière non invasive et longitudinale, ce qui n’est pas le cas pour l’instant. Nous pourrons ainsi réduire les effectifs utilisés lors de nos prochains programmes expérimentaux.

Procédures

Les animaux seront exposés à un TC léger-modéré unique. Le TC sera induit par la technique de percussion latérale fluide. Le principe de la percussion fluide repose sur l’exposition du tissu cérébral à une onde de pression fluide dont les caractéristiques modélisent un TC léger-modéré, c’est à dire un TC ne créant pas de lésion aigue du tissu cérébral mais pouvant induire une hémorragie sous méningée non létale pouvant se résorber naturellement. Cette technique nécessite de réaliser une préparation chirurgicale préalable et en particulier la réalisation d’une craniectomie sous anesthésie générale et analgésie locale. La durée de la phase chirurgicale préparatoire et de l’exposition au TC ne dépassera pas 70 minutes. Deux groupes contrôles sont nécessaires pour comparaison avec les animaux traumatisés. Des animaux contrôles « naïfs » ne subiront aucune préparation chirurgicale. Des animaux contrôles subiront les mêmes étapes préparatoires mais pas le TC. Le groupe contrôle est nécessaire car la chirurgie préparatoire au TC dans le modèle utilisé peut entraîner des phénomènes inflammatoires au niveau du cerveau et pourrait ainsi modifier les mesures IRM réalisées. Chaque animal subira un examen IRM unique 4 semaines après avoir été exposé au TC. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale. Ils seront maintenus sous anesthésie durant l’intégralité de leur séance de neuro-imagerie IRM. La durée du passage à l’IRM sera d’environ 1h30 pour chaque animal. Chaque animal ne recevra qu'une seule séance d'imagerie. Une fois réveillés, les animaux seront replacés dans leur cage d’origine avec leurs congénères. Chaque animal subira un examen IRM unique 4 semaines après avoir été exposé au TC . Les animaux seront soumis à une anesthésie générale. Ils seront maintenus sous anesthésie durant l’intégralité de leur séance de neuro-imagerie IRM. La durée du passage à l’IRM sera d’environ 1h30 pour chaque animal. Chaque animal ne recevra qu'une seule séance d'imagerie. Une fois réveillés, les animaux seront replacés dans leur cage d’origine avec leurs congénères. Les animaux devront être euthanasiés pour la suite des recherches. 48 heures après leur passage à l’IRM,

Impact sur les animaux

L’exposition au traumatisme crânien s’accompagne d’un taux de mortalité de 15% au maximum, au moment de l'intervention. En règle générale, les animaux exposés au traumatisme crânien qui survivent perdent 13 % de leur poids initial au maximum et commencent à prendre du poids sous 2 à 4 jours. Ils ne montrent pas de signes chroniques de douleur (pas de prostration, pas d’atonie prolongée, pas de vocalisations lorsque la plaie chirurgicale est manipulée, pas d’agressivité). Les animaux contrôle perdent en général moins de 10% de leur poids initial, et commencent à prendre du poids sous 2 à 3 jours. Ils ne montrent pas non plus de signes chroniques de douleur.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. Leur cerveau sera étudié par histologie afin de compléter les analyses IRM.

Remplacement

L’utilisation de l’animal et non d’alternatives non vivantes s’explique par le fait que le fonctionnement du cerveau est complexe et que les effets du TC sur ce dernier ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être modélisés à l’aide de systèmes informatiques ou de systèmes cellulaires moins complexes. Le modèle choisi est le rat, qui est classiquement utilisé pour la modélisation du TC en laboratoire. Le rat est par ailleurs le modèle de choix pour étudier le fonctionnement du cerveau et ses perturbations, car la structure du cerveau du rat est proche de celle de l’Homme.

Réduction

L’objectif est de pouvoir comparer les résultats obtenus sur 5 animaux par groupe expérimental, comprenant des rats traumatisés et des rats contrôles (des animaux contrôles sains / « naïfs » n’ayant subi aucune préparation chirurgicale, et des animaux contrôles ayant subi les étapes chirurgicales préalables au TC mais n’ayant pas été exposés au TC). Ce nombre a été estimé grâce à nos expérimentations préalables et une analyse bibliographique. Le projet consistant essentiellement à vérifier si l’IRM peut générer des mesures fiables et reproductibles chez le rat, ce nombre semble cohérent et adapté. Aucun test statistique particulier n’est prévu car il s'agit une première approche exploratoire basées sur l'interprétation d'images radiologiques. Le taux de mortalité des rats Naïfs et contrôles étant nul, 5 animaux seront utilisés pour constituer chacun de ces groupes. En revanche, le taux de mortalité des rats traumatisés étant d’environ 15%, nous estimons qu’un animal supplémentaire pourrait être requis pour atteindre un nombre de 5 individus dans ce groupe expérimental au final. Ainsi, 5 animaux seront initialement exposés au TC, et un animal supplémentaire sera exposé en cas de nécessité.

Raffinement

Le modèle de TC choisi ainsi que les procédures d’hébergement, de médication (analgésie et anesthésie) et de soins sont parfaitement maitrisées par notre laboratoire depuis plus de 10 ans. Les étapes chirurgicales nécessaires à l’induction du TC seront réalisées sous anesthésie gazeuse et après une prémédication antalgique, ce qui assure une prise en charge optimale de la douleur infligée aux animaux. Une attention particulière sera portée aux conditions d’hébergement des animaux de manière à limiter leur angoisse (contact social, contact humain, enrichissement du milieu). Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de compléter les analyses IRM par des analyses histologiques du cerveau et des analyses sanguines.

Choix des espèces

Le rat Sprague Dawley est l’espèce/la souche utilisée dans la majorité des études pré-cliniques du TC et est une des espèces animales communément choisie pour les étudier le fonctionnement du cerveau. Son utilisation pour les études proposées est donc préconisée, car il est important de se fonder sur les connaissances existantes. Les rats seront réceptionnés à l’âge de 8 semaines. Ils seront âgés de 10 semaines au moment de l’induction du traumatisme crânien/de la chirurgie, ce qui correspond au stade de jeune adulte, stade pertinent chez l’humain car correspondant à un âge particulièrement propice à l’exposition au TC. Ils seront soumis à des examens par IRM et seront mis à mort entre les 4ième et 5ième semaines post-TC, ce qui correspond, d’un point de vue pathologique, au stade chronique précoce.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Le porteur leur injecte des cellules de cancer du sein humain par voie intraveineuse pour induire des métastases pulmonaires, puis un inhibiteur enzymatique par voie intrapéritonéale tous les deux jours pendant cinq semaines. Il précise que les souris sont maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et la croissance tumorale, tout signe de souffrance conduisant à la mise à mort et au prélèvement des poumons. Il affirme que le processus métastatique ne peut être modélisé in vitro et que l'usage de la souris est "nécessaire".

Objectifs

Ce projet vise à démontrer l’importance de l’élongation des acides gras catalysée par l’enzyme Elovl5 et l’accumulation induite de gouttelettes lipidiques dans le développement de métastases pulmonaires dans un contexte de cancer du sein.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à définir le rôle de l’accumulation de triglycérides dans les gouttelettes lipidiques des cellules métastatiques et à démontrer que l’inhibition de leur formation pourrait être une stratégie thérapeutique en ciblant l’enzyme DGAT1 impliquée dans la synthèse des triglycérides.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique injection caudale intraveineuse et des injections intrapéritonéales tous les deux jours pendant 5 semaines.

Impact sur les animaux

Les études précédentes utilisant le modèle de souris Nude NMRI injectées en i.v. avec des cellules MCF-7 shRNA ctrl ou Elovl5 n’ont pas montré de nuisance ou effets indésirables sur une période de 5 semaines si ce n’est le stress lié à la contention de l’animal au moment de l’i.v. Dans ce nouveau projet, l’inhibiteur DGAT1 sera injecté en intrapéritonéal tous les deux jours pouvant occasionner un stress. Les animaux seront suivi quotidiennement et une prise de poids hebdomadaire sera effectuée. Tout signe de souffrance conduira à la mise à mort des souris et aux prélèvements des tissus. Il est à noter que la littérature décrivant l’utilisation de cet inhibiteur ne fait pas apparaitre d’effets indésirables.

Devenir

Après transfert des cellules cancéreuses par i.v., les souris seront maintenues 5 semaines en cage à l’animalerie avec un suivi quotidien. Elle seront ensuite mises à mort pour le prélèvement des poumons

Remplacement

L'utilisation de ce modèle murin de cancer métastatique est nécessaire car la le processus métastatique est mécanisme complexe ne pouvant être modélisé in vitro. En effet, la capacité de dissémination des cellules cancéreuses par la voie sanguine et de colonisation des tissus pulmonaires ne peut s’observer que dans un modèle animal. Ainsi, les similarités physiologiques et métaboliques entre la souris et l'Homme permettront de transposer les résultats obtenus à la situation des patients atteints de cancer.

Réduction

Pour limiter le nombre d'animaux utilisés, nous avons déterminé l'effectif nécessaire par groupe en s'appuyant sur notre expérience antérieure en prenant en compte la variabilité interindividuelle et à l'aide d'un outil statistique prédictif permettant d’obtenir un résultat fiable et analysable.

Raffinement

Les souris soumises à cette procédure expérimentale seront maintenues en groupe pour favoriser la socialisation et placées dans un environnement calme avec enrichissement structural du milieu permettant la construction de nid. Les souris seront maintenues sans traitement antalgique pour ne pas interférer avec la réponse inflammatoire et éviter des modifications de croissance tumorale. Elles seront surveillées quotidiennement et tout signe de douleur ou souffrance conduira à leur mise à mort. Au total, 80 souris femelles sur un fonds génétique Nude NMRI seront utilisées

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de la carcinogenèse par sa proximité avec la physiopathologie chez l’Homme. En outre, les souches consanguines de souris, telle que la souche Nude NMRI a un phénotype homogène, ce qui permet d’identifier plus facilement les effets induits par les manipulations expérimentales. De plus, l’injection de cellules humaines nécessite l’emploi de souris immunodéficiente de type Nude. D’un point de vue technique, les coûts limités de maintenance, et le taux de reproduction élevé de la souris permettront la création des groupes d’animaux requis sur une période de courte durée. Des souris femelles âgées d’au moins 8 semaines seront utilisées pour une prise tumorale homogène et faciliter l’injection des cellules cancéreuses par voie intra-veineuse.

500 souris et 350 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les animaux subissent des craniotomies pour provoquer un accident vasculaire cérébral ischémique, permanent ou transitoire, avec pose de cathéter et injection d'agents de contraste pour l'imagerie. Le porteur indique que des complications peuvent survenir, prostration, arrêt de l'alimentation et perte de poids, les animaux concernés étant alors euthanasiés par exsanguination sous anesthésie. Il affirme le caractère de "stricte nécessité" des procédures et conclut qu'aucune méthode sans animaux vivants n'apporterait le même niveau d'information.

Objectifs

L’objectif principal de notre travail est d’étudier l’implication de la réaction inflammatoire post-ischémique dans les différentes situations de reperfusion. Cette étude établira également le potentiel des différents agents de contraste révélant l’inflammation comme outil prognostic de l’AVC ischémique. Les différents modèles d’AVC que nous allons comparer correspondent à des situations cliniques différentes. Pour ces modèles nous créerons une ischémie permanente ou transitoire, au niveau de l’artère cérébral moyenne (ACM) ou via l’artère carotide interne, avec une occlusion mécanique contrôlée ou via la formation d’un caillot in situ.

Bénéfices attendus

Cette étude établira le potentiel des différents agents de contraste révélant l’inflammation en IRM-TEP et de l'échographie super-résolur comme outil prognostic de l’AVC ischémique.

Procédures

Les animaux seront soumis à des chirurgies invasives comprenant des craniotomies pour induire l'ichémie cérébral (modèles AVC ischémiques), à la pose de cathéter dans la veine caudale pour l'injection d'agent de contraste et à des protocoles d'imagerie non invasive.

Impact sur les animaux

Des problèmes techniques importants peuvent avoir lieu pendant ou après la réalisation des différents modèles d'inflammation. Des complications peuvent apparaître comme une douleur chez les animaux (répérée par de la prostration, une inactivé dans la cage, un arrêt de la prise alimentaire et de boisson voire une perte de poids). Les animaux seraient alors euthanasiés par anesthésie profonde si l'une des situations se présentaient.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés par exsanguination après perfusion intracardiaque de sérum physiologique sous anesthésie profonde (5% isoflurane, O2/N2O 1/1). DIRECTIVE 2010/63/UE, ANNEXE IV.

Remplacement

D’un point de vue scientifique cette étude va permettre des recherches translationnelles ou appliquées menées pour le diagnostic d’un mauvais état de santé chez l'homme. Les procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l’étude d’un diagnostic positif de l’inflammation post AVC et de son rôle dans la mauvaise reperfusion sanguine cérébrale doit s’effectuer sur des modèles in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures et la littérature disponible sur les modèles animaux utilisés. En s’appuyant sur nos précédents projets et sur les données disponibles dans la littérature, nos estimations du nombre d’animaux utilisés sont faites de manière à bénéficier d’une puissance statistique suffisante, tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux seront suivies quotidiennement par un personnel qualifié. Plusieurs fois par jour, un contrôle du bien-être animal est réalisé sur l’ensemble des animaux utilisés dans ce projet. Tous les moyens pouvant contribués à la diminution de la souffrance animale seront mis en oeuvre. Seules les expérimentations considérées comme indispensables seront réalisées sur les animaux. Les animaux sont suivis et manipulés quotidiennement par un personnel formé afin de réduire le stress les jours d’expérimentation.

Choix des espèces

La souris (mus musculus) et le rat (rattus norvegicus) sont les espèces animales qui ont été le plus étudiées dans le domaines de l’accident vasculaire cérébrale et les caractéristiques de la pathologie sont donc bien connus. Dans cette étude, nous allons intéresser précisément à la microcirculation cérébrale et au taux de collatéralité des animaux. Les données de la littérature scientifique rapportent un certains nombre de différences en IRM de perfusion sur des modèles d’AVC entre rats et souris. Cette différence dans le taux de microcirculation pourrait en être la raison. Il y a également des différences importantes au niveau de cette microcirculation cérébrale entre différentes races d’une même espèce. Il y a aussi des différences de réponses à l’AVC ischémique marqués entre rats et souris. Pour les souris le stade de développement des animaux est de 8 à 12 semaines soit un poids de 35-40g. Nous effectuons donc notre modèle sur des jeunes adultes. Pour les rats nous utiliserons également des jeunes adultes, de 8 à 12 semaines soit un poids de 220 à 250g.

130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès la naissance, du matériel génétique est injecté dans leur cerveau, puis une fenêtre d'observation est implantée sur le crâne et une narine est obstruée, pour étudier le développement du système olfactif sous microscope. Le porteur indique que l'électroporation sous anesthésie par le froid entraîne une faible mortalité et que l'occlusion nasale gêne la respiration et l'olfaction. Les souris sont tuées par perfusion d'un fixateur dans le cœur pour conserver le cerveau.

Objectifs

L'olfaction joue un rôle majeur dans le comportement des animaux et leur adaptation à environnement. A ce titre, le système olfactif représente un modèle très attractif pour étudier une question centrale en neurosciences : comment le cerveau traite les signaux issus de notre environnement sensoriel et comment ces signaux influencent le développement neuronal. Au cours des dix dernières années, le développement d'approches d'imagerie fonctionnelle in vivo chez le rongeur a permis de commencer à comprendre ces différents mécanismes. Néanmoins, le manque de marqueurs et d'outils a empêché l’étude du développement du système olfactif et la délimitation de rôles précis pour plusieurs des populations neuronales impliquées. Le but de ce projet est de mieux comprendre le développement et le fonctionnement du système olfactif. Nous étudierons dans un premier temps le rôle de l’environnement sensoriel olfactif dans le développement du système bulbe olfactif. Nous nous intéresserons ensuite à la représentation neuronale des odeurs et de leur concentration dans le bulbe olfactif.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre le role d'activité sensoriel dans le développement cérébral en condition physiologique. Cela nous permettra également de mieux comprendre comment la concentration des odeurs est codées dans le cerveau.

Procédures

Pour la partie 1 (40 animaux), du matériel génétique est injecté le jour de la naissance dans le cerveau. Quatre semaines plus tard, les animaux sont anesthésiés et une fenêtre d'observation du cerveau est implantée sur le crâne. Une narine est également obstruée à ce moment. Les animaux sont ensuite observés toutes les semaines pendant 4 semaines sous un microscope en condition anesthésiée. Cette observation dure moins d'une heure. Pour la partie 2 (40 animaux), du matériel génétique est injecté le jour de la naissance dans le cerveau. Quatre semaines plus tard, les animaux sont anesthésiés et une fenêtre d'observation du cerveau est implantée sur le crâne. Une narine est également obstruée à ce moment. Les animaux sont ensuite observés toutes les semaines pendant 4 semaines sous un microscope en condition anesthésiée. Cette observation dure moins d'une heure. Au bout de 4 semaines d'observation la narine est débouchée. Les animaux sont alors observés à nouveau toutes les semaines pendant 4 semaines sous un microscope en condition anesthésiée. Pour la partie 3 (50 animaux), dans une période comprise entre 2 et 12 mois, les animaux sont anesthésiés et une fenêtre d'observation du cerveau est implantée sur le crâne. Après une semaine de récupération les animaux commencent à être enregistrés « tête-fixée » anesthésiés (injection combinée de xylazine (10 mg/kg) et de kétamine (100 mg/kg) par voie intrapéritonéale (0.1ml pour 10g) sous le microscope lors de session durant au maximum 1h et où ils sont exposés brièvement à des odeurs pendant 3s (x 6 concentrations, 40 secondes entre les concentrations) et jusqu’à 3 odeurs différentes (total 54 stimulations). Pour mesurer la stabilité des réponses aux odeurs dans le temps, les animaux sont placés à nouveau sous le microscope sous anesthésie 1 jour, 1 semaine et 1 mois plus tard.

Impact sur les animaux

L’électroporation in vivo sur de jeunes animaux postnataux est exécutée sous anesthésie par le froid qui peut malheureusement induire un très faible taux de mortalité. Consécutif à l’implantation d’une fenêtre crânienne la présence d’une barre de contention pourra potentiellement entrainer une gêne dans les mouvements des animaux. L’occlusion nasale unilatérale entrainera une gène au niveau respiratoire et une perturbation de l’olfaction.

Devenir

Les cerveaux des animaux sera conservés pour analyse complémentaire potentiel. La burprenorphine (0.05mg/kg, en SC) est injecté 30 minutes avant une anesthésie profonde à l’aide d’un mélange ketamine (150 mg/kg) et xylazine (15 mg/kg) par IP puis d’une perfusion de para-formaldéhyde par voie intracardiaque » »

Remplacement

L’étude du système olfactif, de par leur complexité d’organisation, de développement et de fonctionnement ne peut pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, seules des approches menées chez un modèle animal peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau dont pourra bénéficier à terme les études menées chez l’homme.

Réduction

Les procédures visent à limiter l’utilisation d'animaux tout en obtenant suffisamment de données. -la méthode d’électroporation et les vecteurs d’expression ont été optimisés pour limiter le nombre d’animaux. -Les étapes de validation fonctionnelle générant des résultats quantitatifs utiliseront des outils statistiques (p

Raffinement

-L’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé quotidiennement. -Enrichissement des cages avec des carrés de coton et des bâtons de bois. -Hébergement des animaux en groupes sociaux. -Chaque intervention chirurgicale ( chirugie cranienne, occlusion nasale) est réalisée sous anesthésie générale (ketamine 125 mg/kg + xylazine 12,5 mg/kg par IP) en présence d’analgésique : analgésie locale (Lidocaine) lors de l’injection d’ADN avant électroporation in vivo ou lors de l’occlusion nasale. Analgésie générale : Dès la fin de la chirurgie, les animaux reçoivent par injection sous-cutanée, du carprofène (10mg/kg). Cette injection est renouvelée pendant 3 jours. -Pour la perfusion intracardiaque, pour éviter toute souffrance, la buprénorphine (0.05mg/kg, en SC) est injectée 30 minutes avant la perfusion et les doses de Ketamine/Xylazine (150 mg/kg et 15 mg/kgrespectivement) utilisées pour anesthésier les animaux sont sub-létales (et la procédure n’est enclenchée qu’après s’être assuré que l’animal est sans réaction. -Etablissement des points limites les plus précoces possibles. En cas d'infection de la narine de la pommade antibiotique dermaflon est appliquée pendant plusieurs jours. -en cas d’observation de souffrance les animaux seront injectés avec la buprénorphine (0.05mg/kg, en SC) de façon journalière. Si la souffrance persiste malgré la buprénorphine ou après 3 jours de traitement à la buprénorphine alors l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

L’étude du système olfactif, de par leur complexité d’organisation, de développement et de fonctionnement ne peuvent pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, seules des approches menées chez un modèle animal comme la souris peuvent améliorer les connaissances fondamentales sur le cerveau dont pourra bénéficier à terme les études menées chez l’homme. C’est dans ce contexte que se situent nos travaux dont l’objectif est d'étudier le développement et la fonction du système olfactif. Notre projet utilisera des animaux à partir de la naissance et jusqu'à 12 mois. Il semble qu'il y ait une diminution des performances olfactives passé cet age.