Procédures sévères

1800 rats vont être utilisés, toutes tuées à l'issue, dans des procédures majoritairement classées de souffrance sévère. Rendus obèses par un régime gras et sucré, ils subissent des gavages, des injections d'insuline et des prises de sang sur animal vigile, et une partie une chirurgie de l'estomac et de l'intestin de type bariatrique. Le porteur affirme qu'il n'est pas possible de recréer sans animaux la complexité des interactions entre l'intestin et le système immunitaire, tout en indiquant développer en parallèle des mini-intestins en culture pour les remplacer à terme. L'objectif est de comprendre le rôle de l'immunité intestinale dans les effets de la chirurgie de l'obésité.

Objectifs

L’obésité est une maladie chronique et un problème de santé publique majeur souvent associée au diabète. En France, elle est en augmentation constante depuis plusieurs années et touche maintenant près de 15% de la population. La chirurgie bariatrique (appelée aussi chirurgie de l'obésité) est le traitement de référence quand l’obésité devient très grave et dangereuse pour la santé. C'est une chirurgie qui remodèle l'estomac et l'intestin. Les deux chirurgies les plus pratiquées en France sont la Vertical Sleeve Gastrectomy (VSG, 80% de l'estomac est retiré) et le Roux-en-Y Gastric Bypass (RYGB, l'estomac et une partie de l'intestin sont détournés du circuit des aliments). L’obésité est asociée à une inflammation qui se caractérise par une augmentation des cellules immunitaires qui ont de nombreux effets délétères. L'intestin possède ses propres cellules immunitaires qui sont peu étudiées mais qui pourraient être impliquées dans le développement de l’obésité et du diabète, et donc pourraient jouer un rôle dans les effets bénéfiques de la chirurgie sur la perte de poids ou la réduction du diabète. Les objectifs du projet sont de caractériser le système immunitaire de l'intestin au cours de l’obésité et après chirurgie bariatrique et de déterminer son rôle sur la résolution du diabète observée après l’opération. Nous allons également comparer les effets de la chirurgie sur le diabète aux effets d’un antidiabétique couramment utilisé, la metformine, et caractériser les effets de la combinaison des deux (chirurgie et metformine).

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’obtenir des données uniques pour caractériser les conséquences de la chirurgie bariatrique de type VSG et RYGB sur l’immunité intestinale et comprendre le rôle de l’immunité intestinale dans les effets bénéfiques de la chirurgie bariatrique combinée ou non à un anti-diabétique couramment utilisé chez l'homme.

Procédures

Les animaux sont nourris pendant 14 semaines avec un régime riche en graisses et sucres qui va leur faire prendre du poids. Ils sont soumi, éveillés, à des gavages (glucose ou anti-diabétique), des injections intra-péritonéales (insuline) et des prélèvements de sang à la queue. Au maximum, les animaux, toujours éveillés, subissent 3 gavages de glucose et 3 injections d'insuline suivis de prélèvements à la queue. Chaque manipulation est séparée d'au moins une semaine. Une partie des animaux aura une chirurgie intestinale (opération RYGB ou VSG ou contrôle) qui sera réalisée sous anesthésie et analgésie et va entrainer une perte de poids.

Impact sur les animaux

Le régime riche en graisses et en sucres est extrêmement agréable pour les animaux mais il entraine une prise de poids. Cependant, et contrairement à l'homme, il n'y a pas de maladies associées dans ce modèle (ni diabète, ni foie gras). Une augmentation modérée du taux de sucre dans le sang est parfois observée. L'anti-diabétique est très utilisé chez l'homme, il permet de diminuer le taux de sucre dans le sang des animaux diabétiques sans effets néfastes associés. Les chirugies sont réalisés sous anesthésie avec une prise en charge de la douleur avant, pendant et après l’acte chirurgical .Ces chirurgies entrainent une perte de poids sans aucun autre problème associé (pas de dénutrition majeure, pas de diarrhée). Les gavages, les injections et les prélèvements sanguins sont réalisés dans le respect du bien-être animal.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de toutes les procédures afin de prélever et d'analyser leur système immunitaire intestinal

Remplacement

Il n’est pas possible de re-créer sans l'usage d'animaux, la complexité des interactions entre le tractus gastro-intestinal et le système immunitaire intestinal dans les maladies associées à l’obésité comme le diabète. En parallèle de l’étude chez l’animal, la mise en place d’organoïdes à partir des intestins prélevés, c'est-à-dire de culture de cellules permettant de recréer et d'étudier des mini-intestins sans animaux, va permettre à terme de remplacer les animaux pour certaines études.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables. Au final, ce projet nécessitera l'utilisation de 810 rats Wistar et 810 rats GK sur 5 ans. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet.

Raffinement

L'ensemble des procédures de ce projet se fera dans le respect du bien-être animal. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et la prise en charge de la douleur, avec l’administration d’analgésique, comme cela se fait chez les patients opérés d’une VSG ou d’un RYGB, est prévue avant, pendant et après l’opération. Nous avons inclus dans toutes les procédures des grilles de suivi de poids et de la prise alimentaire des animaux avec des pesées journalières les 15 jours après l'opération puis hebdomadaires, ainsi qu’une grille d'évaluation de la douleur avec des points limites précis et adaptés. Nous essayons de limiter au maximum l'isolement des animaux mais quand cela est nécessaire nous enrichissons les cages avec des tubes en polycarbonate.

Choix des espèces

Le rat est connu depuis longtemps pour être un bon modèle d’étude de l’obésité, suffisamment gros pour pouvoir reproduire le plus fidèlement possible les chirurgies réalisées chez l'homme. De plus il existe une souche de rat qui devient naturellement diabétique que nous utilisons également dans ce projet. Nous utilisons des animaux adultes mâles et femelles obèses car 80% des chirurgies sont réalisées chez des femmes adultes et 20% chez des hommes adultes.

200 animaux, 100 souris et 100 rats, vont être utilisés dans des procédures classées de souffrance modérée à sévère, la plupart tués à l'issue et cinquante animaux témoins réutilisés. Les rats reçoivent une tumeur cérébrale et les souris un accident vasculaire cérébral provoqué, la gravité venant de ces modèles et non des séances d'imagerie qui suivent. Le porteur indique que l'objectif est d'optimiser des séquences d'IRM et de TEP fournies par le constructeur, un travail de mise au point technique de la plateforme. Il justifie le recours à l'animal par la nécessité d'étudier ces pathologies dans un "organisme entier".

Objectifs

Le projet consistera principalement à optimiser des séquences en imagerie par resonance magnétique grâce à un imageur à très haut champ. La plateforme dispose également d’un imageur hybride qui réalise des imageries par resonance magnétique couplés à de la tomographie par émission de positons qui permet des imageries à haute résolution. Les séquences et acquisitions à optimiser bénéficieront aux deux imageries. Pour cela nous avons prévu d'étudier les deux pathologies à étude. Les séquences à optimiser seront celles disponibles pour nos imageurs que nous souhaitons optimiser : anatomiques, de diffusion, de perfusion, ... avec injection ou non de produits de contraste ou de produits spécifiques.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons optimiser nos séquences d'imagerie à la mailleure qualité possible afin d'assurer aux chercheurs un maximum de signal réalisant des manipulations le plus courtes possibles (techniques moins invasives pour les animaux et moins de frais de temps machine et personnel).

Procédures

Les animaux setont inclus dans les groupes expérimentaux: - rats : tumeurs ou controles. - souris : accident vasculaire cérébral ou controles. Ils suivront donc une des deux procédures ou en seront les controles (sans chirurgie). Modèle tumoral : anesthésie maximum 30 minutes. Modèle d'accident vasculaire cérébral, anesthésie maximum 120 minutes. Dans les deux casn ils suivront les optimisations d'imagerie suivant maximum 3heures d'expérience pour les rats et 1,5h pour les souris, incluant le temps de pose de cathéter quand nécessaire (autour de 5 minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux suivront des procédures d'imagerie qui ne sont pas invasives. Les séances se feront sous anesthésie et analgésie. Nous savons de facto qu'une pose de cathéter sera nécessaire pour des challenges en imagerie dynamique par exemple ou pour l'injection simple de contrastes, l'analgésie sera faite en conséquence. Nous avons prévu une analgésie locale (lidocaïne en spray) puis également à la buprénorphine au moment de la sédationLes animaux qui suivront des procédures pour la création d'AVC ou de tumeurs cérébrales auront en plus suivi le modèle propre à la thématique et qui prévoit une analgésie adaptée. La sévérité du protocole ne vient pas des séances d’imagerie mais des modèles utilisés (création de tumeurs et d’AVC) en amont de cette imagerie. Pour le modèle tumoral, d'après notre expérience les animaux ont un comportement social et score clinique normal. Néanmoins, un suivi du volume tumoral et du poids de l'animal est fait pour suivre le bien-être des animaux. Pour le modèle d'AVC, d'après notre expérience les animaux récupèrent de la chirurgie sans problème de comportement ou de score clinique une fois l'analgésie post-opératoire faite. Néanmoins, un suivi du score clinique est réalisé afin de suivre le bien-être des animaux.

Devenir

Les animaux modèle ont eu des procédures chirurgicales qui sont cumulées à l'imagerie. Ils seront mis à mort à la fin de la dernière séance d'imagerie, sous anesthésie (comme décrit dans l'onglet mise à mort). Les animaux contrôle seront réutilisés si possible pour les formations prévues en interne car ils n'auront pas subi d'interventions invasives (les animaux avec contraste auront eu une pose de cathéter veineux à la queue, nous attendrons une récupération totale avant réutilisation, au minimum d'une semaine). Ces animaux que nous prévoyons pouvoir réutiliser sont les 5 controles utilisés par an, donc 25 pour chaque espèce et pour l'intégralité du projet.

Remplacement

Le recours à des animaux est justifié par la nécessité d’étudier les deux pathologies à étude dans un organe spécifique qu’est le cerveau et d’un organisme entier.

Réduction

Pour chaque pathologie, 15 animaux « modèle » et 5 « contrôle » seront utilisés au maximum afin de valider ces séquences d’IRM par an (20 rats et 20 souris par an, donc 100 rats et 100 souris maximum en total pour tout le projet). Nous tenons compte du temps machine disponible en interne pour notre section de recherche et développement et la disponibilité de notre personnel pour réaliser deux séances de test par mois maximum. De plus, ces groupes expérimentaux sont calculés suivant le fait que le constructeur Bruker met à disposition 41 séquences d'imagerie que nous souhaitons optimiser pour assurer aux chercheurs un maximum de signal dans le minimum de temps possible. Cette optimisation ne nécessitera donc pas plus d'animaux que 50 par an maximum.

Raffinement

Tous les moyens sont mis en oeuvre afin de limiter la souffrance animale. En pré-opératoire et lors de la chirurge les animaux seront anesthésiés à l'isoflurane (4% en induction dans l'O2; 2.5% dans un mélange O2/N2O 30/70%). Une anesthésie locale est appliquée aau niveau de la sutire cutanée (xylocaïne 2%). En péri-opératoire, l'analgésie est assurée par l'injection de buprénorphine (0.05mg/kg au moment de l'installation dans la paillasse) et répétée à 6-8h post-chirurgie. Une surveillance post-opératoire est effectuée quotidiennement pour le suivi des points limites avec une pesée pour le suivi de croissance tumorale (3 fois par semaine). Si l'apparition de signes de critères de mise à mort s'avèrent, les animaux seront ethanasiés. Lors des examens d'imagerie par IRM et/ou TEP, les animaux seront anesthésiés de la même manière.

Choix des espèces

D’après l’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et grâce à l’expérience des plateformes thématiques développant ces modèles, nous avons décidé d’utiliser les espèces choisies : - des rats wistar pour l’implantation intrastriatale de cellules 9L permettant de développer des tumeurs. - des souris swiss dans le cas de l’étude de l’AVC, avec une occlusion de l’artère cérébrale moyenne reperfusées au bout de 20 minutes. Les rats seront âgés d’environ 8 semaines (250g) et les souris 8-10 semaines (30-35g) en début de protocole. Nous effectuons les procédures sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles de tumeurs cérébrales et d’AVC.

Une colite provoquée par du dextran sulfate de sodium versé dans l'eau de boisson, répétée jusqu'à trois cycles de cinq jours, entraîne douleur, perte de poids et prostration chez des souris étudiées pour les symptômes psychologiques des maladies inflammatoires de l'intestin. 231 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, avec, pour 90 d'entre elles, des tests comportementaux répétés six fois, un test de nage forcée pour 30, et pour 45 autres trois jours de gavage d'antibiotiques suivis d'une transplantation fécale par gavage. Le porteur promet pourtant un "bien-être optimal tout au long de l'étude". Toutes sont tuées à l'issue de chaque procédure pour l'examen de leur intestin.

Objectifs

Le projet a pour objectif d’étudier l’impact de stratégies thérapeutiques de modulation de l’écologie microbienne intestinale en développement dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sur un plan comportemental. Le projet a recours à un modèle murin de référence de MICI : colite au dextran sulfate de sodium (DSS). Cette molécule soluble dans l’eau de boisson des animaux entraine une inflammation de la muqueuse intestinale, reproduisant ainsi les lésions existantes dans la maladie humaine et ses caractéristiques physiopathologiques. Les animaux seront étudiés sur un plan comportemental avec une batterie de tests successifs pour évaluer leur état d’anxiété, leur état de dépression, leur réaction au stress et leur capacité de socialisation. Ces tests seront menés de manière séquentielle pour tous les groupes d’animaux. Enfin, l’administration de thérapeutique sera réalisée et l’évaluation sera faite par une nouvelle séquence de tests comportementaux, afin de montrer un avantage ou non de la thérapeutique sur les aspects comportementaux de la colite au DSS. Ceci répondra à des questions de physiopathologie des symptômes psycho-comportementaux des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, et d‘étudier la réponse de ces symptômes aux stratégies thérapeutiques. Etant donné les expériences nécessaires à la mise en place du projet, un nombre minimal de souris a été fixé permettant une bonne analyse des résultats. Le nombre d’animaux a été réduit au maximum sans entraver l’interprétation des résultats et leur significativité au plan statistique. Ainsi, un maximum de souris sera nécessaire pour une étude scientifique pertinente. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. Par ailleurs, ils seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition en permanence.

Bénéfices attendus

Le projet permettra d’améliorer les connaissances sur le modèle de colite au DSS, notamment à court terme sur la faisabilité d’un modèle consistant en une répétition de cycles d’exposition. Le projet consiste en une étude pré-clinique de test d’hypothèse thérapeutique afin d’obtenir des données qui permettront des études en population humaine pour apporter une réponse thérapeutique aux symptômes extra digestifsneuro-comportementaux des MICI. Ces bénéfices du projet sont à long terme.

Procédures

Induction d'une colite inflammatoire par boisson au DSS (exposition de 5 jours par inductions) : - Procédure expérimentale 1 pilote : 6 groupes de 6 souris (un groupe par dosage), une seule induction, mise à morts d'une souris par cage (cages de 3) pour étude histologique et biologique à J5, J10 et J12. - Procédure expérimentale 2 : 6 souris, 2 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. - Procédure expérimentale 3 : 9 souris, 3 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. - Procédure expérimentale 4 : 45 souris, 3 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. - Procédure expérimentale 5 : 90 souris, 2 cycles d'induction avec rémission complète plus repos de 7 jours entre chaque cycle, mise à mort de toutes les souris en fin de procédure pour étude histologique et biologique. Prélèvement sanguin par ponction de la veine mandibulaire avant les mises à mort pour dosage des différents marqueurs inflammatoires dans la procédure expérimentale 1 (36 souris concernées). Test comportementaux léger : 90 souris dans la procédure expérimentale 4, passés à 6 reprises, lors des pics inflammatoire et en fin de rémission pour chaque cycle. Test de la nage forcée : 30 souris dans la procédure expérimentale 4. Gavage antibiotique pour déplétion du microbiote intestinal pendant 3 jours consécutifs, puis gavage pour transplantation fécale le 4ème jour : 45 souris dans la procédure expérimentale 5, entre les 2 cycles d'induction.

Impact sur les animaux

Colite au DSS : douleur, perte de poids, prostration, stress pendant la durée d’exposition au DSS dans l’eau de boisson. Tests comportementaux : stress pendant une période réduite de quelques heures après le test.

Devenir

Mise à mort de toutes les souris à l’issue de chaque procédure pour étude et comparaison histologique et biologique de l'intestin.

Remplacement

Notre projet porte sur l’étude comportementale d’un modèle de colite inflammatoire. Les alternatives expérimentales aux animaux vivants ne permettent pas l’étude comportementale.

Réduction

Le nombre d’animaux destiné au projet a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisante d’analyse statistique. Le nombre d’animaux pour la PE1 et PE2 a été réduit au minimum pour permettre de construire de manière adapté le protocole final. Les PE3 et 4 nécessite un nombre plus important d’animaux du fait de la variabilité importante et inhérente aux analyses comportementales. Les tests statistiques comportent des analyses descriptives et des analyses de comparaisons. Du fait du faible nombre de données les analyses seront menées par des tests non paramétriques.

Raffinement

Les nuisances pour les animaux seront prévenues par une surveillance accrue lors de l’exposition au DSS sur le plan du comportement, du stress, de la douleur et du poids. Afin de limiter le stress lié aux tests comportementaux, les animaux seront habitués aux procédures et au matériel de manière progressive. Concernant le gavage de la PE5, celui-ci sera réalisé par un expérimentateur entrainé. Les cages d’hébergements seront enrichies (nid et bâton à ronger).

Choix des espèces

La souris est l’espèce référencée pour le modèle au DSS. Elle répond aux compétences de l’animalerie PLEXAN où l’expérimentation va être menée. Cette espèce est bien référencée sur les études comportementales et la littérature existante permettra une analyse de qualité. Les animaux seront achetés à l’âge de 6 semaines, et seront utilisé dans le projet à l’âge de 8 semaines. L’âge adulte correspond aux données de la littérature en termes de modèle DSS et d’étude comportementale.

84 rats vont être utilisés, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance modérée à sévère. Ils subissent une chirurgie crânienne pour la pose d'un dispositif de contention, puis reçoivent pendant trois jours un composé neurotoxique de référence, le 3,3'-iminodipropionitrile, avant une mise à mort par perfusion intracardiaque. Le porteur indique que ce toxique provoque une dépression du système nerveux, une faiblesse musculaire, une hypothermie et des troubles de l'équilibre qui persistent dans le temps, et décrit deux tests comportementaux, le retournement et la suspension par la queue. L'objectif affiché est de valider les méthodes du laboratoire pour évaluer plus tard la toxicité de produits industriels sur l'oreille interne.

Objectifs

Ce projet consiste à valider des méthodes qui seront utilisées pour évaluer la toxicité de produits industriels, rencontrés dans le monde de travail, sur les récepteurs de l’audition et de l’équilibre, tous deux situés dans l’oreille interne à l'aide d'une molécule de référence: 3, 3' iminodipropionitrile. Cette étude permettra au laboratoire de poursuivre l'investigation de molécules suspectées toxiques pour l'oreille interne et d’informer les préventeurs sur des risques potentiels de certains produits industriels en renseignant notamment les fiches toxicologiques.

Bénéfices attendus

Les tests mis en oeuvre dans cette pré-étude avec le 3, 3' iminodipropionitrile, molécule de référence connue pour altérer l'audition et l'équilibre chez l’animal, permettront de valider les méthodes expérimentales qui seront déployées afin d'évaluer la toxicité de produits industriels sur la cochlée et le vestibule, récepteurs de l'audition et de l'équilibre.

Procédures

Chirurgie crânienne: Les animaux (42 rates) sont équipées d’un dispositif de contention au niveau de leur crâne, dans le but d'enregistrer leur mouvement oculaire (nystagmus post-rotatoire) après stimulation du système vestibulaire par rotation. Cette intervention chirurgicale sera réalisée sous anesthésie gazeuse et n’excèdera pas une heure par animal. Elle sera réalisée 1 seule fois. Mesures du nystagmus post-rotatoire : Ces mesures seront effectuées sur les 42 rates ayant subi une chirurgie cranienne, au moins 21 jours auparavant. Elles seront réalisées avant administration du 3, 3' iminodipropionitrile ou de NaCl 0,9% (T0) et 1 mois après traitement (T1). Cette mesure nécessite une contention. La durée de cette procédure est estimée à 10 minutes par animal. Tests comportementaux : A T0 et T1, 42 rates seront soumises à 2 tests comportementaux permettant une mesure de la fonction vestibulaire : le test de retournement et la suspension par la queue. Moins de 10 minutes par animal sont requis pour effectuer ces 2 tests comportementaux. Une fois ces mesures effectuées, les rates sont soumises aux mesures des produits de distorsion acoustique. Mesure des produits de distorsion acoustique : 42 rates seront soumises à une anesthésie légère (kétamine / xylazine, 45 / 5 mg/kg) afin d’enregistrer les produits de distorsion acoustique après avoir positionné une sonde au niveau de l’oreille gauche. Ces mesures seront effectuées avant traitement au 3, 3' iminodipropionitrile (T0) puis 1 mois (T1) après traitement. Quinze minutes par animal sont nécessaires. Traitement par voie intrapéritonéale avec le 3, 3' iminodipropionitrile ou NaCl 0,9% : Les rates seront traitées pendant 3 jours successifs par voie intrapéritonéale (2mL/kg) soit au NaCl 0,9% (20 rates), soit à une des trois doses de 3, 3' iminodipropionitrile : 150, 200 ou 300mg/kg (64 rates). Au terme des expérimentations, les animaux seront mis à mort par perfusion intracardiaque afin de réaliser l’histologie de l’oreille interne.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus dans ce projet sont ceux résultant du traitement des rats avec le 3, 3’ iminodipropionitrile, décrit dans la littérature comme un toxique engendrant des dommages au niveau des récepteurs de l’audition et de l’équilibre. Il est rapporté une apparition rapide d’un effet dépresseur sur le système nerveux central, ainsi qu’une faiblesse musculaire et une hypothermie. Des troubles de l'équilibre et des effets sur le système locomoteur apparaissent dans les jours qui suivent la fin du traitement et persistent dans le temps. Des pertes de poids reversible sont attendues pendant la semaine du traitement. L’utilisation de ce toxique nous permettra de valider les outils mis au point au laboratoire pour évaluer la toxicité de produits chimiques rencontrés par les salariés au niveau de leur poste de travail.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates traitées au 3, 3’ iminodipropionitrile) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 2 (Evaluation de la fonction vestibulaire par la mesure du nystagmus post-rotatoire chez des rates contrôles) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 3 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique chez des rats traités au 3, 3’iminodipropionitrile) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus biologiques. Tous les animaux de la procédure 4 (Evaluations des fonctions vestibulaire et auditive par l’utilisation de tests comportementaux et par la mesure des produits de distorsions acoustique chez des rates contrôles) seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements de tissus biologiques.

Remplacement

La toxicité de certains solvants industriels sur la cochlée a été démontrée par de nombreuses études expérimentales (rat, cobaye) mais aussi par des études épidémiologiques en entreprise. A l’inverse, les effets de ces substances sur le vestibule qui partage de nombreuses similitudes avec la cochlée n’ont jamais été étudiés in vivo. Il est à noter, cependant, qu'un modèle in vitro de culture d’explants vestibulaires, développé au laboratoire, a suggéré une toxicité de ces solvants sur le vestibule. Ces données devront être confirmées par une étude sur l’animal avant d’alerter les services de santé au travail de la dangerosité de ces substances sur cet organe. L’étude prévue s’appuiera sur des mesures fonctionnelles, comportementales et histologiques qui devront permettre une comparaison fiable et objective des effets cochleotoxiques et vestibulotoxiques. Etant donné l’absence de recul sur ces techniques appliquées au vestibule, il s’averait nécessaire de valider et calibrer nos méthodes à l’aide d’une molécule toxique à la fois pour la cochlée et le vestibule. Le choix s’est porté sur le 3, 3’ iminodipropionitrile. Les méthodes utilisées dans le cadre de cette étude évaluent les fonctionnements physiologiques de ces deux systèmes sensoriels ainsi que diverses réponses réflexes. Ces méthodes ne peuvent être testées que sur des organismes vivants. Ces tests sont des mesures de produits de distorsion acoustique pour l'audition et la mesure du nystagmus post-rotatoire ainsi que deux tests comportementaux pour l'équilibre (retournement et suspension par la queue). Des analyses histologiques seront également réalisées. D’autre part, pour évaluer la toxicité de ces agents chimiques, il est nécessaire que ces derniers soient métabolisés par des organismes vivants.

Réduction

Tous les efforts ont été faits pour limiter le nombre d’animaux utilisés afin de répondre à la question scientifique. Trois doses différentes de 3, 3’ iminodipropionitrile sont nécessaires pour encadrer le seuil de toxicité qui doit se trouver vers 3 x 200 mg/kg. Le dispositif crânien des rates destinées aux mesures du nystagmus post-rotatoire ne permettant pas les mesures de produits de distorsion acoustique, des lots de rates dédiés spécifiquement à ces tests seront donc prévus. Ainsi pour chaque dose de 3, 3’ iminodipropionitrile, 2 groupes expérimentaux seront programmés, l’un pour la mesure du nystagmus post-rotatoire et le second pour les mesures de comportement suivies des mesures de produits de distorsion acoustique. De la même manière, 2 groupes contrôles seront également prévus. Le nombre d’animaux par groupe expérimental a été déterminé en réalisant un calcul de puissance statistique (logiciel G-Power) en se basant sur un test de comparaison de moyennes à partir de données obtenues dans une étude antérieure avec un autre toxique où des variations de 25 % du nombre de saccades du nystagmus post-rotatoire sont attendues (contrôle : 100 ± 10, traités 75 ± 15, p

Raffinement

Dès leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront placés en cycle inversé jour-nuit de 12h / 12 h, à une température de 22 ± 2°C et une hygrométrie de 55 ± 15%. Ils seront stabulés à 2 ou 3 animaux par cage dans des cages de polycarbonate ayant une surface au sol de 1032 cm2, et une hauteur conforme aux critères habituels pour leur espèce. Seuls les animaux ayant subi une intervention chirurgicale, afin de les équiper du dispositif crânien, seront hébergés seuls pendant deux semaines afin d’assurer une bonne cicatrisation. L’utilisation de cages ouvertes et transparentes leur permettra de créer des liens sociaux et des contacts visuels, olfactifs et auditifs nécessaires à leur bien-être. La litière utilisée sera constituée de carrés de cellulose irradiée. Leur environnement sera enrichi par des tunnels en carton. Selon les procédures du projet, les animaux seront habitués à être manipulés dans un premier temps puis à la contention.

Choix des espèces

Le rat est une espèce couramment utilisée dans les études de toxicologie et, est un modèle sélectionné dans les lignes directrices de l’OCDE portant sur les essais in vivo de toxicité des produits chimiques. Par ailleurs, le métabolisme des solvants par le rat est proche de celui de l'Homme. De plus, les expérimentations doivent être menées sur des souches de rat pigmentées comme les rats Long Evans puisque la mélanine est présente au niveau de l'oreille interne, comme chez l'Homme. Les souches albinos sont dépourvues de mélanine ce qui les rend plus sensibles aux solvants. Par ailleurs, la plupart des études expérimentales portant sur les systèmes sensoriels de l'audition et de l'équilibre ainsi que les études comportementales ont été menées avec cette souche de rat ce qui facilitera la comparaison avec nos résultats obtenus au sein du laboratoire. Les rates seront utilisées, pour les mesures fonctionnelles, à l'âge adulte entre 16 et 18 semaines car l'oreille interne ainsi que les cytochromes intervenant dans le métabolisme des toxiques doivent être matures.

250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 170 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 80 un niveau modéré. Elles sont irradiées puis greffées de cellules et suivies pendant leur vieillissement, avec prélèvements de sang mensuels sous anesthésie, pour étudier le rôle de la protéine IGFBP2 dans une leucémie chronique. Le porteur indique que les effets indésirables tiennent à l'irradiation et au développement du clone leucémique. Il affirme travailler autant que possible sur des cellules de patients, mais conclut que certaines questions ne peuvent être résolues ni chez l'homme ni en culture in vitro.

Objectifs

Notre équipe explore les mécanismes physiopathologiques à l’origine d’une leucémie chronique appelée leucémie myélomonocytaire chronique. C’est une affection maligne associée au vieillissement de la moelle osseuse hématopoïétique, le tissu qui fabrique les cellules sanguines. C’est une affection sévère puisque l’espérance de vie est en moyenne de 2 à 3 ans après le diagnostic. Le seul traitement susceptible de guérir de cette leucémie est la greffe de cellules souches hématopoïétiques allogéniques mais ce traitement est souvent irréalisable compte tenu de l’âge des patients – en moyenne 70 ans et ne fonctionne pas très bien avec des rechutes fréquentes. Il n’y a pas de solution médicamenteuse efficace. Depuis des années, notre équipe s’efforce de déchiffrer les mécanismes de cette maladie afin d’imaginer des solutions thérapeutiques. Le plus souvent, nous travaillons à partir de cellules de patients. Pour répondre à certaines questions, il nous est utile de recourir aux modèles animaux. Cette leucémie est attribuée à l’accumulation d’évènements génétiques anormaux dans une cellule souche de la moelle osseuse hématopoïétique. Ces évènements sont nécessaires, ils ne sont pas suffisants. Pour que la maladie se développe, il faut que le tissu dans lequel se fait la fabrication des cellules sanguines (on parle de niche médullaire) le permette. En d’autres termes, la leucémie est la conséquence à la fois d’un dérèglement du tissu hématopoïétique (celui qui fabrique les cellules sanguines) et du tissu qui l’entoure (la niche médullaire). Nos travaux nous ont permis d’observer que l’une des modifications les plus nettes de la niche médullaire est la capacité de certaines des cellules de cette niche à produire une protéine appelée IGFBP2. Or, cette protéine est connue pour modifier le comportement des cellules hématopoïétiques. Elle est même utilisée pour favoriser l'expansion des cellules souches hématopoïétiques humaines dans le contexte de la greffe de moelle. Dans le projet proposé, nous posons la question suivante : est-ce qu’IGFBP2 produit anormalement par les cellules de la niche médullaire favorise le développement de cellules leucémiques? Nous explorerons l’impact du vieillissement normal, de la production excessive de la protéine IGFBP2, et du développement d’un clone leucémique sur la composition de la niche médullaire. Puis nous déterminerons si la quantité d’IGFBP2 produite favorise le développement d’un clone leucémique.

Bénéfices attendus

Les résultats de nos travaux chez la souris, complétés par des analyses en cours chez les patients, nous indiquerons s’il serait utile de tester un médicament inhibant IGFBP2 pour contrôler l’évolution de la leucémie étudiée. C’est une hypothèse d’autant plus séduisante que la neutralisation d’IGFBP2 chez la souris la protège de maladies chroniques comme le diabète.

Procédures

Irradiation des souris destinées à subir une transplantation (environ 10min). Transplantation de splénocytes (sous anesthésie par inhalation d'isoflurane 1.5-2%) (environ 10min). Prélèvement de sang au niveau sous-mandibulaire sous anesthésie par inhalation d'isoflurane 1.5-2% (< 5min).

Impact sur les animaux

Nous allons suivre l’évolution de la composition de la niche médullaire au cours du vieillissement de souris sauvages ou produisant trop d’IGFBP2. Les nuisances et effets indésirables seront limités puisque nous laisserons les souris vieillir sans autre manipulation qu’un prélèvement sanguin sous anesthésie tous les mois. Il a été montré que la surexpression d’IGFBP2 chez la souris la protège de l’obésité et du diabète induit par un régime riche en sucres et graisses sans phénotype délétère identifié. Nous allons également suivre l’évolution de la composition de la niche médullaire au cours du vieillissement de souris développant une leucémie. Les effets indésirables seront liés au développement du clone leucémique au cours du vieillissement. Les effets indésirables seront ceux de l’irradiation (perte de poids transtoire) nécessaire à la greffe puis ils seront liés au développement du clone leucémique .

Devenir

Pour chaque procédure, les souris seront euthanasiées à terme afin de récolter tout le matériel biologique (souris CTRL comprises) nécessaire à nos analyses (scRNAseq, cytométrie en flux, numération des cellules sanguines, immunohistochimie sur coupes, ELISA)

Remplacement

Aussi souvent que possible, les expériences réalisées dans ce programme le sont à partir de cellules de patients collectées lors de bilans de surveillance. Cependant, la réponse à certaines questions ne peut pas être obtenue chez l’homme ni dans des systèmes de culture cellulaire 2D ou 3D in vitro. Il s’agit de connaître 1)le rôle du vieillissement sur l’évolution de la composition de la niche médullaire (l’analyse de souris de génotype identique et d’âge variable permet de maîtriser ce paramètre considéré comme important puisque la maladie étudiée est une maladie directement liée au vieillissement, ce que révèle l’analyse génomique des cellules leucémiques des patients) 2)la dynamique de l’impact d’un clone leucémique sur la composition de la niche médullaire qui, elle aussi, nécessite des analyses répétées au cours du vieillissement, non réalisables chez l’homme. 3)l’impact d’un taux accru d’IGFBP2 sur la croissance d’un clone leucémique et sa compétitivité vis-à-vis d’un clone sauvage est une troisième question à laquelle il n’est pas possible de répondre à partir d’échantillons issus de patients. Ces données doivent nous permettre d’évaluer l’utilité d’une approche thérapeutique visant à maîtriser la production d’IGFBP2 chez les patients lorsqu’un clone leucémique a été détecté. Dans ce programme de recherche, les animaux ne sont utilisés que lorsque la réponse aux questions générées par l’exploration de la leucémie étudiée ne peut être obtenue chez l’homme et par des expériences à partir de modèles in vitro : la plupart des expériences du programme de recherche soutenu par l’INCa sont réalisées à partir de prélèvement de sang ou de moelle obtenus de patients avec leur accord. Ce sont ces analyses qui nous conduisent maintenant à interroger le rôle d’IGFBP2 dans la leucémie myélomonocytaire chronique.

Réduction

Les expériences seront réalisées sur des cohortes d’animaux les plus petites possibles, mais assez grandes pour nous permettre d’obtenir des résultats fiables et, lorsque cela a du sens, significatifs d’un point de vue statistique. Le nombre des animaux nécessaires a été calculé - A partir du nombre de cellules à collecter pour les analyses envisagées : l’analyse de la composition de la niche médullaire des souris au cours du vieillissement ne nécessite pas de calcul statistique puisqu’il s’agit d’analyses observationnelles qui seront réalisées en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaires à la collecte de 25000 cellules analysables par une approche de séquençage d’ARN à l’échelle unicellulaire. Tout sera fait pour optimiser la collecte de cellules afin de réduire le nombre des animaux impliqués. - A partir d’une hypothèse sur le gain de compétitivité du clone muté en présence d’IGFBP2,le nombre d’animaux utilisés repose sur un calcul statistique. Certains animaux seront caractérisés à différentes étapes de leur vieillissement (4, 8, 12 mois). Il pourra s’agir d’animaux sans phénotype anormal ou d’animaux génétiquement modifiés susceptibles de développer un phénotype lié à l’expansion du clone leucémique après quelques mois. Ils seront étudiés à différentes étapes de leur vieillissement.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement, des mesures d'adaptation du régime seront mises en place quand nécessaire (en cas d'amaigrissement, même minime, un régime de haute énergie, facile à ingérer sera fourni). Toutes les interventions seront faites sous anesthésie locale ou générale, dépendanmment de l'intervention. Les animaux seront maintenus en groupes et logés dans des cages appropriées de taille adaptée au nombre d’individus. De plus, le milieu sera enrichi à l’aide de nestlets et maisons en cartons afin de réduire le stress. Des points limite stricts ont été définis et seront scrupuleusement appliqués.

Choix des espèces

Le choix de la souris est dicté 1) par la bonne connaissance que nous avons de l’hématopoïèse murine qui reproduit de nombreux aspects de l’hématopoïèse humaine ; 2) la disponibilité de modèles génétiquement modifiés permettant de répondre aux questions que nous nous posons ; 3) son vieillissement relativement rapide, compatible avec les analyses envisagées Nous envisageons de réaliser nos expériences de transplantation de cellules souches hématopoïétiques sur des souris âgées de 1.5 à 5 mois pour mimer la situation chez les patients. Les analyses au cours du vieillissement spontané seront réalisées chez des souris âgées de 4, 8 et 12 mois pour observer une évolution de la maladie dans le temps comme chez les patients.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 80 un niveau modéré. Une partie subit une chirurgie d'infarctus du myocarde sous anesthésie, avec ischémie cardiaque provoquée, ainsi que des tests de glycémie et des prélèvements de sang à la queue. Le porteur décrit un modèle de suralimentation postnatale reproduisant surpoids et intolérance au glucose, et prévoit d'euthanasier les petits écartés lors de la réduction des portées. Il affirme que le projet, reposant sur des interactions entre organes, ne peut être conduit que sur un "animal entier".

Objectifs

Le surpoids et l’obésité constituent des facteurs de risque majeurs dans l’apparition des maladies cardio-métaboliques, qui touchent aujourd’hui des populations de plus en plus jeunes. Le concept d’origines développementales de la Santé indique que l’environnement nutritionnel périnatal jouerait un rôle clef dans la détermination du phénotype ultérieur de l’individu. Le modèle de suralimentation postnatale (SAPN) est particulièrement pertinent car il rassemble plusieurs des composantes caractéristiques du syndrome métabolique chez l’Homme : il est d’apparition progressive, s’accompagne d’un surpoids, d’une intolérance au glucose et d’une résistance à l’insuline ; la dysfonction cardiaque et la sensibilité cardiaque accrue à l’ischémie sont présentes, et apparaissent à l’âge adulte. Ce modèle original correspond donc à une situation de programmation précoce du risque cardio-métabolique. Les inhibiteurs SGLT2 (ex : dapagliflozine) constituent une nouvelle classe de médicaments ouvrant des perspectives nouvelles en termes de cardioprotection chez le patient diabétique. Les objectifs de ce projet, qui sera conduit sur notre modèle original de syndrome métabolique induit par SAPN, sont les suivants : 1. Déterminer si un traitement chronique par la dapagliflozine peut diminuer l’altération progressive de la fonction contractile cardiaque 2. Evaluer si un traitement par la dapagliflozine peut réduire la survenue d’une insuffisance cardiaque après un infarctus du myocarde expérimental 3. Explorer l’importance de l’environnement inflammatoire paracrine, lié au développement de la graisse péricardique, et l’effet de la dapagliflozine sur cet environnement

Bénéfices attendus

Ce travail permettra de mieux comprendre l’origine des effets cardioprotecteurs de la dapagliflozine dans le contexte du syndrome métabolique et d’accroitre nos connaissances sur les liens entre la graisse péricardique et le cœur. Nous souhaitons confirmer que des perturbations nutritionnelles précoces ont un impact à long terme sur la santé cardiovasculaire et métabolique des individus, et que des mesures de correction thérapeutiques appropriées, même une fois le phénotype « programmé », s’avèrent bénéfiques

Procédures

Une partie des animaux utilisés pour ce projet auront une procédure chirurgicale invasive, c’est-à-dire 60 animaux. La chirurgie dure en moyenne 20 mins, c’est-à-dire que les animaux sont sous anesthésie profonde pendant 20 mins, et les souris se réveillent et sont mobiles seulement 3-4 mins après l’arrêt de l’anesthésie. Une fois réveillées, les souris sont placées en couveuse pendant environ deux heures afin de se remettre pleinement de la chirurgie dans une atmosphère chauffée, ventilée et calme.

Impact sur les animaux

La procédure de mesure de la fonction cardiaque par échocardiographie se fait sous anesthésie par isoflurane, mais peut constituer un stress pour l’animal lié à l’anesthésie générale. Les mesures de sensibilité au glucose et l’insuline sont accompagnées d’une injection intrapéritonéale et de prélèvement de sang à la queue après légère coupure, qui peuvent générer de la douleur ou de l’inconfort chez la souris. Une crème anesthésique locale (Anesderm Gé, 5% Lidocaïne) sera au préalable utilisé sur la queue des souris. La procédure chirurgicale de réalisation d’un infarctus du myocarde expérimental in vivo, réalisé sous anesthésie générale à l’isoflurane, s’accompagne d’ouvertures cutanées au niveau du cou et du thorax (utilisation d’un anesthésique local : Anesderm, Gé, 5% Lidocaïne), de l’espace intercostal, d’une intubation trachéale, et de l’induction d’une ischémie cardiaque. La prise en compte de la douleur péri et post-opératoire est jugulée par l’administration d’un antalgique puissant : la buprénorphine.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin des deux procédures afin de réaliser des prélèvements tissulaires et sanguins pour des analyses biochimiques ultérieures.

Remplacement

Ce projet de recherche, qui repose sur des interactions entre différents organes (tissu adipeux, cerveau, foie, cœur et vaisseaux) ne peut malheureusement être approché par des techniques reposant sur la culture cellulaire. Il nécessite d’être conduit sur un animal entier

Réduction

Ne seront utilisés que le nombre d’animaux strictement nécessaire et suffisant à la conduite du projet et à l’obtention de statistiques suffisantes (utilisation de tests statistiques adaptés aux petits échantillons, ANOVA à un ou deux facteurs). En outre, la gestion de l’élevage permettra de réguler le nombre d’animaux nécessaires à la réalisation du projet et cet élevage s’arrêtera une fois le nombre d’animaux nécessaire obtenus : selon notre expérience dans le modèle de SAPN, le nombre de 10 animaux par groupes est suffisant pour

Raffinement

La reproduction et l’élevage des animaux se feront dans des cages dont le milieu aura été enrichi, dans un environnement calme et non stressant. Le sacrifice des petits non conservés pour réaliser les groupes lors de la réduction des portées se fera par inhalation de CO2 suivie de dislocation cervicale. Les manipulations non douloureuses (pesées, mesure de la pression artérielle) se feront dans des conditions de calme non stressantes. Toutes les procédures chirurgicales seront accompagnées de l’utilisation d’antalgique approprié (buprénorphine injectable) afin d’inhiber la douleur occasionnée. Le suivi post opératoire sera strictement encadré (réveil et maintien en couveuse thermostatée, surveillance) afin de détecter des signes précoces de souffrance (aspect physique externe, non réponses comportementales aux stimuli externes, diminution de la fréquence cardiaque et respiratoire...), qui seront éventuellement traités par une nouvelle administration d’antalgiques. Tout animal dont l’état fonctionnel post opératoire ne s’améliore pas et présente des signes persistants de douleurs sera euthanasié (inhalation de CO2).

Choix des espèces

Les études actuelles poursuivies par le laboratoire PEC2 sur la sensibilité du cœur à l’ischémie et l’infarctus sont réalisées chez la souris. De nombreuses données expérimentales sont déjà à disposition, et le protocole de chirurgie est parfaitement maitrisé dans cette espèce (plus de 3 ans de recul). Ce projet fait suite au projet numéro APAFIS#16589-201809031052199 v2. Les animaux auront 4 mois de vie lors de leur première utilisation. Ce stade de la vie correspond au stade de jeune adulte chez la souris, période à laquelle les maladies cardiovasculaires apparaissent chez l’homme. Ce projet prévoit de suivre ces animaux pendant 4 mois, donc les souris auront 8 mois à la fin des expérimentations, ce qui correspond au stade adulte mature chez la souris.