Procédures sévères

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Trois modèles de myélome leur sont greffés par injection de cellules tumorales, suivie de traitements administrés chaque jour pendant quatre semaines, l'animal étant tué en cas de détresse vitale ou quand la tumeur atteint deux centimètres cubes. Le porteur revendique l'importance de valider ces cibles thérapeutiques "in vivo" pour reconstituer le microenvironnement tumoral. Il affirme que l'utilisation des animaux est "essentielle" pour produire des données précliniques fiables.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de confirmer la pertinence de ces dépendances géniques in vivo. Objectif. Etablir des approches thérapeutiques à partir de modèles précliniques in vivo pour cibler le MM surexprimant MYC. a. Etudier in vivo les stratégies de létalité synthétique dans des modèles murins de xénogreffes de MM surexprimant MYC. b. Etudier in vivo les stratégies thérapeutiques ciblant les dépendances géniques dans le modèle murin transgénique Vk*MYC

Bénéfices attendus

En utilisant le concept de dépendance génomique, nous avons pu prouver l'importance élevée du métabolisme de la glutamine dans les cellules MYC+, que nous étudions en tant que nouvelle stratégie de traitement. Notre travail vise à mettre en évidence la possibilité d'orienter précisément la thérapie vers certains types de cancers grâce à l'identification de leurs vulnérabilités.

Procédures

Trois modèles murins differents seront utilisés: 1-Modèle de xénogreffes chez des souris SCID injectées en intraveineux avec 3.5 millions de cellules des lignées de MM exprimant la luciférase disponibles dans le laboratoire (MM1S luc-GFP). Les souris seront randomisées et le traitement sera débuté après 15 jours de prise de greffe tumoral (Pour le traitment, les souris seront traitées avec le CB839 (200 mg/kg) par voie orale et avec le V9302 (30 mg/kg) par voie intra-péritonéale toutes les 24h, pour 4 semains). 2-Modèle syngénique à partir de souris C57BL/6J injectées en intraveineux avec 3.5 millions des cellules disponibles dans le laboratoire vk*myc, les prises de sang se feront toutes les semaines pour suivre le pic monoclonal. Les souris seront randomisées et le traitement sera débuté après 15 jours de prise de greffe tumoral (Pour le traitment, les souris seront traitées avec le CB839 (200 mg/kg) par voie orale et avec le V9302 (30 mg/kg) par voie intra-péritonéale toutes les 24h, pour 4 semains). 3-Modèle de xénogreffes chez des souris SCID injection sous-cutanée dans le flanc droit de 5millions cellules U266-CT ou U266-MYC dans du Matrigel. Le traitement sera débuté après 15 jours de prise de greffe tumoral (Pour le traitment, les souris seront traitées avec le CB839 (200 mg/kg) par voie orale et avec le V9302 (30 mg/kg) par voie intra-péritonéale toutes les 24h, pour 4 semains).

Impact sur les animaux

Les toxicités: Concernant le CB839 et V9302, aucune toxicité grave n’a été observée aux doses maximales possibles (limitées par la solubilité et par le volume). CB-839 est maintenant en Phase 1 des essais cliniques. Les poids corporels des souris sera surveillé pour identifier une éventuelle toxicité pendant le traitement ce qui peut indiquer la tolérablilité de cette combinaison

Devenir

Les souris sont sacrifiées par inhalation de CO2 pendant 5 minutes, suivi d’une dislocation cervicale. Les souris sont sacrifiées en cas de signe de souffrance ou de détresse vitale et en cas de volume tumorale atteignant 2cm3

Remplacement

L'utilisation des animaux dans cette étude est essentielle afin de valider l'efficacité de thérapies ciblées sur des tumeurs de myélome surexprimant MYC. Cette étape de validation in vivo est déterminante afin de produire des données pré-cliniques fiables, avec la reconstitution du microenvironnement tumoral, y compris du système immunitaire interagissant avec les cellules tumorales. Ces données pourraient permettre de développer par la suite des essais cliniques de phase précoce.

Réduction

A fin de respecter le principe de réduction, les experiences ont été conçues afin de coordoner plusieur paramètres d'analyse à partir d'expériences individuelles et permettent une analyse longitudinale. Cela réduit la nombre total d'animaux requis. De plus, si les premiers résultats obtenus sont statistiquement signifiatifs et suffisamment homogènes, le nombre d'animaux et de répétitions d'expérimentations sera diminue. Des groupes de 7 souris seront étudiés, permettant une puissance de 80% en projetant une différence de 1.5 déviation standard en utilisant un t test avec un risque alpha de 0.05. Chaque groupe sera exposé à des traitements en combinaisons de différents inhibiteurs d’intérêt ou aux inhibiteurs seuls ou à du DMSO

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans des conditions standards et auront une période d'acclimatation dans l'animalerie de 7 jours avant toute manipulation. Ils seront manipulés tous les jours avec douceur et calme par du personnel expérimenté. Les signes de souffrances seront activement recherchés. Lors des procédures (injections IP, SC ou mesure du volume tumoral), les souris seront maintenus sous anesthésie par inhalation d'isoflurane (2% d'isoflurane) afin de les maintenir immobile et d'empêcher l'angoisse des animaux. Concernant le CB839 et V9302, aucune toxicité grave n’a été observée aux doses maximales possibles (limitées par la solubilité et par le volume) et CB-839 est maintenant en Phase 1 des essais cliniques. Les poids corporels seront surveillés pour l’indication de toxicité pendant le traitement ce qui peut indiquer la tolérablilité de cette combinaison.

Choix des espèces

Les modèles murins sont adaptés aux lignées cellulaires utilisées dans le myélome multiple et permettant de générer les données in vitro. Deux modèles sont utilisés dans ce projet, un modèle de xénogreffe à partir des souris génétiquement modifiées SCID, injectées avec les lignées cellulaires MM.1S luc/GFP et U266. Ces deux lignées cellulaires sont des lignées de référence dans le myélome multiple. Afin de valider les données du modèle de xénogreffe, un modèle syngénique sera utilisé avec des souris BL6 injectées avec la lignée cellulaire murine Vk*MYC. Ce modèle permet une analyse de l’efficacité des thérapeutiques dans un contexte immunocompétent, plus représentatif des conditions biologiques humaines. La pertinence de ces modèles de xénogreffe et syngénique a été démontré dans de nombreuses études pré-cliniques, ce qui en fait le modèle de choix des analyses in vivo. Les souris SCID et C57BL/6J seront injectées entre 6 et 8 semaines d'âge, ce qui coorespond au modèles les plus fréquemments utilisés dans la litérature.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées comme impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par chirurgie un capteur enregistrant l'activité musculaire, puis sont maintenues trente jours dans un dispositif simulant l'absence de gravité par suspension, avant d'être tuées par injection létale. Le porteur présente ce modèle comme "indispensable" pour préparer les vols spatiaux vers Mars et le décrit comme maîtrisé depuis vingt-cinq ans. Il minimise les atteintes, évoquant une perte de poids inférieure à 15 % et une "angoisse modérée de courte durée", alors que la procédure est elle-même déclarée sévère.

Objectifs

L'envoi d'animaux dans les véhicules spatiaux est indispensable pour mieux comprendre les effets de l'absence de gravité sur l'organisme. Cette connaissance est le préalable obligatoire à un voyage de plusieurs années sur Mars. Afin de bien préparer ces vols spatiaux, nous utilisons un modèle animal mimant les effets de l'absence de gravité (Hypodynamie-hypokinésie ou HH).

Bénéfices attendus

Le projet s’inscrit dans le cadre de l’étude du système musculaire squelettique et ses altérations lors de situations de dysfonctionnement ou de non-utilisation. Parmi les critères permettant de déceler les altérations musculaires, l’étude de l’activité électromyographique (EMG) peut fournir des indications précieuses sur le bon fonctionnement ou non du muscle squelettique. Notre projet consiste à affiner une technique d’enregistrement de l’EMG par télémétrie chez la souris en condition de non-utilisation (HH) .

Procédures

Les animaux seront équipés par voie chirurgicale d'un capteur télémétrique permettant d'enregistrer l'électromyogramme, caractéristique de l'activité électrique musculaire. La méthode télémétrique permettra d’enregistrer en continu (pendant 30 jours) à la fois l'électromyogramme et la température chez un animal vigile, non contraint et dans son environnement habituel. Après l’implantation des capteurs (opération d’1h maximum, anesthésie comprise) et le suivi post-opératoire (d'une durée de 24h), les animaux ne sont plus soumis à aucune manœuvre susceptible d’induire de la souffrance ou de la douleur.

Impact sur les animaux

Seule la procédure de simulation de microgravité peut engendrer quelques nuisances. Cette procédure est appliquée depuis 25 ans dans notre laboratoire et elle est bien maîtrisée. Nous surveillons chaque jour la prise alimentaire et la prise de boisson pendant les 30 jours de la procédure. Les souris sont pesées tous les 2 jours en début de procédure puis tous les 3 jours pendant la suite de restriction sensorimotrice. On observe une perte de poids les 2-3 premiers jours du fait d’une angoisse modérée de courte durée, mais elle est

Devenir

Les animaux du lot "contrôles" et HH seront euthanasiés en fin de protocole (après 40 jours d'enregistrement) par injection létale de produit anesthésiant (doléthal, ip, 180 mg.kg-1) par voie intrapéritonéale.

Remplacement

il s'agit d'un projet portant sur l'inactivté physique et ses effets sur les propriétés éléctriques musculaires. Un tel projet ne peut etre mené avec des méthodes alternatives in vitro ou in silico.

Réduction

l'ensemble des procédures expérimentales nécessaires à l'accomplissement de ces études requiert un nombre total de 80 souris. Le nombre d'animaux a été réduit au maximum tout en permettant l'obtention derésultats satisfaisants (différences statistiquement observables entre les animaux traités et les animaux contrôles).

Raffinement

dans tous les cas, l'ensemble des procédures expérimentales seront réalisées en limitant au maximum (durée et intensité) toute douleur et/ou stress pour les animaux, et en étant particulièrement vigilant sur les points limites.

Choix des espèces

Ces travaux viennent en prolongement d’études réalisées depuis plusieurs années au laboratoire. Afin de pouvoir comparer les résultats avec les études antérieures, il est important de conserver la même espèce animale, à savoir la souris. La souche mutante choisie, la C57BL/6J, est un modèle polyvalent utilisé dans de nombreux domaines d’application. Les fournisseurs standardisent l’élevage de cette souche en conformité avec les procédures d’élevage et le programme de qualité génétique de The Jackson Laboratory, ce qui nous permet de travailler avec les mêmes animaux que nos collègues russes qui organisent le vol spatial. Arrivée des animaux à l’animalerie à 8 semaines. Après 1 semaine d’acclimatation, les implantations auront lieu à 9 semaines d’âge, ce qui constitue un état stable mature de développement (âge adulte).

218 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Porteuses d'une mutation reproduisant la progéria, elles reçoivent un composé par gavage cinq à sept jours par semaine pendant quatre semaines, pour évaluer un candidat médicament contre l'atteinte cardiaque de cette maladie. Le porteur décrit un phénotype dommageable, avec un poids dépassant rarement 15 à 17 grammes, une survie moyenne d'environ 117 jours, des anomalies du squelette et de la peau et des troubles cardiaques souvent mortels. Il affirme que ce modèle murin est le "seul" modèle mammifère reproduisant fidèlement la maladie humaine.

Objectifs

Le syndrome de Hutchinson-Gilford (HGPS), ou Progéria, est une maladie génétique rare conduisant à un vieillissement prématuré. Les enfants atteints par cette pathologie présentent des atteintes sévères du système cardiovasculaire responsables d’une mortalité précoce par infarctus du myocarde ou accident vasculaire cérébral vers l’âge de 13 ans. Cette pathologie est due à une mutation hétérozygote d'un gène conduisant à la production d’une protéine toxique. A l’heure actuelle, aucun traitement n’est disponible. Pour réfléchir à de nouvelles pistes thérapeutiques, nous nous sommes intéressés aux liens entre l’accumulation de la protéine toxique et la survenue de l’atteinte du système cardiovasculaire conduisant au décès prématuré des enfants. Nos travaux récents ont en particulier permis de démontrer que l’accumulation de cette protéine conduit à d’autres anomalies cellulaires qu’on a réussi à restaurer grâce à une molécule antivirale et antinéoplasique (anticancéreux) testée sur des cellules de souris mutantes de notre gène d’intérêt. De plus avant de réaliser des tests d’efficacité in vivo et d’envisager un essai thérapeutique sur les patients, nous avons évalué dans une étude précédente, la tolérance à cette molécule et défini les doses maximales tolérées sur des souris du même fond génétique que notre modèle de souris mutantes. Notre projet a donc pour but d’évaluer l’effet de notre molécule sur la survenue des troubles cardiaques observés dans la Progéria et de comparer ses effets à une autre molécule de référence. .

Bénéfices attendus

Il n’existe à ce jour aucun traitement de la progeria et les enfants décèdent très jeunes d’une atteinte vasculaire. Plusieurs études ont clairement établi que la perte des cellules des vaisseaux sanguins induite par l'accumulation de la protéine toxique est l’un des facteurs majeur déclenchant le décès prématuré. Toute molécule capable de ralentir voire stopper la mort de ces cellules sera donc d’un grand bénéfice pour les patients. Enfin, nous avons choisi de réaliser ces tests en administrant les molécules par voie orale car il s’agit d’un mode d’administration peu invasif et compatible avec un transfert vers un essai thérapeutique sur des enfants.

Procédures

maintien d’une lignée à phénotype sévère, gavage (5X/semaine, sur une durée de 4 semaines pour 2 groupes, 7x/semaine sur une durée de 4 semaines pour un groupe): chaque gavage dure moins d'une minute pour une souris. mise à mort par prélèvement intracardiaque, la durée est de 5 min par souris.

Impact sur les animaux

Le phénotype du modèle animal utilisé est considéré comme dommageable. En effet, il présente de nombreux signes cliniques retrouvés dans la pathologie humaine. Les souris homozygotes pour la mutation, présentent un décrochage dans les courbes de poids, avec des poids ne dépassant que très rarement 17g pour les males et 15g pour les femelles. La lignée est également caractérisée par une mortalité prématurée. En effet, la moyenne de survie basée sur l’ensemble des 7 publications utilisant ce modèle et présentant ce type d’étude est de 117 jours, soit 16,5 semaines environ. Enfin, des anomalies squelettiques sont également à noter, comme une lordokyphose, ou des anomalies cutanées avec un pelage pouvant devenir épars. Enfin, des problèmes cardiaques importants sont souvent responsables de la mort prématurée de ces souris.

Devenir

les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever les tissus en vue d'analyse post-mortem

Remplacement

Cette étude a pour but d’évaluer les propriétés thérapeutiques d’un antiviral/anticancéreux sur l’atteinte cardiaque observée chez les patients Progeria. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle vivant. Notre modèle de souris mutantes est le seul modèle mammifère disponible à ce jour reproduisant fidèlement les anomalies observées chez les patients HGPS. Elle permet donc de réaliser des essais précliniques et d’obtenir des preuves de principe d’efficacité thérapeutique en vue d’une mise en œuvre d’essais thérapeutiques chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux a été limité au minimum nécessaire pour obtenir des résultats d’efficacité et de pharmacocinétique interprétables. Dans cette étude, nous comparerons troix groupes de souris mutantes, à savoir des souris traitées avec notre molécule à tester, des souris traités avec une molécule de référence et des souris traitées avec une solution sans molécule active. Chaque groupe sera composé de 5 souris males et 5 souris femelles. Nous avons évalué le nombre de souris nécessaires pour pouvoir valider de façon statistique l’hypothèse que l’effet du traitement entre les groupes n’est pas nul. En fonction de ces paramètres, 10 souris par groupe seront nécessaires pour faire face à une perte éventuelle de 10% des souris au cours de l’essai.

Raffinement

Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance de l'animal. Afin de maintenir un état nutritionnel correct, nous utiliserons, si nécessaire, une alimentation sous forme de gels, facile à ingérer par les souris. En cas de signe de souffrance, le personnel qualifié et le vétérinaire pourront décider de l'arrêt de l'expérimentation et de l'euthanasie de l'animal.

Choix des espèces

Le génome de notre modèle de souris reproduit exactement la même séquence génomique humaine, il a fait l’objet d’une étude poussée et reproduit les anomalies phénotypiques et moléculaires du HGPS. C’est donc le modèle le plus pertinent pour évaluer l’effet de nouveaux médicaments pour ce syndrome. Les animaux seront traités à partir de l'age de 4 semaines, avant que la pathologie ne se développe, jusqu'à l'age de 8 semaines, afin d'analyser les effets de notre molécule sur les troubles vasculaires.

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par voie nasale, sous anesthésie, une bactérie responsable de pneumonie grave, puis leur survie est suivie pendant sept jours pour tester l'effet protecteur d'un probiotique. Le porteur indique que les souris infectées sans protection peuvent perdre du poids et présenter douleurs, mobilité réduite voire inactivité, une analgésie étant administrée en cas de douleur effective. Il affirme ne pas pouvoir répondre à la question par des cultures cellulaires et conserve donc le modèle animal.

Objectifs

Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie responsable d’infection pulmonaire grave chez les patients atteints de mucoviscidose et chez les patients en réanimation. Cette bactérie, au gré de successives antibiothérapies, devient résistante à tous les antibiotiques habituellement utilisés. Aussi il est capital de rechercher des alternatives thérapeutiques aux antibiotiques comme les probiotiques. Les probiotiques sont des microorganismes qui, administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l’hôte. Lors d’une étude précédente, l’analyse du microbiote respiratoire de patients atteints de mucoviscidose a permis de mettre en évidence un genre bactérien particulier : Porphyromonas. Ce genre bactérien et plus particulièrement Porphyromonas cationae (PC) semble être prédictif de l’infection à PA. Il a été montré chez ces patients, que ceux qui avaient moins de Porphyromonas dans les poumons, avaient plus de risque de se coloniser à PA. Par la suite, il a également été montré que la quantité de PC pulmonaire venait à diminuer, voire disparaître, préalablement à la colonisation à PA alors que PC restait stable chez les patients non colonisés. Précédemment, nous avons testé une souche clinique de Porphyromonas catoniae isolée de patients atteints de mucoviscidose qui semblerait plus efficaces in vivo. Nous avons réalisés 2 expérimentations indépendantes qui ont permis de valider l’effet bénéfique observée ; (réduction significative de la quantité de Pseudomonas aeruginosa à 24h post infection) avec la souche clinique de Porphyromonas catoniae. Nous souhaitons donc poursuivre ces expérimentations afin d’évaluer la survie à l’infection, en complément des diminutions de charge bactérienne, avec un modèle murin d’infection pulmonaire à PA avec ou sans prophylaxie à PC.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra de recueillir des données sur l’intérêt de l’utilisation de souches cliniques de Porphyromonas comme potentiels bactéries bénéfiques (probiotiques) à visée anti-Pseudomonas aeruginosa, pathogène clé de plusieurs pathologies respiratoires humaines dont la mucoviscidose.

Procédures

Les animaux recevront deux suspensions bactériennes par instillation nasale à 18h d’écart sous anesthésie gazeuse, La durée de chaque instillation dure moins d'une minute. A la suite de quoi, une courbe de survie sera réalisée sur 7 jours.

Impact sur les animaux

L’installation intranasale de bactérie peut induire un stress chez les animaux. L’utilisation d’anesthésie gazeuse lors de l’instillation permet de diminuer significativement le stress chez les animaux, par ailleurs un geste maitrisé par l’expérimentateur, une surveillance accrue (deux fois par jour minimum) des animaux avec un score validé par une publication et l’administration d’un antalgique en cas de dégradation de l’état des animaux permettent également une diminution de ces effets. Lors de la réalisation de la courbe de survie, le groupe témoin recevant seulement PA peut être sujet à une perte de poids, des douleurs, une mobilité réduite voire, une inactivité. Ces derniers seront gérés en accord avec le score choisi, induisant une antalgie en cas de douleur effective. Pour les groupes essais et témoin PC recevant du Porphyromonas, aucun effet indésirable n’est attendu au vu des expérimentations précédentes.

Devenir

A l'issue de la procédure, toutes les souris seront mises à mort afin d'analyser les différents groupes, réaliser les courbes de survie et procéder aux tests statistiques permettant de démontrer le bénéfice thérapeutique d'une proxylaxie par Porphyromonas lors d'une infection à Pseudomonas aeruginosa.

Remplacement

Compte tenu des résultats obtenus in vitro montrant une réduction de la quantité de Pseudomonas aeruginosa souche PAO1 (PAO1) en présence de Porphyromonas cliniques ainsi que les premiers résultats positifs in vivo pour la souche clinique, nous souhaitons poursuivre sur cette voie en confirmant la capacité protectrice de Porphyromonas, ainsi qu’évaluer sa persistance dans le poumon après instillation. Nous ne pouvons pas répondre à cette question scientifique en utilisant des outils de culture cellulaire et tissulaire (culture in vitro et ex vivo), nous choisissons donc de conserver le modèle animal.

Réduction

L’analyse de la survie sera réalisée par comparaison du pourcentage de survie au 7eme jour. Dans l’hypothèse d’une mortalité de 100% dans le groupe des souris infectées par Pseudomonas aeruginosa (souche PA01) et d’une mortalité de 60% dans le groupe des souris ayant reçu une administration prophylactique de Porphyromonas cationae clinique (PC 103) et infectées par PA01 (Groupe PC 103+PA 01) ; le nombre de souris nécessaire par groupe est de 20 souris (risque alpha=0.05, puissance du test 1-béta=90%) Afin de réduire le nombre d’animaux, nous choisissons de limiter le groupe contrôle (Sérum physiologique) à 10 souris car nous n’attendons pas de mortalités Le nombre total de souris sera donc de (3*20) + (1*10) soit 70 souris. Par ailleurs, nous nous limitons à une seule souche de Porphyromonas (P. catoniae ou PC) alors que plusieurs espèces sont décrites dans le poumon. La souche PC103 utilisée lors de ce projet a été préalablement sélectionnée parmi les 7 autres souches cliniques isolées lors d’une précédente étude menée au laboratoire. PC103 a été sélectionnée sur sa capacité à réduire in vitro la croissance de PAO1, sa production d’acides gras à chaines courtes, et son action sur des macrophages, également in vitro.

Raffinement

Avant toutes instillation intranasale, les animaux seront préalablement anesthésiés (isoflurane gazeux), une analgésie est mise en place en cas de dépassement du score M-CASS 11 (de la buprénorphine pour réduire la douleur). Une mise à mort par CO2 sera pratiquée en cas de besoin au cours du suivi ou à la fin du protocole pour les animaux ayant survécus. De plus, les points limites seront monitorés régulièrement afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux.

Choix des espèces

Les souris C57BL6/J ont été choisies, car leur sensibilité à P. aeruginosa permet de provoquer une pneumonie tout en évitant une mortalité trop importante. Par ailleurs ce modèle a déjà été étudié au sein de notre équipe de recherche à plusieurs reprises. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 8 semaines, car c’est l’âge des souris du même modèle retrouvé dans la littérature. C’est également l’âge des souris utilisées dans de précédentes expérimentations réalisées dans notre équipe, ce qui nous permettra de conserver le même modèle d’étude pour l’interprétation de nos résultats. Les animaux seront utilisés après 1 semaine d’acclimatation à l’animalerie.

288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour le prélèvement de leurs organes. Une ligature et une ponction du cæcum leur provoquent un choc septique : 178 sont tuées dix-huit heures plus tard, après une échographie cardiaque et la pose d'un cathéter dans la carotide sous anesthésie, et 110 sont suivies cinq jours dans une étude de survie, sauf mise à mort anticipée au point limite. Le projet évalue si agir sur un récepteur des vaisseaux, le récepteur β3-adrénergique, améliorerait la fonction vasculaire des patients en choc septique. Une partie des souris est dépourvue du récepteur β1, une lignée rare que le porteur dit avantageuse puisque "les animaux sont déjà connus des expérimentateurs".

Objectifs

Le choc septique est défini comme la forme la plus sévère d’une infection caractérisée par une dysfonction multiple d’organes pouvant conduire au décès du patient. Le choc septique est un problème majeur de santé publique, responsable de 15% des admissions et de 40% de mortalité en réanimation. Le choc septique est associé à une dysfonction du système cardiovasculaire et immunitaire. En effet, afin de combattre l’infection, l’organisme active une série de phénomènes au niveau vasculaire notamment pour permettre l’arrivée des globules blancs sur le site inflammatoire. L’activation excessive de ces mécanismes conduit entre autre à un phénomène d’hypotension (chute de la pression dans les vaisseaux) menant à un défaut d'apport en oxygène aux organes. La présence des récepteurs β3-adrénergiques (β3-ARs) au niveau vasculaire, dont la concentration croît durant une infection (inversement aux β1, β2-ARs), pourrait jouer un rôle dans l'hypotension. La vasodilatation excessive, responsable de l'hypotension, est contrée par l’organisme grâce à une modulation de la vitesse et de la force de contraction du cœur. L'utilisation de ligands β-adrénergiques, des β1-bloquants, permet ainsi de moduler la fonction cardiovasculaire dérégulée pendant l’état de choc septique via le système nerveux. En effet, il a été prouvé que l’administration de β1-bloquants lors du choc septique améliorait expérimentalement la réactivité vasculaire à un vasoconstricteur de vaisseaux de gros et petits calibres. Parallèlement, la quantité de sang éjectée par le cœur, était améliorée alors que les animaux présentaient la même fonction cardiaque et le même volume de fluide perfusé témoignant peut-être d’une moindre fuite liquidienne au niveau vasculaire induite par le choc septique. Les β1-ARs étant très peu présents dans les vaisseaux, notre hypothèse est que, durant le choc septique, la modulation des β3-ARs au niveau vasculaire modifie la vasoréactivité. L'hypothèse de ce travail est qu'en agissant sur les β3-ARs, les fonctions vasculaires et cardiaques des patients septiques pourraient être améliorées.

Bénéfices attendus

En mettant en évidence un effet de la modulation des β3-ARs sur la perte de la vasoréactivité dans le choc septique, il est attendu un bénéfice sur la prise en charge clinique du choc septique. En effet, un traitement modulant les β3-ARs pourrait améliorer la chute de la contraction vasculaire et diminuer la vasodilatation excessive conduisant à l’hypotension lors du choc septique.

Procédures

Les animaux (n=288) seront soumis à une procédure chirurgicale, la ligature et ponction caecale, de type sévère conduisant à un état de choc septique. C’est 18 heures après cette intervention que les analyses in vivo et ex vivo (procédure 2) débuteront pour les animaux de la première série (n=178). Les animaux de la première série seront soumis à une évaluation hémodynamique par échocardiographie pendant 15 minutes et par l'implantation d'un cathéter carotidien pour une durée d'environ 15 minutes sous anesthésie. La mise à mort des animaux sera effectuée à la fin de la procédure de cathétérisme carotidien et permettra le prélèvement des organes et du sang permettant les analyses ex vivo (myographie, rapport poids humide/sec pulmonaire) et biochimiques. Les animaux de la deuxième série (n=110) traités pendant 24 heures seront soumis à une étude de survie sur 5 jours.

Impact sur les animaux

La ligature et ponction caecale, notre modèle, est une procédure chirurgicale sévère qui induit un choc septique chez l'animal. Cette procédure va induire une douleur chez l'animal qui sera traitée grâce à l'administration d'un analgésique, la buprénorphine à la posologie de 0,2mg/kg une heure avant la chirurgie, 3 heures après la chirurgie puis 1 fois/jour. Le stress et la douleur engendrés chez les animaux de la première série sont limités dans le temps avec des analyses in vivo et des prélèvements suite à la mise à mort 18h après la chirurgie. Une observation de l'état général des animaux de la deuxième série sera réalisée chaque jour et dans le cas où un point limite est atteint, la mise à mort de l'animal pourra être décidée.

Devenir

Tous les animaux (178) de la première série seront mis à mort après la pose de cathéter carotidien (procédure 2) analysant la pression artérielle. Tous les animaux de la deuxième série (n=110) seront mis à mort à la fin de l'étude de survie soit 5 jours après la chirurgie ou seront mis à mort avant le cinquième jour dans le cas où un point limite est atteint. Tous ces animaux seront mis à mort pour prélévement d'organes.

Remplacement

Tout d'abord, ce modèle est choisi par rapport à sa proximité avec les situations cliniques humaines. En effet, on ne peut pas modéliser le choc septique avec d’autres types de modèles, par exemple in vitro, puisqu’on étudie plusieurs fonctions biologiques et leurs interactions : fonction cardiaque, fonction vasculaire, et le métabolisme. De plus, il n’existe pour l’heure nulle autre expérimentation que le modèle animal afin de remplacer l’utilisation des souris pour les procédures expérimentales prévues dans ce projet (ligature et ponction caecale, échocardiographie, cathéter carotidien). Enfin, ce modèle est le plus utilisé dans la littérature (modèle de choc septique multi-microbiens) et il est maîtrisé par le laboratoire.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, les mâles et les femelles seront utilisés. Dix animaux par groupe sont nécessaires afin de ne pas compromettre les objectifs du projet et de pouvoir réaliser de bonnes analyses statistiques.

Raffinement

Pour le raffinement, les animaux ne seront pas manipulés dans la même pièce que celle où ils sont hébergés. Les souris sont hébergées à 5 maximum par cages individuellement ventilées de 500 cm². Elles auront de l'eau et de la nourriture à volonté. L’enrichissement du milieu se fera avec des petits abris, des tunnels, du sizzle pad ou des bâtons à ronger. Les gestes chirurgicaux sont maîtrisés par le personnel de l’étude permettant ainsi une manipulation plus rapide conduisant à un réveil et à une récupération plus rapide en post-opératoire. Plusieurs types de mesures seront effectués sur un même animal en traitant la douleur induite par injection sous-cutanée d’analgésique (buprénorphine) une heure avant, 3 heures après la chirurgie puis 1 fois par jour. Les chirurgies se feront sous anesthésie gazeuse (isoflurane). Enfin, la durée de l’étude est courte (18 heures) pour la première série d'animaux en post-opératoire afin de limiter les souffrances. Une observation des animaux de la deuxième série sera réalisée chaque jour, et dans le cas où un point limite est atteint la mise à mort pourra être décidée.

Choix des espèces

La souris C57BL/6 est une espèce fréquemment retrouvée dans la littérature sur le choc septique. Nos résultats seront ainsi plus facilement comparables avec la littérature. Le modèle animal dont nous avons accès au laboratoire est un modèle de souris rare KO pour le β1-AR, ce qui est un avantage pour les expérimentations puisque les animaux sont déjà connus des expérimentateurs. Les évaluations hémodynamiques, vasculaires et inflammatoires de ces souris KO pour le β1-AR subissant la CLP ou non permettront de mettre en évidence des effets modulatoires des β3-ARs en l’absence du β1-AR. Des souris de 20g-30g seront utilisées pour comparer avec les autres résultats dans la littérature, qui utilisent cette gamme de poids. Ces souris auront entre 12 et 16 semaines et les mâles et les femelles seront utilisés. Ce stade de développement a également été utilisé précédemment dans nos études.

Conditionnées par chimiothérapie à l'hydroxyurée ou au busulfan, ou par irradiation, puis greffées de cellules humaines de myélome dans le fémur ou dans une veine, 664 souris sévèrement immunodéprimées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. À partir de la deuxième semaine après la greffe, elles subissent une prise de sang chaque semaine et des séances d'imagerie par bioluminescence, et reçoivent par voie intraveineuse ou par gavage des inhibiteurs de la protéine PIM2 ou une thérapie par ARN. Le cancer peut provoquer perte de poids, léthargie et dos courbé, selon le porteur. Chaque souris passe jusqu'à douze mois en expérimentation, gardée en vie pour la procédure suivante ou tuée.

Objectifs

Le myélome multiple (MM) est un cancer du sang (hémopathies) parmi les plus fréquents, en deuxième position après les lymphomes. Il représente 1% de la totalité des cancers et environ 10% des hémopathies. Malgré l’apparition de nouveaux traitements, le MM reste aujourd’hui une maladie incurable avec une médiane de survie moyenne à 6 ans (Rapport InVS 2018). Des travaux ont montré que la surexpression de la proteine PIM2 dans les cellules tumorales du MM était associée à une maladie plus agressive et à une survie réduite pour les patients. Le ciblage thérapeutique de la protéine PIM2 ouvre donc de nouvelles perspectives thérapeutiques dans cette maladie. Des tests in vitro ont été réalisés au sein du laboratoire montrant l’efficacité de molécules pour inhiber la protéine PIM2 dans les cellules de MM et induire la mort des cellules. L'expérimentation animale est cependant rendue indispensable du fait de l'impossibilité de reproduire le microenvironnement tumoral in vitro et de mener ce type d'exploration directement chez l'Homme. Notre projet a pour objectif d’utiliser un modèle murin de xénogreffe de lignées de MM pour tester différentes molécules ciblant la protéine PIM2. Les traitements que nous voulons tester sont d’une part des inhibiteurs chimiques de la protéine PIM2 (utilisés seuls ou en association avec d'autres inhibiteurs) et, d’autre part, une thérapie de type ARN qui inhibe le gène PIM2. Globalement, ce projet consiste à implanter, chez des souris immunodéprimées, des cellules de lignées de myélome multiple (MM) humaines dans le but de pouvoir étudier la progression tumorale après injection de molécules à visée thérapeutique dans le MM.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’établir de nouveaux modèles murins de myélome pertinents pour reproduire la pathologie humaine et pour tester de nouvelles thérapeutiques dans le MM. La première étape permettra de déterminer les meilleures conditions d’implantation des cellules de MM chez une souris immunodéficiente avec une prise de greffe permettant un développement tumoral durable, et la deuxième étape caractérisera précisement la progression et dissémination tumorale dans les conditions définies comme optimales à l’étape 1. Enfin, grâce à ces étapes d'optimisation, nous pourrons évaluer à l’étape 3, l'impact de traitement inhibant la protéine PIM2 sur la progression tumorale. Nous testerons deux nouvelles possibilités de traitement ciblant cette protéine, soit au moyen d'association d'inhibiteurs chimiques, soit au moyen d'une thérapie ARN originale, toutes deux jamais testés à ce jour dans le MM. Ces stratégies thérapeutiques pourraient trouver leur place dans la prise en charge des patients atteints de MM.

Procédures

Pour obtenir des modèles murins fiables et robustes des myélomes humains, les souris devront recevoir un conditionnement (traitement chimique par hydroxyurée ou busulfan, ou irradiation) puis une greffe de cellules tumorales humaines dans un site reproduisant au mieux la pathologie humaine (dans la moelle par voie intra-fémorale ou à défaut, dans le sang par voie intraveineuse). Les traitements évalués seront administrés soit par voie intraveineuse soit par gavage. Enfin dans le cadre du suivi de ces animaux greffés, des prélèvements de sang hebdomadaires à partir de la 2eme semaine post-greffe seront réalisés ainsi que des analyses par imagerie bioluminescence (méthode non invasive) dès l'étape 2, au plus tôt une semaine après la greffe et au maximum une fois par semaine.

Impact sur les animaux

Le maintien de ces souris en hébergement protégé permettra de prévenir tous les risques d’infection. Egalement le développement tumoral peut engendrer un affaiblissement de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter l'apparition de signes de myélome (perte de poids, léthargie, dos courbé...).

Devenir

A l'issue de chaque procédure, chaque souris sera gardé en vie afiin de subir la procédure suivante ou sera euthanasiée.

Remplacement

Le projet est basé sur des études préliminaires in vitro ayant démontrées l'efficacité de nos différentes molécules (inhibiteurs chimiques et oligonucléotide) pour induire la mort des cellules de MM (cellules de lignées de MM et cellules primaires de patients atteints de MM). Le microenvironnement tumoral ne peut être reproduit in vitro du fait de sa complexité, de nombreux acteurs impliqués dans le développement tumoral et la résistance aux traitements. Il est par ailleurs impossible de conduire ce type d’expérimentation chez l’Homme rendant indispensable le recours à des modèles murins.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Aussi, avant de mener les expérimentations à visée thérapeutique nécessitant des lots d’animaux importants (10 animaux par lots), les choix des conditions expérimentales seront étudiés en amont sur des lots réduits mais suffisants (6 animaux par lots) afin de trouver la technique la plus optimale en termes de prise de greffe : choix du type de souris (NSG, RagGC ou BRGS), du type de conditionnement (hydroxyurée, busulfan ou irradiation) et enfin du type d’injection (intra-veineuse ou intra-fémorale). Des combinaisons de conditions vont être testées successivement à l'étape 1 (en commençant par les plus relevantes au regard de notre expérience) et si une s'avère pertinente et validée, nous ne testerons pas les autres. Les tailles des groupes de souris sont choisies de façon à permettre une interprétation des données statistiquement valides, que l’expérimentation soit donc réalisée de façon productive et sans nécessiter d’avoir à refaire ces tests. Les statistiques seront réalisées à l’aide de tests non paramétriques car la normalité de la loi sur la population considérée n'est pas certaine. Pour les échantillons indépendants, le test de Mann-Whitney sera appliqué. Pour les échantillons appariés, le test de Wilcoxon sera utilisé. Pour les comparaisons de plus de 2 groupes, les tests non-paramétriques de Kruskal-Wallis (pour les échantillons indépendants) ou de Friedman (pour les échantillons appariés) seront utilisés avec le test de comparaison multiple de Dunn pour comparer chaque groupe par rapport à un groupe contrôle.

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Également, aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Enfin, au cours de nos expérimentations, la caractérisation précise de la propagation/dissémination des cellules de MM dans l’organisme murins au cours du temps sera fait par bioluminescence ; technique non invasive, sans aucun prélèvement, et sans sacrifice des animaux en cours d'expérimentation.

Choix des espèces

Seul un modèle à l'échelle d'un organisme vivant peut reproduire la complexité des interactions entre les cellules tumorales et les cellules du microenvironnement et permet d'être au plus près de l'effet obtenu chez l'homme lors du test de nouvelles thérapeutiques. Les souris sont de bons modèles d'étude, notamment pour évaluer l’efficacité de traitements anti-tumoraux, de par leurs facilitées d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leur similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines chez la souris nécessite l’utilisation de souris sévèrement immunodéprimées pour permettre la prise tumorale. Plusieurs lignées murines sont parfaitement adaptées à ce type de greffes, notamment les RagGC (RAG2-/- IL2 gammaC-/-), les NSG (NOD SCID IL2gammaC-/-) ainsi que les BRGS (BALB/c RAG2-/- IL2gammaC-/- SIRPA.NOD) que nous testerons à l’étape 1. L’espèce avec laquelle nous obtenons la meilleure prise de greffe sera alors utilisée pour l’ensemble des expérimentations aux étapes 2 et 3. L’expérimentation sera commencée sur des animaux à partir de 6 semaines jusqu'à 5 mois de vie. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 12 mois.