Procédures sévères

60 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque rat reçoit un cathéter dans la veine jugulaire, puis subit une plongée hyperbare simulée reproduisant un accident de décompression, suivie d'une heure d'observation des symptômes pouvant aller jusqu'à la paralysie ou la convulsion, seule cette dernière déclenchant un arrêt anticipé. Les survivants sont ensuite mis à mort pour analyses. Le porteur affirme que les expérimentations induisant un accident de décompression ne sont envisageables que chez l'animal et que le remplacement n'est pas possible.

Objectifs

L’accident de décompression (ADD) représente le risque le plus grave chez les plongeurs subaquatiques professionnels et de loisir, mais concerne aussi toutes les personnes soumises à des modifications de la pression ambiante (patients et personnels des chambres hyperbares, pilotes, astronautes, ouvriers tunneliers…). Ses manifestations vont de la simple démangeaison jusqu’à la paralysie définitive ou, à l’extrême, au décès. Or, environ un tiers des personnes accidentées conserve des séquelles invalidantes malgré les traitements actuels. Il est donc nécessaire d’améliorer l’efficacité du traitement de cette pathologie. L’administration intraveineuse de solutions de perfluorocarbone (PFC) a montré son efficacité chez des modèles animaux (rongeurs et miniporcs). Ce transporteur d’oxygène est potentiellement efficace dans le traitement de nombreuses pathologies dont l’ADD. L’encapsulation du PFC dans des nanocapsules d’albumine offre des perspectives prometteuses. Ces préparations présentent une faible toxicité autorisant des applications thérapeutiques ; de plus, l’enveloppe d’albumine, soluble à la fois dans l’eau et les lipides, ne provoque pas de réaction immunitaire ; Enfin, ces capsules sont stables en solution et peuvent être administrées par voie intraveineuse. Un travail récent a permis de montrer l’intérêt de ces nanocapsules en prévention primaire sur un modèle murin d’ADD mais son administration en préventif n’est pas envisageable chez le plongeur. Il serait plutôt destiné à être administré immédiatement et uniquement en cas d’apparition de symptômes d’ADD, soit après la plongée. Pour nous rapprocher des conditions d’administration réalistes des nanocapsules, la pose chronique d’une voie d’injection par la veine jugulaire avec un suivi post-opératoire des animaux pendant un mois et administration juste après une plongée simulée ont été validés. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité des nanocapsules dans la prévention secondaire de l’accident de décompression chez un modèle murin d’ADD.

Bénéfices attendus

A court terme, les bénéfices de ce projet portent sur l’étude de l’efficacité des nanocapsules d’albumine contenant de la perfluorodecaline en traitement secondaire de l’ADD. Nous allons pouvoir confirmer ou infirmer ce que nous avions déjà observé en comparant les différents groupes. A moyen terme, si les résultats sont confirmés positivement, nous pourrons envisager une étude clinique pour le traitement secondaire de l’ADD chez l’homme. A long terme, les bénéficiaires seront tous les personnels susceptibles d’être atteints d’ADD.

Procédures

Tous les animaux (n=60) sont soumis à deux actes pendant la procédure : - En condition d’asepsie stricte, un cathéter veineux est implanté dans la veine jugulaire externe droite. En pré-opératoire, les rats sont soumis à une injection de buprénorphine (0.05mg/kg en sous-cutanée, aiguille 25G) 30 minutes avant la chirurgie. Cette chirurgie est réalisée sous anesthésie générale (injection intrapéritonéale de kétamine 1000 à 100mg/kg associée à de la xylazine à 10mg/kg). Nous réinjectons des demies doses si nous observons une réaction lors du pincement de la patte arrière du rat. En phase post-opératoire, un antalgique est injecté en sous-cutané (minimum 3 jours en fonction de l’état de l’animal) ainsi qu’un antibiotique. La récupération des animaux est surveillée quotidiennement pendant un mois. Puis : - si l’animal est en bonne santé, il rentrera dans le protocole de plongée hyperbare, après administration d’un antalgique, qui est une procédure sévère. Les animaux qui sortent vivants de la plongée reçoivent immédiatement, via le cathéter veineux, une injection dont le contenu est différent entre les groupes que nous avons constitués. Une observation stricte de l’évolution des symptômes à l’aide de la table de suivi de soin sera réalisée pendant une heure. Les animaux vivants seront mis à mort (cf item 3.3.3.) à l’issue de la période d’observation de 60 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances /effets indésirables attendus sont : - la douleur après la chirurgie : intensité de modérée à faible et durée 5 jours après la chirurgie. - l’isolement des animaux en cage individuelle le temps que la cicatrisation soit effective après la chirurgie. Durée une semaine maximum. - la vérification de la perméabilisation des cathéters par injection de 100 microlitres de NaCl hépariné stérile à usage vétérinaire 3 fois par semaine en moyenne après la chirurgie. Intensité de l’acte : légère. - Une possible infection bactérienne après la chirurgie : au maximum 5 jours post-opératoire. - l’angoisse lors de l’injection de nos nanocapsules : intensité légère et durée maximale de 2 minutes. - la douleur et l’angoisse lors de la plongée simulée et lors de la période d’observation de l’apparition des symptômes sur une heure post-plongée. Intensité sévère, durée maximale une heure.

Devenir

A l’issue de la période d’observation de la plongée simulée, tous les animaux survivants seront mis à mort. Nous prélèverons sang, tissus, organe pour des analyses multiples (Histologie des tissus prélevés, dosages biochimiques des paramètres inflammatoires, détermination des activités enzymatiques (LDH, CK, AST, ALT, creatinine)... afin de déterminer si notre traitement est efficace.

Remplacement

Les expérimentations cliniques induisant des accidents de décompression ne sont envisageables que chez l’animal. Chez l’Homme, le risque d’ADD est quantifié à partir de la quantité de bulles veineuses circulantes, or les données récentes montrent clairement que cette mesure est très insuffisante. Par ailleurs, en l’absence de marqueur biologique validé de l’ADD, les approches in vitro ne peuvent être mises en œuvre que sur des échantillons de tissus prélevés sur des animaux préalablement soumis à des décompressions génératrices d’accidents de décompression. De même, les modèles cellulaires, par ailleurs utilisés au laboratoire, permettent d’étudier les effets de la pression ambiante, mais ne sont pas applicables à l’étude de l’ADD. Le remplacement n’est donc pas possible dans cette étude.

Réduction

Plusieurs variables sont analysées : - La proportion d’animaux souffrant d’un accident de décompression, en relation avec le traitement pharmacologique. - La gravité de l’ADD et son évolution en relation avec le traitement pharmacologique - les paramètres biologiques d’intérêt, déterminés à partir de dosages biologiques dans les tissus prélevés. Des tests statistiques appropriés permettront de comparer l’effet de nos traitements (3 groupes de 15 animaux) à notre groupe témoin (1 groupe de 15 animaux). Le nombre d’animaux dans chaque groupe correspond à l'effectif minimal pour assurer une puissance statistique de 0,8 au risque de 0,05.

Raffinement

Tout au long de la procédure, les conditions de stabulation sont réalisées dans un souci de bien-être de l’animal et ils sont suivis quotidiennement (tables de suivi de soin fournies en annexe). Toute la procédure expérimentale est réalisée par des personnes formées et habituées à travailler avec des animaux de laboratoire. La chirurgie aseptique est réalisée sous anesthésie gazeuse avec injection d’antalgique en pré-opératoire et en post-opératoire minimum 3 jours en fonction de la gravité des critères comportementaux observés. Un antibiotique sera aussi injecté en post-opératoire. Son utilisation est préventive (au maximum 5 jours post-opératoire) pour enrayer immédiatement la contamination bactérienne si elle a lieu. La vérification de la perméabilisation des cathéters (injection de 100µL de NaCl stérile hépariné à usage vétérinaire, 3 fois par semaine) est un acte léger qui relève de la contention des animaux par les mêmes personnels durant toute la procédure. Nous administrerons un traitement antalgique avant l’entrée des animaux dans le caisson hyperbare afin de diminuer la douleur pendant les injections des nanocapsules et la période d’observation sans modifier l’évolution des symptômes. L’angoisse lors de l’injection de nos nanocapsules est légère et ne dure que 2 minutes après la sortie du caisson hyperbare, cela relève davantage de la contention à laquelle les rats sont déjà habitués pendant la période post-chirurgie. L’appréciation de la survenue d’un ADD à l’issue du protocole hyperbare ne peut se faire que sur des animaux vigiles dont le comportement n’est pas modifié par d’autres facteurs que la présence d’ADD. C’est un accident grave mais certains animaux survivent et ne présentent aucun symptôme. La grille que nous utilisons pour évaluer la gravité de l’ADD est un outil robuste avec des critères fiables. Dans cette étude l’évolution de l’ADD sera appréhendée en fonction de sa gravité sur 60 minutes. C’est le temps nécessaire pour observer et s’assurer que les traitements sont efficaces ou pas. Puis les animaux seront mis à mort (item 3.3.3). Le point limite est la convulsion, seul critère qui conduira systématiquement à l’arrêt de la procédure avant les 60 minutes d’observation.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans ce projet sont des rats Wistar. Chez ce modèle expérimental, nous possédons à la fois de nombreuses données biologiques concernant les effets d’expositions hyperbares et une bonne connaissance des symptômes d’ADD. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Afin d’être certain d’avoir atteint le stade de «jeunes adultes», matures sexuellement, au moment de la plongée simulée dans le caisson hyperbare, tous les animaux sont âgés de 12 pour qu’ils atteignent la masse corporelle de 450g environ (c’est ce paramètre le plus important dans notre projet). Les rats seront cathétérisés un mois avant soit à l’âge de 8 semaines.

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont infectées par le métapneumovirus humain par voie nasale, puis reçoivent des vaccins ou des antiviraux, l'infection provoquant une perte de poids importante et une prostration avant euthanasie par dislocation cervicale. Le porteur écarte tout analgésique au motif qu'il modifierait la réponse immunitaire, et s'appuie sur un suivi clinique pour euthanasier les animaux atteints. Il affirme qu'aucun test in vitro ne permet de valider une approche vaccinale contre ce virus.

Objectifs

Nos expérimentations reposent sur l’expertise acquise par l’équipe concernant des approches similaires mises au point pour lutter contre l’infection par le virus respiratoire syncytial (VRS). La stratégie de vaccin inerte contre le VRS a fait l’objet de 2 brevets et de financements. La stratégie de vaccin vivant atténué fait l’objet d’un financement ANR. Différents antiviraux ont montré un potentiel inhibiteur sur la réplication du VRS en culture cellulaire ainsi qu’in vivo chez la souris. Etant données les fortes homologies entre VRS et HMPV, des antiviraux actifs contre ces 2 virus ou spécifiques du HMPV sont en cours d’étude. Etant données les fortes homologies entre VRS et le métapneumovirus humain (HMPV), des antiviraux actifs contre ces 2 virus ou spécifiques du HMPV sont en cours d’étude. Les objectifs du projet sont de i/ caractériser les réponses immunitaires induites par ces différents vaccins (production d’anticorps protecteurs, inflammation), et ii/ valider l’efficacité de la vaccination contre les infections par le HMPV.

Bénéfices attendus

Il n'existe à ce jour aucun vaccin ni traitement pour lutter contre les infections par le Meétapneumovirus. Ces projets visent à identifier des vaccins permettant d'induire une réponse immunitaire efficace chez l'hôte et/ou des molécules antivirales actives in vivo. Ces données constituent un préalable afin d'envisager des tests pré-cliniques de potentiels vaccins ou antiviraux.

Procédures

Les animaux réceptionnés à l'animalerie seront marqués à l'oreille. Nos protocoles consistent à infecter les animaux par le HMPV et adiministrer des traitements (vaccins ou antiviraux). Les animaux seront infectés par administration de 50 µl de virus par voie intranasale. Dans le cadre des essais de vaccins, ceux-ci pourront être administrés par voie intranasale, ou sous-cutanée, ou intrapéritonéale. En cours de protocole (J0, J15, J30 et J34), un prélèvement de sang par ponction à la joue sera réalisé. Les protocles de vaccination pourront durer de 30 à 65 jours. Dans le cadre de l'administration d'antiviraux, ceux-ci pourront être administrés par voie intranasale, intrapéritonéale ou gavage, 2 administrations quotidiennes seront considérées en fonction de la demi-vie des composés. Les traitements seront réalisés sous anesthésie (kétamine (50mg/kg)/xylazine (10 mg/kg), ou isofluorane). La durée des protocoles visant à tester l'activité antivirale de composés sera comprise entre 5 et 8 jours. Une contention des animaux sera réalisée lors de l'anesthésie ainsi que lors des traitements. D'autre part, un suivi quotidien des animaux sera réalisé, nécessitant la pesée des animaux. En fin de protocole, une dislocation cervicale sur animaux anesthésiés sera réalisée.

Impact sur les animaux

L’infection par le HMPV induit rarement la mort de l’animal mais peut induire une souffrance chez l’animal. La sévérité des symptômes peut varier en fonction de la souche virale et la dose de virus inoculée. Le principal signe clinique est une perte de poids importante, ainsi qu’une modification du pelage et du comportement (prostration)

Devenir

A l'issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale, des prélèvements devant êtres réalisées sur les animaux en fin de protocole. En fin de protocole de vaccination sont prévus un prélèvement final de sang et lavage broncho alvéolaire après euthanasie. Lors de test d'antiviraux, des prélèvement d'organes (poumons, rate, foie, vessie, rein cerveau) seront effectués en fin de protocole afin de valider l'inocuité des molécules (analyse histopathologique).

Remplacement

Il n’existe pour l’instant aucun test in vitro pour valider l’efficacité et la qualité d’une approche vaccinale contre le HMPV. Il est également nécessaire de valider in vivo l’efficacité de traitements antiviraux préalablement testés in vitro sur cellules infectées, ces systèmes simplifiés ne permettant pas de déterminer leur potentielle efficacité et innocuité à l’échelle de l’organisme.

Réduction

Nous utiliserons des virus luminescents permettant le suivi de l’infection chez un même individu sur plusieurs jours. Des doses de virus permettant de quantifier l’infection in vivo tout en limitant la sévérité des symptômes liés à l’infection seront administrées. Des pré-tests seront réalisés sur cellules afin d’évaluer l’efficacité et l’absence de toxicité des molécules antivirales, limitant le nombre de composés présentant un potentiel intérêt. L’analyse de nos résultats reposera sur des tests statistiques non paramétriques Mann-Withney. La puissance du test est fixée à 80% avec un risque fixé de 5%. Le nombre d’animaux estimé pour répondre à ces contraintes statistiques est de 10 animaux par groupe de traitement.

Raffinement

Les animaux seront eleves dans une animalerie ventilée à température et luminosité contrôlées, avec accès à volonté à eau et nourriture. Des morceaux de bois et une feuille de cellulose pour la nidification seront ajoutés pour enrichir le milieu. La vaccination par voie intranasale, sous-cutanée ou intra-péritonéale n’entraine à priori pas de souffrance visible des animaux. De même, l’administration de composés antiviraux par voie intranasale, intrapéritonéale ou gavage n’entraine pas de souffrance dans la mesure où des doses non toxiques de composés sont utilisées. Toutefois, pour toute manipulation pouvant entrainer un stress ou une souffrance de l’animal (administration intranasale, prélèvements), les animaux seront anesthésiés (injection intrapéritonéale de mélange kétamine (50 mg/kg) / xylazine (10 mg/kg) ou anesthésie gazeuse par isofluorane). Nos protocoles ne permettent pas l’utilisation d’analgésique qui peut induire une modification des réponses de l’hôte lors de l’infection. Certaines souris pouvant s’avérer sensibles aux traitements ainsi qu’à l’infection par HMPV, un suivi quotidien des souris sera donc réalisé. La sévérité des symptômes sera évaluée par analyse des signes cliniques en utilisant une grille de scores spécifique (poids, comportement, apparence poils). En cas d’apparition de signes cliniques significatifs, l’animal sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris Balb/c est un bon modèle pour étudier la vaccination contre le HMPV, car ce virus peut se multiplier dans les poumons des souris. De plus, l’infection par le HMPV induit chez les animaux une pathologie similaire à celle observée chez l’homme et constitue un modèle d’étude privilégié pour l’étude de l’efficacité d’antiviraux. Enfin, les souris Balb/c permettent la détection de luminescence et par conséquent le suivi de l’infection avec des virus luminescents, sur animal vivant. Les animaux utilisés au cours de ces procédures seront adultes (8-10 semaines). Ce stade de développement est le plus utilisé dans la littérature, ce qui permettra de comparer nos résultats aux données publiées dans la littérature.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont soumises à une alcoolisation forcée par un régime liquide pendant dix-sept jours et gavées d'oméprazole ou de benzopyrène, un polluant, cinq jours sur sept, avant mise à mort pour analyses. Le porteur reconnaît que certaines souris peuvent mourir d'un coma éthylique en quelques heures de façon imprévisible, et demande une dérogation à l'anesthésie locale pour limiter le stress des contentions. Il affirme que seul l'animal permet d'intégrer les interactions entre alcool, microbiote, intestin et foie.

Objectifs

La consommation d’alcool induit une maladie alcoolique du foie (MAF). Cependant tous les individus consommateurs ne développent pas de formes sévères de MAF. Il existe un risque de développer des lésions du foie dès une consommation équivalente à 5 verres de vin chez l’homme et 3 verres de vin (ou 2 bières à 6° d’alcool) chez la femme. Il a été démontré que les bactéries intestinales qui constituent le microbiote intestinal (MI) ont un rôle dans ce risque individuel, et que moduler ce MI permet de réduire voire d’empêcher les lésions du foie. Des études ont montré que la pectine, une fibre soluble que l’on retrouve dans les végétaux dont la pomme ou les agrumes a un effet protecteur sur les lésions de MAF. En effet, la pectine va favoriser la croissance de certaines bactéries intestinales et favoriser la production de produits bactériens, les indoles, qui vont être protecteurs et diminuer l’apparition des lésions du foie. Ces indoles exercent leurs effets bénéfiques par le biais d’un récepteur, le AhR (récepteur aux hydrocarbures aromatiques). Ce récepteur interagit également avec d’autres molécules, en particulier les médicaments et les polluants, permettant notamment de les éliminer de l’organisme. L’oméprazole est un médicament largement prescrit aux patients ayant une MAF pour traiter l’acidité gastrique. Le Benzoapyrène (BaP) est un hydrocarbure présent notamment dans notre alimentation. Comme les indoles, ces deux xénobiotiques auquels nous sommes couramment exposés interagissent avec le récepteur AhR. Dans ce contexte, notre projet vise donc à évaluer les effets croisés d’une stimulation physiologique bénéfique du AhR par la pectine, et donc les indoles issus du MI dans des situations où il existe une co-exposition de l’individu soit à l’oméprazole, soit à des polluants tels que le BaP. L’approche in vivo nous permettra d’évaluer les effets croisés des indoles et des médicaments/polluants en prenant en compte les interactions entre l’intestin, l’immunité digestive, le microbiote intestinal, et le foie.

Bénéfices attendus

Il n’existe pas de traitement pour prévenir et encore moins améliorer les lésions du foie au cours de la maladie alcoolique du foie. Il a été démontré que les bactéries du tube digestif appelées le microbiote intestinal (MI) joue un rôle dans la MAF. Ces bactéries agissent sur notre organisme en produisant des métabolites qui peuvent s’avérer bénéfiques. Nous avons montré que dans la MAF, l’ajout de pectine, une fibre alimentaire, au régime quotidien permet de favoriser la croissance de certaines bactéries qui produisent des métabolites, les indoles, protecteurs des lésions du foie. Ces indoles agissent par le biais de voies métaboliques également utilisées pour détoxifier l’organisme des polluants et des médicaments. Dans un contexte où un individu est traité avec ces indoles pour améliorer les lésions de MAF, il s’agit de voir si la co-exposition aux médicaments et aux polluants n’affecte pas le traitement. Cela permettra également de vérifier si le traitement n’impacte pas l’élimination des polluants/medicaments. L’absence d’effets croisés permettrai d’envisager la voie des indoles comme traitement dans la MAF.

Procédures

- Les souris de toutes les procédures sont alcoolisées avec un régime semi-liquide contenant l’alcool et +/- de la pectine. 168 souris pendant 17 jours - les souris reçoivent le traitement à l’oméprazole (médicament) ou le placebo par gavage 5 fois/semaine durant toute la phase d’alcoolisation : 48 souris pendant 11 jours (procédure 1). - Les souris recevront le benzoapyrène en gavage 3 fois/semaine : 72 souris pendant 4 semaines (procédures 2 et 3). - 24 souris recevront le benzoapyrène en injection intra-peritonéale 3 fois par semaine : 24 souris pendant 4 semaines -Un seul prélèvement de sang est effectué, le jour du sacrifice chez toutes les souris anesthesiées : 168 souris, 1 seul prélèvement.

Impact sur les animaux

- Nous soumettons les souris à une alcoolisation forcée avec des doses élevées d’alcool. La quantité d’alcool dans le régime peut engendrer une réaction forte chez la souris en peu de temps. Des souris peuvent décéder d’un coma éthylique en quelques heures sans pouvoir le prévoir, alors que certaines souris récupèrent très bien. - L’exposition au polluant ou la prise de l’oméprazole nécessite de gaver régulièrement les animaux. Ce geste répété induit un stress de l’animal dès la contention. Cependant, les canules de gavage et la compétence de l’assistant ingénieur formé à ce geste permettra de réduire au maximum le temps de la contention. - Une exposition au BaP via une injection intra-péritonéale est également prévue. La contention à chaque injection induit un stress chez l’animal en plus de l’injection intrapéritonéale.

Devenir

Mise à mort pour analyses post-mortem.

Remplacement

Les complications qui vont être observées au cours de la maladie alcoolique du foie mettent en jeu des interactions entre les différents organes qu’il est encore actuellement impossible de reproduire in vitro. Notre projet vise en effet à étudier l’effet curatif des indoles bactériens produits par le microbiote intestinal dans un contexte d’exposition à des xénobiotiques, l’oméprazole un médicament diminuant la production d’acide gastrique et un hydrocarbure aromatique polycyclique, le benzoapyrène (BaP) présent dans notre alimentation quotidienne. Si nous réalisons un certain nombre d’expériences in vitro sur des lignées hépatocytaires et entérocytaires différenciées afin d’approcher les effets à l’échelle d’un organe spécifique. Nous devons également considérer l’effet sur les bactéries intestinales présentes dans le tube digestif, sur les cellules immunitaires de l’intestin et leur impact sur la barrière intestinale puis sur le foie. Le seul modèle auquel nous pouvons avoir recours est donc l’animal permettant d’intégrer les interactions entre alcool, xénobiotiques/ bactéries du tube digestif / altération du tube digestif y compris au niveau immunitaire et lésions du foie.

Réduction

Notre critère de jugement principal est la modulation des transaminases. Pour mettre en évidence des différences de transaminases entre les groupes qui puissent etre validés statistiquement, nous allons avoir besoin de 12 souris par groupe.

Raffinement

Les souris seront par 2 pour avoir accès au régime en quantité suffisante. L’enrichissement classique en cellulose, ayant un impact sur le microbiote intestinal, sera remplacé par un enrichissement plastique et la quantité de sciure augmentée pour favoriser l’enfouissement. La longueur des dents sera vérifiée lors des pesées et coupées avec des ciseaux si nécessaires. Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. Néanmoins, le gavage administré aux souris nécessitera leur manipulation très régulière. Cela sera réalisé par le même ingénieur, formé à cette technique, tout du long du protocole. Lors de l’injection intrapéritonéale du benzapyrène, nous demandons une dérogation à l’anesthesie locale à la lidocaïne afin de limiter le stress de 2 contentions successives et sachant que le diluant , de l’huile isio 4, n’a pas de toxicité avérée. Le jour du sacrifice, les souris seront manipulées dans un local différent de celui où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées. L’option du gavage pour le benzoapyrène plutot que l’ajout au régime a été choisi pour contrôler parfaitement la dose de xénobiotiques par poids de souris.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris car les mécanismes cellulaires développés dans la pathologie de la maladie alcoolique du foie sont proches de ceux observés chez l’Homme bien que l’évolution des lésions du foie reste plus modérée que celles observées chez l’homme. Le modèle d’alcoolisation chez la souris est bien décrit dans la littérature, et c’est un modèle largement utilisé et validé par la communauté scientifique.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont cousues deux par deux par chirurgie pour relier leurs circulations sanguines, puis leur poumon est irradié, afin de déterminer l'origine des macrophages impliqués dans la fibrose. Le porteur reconnaît une douleur post-opératoire et une mobilité modifiée par la suture, mais s'appuie sur une publication rapportant l'absence d'effet de la parabiose sur le sommeil et le toilettage. Il affirme qu'il n'existe aucune alternative et que la souris est un "modèle incontournable" pour ces tests.

Objectifs

Chaque année en France, 30 000 nouveaux cas de cancers pulmonaires sont diagnostiqués. Dans 25% des cas, le diagnostic est précoce et la prise en charge thérapeutique est chirurgicale avec de bons résultats. Néanmoins, environ 40% des patients sont considérés comme inopérables et depuis 10 ans, la radiothérapie stéréotaxique (permettant de cibler précisément la zone à traiter) leur est proposée. Elle nécessite des appareils permettant de délivrer avec une grande précision de fortes doses en quelques fractions, sur un très petit volume. Globalement, la toxicité majeure associée à la radiothérapie stéréotaxique, est la pneumopathie radique pouvant évoluer vers une fibrose radique. Vu son efficacité sur le contrôle tumoral, des questionnements sont en cours sur une possible utilisation de la radiothérapie stéréotaxique en première intention chez les patients opérables mais également sur la possibilité d’utiliser des champs plus larges pour traiter des tumeurs plus grosses, permettant une utilisation plus large. Les connaissances sur ces doses ablatives (très fortes doses par fraction) ne sont que parcellaires. L’acquisition d’un appareil permettant ce type d’irradiation chez le petit animal a permis la conduite d’études (thèses et publications). Un recul important sur le modèle d’irradiation stéréotaxique pulmonaire chez la souris a été acquis, avec des données anatomopathologiques précises jusqu’à 12 mois après irradiation en dose unique ou fractionnée. L’objectif de ce projet est de déterminer si les macrophages sont issus du tissu lui-même ou s’ils sont recrutés depuis la circulation sanguine. Pour cela, l’objectif est de pouvoir faire circuler dans le sang des souris avant irradiation des cellules colorées, que nous pourrons rechercher ensuite dans le tissu (seules les cellules sanguines circulantes sont colorées, les cellules du tissu restent normales). Pour cela, le projet utilisera le modèle de parabiose chez la souris permettant de créer une connexion des systèmes sanguins de deux souris. Les souris GFP sont des souris dont toutes les cellules expriment une protéine fluorescente verte, la GFP : toutes leurs cellules sanguines sont donc vertes. Une fois la parabiose établie entre une souris normale et une souris GFP, la souris normale se retrouve donc avec des cellules vertes circulantes. Nous allons rechercher ces cellules chez la souris normale après irradiation localisée du poumon.

Bénéfices attendus

La fibrose est une cicatrisation exagérée aboutissant à un dépôt excessif de collagène au sein des tissus et organes. Les macrophages, cellules immunitaires jouant un rôle également dans la cicatrisation, ont été démontrés comme impliqués dans le développement de la fibrose pulmonaire, que l’on peut observer chez certains patients traités par radiothérapie au niveau du thorax (cancers pulmonaires, cancers du sein, lymphomes). Les techniques de radiothérapie ont beaucoup évolué ces dernières années, avec en particulier l’irradiation de très petits volumes pulmonaires avec des doses quotidiennes beaucoup plus fortes que lors des protocoles classiques. Si on sait aujourd’hui que les macrophages jouent un rôle dans le développement de la fibrose pulmonaire lors des protocoles « classiques » de radiothérapie, très peu de choses sont connues sur la fibrose induite par l’irradiation de petits volumes pulmonaires. La possibilité récente de modéliser ces petits volumes irradiés chez la souris permet de mieux connaître les processus responsables du développement fibreux dans ce contexte, et en particulier le rôle des macrophages. Le but de ce projet est savoir si les macrophages sont issus des macrophages présents au sein du tissu (prolifération in situ) ou issu d’un recrutement depuis la circulation sanguine. La réponse à cette question est déterminante pour la suite des projets de recherche. En effet, dans une perspective thérapeutique, les stratégies pouvant être mises en place pourront être très différentes en fonction de l’origine des macrophages. Par exemple et de manière simplifiée, si la stratégie thérapeutique mise en place vise à bloquer le recrutement des macrophages depuis la circulation sanguine alors qu’en réalité ils prolifèrent in situ au sein du tissu, la stratégie est vouée à l’échec.

Procédures

• Chirurgie de mise en place de la parabiose, anesthésie générale : durée 1 heure • Prélèvement au sinus rétro-orbital, animal vigile, 1 prélèvement par animal 2 semaines après la chirurgie • Irradiation sous anesthésie : durée maximale 35 min • Durée totale d’une étude : 8 semaines

Impact sur les animaux

Le modèle de parabiose implique une douleur post-opératoire, prise en charge par injection de buprénorphine. Une perte de poids est observée de l’ordre de 10%, avec récupération du poids initial dans les 8 jours suivant la chirurgie. Les souris étant suturées l’une à l’autre, ceci implique forcément une modification de mobilité, sans réduction. Lorsque la parabiose est équilibrée (souris habituées l’une à l’autre, poids identiques, pas de dominance), le comportement des souris n’est pas affecté. Une publication ne rapporte aucun effet de la parabiose sur les différentes phases de sommeil ni sur les activités de toilettage.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux pour prélèvements sous anesthésie terminale

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à ce jour concernant l’étude du recrutement macrophagique depuis la circulation sanguine vers le tissu pulmonaire irradié. L’utilisation des animaux vivants est indispensable à l’étude de ce processus.

Réduction

Les modèles d’expérimentation présentés pour l’étude des lésions radio-induites sont fortement influencés par la physiologie. Pour effectuer des tests statistiques paramétriques (Anova, T-test), il est donc en général nécessaire d’avoir un minimum de 5 animaux pour chaque groupe et condition étudiée. Nous prévoyons donc 5 couples en parabiose pour les analyses en cytométrie en flux. En revanche, étant donné le recul acquis au laboratoire sur les lésions tissulaires et leur étude en histologie et immunohistologie, nous jugeons suffisant de réaliser 3 couples en parabiose pour les analyses histologiques. Nous prévoyons également 6 couples contrôles (parabiose mais non irradiés), 3 pour la cytométrie en flux, 3 pour l’histologie. Enfin, le risque chirurgical impose de réaliser quelques couples supplémentaires, nous avons choisi de réaliser 6 couples supplémentaires afin de garantir la taille des groupes d’étude.

Raffinement

Pour la chirurgie et l’irradiation, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane. Des traitements associés à la chirurgie seront mis en place : analgésie per et post-opératoire, anti-inflammatoires et antibiotiques. Un seul couple de parabiose sera hébergé par cage. Des dômes jetables seront disposés dans les cages afin de fournir un abri rassurant. La taille de l’ouverture sera adaptée pour que le couple de parabiose puisse y avoir accès. Les souris sont suivies régulièrement (2 fois par jour/1 fois par jour le week-end les 2 premières semaines puis 1 fois par jour) et tout signe de détresse sévère et de prostration d’un animal entrainera l’euthanasie anticipée des deux souris impliquées dans la parabiose (immobilité, perte de poids, anémie, déshydration sévère, signes de détresse respiratoire, conflit entre les deux membres de la parabiose).

Choix des espèces

Le développement fibreux est un processus évolutif s’étendant sur une période longue. Le rongeur est utilisé pour plusieurs raisons : - durée de vie courte (la fibrose peut s’installer en 8 semaines) - facilité de manipulation - modèles incontournables pour réaliser des tests thérapeutiques préventifs ou curatifs La souris est utilisée pour ses variantes génétiques et la grande quantité d’outils moléculaires disponibles sur le marché. Les animaux seront commandés âgés de 10 semaines et utilisés après 1 semaine d’habituation à l’animalerie.

2 000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent l'induction d'un asthme sévère ou d'un syndrome de détresse respiratoire par instillation de bactéries ou de toxines dans la trachée, avec une gêne respiratoire pouvant évoluer vers la détresse et une perte de poids allant jusqu'à 25 %. Le porteur fixe des points limites, notamment la mise à mort au-delà de 25 % de perte de poids ou d'une température tombant à 33 degrés, et prévoit une ventilation forcée pouvant léser les poumons avant euthanasie. Il justifie l'animal par la difficulté de recréer in vitro une pathologie impliquant plusieurs types de cellules et de tissus.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de développer des modèles d’inflammation pulmonaire afin de tester des composés chimiques ou biologiques pour le traitement des pathologies associées, notamment un modèle d’asthme sévère résistant aux traitements par les stéroïdes ainsi qu’un modèle de syndrome de détresse respiratoire aigüe (SDRA). L'asthme est défini comme une dyspnée ou gêne respiratoire. Il s'agit d'une maladie multifactorielle où l'allergie joue un rôle important. L'asthme allergique est une maladie inflammatoire des bronches qui débute essentiellement avant l’âge de 20 ans : il représente plus des 2/3 des asthmes chez l'enfant et 1/3 des asthmes chez l'adulte. L'asthme allergique est lié à l'inhalation d'allergènes de l'environnement, même si des facteurs non spécifiques (pollution, tabac, effort, stress...) peuvent le favoriser ou l'aggraver. De même, l’infection par des virus ou des bactéries induit une exacerbation de l’asthme et est associée à une inflammation neutrophilique au niveau des voies aériennes. Près de 20 à 30% des patients présentent un asthme neutrophilique et répondent très mal aux traitements conventionnels, à savoir les corticoïdes. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux modèles animaux pour évaluer l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces patients. Le SDRA (Syndrome de détresse respiratoire aigüe) est une réaction pulmonaire sévère amenant souvent à une hospitalisation, se produisant en réponse à des facteurs pulmonaires (infections bactériennes ou virales, quasi noyade, aspiration de contenu gastrique, traumatisme thoracique), et/ou non pulmonaires (sepsis extra thoracique, traumatisme abdominal, choc, brûlures étendues…). Ce syndrome se manifeste de manière brutale et est associé à une inflammation et des lésions importantes de l’épithélium et endothélium alvéolaires, et à une accumulation de fluides dans les alvéoles pulmonaires (œdème pulmonaire), ce qui cause une détresse respiratoire et une hypoxie chez le patient. Selon sa gravité, ce syndrome entraine la mort chez 27% (SDRA léger) à 45% (syndrome sévère) des patients concernés (JAMA, 2012). A ce jour, la stratégie thérapeutique principale se base uniquement sur une oxygénothérapie et une gestion symptomatique des complications. Il est donc crucial de développer des stratégies thérapeutiques pour ces patients via des modèles animaux de ce syndrome.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur l’asthme résistant aux stéroïdes ou sur le SDRA. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces deux maladies pour lesquelles les options sont pour le moment limitées.

Procédures

Induction d’asthme allergique : Sous anesthésie générale à l’isoflurane, J0: Sensibilisation à l’OVA par voie IP J12 & J13: administration d’OVA par voie intra-nasale J14: inoculation des bactéries Haemophilus Influenzae ou Chlamydia pneumoniae par voie intratrachéale. J32-33-34: Traitement aux corticoïdes par voie IP J33-34: sensibilisation à l’OVA par voie intra-nasale Euthanasie au plus tard à J35. Induction de SDRA : sous anesthésie générale, administration intratrachéale de LPS ou de Streptococcus pneumoniae. Euthanasie au plus tard une 7j après. Test de composés chimiques ou biologiques: Administrations intra-nasales sous anesthésie générale, maximum 25µL par narine Administrations intratrachéales sous anesthésie générale, maximum 50 µL Administrations IV, IM, IP, SC et ID sous anesthésie générale si nécessaire Implantation de mini-pompes osmotiques en sous-cutané pour administrer les composés, sous anesthésie générale, avec administration d’analgésiques : AINS vétérinaire (Meloxicam) ou dérivé morphinique si contre-indication de l’AINS (Buprénorphine). Désinfection de la plaie régulière et application d’un cicatrisant (Dermaflon crème). Si besoin, suture reprise sous anesthésie à l’isoflurane Administration per os: gavage sous contention Prélèvements: Sang: Si peu invasifs: sous anesthésie générale à l’isoflurane (veine faciale, jugulaire, caudale, ou sinus rétro-orbitaire…) Piqure à la veine caudale potentiellement uniquement sous contention Prélèvement terminal (grand volume de sang) par ponction cardiaque ou par prélèvement sinusal sous anesthésie générale profonde. Puis constat de la mort de l’animal et si nécessaire dislocation cervicale Liquide céphalorachidien (10 µL pour une souris) sous anesthésie générale Biopsie tissulaire: anesthésie générale et conditions aseptiques Prélèvements de tissus et lavages broncho-alvéolaires post mortem Mesures de la mécanique pulmonaire : sous anesthésie générale, la souris est intubée puis reliée à un appareil de ventilation mécanique forcée qui mesure des paramètres mécaniques (pression, volume) des poumons. Puis euthanasie. Euthanasie : - Overdose d’anesthésique + méthode physique. - Dislocation cervicale - Sur animaux inconscients, sans reprise de conscience avant de mourir: prélèvement de sang terminal et dislocation cervicale

Impact sur les animaux

Dans les deux modèles, nous nous attendons à observer chez les souris des signes de difficulté respiratoire (dyspnée), pouvant potentiellement évoluer jusqu’à la détresse respiratoire et l’hypoxie. Un suivi clinique longitudinal sera effectué par du personnel compétent. Une grille de scoring clinique, et des points limites adaptés seront mis en place. Nous nous attendons par ailleurs à observer une perte de poids transitoire chez les animaux, se résolvant en quelques jours ( à 25% ou persistantes (entre 20 et 25% pendant 3 jours consécutifs) constitueront un point limite. Concernant le modèle de SDRA, nous nous attendons par ailleurs à observer au cours des 2 premiers jours une chute de température corporelle de 5 à 10%. Les animaux seront équipés de puces de mesure de température sous cutanées (mises en place sous anesthésie) afin de pouvoir suivre la température des animaux. Les pertes de températures atteignant 33°C constitueront un point limite. Si des baisses de températures sont observées (entre 1 et 3°C), du coton et du sizzle dry seront rajoutés dans la cage afin que les animaux puissent s’y réchauffer. Concernant les mesures de saturation, peu d’effets indésirables pour l’animal sont attendus, puisque la mesure est peu invasive et indolore et seront réalisées sur animal anesthésié (Isoflurane) Concernant les mesures de paramètres mécaniques par ventilation forcée, elles peuvent potentiellement créer des lésions pulmonaires, c’est pourquoi elles seront réalisées sous anesthésie profonde avec analgésie (Xylazine et Buprénorphine) et suivies d’une euthanasie sans réveil. Les administrations de traitement se feront sous anesthésie générale, sauf pour les administrations pour lesquelles le stress engendré serait inférieur au stress d’une anesthésie, et pour les administrations incompatibles avec une anesthésie (gavage).

Devenir

Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, ainsi qu’à des lavages broncho-alvéolaires et des mesures de compliance pulmonaire, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront dans la mesure du possible été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité apparente. Elles auront si possible aussi été sélectionnées sur leurs propriétés pharmacocinétiques in vivo. Cependant, l’ensemble de ces données est insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.

Réduction

Un nombre minimum de 8 animaux adultes par groupe sera nécessaire si une réduction significative de l’inflammation pulmonaire doit être observée suite à un traitement préventif ou curatif. Ce nombre pourra monter jusqu’à 15 en fonction d’autres paramètres devant être mesurés comme le dosage des cytokines, l’histologie et/ou l’expression de gènes dans les poumons. Cette analyse sera effectuée au moyen du test ANOVA.

Raffinement

S’agissant de modèles d’inflammation pulmonaire, les animaux pourraient présenter de la dyspnée. Si celle-ci évoluait vers la détresse respiratoire (position d’orthopnée, mouvements respiratoires anormaux) ou la suffocation, cela constituerait un point limite avec euthanasie dans les plus brefs délais. Du fait de l’inflammation générée, nous nous attendons aussi à ce que les animaux perdent du poids. En conséquence, les animaux seront pesés 2 fois par semaine avant induction de la maladie, puis une fois par jour à partir de l’induction de la maladie. A partir de 10% de perte de poids, une réhydratation sous-cutanée sera mise en place. -Entre 10 et 15% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate par voie sous-cutanée, 0.5mL, une fois par jour. -Entre 15 et 25%% du poids au J0 du protocole : les animaux seront réhydratés avec du Ringer Lactate, 0.5mL par voie sous cutanée, deux fois par jour. En cas de perte de poids constatée supérieure à 10% sur certains animaux, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de toutes les cages. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, les traitements seront interrompus.

Choix des espèces

- La réponse asthmatique allergique est aussi très bien caractérisée chez la souris. - Les challenges OVA et infections avec Haemophilus influenzae ou Chlamydia pneumoniae chez la souris sont bien documentés. - Les inductions de SDRA par le LPS ou Streptococcus pneumoniae sont bien documentés chez la souris. - Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées à minima sur une espèce rongeur (par exemple la souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur (par exemple la souris) est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie pulmonaire et la dose toxique dans la même espèce. Des animaux sevrés (jeunes adultes de plus de 6 semaines) seront utilisés pour procédures d’induction d’asthme résistant aux corticoïdes et de SDRA, ces modèles étant bien décrits chez les animaux adultes.

485 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales pulmonaires par chirurgie du thorax, puis des injections répétées et un suivi de la tumeur par imagerie, pour tester des molécules censées restaurer la reconnaissance des tumeurs par le système immunitaire. Le porteur reconnaît des alternatives sur cellules mais affirme que seul un "animal vivant, entier" permet d'étudier l'effet anti-tumoral. Les effets attendus incluent une gêne respiratoire liée à la greffe et une toxicité possible du traitement.

Objectifs

Le cancer est un groupe de maladie touchant une grande partie des organes, il se caractérise par la multiplication anarchique de cellules. Ces cellules, dites « tumorales », ont subi plusieurs mutations qui leur ont permis d’acquérir de nouvelles propriétés telles que l’immortalité. Aujourd’hui, le cancer est une cause majeure de décès dans le monde, en particulier en France où il est devenu la première cause de décès. De plus, avec 30 991 morts répertoriés en 2017, le cancer du poumon est la première cause de mortalité par cancer en France. Celui-ci est divisé en deux catégories en fonction des cellules à partir duquel il se développe : les cancers non à petites cellules (NSCLC) et les cancers à petites cellules (SCLC). Les NSCLC représentent 85% des cas, contre 15% pour les SCLC. Cette distinction est importante car la prise en charge des patients est différente. Le choix de traitement d’un patient dépend du type de tumeur, mais aussi de son stade de développement. Parmi ce choix thérapeutique, il existe la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et l’immunothérapie. Cette dernière se définie par l’administration de molécules stimulant le système immunitaire afin de lutter contre le cancer. En autres, les anticorps anti-PD1 (Nivolumab© ou Pembrolizumab©) sont indiqués pour le traitement de certains cancers avancés, tels que les mélanomes, les NSCLC, etc. Cependant chez les patients atteints de NSCLC, seuls 20-30% d’entre eux répondent positivement à l’immunothérapie anti-PD1. Cette résistance peut être expliquée par plusieurs paramètres intrinsèque à la tumeur du patient, par exemple le faible taux d’expression d’antigène à la surface de la tumeur. A savoir, ces antigènes sont des protéines qui sont présentes seulement à la surface des cellules cancéreuses. La présentation de ceux-ci permette au système immunitaire du patient de différencier les cellules tumorales des cellules saines. Ainsi, le système immunitaire est capable de protéger quotidiennement notre organisme en surveillant, puis en éradiquant les cellules non-saines. Le faible taux d’antigènes sur les NSCLC met donc en péril la reconnaissance des cellules tumorales par le système immunitaire. Notre étude donc sur la restauration de l’expression d’antigènes sur les NSCLC grâce à de petites molécules. Cette restauration permettrait donc au système immunitaire du patient de lutter contre les cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

Notre stratégie thérapeutique est de favoriser l’expression d’antigènes au sein de la tumeur NSCLC lors de son développement facilitant sa reconnaissance par le système immunitaire et donc, sa régression et/ou son élimination. Cette réactivation du système immunitaire à l’aide de ces molécules pourrait aussi être combinée avec des immunothérapies déjà approuvées chez les patients, telles que anti-PD1, afin de lever la résistance chez les patients concernés.

Procédures

Greffe orthotopique pulmonaire chirurgicale avec incision au niveau du thorax et injection sous anesthésie de moyenne durée (quelques minutes). Après l'inoculation des cellules, les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales (anesthésie locale) pour la voie d'administation du traitement (1, 2 ou 3 fois par semaine pendant 2 semaines) et pour le suivi de la croissance tumorale par bioimagerie (2 injections de luciferine par semaine pendant 2 semaines, puis 1 injection par semaine si l'animal ne présente plus de signe de tumeur). Du sang pourra être prélevé au niveau sub-mandibulaire après anesthésie sous anesthésie gazeuse (isoflurane) (1 fois par semaine durant la durée du traitement). Après euthanasie des animaux, certains organes seront prélevés afin d’étudier l’impact des traitement sur le système immunitaire et les cellules tumorales.

Impact sur les animaux

Les animaux pourraient présenter des signes moteurs anormaux et des changements sensoriels au réveil après anesthésie, ils seronts donc oberservés de façon accentuée les 24 heures suivant l'opération. De plus, pour favoriser une récupération rapide, les souris seront nourries avec du DietGel Recovery. Les effets indésirables attendus sur les animaux sont liés à la greffe intrapulmonaire et une toxicité éventuelle du au traitement par les petites molécules.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des organes (poumons, rate, ganglions drainants) et d'étudier au mieux la réponse anti-tumorale mise en place après traitement de nos deux molécules.

Remplacement

Concernant cette étude, il existe des alternatives non-animales comme des tests de toxicité sur cellulles, test d'inhibition du splicésome sur cellules à l'aide plasmide. Cependant ces alternatives nous permettent seulement de décrire les caractéristiques de nos molécules et non leur activité anti-tumorale sur les NSCLC. L'utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité et l’effet anti-tumoral des thérapies sur le modèle TC-1 en orthotopique. En effet, les relations entre les cellules cancéreuses pulmonaires et les cellules immunitaires s’effectuent via différents organes, nécessitant toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.

Réduction

D'après nos études antérieures, on observe une différence significative de surface tumorale entre deux groupes lorsque la différence entre les moyennes est supérieure à 28%, avec une variabilité d’environ 22%. Après calcul de puissance, avec un risque alpha à 0.05 et beta de 0.20, on obtient 12 animaux par groupe. Nous ferons un suivi longitudinal de la croissance tumorale. Nous vérifierons si les valeurs suivent une loi normale. En fonction, nous utiliserons soit un Mann Withney ou un t test lorsqu’il n'y a que deux groupes à comparer, ou un 2-way ANOVA avec un post test Kruskal Wallis ou Bonnferoni lorsqu'il y a plus de deux groupes. Nous pourrons ainsi également comparer les groupes entre eux à un temps T défini (par exemple à J7 afin de voir si le lot de souris développant la tumeur avant traitement est homogène, ou bien à des temps plus avancés afin d’apprécier la différence de croissance entre 2 ou plusieurs groupes). Afin de répondre aux obejectifs scientifiques de cette étude, nous avons calculé que 4 groupes suivants 4 conditions de traitement différents (procédure 1) serait suffisant.

Raffinement

Afin de réduire la douleur chez l’animal les injections intrapéritonéales seront effectuées après anesthésie locale (lidocaïne); les injections intra-pulmonaires seront faites sous anesthésie isoflurane . Le milieu est enrichi afin de réduire le stress des animaux. Les animaux seront maintenus en groupes et logés dans des cages appropriées de taille adaptée au nombre d’individus. De plus, le milieu sera enrichi à l’aide de nestlets et maisons en cartons afin de réduire le stress des animaux.Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

- Génétique proche de celle de l’Homme - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité et l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale dans leur globalité. Animaux adultes à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines, car ce cancer se développe chez les adultes.

26 rats immunodéprimés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur cérébrale leur est implantée, puis une canule est fixée dans le crâne pour des séances de microdialyse pouvant durer cinq heures par jour, l'hébergement se faisant en cage individuelle pour éviter que les animaux ne rongent le dispositif. Le porteur classe l'implantation de la canule comme sévère et indique des points limites liés au volume tumoral et à l'état de l'animal, tous les rats étant tués au plus tard cinq jours après la pose. Il affirme que le remplacement n'est "clairement pas possible" car le développement d'une tumeur cérébrale dépend de phénomènes biologiques complexes.

Objectifs

Les glioblastomes sont les cancers du cerveau les plus fréquents et sont généralement agressifs. Le traitement de référence consiste, lorsque cela est possible, à retirer chirurgicalement la tumeur, puis à traiter par radiothérapie (traitement par les rayons X) et chimiothérapie. La radiothérapie occupe une place incontestée après la chirurgie. Malgré un traitement bien conduit, de nombreux patients développent une récidive tumorale locale. La Nanomédecine offre de remarquables perspectives de développement et d'innovation en matière de radiothérapie. Afin d’évaluer le potentiel thérapeutique d’une nanoparticule innovante (en cours de développement clinique), la compréhension approfondie des effets de ce traitement sur la réponse immunitaire et inflammatoire est une étape cruciale qui permettra de maitriser et potentialiser les effets du traitement. Pour cela, il est important de mettre en place une technique d’approche permettant de suivre en direct les marqueurs participant à la réponse immunitaire et inflammatoire. L’identification des marqueurs de l’inflammation se fait traditionnellement par technique d’immunohistochimie (méthode de localisation de marqueurs dans des coupes de tissu, par la détection d'antigènes au moyen d'anticorps) mais cette technique reste invasive puisqu’elle ne se fait que sous une approche « ex vivo » nécessitant la mise à mort de l’animal. Il est donc nécessaire d’utiliser une technique plus pertinente permettant de réduire le nombre d’animaux en effectuant un suivi longitudinal des marqueurs de l’inflammation « in vivo » sans avoir à mettre à mort l’animal. a microdialyse intracérébrale constitue une technique adaptée puisqu’elle permet d’assurer un échantillonnage sur animal vivant. Elle nécessite l’introduction dans le cerveau d’une sonde (passant à travers un guide ou canule) contenant une membrane semi-perméable à l’eau et aux petites molécules. L'atout principal associé à cette technique est qu'elle permet la mesure répétée de molécules dnas l'environnement du cerveau et de la tumeur sans nécessité de biopsie.

Bénéfices attendus

La microdialyse est une technique largement employée en clinique, permettant la surveillance du métabolisme cérébral. Elle permet, par l'intermédiaire d'une sonde implantée dans le cerveau, d' obtenir des échantillons du liquide prése,t dans le cerveau. La maitrise de cette technique d’échantillonnage permettra de mieux appréhender les mécanismes liés au développement de la tumeur et permettra par la suite de pouvoir caractériser les mécanismes d’action des différentes stratégies thérapeutiques menées au sein du laboratoire, notamment au niveau de la réaction inflammatoire. Dans le cas précis du projet européen, la mise en place de ce modèle permettra à terme d’apporter une compréhension approfondie des effets sur la réponse immunitaire qui constitue une étape cruciale pour maitriser et potentialiser les effets thérapeutique d’une nanoparticule innovante pour le traitement du glioblastome.

Procédures

- Implantation de la canule intra-cérébrale (suite à la réalisation de la procédure 1) : présence d'une canule (guide) qui émerge au niveau du crâne et qui reste présente à partir du moment de son implantation jusqu'à la mise à mort de l'animal pour une durée de 5 jours maximum. La chirurgie en elle-même est quant à elle estimée à 1h - Microdialyse intracérébrale (procédure 2) consiste en l'infusion d'un perfusat à travers des tubulures et à travers la sonde dans le but d'én récupérer un dialysat. Cette technique nécessite une équilibration préalable de la sonde antérieure à la récupération du diaysat. Pour la série 1, 5 microdialyses sont prévue de Jn+1 à Jn+5 avec 3h d'équilibration de la sonde au préalable et 2h de collecte des dialysats, ce qui correspond à une durée de 5h/jour soit 25h au total. Pour la série 2, 3 microdialyses sont prévues à J11, J13 et J15 avec de la même façon 3h d'équilibration de la sonde au préalable et 2h de collecte des dialysats correspondant à une durée de 5h/jour soit 15h au total.

Impact sur les animaux

Implantation de la canule : chirurgie opératoire classée sévère mais utilisation d'analgésiques pour limiter la souffrance des animaux (cf procédure 1). Hébergement en cage individuelle après l’implantation de la canule (pour éviter que les animaux ne se rongent la partie visible de celle-ci) pouvant conduire à un stress des animaux (limitation des interactions sociales directes) mais atténuation de cet effet indésirable en accolant les cages les unes aux autres qui sont de surcroit transparentes. Cages d’hébergements spéciales (30 cm *30 cm) et système de contention nécessaire à la protection des 2 tubulures (infusion du perfusat et récupération du dialysat)

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de chaque procédure sauf si un des points limites détaillés précédemment est atteint, conduisant alors à la mise à mort de l'animal. Pour réaliser un suivi longitudinal des marqueurs de l’inflammation, les animaux sont gardés en vie après chaque séance de micro-dialyse(procédure 2), sauf atteinte d’un des points limites (volume tumoral, dysfonctionnement moteur, modification comportementale, altération de l’état physiologique de l’animal) ou critère de perte de poids décrit comme précédemment. Cependant, comme mentionné précédemment, tous les rats seront mis à mort maximum 5 jours après la pose de la canule suite à la dernière session de micro-dialyse (soit Jn+5) pour a série 1 ou de la même façon à J15 post-implantation tumorale pour la série 2. Une mise à mort plus précoce sera préconisée dans le cas de problèmes techniques liés à la micro-dialyse (interruption de l’infusion, sonde mal positionnée par rapport à la tumeur)

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes (influence du microenvironnement tumoral, activation des cellules immunitaires, envahissement du tissu cérébral, processus inflammatoires...). De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires (cellules tumorales, cellules des caisseuw sanguins, tissu cérébral,...). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal. Cependant une expérience préliminaire « in vitro » sera menée pour dans un premier temps estimer les rendements de micro-dialyse ainsi que les temps d’équilibration de la sonde.

Réduction

La technique de micro-dialyse intra-cérébrale est une méthode d’échantillonnage permettant le recueil de molécules produites par l'organisme sans avoir à mettre à mort les animaux pour récupérer l’organe d’étude afin d’en extraire les molécules à doser. Elle offre donc l’opportunité d’utiliser un nombre plus restreint d’animaux dans la mesure où les prélèvements de dialysats peuvent être réitérés au cours du temps : chaque animal sera donc utilisé à plusieurs temps cinétiques, permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux impliqués.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) mais d'autre part lors de la chirurgie d'implantation de la canule (analgésie avec réitération, mise en cage individuelle, pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie). Une vigilance accrue sera accordée au moment de la micro-dialyse, en effet les animaux connectés aux tubulures seront régulièrement observés, d’une part pour vérifier que le prélèvement se déroule correctement mais aussi pour s’assurer que le comportement des animaux n’est pas trop altéré par la contrainte des tubulures. L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie (5 min de trajet à pieds), notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées : l’anesthésie sous gazeuse étant rapidement réversible. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger.

Choix des espèces

Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins (souris et rats). Les rats constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. En outre, le choix de cette espèce se justifie par la nécessité d’obtention de volumes de dialysats suffisamment importants pour les dosages ultérieurs mais aussi par les limitations de résolution offertes par l’imagerie anatomique. Les rats immunodéprimés sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines car du fait leur immunodéficience, il n'y a ainsi pas de rejet du greffon tumoral implanté. Des rats âgés de 6 semaines sont utilisés, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle d'un atlas permettant de cartographier le cerveau de rat.