Procédures sévères

Pour estimer si la résistance aux maladies bactériennes est héritable dans une lignée commerciale, 6 060 truites arc-en-ciel sont infectées par la furonculose et la lactococcose, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur indique que ces infections provoquent des signes cliniques et la mort d'une partie des poissons, et que les survivants seront tués à la fin de l'essai pour des raisons sanitaires. Aucune intervention n'est déclarée sur les poissons éveillés, la maladie faisant le travail, une grille de points limites servant à décider des mises à mort en cours d'essai. Les retombées annoncées sont une meilleure santé des poissons d'élevage et 2 à 10 % de survie gagnée par génération de sélection, dans une filière qui produit 35 000 tonnes de truites par an en France.

Objectifs

La furonculose et la lactococcose sont deux maladies bactériennes à forte prévalence en France qui affectent les salmonidés, et notamment la truite arc-en-ciel (TAC), à différents stades de vie. Elles peuvent provoquer de nombreuses pertes dans les élevages et nécessitent fréquemment un abattage des cheptel touchés. La furonculose est une maladie bien connue provoquée par Aeromonas salmonicida. La lactococcose, pathologie généralement des zones méridionales chaudes, est associée à un agent bactérien du genre Lactocoque (Lactococcus garvieae, Lactococcus petauri). Principalement retrouvées dans les piscicultures où la température des eaux dépasse les 16°C (furonculose) à 18°C (lactococcose), la fréquence de ces pathologies augmente ces dernières années dans un contexte global de réchauffement climatique. Les traitements antibiotiques et les vaccins existants présentent des efficacités limitées. Un des leviers utilisable pour améliorer la résistance de TACà ces pathogènes est la sélection génétique, qui se pratique déjà avec succès pour d’autres espèces piscicoles. Pour évaluer la faisabilité d’une telle approche, il est nécessaire de déterminer dans quelle mesure la résistance à ces pathogènes est un caractère héritable permettant de générer, sur plusieurs générations d’animaux, des progrès significatifs. Ces éléments sont à l’heure actuelle inconnues pour ces maladies. Le premier objectif de ce projet consiste à évaluer la résistance d’une lignée commerciale de truites arc-en-ciel à ces 2 pathogènes afin d’estimer les paramètres génétiques et les héritabilités associés. En complément de cette approche de génétique classique, un second objectif consistera à évaluer une méthode innovante de sélection des animaux sur la base de leur robustesse immunitaire à ces pathogènes, en identifiant des gènes dont l’expression est modifiée chez les individus les plus résistants.

Bénéfices attendus

Les retombées attendues sont une amélioration de la santé et du bien-être des poissons en élevage ainsi qu’une diminution de l’utilisation de médicaments. L’amélioration attendue de la survie est estimée entre 2 à 10% par génération de sélection en fonction de la composition des objectifs de sélection et des pressions de sélection appliquées.

Procédures

Il n'y a pas d'intervention prévue sur les animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les infections bactériennes vont induire des signes cliniques plus ou moins marqués et de la mortalité chez certains individus.

Devenir

Du fait de la nature des essais menés dans cette procédure et pour des raisons sanitaires, il n’est pas envisageable de retransporter les animaux dans leur ferme d’origine. En conséquence, les animaux survivants seront mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Il n'existe pas d'alternative in vitro pour ce projet. L'évaluation de la résistance d'individus à un pathogène à des fins d’amélioration génétique progressive d’une population doit se faire sur des animaux vigiles capables de mettre en œuvre des systèmes de défense complexes (immunité).

Réduction

Le nombre de poissons utilisé est réduit au minimum requis par les méthodes d'évaluation génétique. En effet, les individus testés dans le projet servent à évaluer et classer leurs collatéraux restés en pisciculture. De ce fait, le meilleur compromis doit être trouvé entre un nombre faible de poissons testés et une classification précise de leurs collatéraux en ferme.

Raffinement

Un enrichissement des bassins est réalisé (couvercles pour permettre aux poissons d'avoir une zone d'ombre et de se cacher, bullage). Au cours des essais, les animaux font l’objet d’une évaluation quotidienne de leur état de santé en utilisant une grille de points limites adaptée qui permet de positionner, si nécessaire, des mises à mort compassionnelles.

Choix des espèces

La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est l’espèce dulcicole la plus produite en France (35000 t/an) et en Europe. Les essais seront réalisés à un poids moyen entre 30 et 50g car c’est à partir de ce stade de vie que les poissons peuvent présenter des signes cliniques visibles pour les pathologies étudiées.

Pour tester un anticorps censé renforcer les immunothérapies du cancer du foie, 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Chaque souris reçoit dans la veine de la queue une injection rapide d'un large volume de liquide qui déclenche un choc et fait pousser des tumeurs dans son foie, puis des injections d'anticorps deux fois par semaine et un prélèvement de sang terminal. Le porteur indique que les tumeurs volumineuses peuvent entraîner une gêne et des douleurs, et décrit le choc provoqué par l'injection comme un épisode dont l'animal récupère en moins d'une heure sans séquelle. Cette description s'accorde mal avec le niveau de souffrance sévère déclaré pour les 360 souris.

Objectifs

Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules immunitaires par notre anticorps permet de moduler leur activité. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire. Egalement, ce projet nous permettra d’évaluer la pertinence de l’utilisation de cette stratégie thérapeutique innovante dans d’autres cancers exprimant fortement la protéine.

Bénéfices attendus

Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Egalement, ce projet pourrait ouvrir vers de nouvelles pistes thérapeutiques pour prendre en charge les autres cancers exprimant fortement la protéine que nous avons identifiée.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une injection rapide d’un large volume de liquide. Cette injection entraine un choc chez l’animal, qui récupère en moins d’une heure et ne subit pas de séquelle à long terme. Cette procédure dure moins d’une minute. En fonction des groupes, les animaux seront anesthésiés ou vigiles. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant la durée totale du traitement, par injection réalisée sur animal vigile, cette injection est réalisée en moins d’une minute. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisée en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

La manipulation des animaux entraîne un stress physique modérée de courte durée. L’injection d’un large volume peut entrainer du stress et peut-être de la douleur à court terme mais l’animal récupère en général rapidement (5 à 10 minutes) et complètement au bout d’une heure. Notre modèle induit des tumeurs dans le foie, qui peuvent entrainer une gêne et des douleurs en cas de tumeurs volumineuse. Un stress physique lors de la manipulation et de la contention nécessaires à l’injection des traitements sont attendus. De même, les injections répétées peuvent parfois engendrer une douleur légère transitoire.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.

Réduction

Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux seront soumis à une période d’acclimatation d’une semaine, puis habituées à la contention pendant une semaine avant le début des procédures afin de diminuer le stress lié aux injections.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle développé d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue est spécifique à la souris et permet le développement in situ de tumeurs hépatiques, sur la base d’un foie sain, très semblables aux tumeurs retrouvées chez les patients. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de minimum 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire et hépatique mature.

Soumis à des chocs électriques inévitables de 1 mA pendant quatre secondes, 205 rats Wistar vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent ensuite une à deux injections de composés psychotropes sur animal vigile, puis passent le test du champ ouvert, le test de reconnaissance d'objet et un enregistrement de vocalisations ultrasonores, cinq à sept minutes par session. Le projet cherche deux molécules capables de favoriser la récupération après un traumatisme psychologique, piste rattachée aux substances à faible dose associées à une psychothérapie chez l'humain. Le porteur qualifie ce stress de modéré à intense mais sans séquelle physique, et rattache la mise à mort de tous les rats aux neuro-adaptations provoquées par les traitements, qui interdisent de les réutiliser.

Objectifs

Le trouble de stress post-traumatique est une réponse anormale à un traumatisme, qui touche une part importante de la population. Dans de nombreux cas, ce trouble est associé à d'autres pathologies psychiatriques, comme la dépression, ce qui complique sa prise en charge. Il est souvent décrit comme un dysfonctionnement de la mémoire, où le souvenir du traumatisme reste envahissant au lieu de s’atténuer naturellement. Les traitements actuels, notamment les antidépresseurs classiques, restent souvent peu efficaces, en particulier chez les patients souffrant de comorbidité. Face à ces limites, de nouvelles approches thérapeutiques sont explorées. Certaines substances agissant sur la plasticité cérébrale ont montré des effets prometteurs sur les symptômes du trouble de stress post-traumatique et de la dépression associée, notamment lorsqu’elles sont utilisées à faibles doses et en complément d’un accompagnement psychothérapeutique. Dans ce contexte, notre projet vise à étudier deux composés innovants susceptibles de favoriser la récupération après un traumatisme psychologique, sans provoquer d'effets indésirables majeurs. Nous utiliserons un modèle animal de trouble de stress post-traumatique afin de mieux comprendre les mécanismes en jeu et d’évaluer l’efficacité de ces composés.

Bénéfices attendus

Le trouble de stress post-traumatique est une réponse pathologique à un traumatisme, qui touche une part importante de la population. Dans la majorité des cas, il est associé à d’autres troubles psychiatriques, notamment la dépression, ce qui aggrave le pronostic et rend la prise en charge plus difficile. Ce trouble est souvent lié à un dysfonctionnement de la mémoire : le souvenir du traumatisme reste intense et persistant, au lieu de s’atténuer avec le temps. Les traitements actuels, principalement les antidépresseurs, ne sont pas toujours efficaces, en particulier chez les patients présentant une dépression comorbide. Cela souligne l’importance de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Certaines substances capables de stimuler la plasticité cérébrale ont montré des effets encourageants sur les symptômes résistants du trouble de stress post-traumatique et de la dépression associée, notamment lorsqu’elles sont utilisées à faibles doses et en complément d’une prise en charge psychothérapeutique. Notre projet vise à évaluer d’un composé innovant susceptible de favoriser la récupération après un traumatisme, en agissant sur les mécanismes de plasticité neuronale, sans provoquer d’effets secondaires majeurs. Nous utiliserons pour cela un modèle animal de trouble de stress post-traumatique, afin d’étudier leur efficacité et de mieux comprendre leur mode d’action. Les résultats seront également comparés à ceux obtenus avec un traitement de référence.

Procédures

Les rats seront tout d’abord exposés, ou non selon le groupe expérimental, à une session de stimuli inévitables, de faible intensité, destinés à induire un stress dans le cadre d’un modèle validé de trouble de stress post-traumatique. Cette session constitue l’étape de conditionnement au stress. Par la suite, les animaux recevront des injections de substances actives par voie intra-péritonéale et/ou sous-cutanée. Ces administrations seront réalisées sur des animaux vigiles (non anesthésiés), dans des conditions de contention manuelle douce. Chaque injection impliquera une contention brève, d’une durée estimée entre 10 et 20 secondes. Selon le groupe, les animaux recevront une à deux injections, à des temps définis (par exemple : immédiatement après le stress, ou après un délai de 24 à 48 h dans le cadre de l’évaluation d’un effet différé). Enfin, les animaux effectueront des tests comportementaux : a) le test du champ ouvert avec une durée de session de 5 minutes, b) le test de la reconnaissance d’objet avec une durée de session de 5 minutes, 3) le test de vocalisations ultrasonores avec une durée de session de 7 minutes. L’ensemble de ces interventions est conçu pour limiter le stress additionnel et garantir des conditions d’expérimentation reproductibles, tout en respectant le bien-être animal. Un suivi quotidien sera effectué afin de surveiller l’état de santé des animaux après chaque manipulation.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions selon les groupes expérimentaux, chacune étant associée à un niveau de nuisance spécifique : Stimuli inévitables : Tous les rats recevront une série de stimuli électriques brefs (1 mA, 4 sec) dans le cadre du protocole de stress. Cette procédure entraîne un stress modéré à intense, de courte durée, sans séquelle physique. Injections per os, intra-péritonéales et/ou sous-cutanées : Tous les animaux recevront une à deux injections, nécessitant une contention manuelle douce d’environ 10 à 20 secondes. Ces injections induisent une douleur légère et transitoire liée à la piqûre. Administration de substances psychotropes : Certains rats recevront des composés ayant un effet sur le système nerveux central. Cela peut entraîner un inconfort passager, observé par des comportements typiques comme la sédation, sans conséquence durable. Tests comportementaux (champ ouvert, reconnaissance d’objet, vocalisations ultrasonores) : Ces épreuves consistent à placer les animaux dans des environnements nouveaux. Elles induisent une légère anxiété transitoire, sans manipulation douloureuse ni contrainte physique. Toutes ces interventions seront réalisées dans le respect du bien-être animal, avec une surveillance quotidienne et des critères d’arrêt prédéfinis si une souffrance est détectée.

Devenir

La totalité des animaux seront mis à mort car l'administration des médicaments créant des neuro-adaptations, les animaux ne peuvent pas être réutilisés.

Remplacement

L’objectif de ce projet est de développer de nouveaux médicaments contre le trouble de stress post-traumatique destinés à un usage chez l’humain. L’étude préclinique doit donc inclure une administration chez l’animal entier, d’autant plus que les effets comportementaux de ces composés ne peuvent être évalués que chez un animal vigile. Des approches in vitro sont déjà mises en œuvre au laboratoire (évaluation de la neurogenèse, de la synaptogenèse, et électrophysiologie in vitro). Toutefois, le recours à des modèles complexes, c’est-à-dire à des animaux vivants, demeure indispensable pour analyser les réponses antidépressives induites par de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été défini avec soin afin de concilier la qualité scientifique des résultats et la réduction du nombre d’animaux. Les groupes expérimentaux sont constitués de 10 rats chacun (sauf le groupe contrôle). Cet effectif repose sur l’expérience acquise dans nos travaux antérieurs ainsi que sur les données disponibles dans la littérature pour ce type de modèle, en tenant compte de la variabilité attendue des paramètres étudiés. Ce choix est conforme aux recommandations méthodologiques généralement admises pour garantir une puissance statistique suffisante, tout en limitant le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire, conformément au principe de réduction.

Raffinement

Des mesures de raffinement seront mises en œuvre afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout au long du projet. Chaque cage sera équipée d’un enrichissement environnemental standard comprenant un matériau de nidification végétal à base de fibres de coton, un abri opaque de type igloo et un bâtonnet en bois à ronger, afin de favoriser les comportements naturels et réduire le stress. En cas de difficulté alimentaire, notamment à la suite de procédures stressantes ou de traitements susceptibles d’entraîner une diminution transitoire de l’appétit, une alimentation de substitution facilement accessible sera proposée directement dans la cage. Les animaux feront l’objet d’une observation quotidienne, avec une attention particulière portée à l’état général, à l’apparence physique externe et aux comportements. Une grille de score clinique et comportementale sera utilisée afin d’évaluer objectivement le niveau de souffrance. Des points limites, définis à l’avance, permettront une intervention rapide (adaptation des conditions de prise en charge, traitement antalgique ou arrêt de la procédure) afin d’éviter toute souffrance inutile. En cas de douleur ou d’altération de l’état général, l’animal sera examiné par le vétérinaire référent et un traitement antalgique approprié sera mis en place. Si l’état de l’animal l’exige ou si les points limites sont atteints, une euthanasie sera pratiquée selon une méthode associant une anesthésie générale profonde suivie de l’administration d’un produit euthanasique, garantissant une perte de conscience rapide et l’absence de souffrance.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles particulièrement pertinents en biologie psychiatrique grâce à la forte conservation des circuits neuronaux régulant émotions, stress et mémoire entre ces espèces et l’humain. Les principaux systèmes de neurotransmission et les mécanismes de plasticité synaptique liés aux troubles psychiatriques sont largement partagés, permettant une transposition fiable des résultats. Le rat possède des capacités comportementales et cognitives bien caractérisées, ce qui permet d’évaluer finement l’anxiété, la peur conditionnée, la mémoire émotionnelle et les réponses au stress. L’existence de paradigmes expérimentaux validés assure la comparabilité et la reproductibilité des données. Les rats Wistar sont privilégiés pour leur sensibilité aux épreuves émotionnelles. Lors du paradigme de stimuli inévitables, ils émettent davantage de vocalisations ultrasonores à 22 kHz que les Sprague-Dawley, reflétant une réponse émotionnelle plus marquée, ce qui les rend particulièrement adaptés pour l’étude des altérations affectives et l’évaluation des traitements. Des animaux adultes seront utilisés, en cohérence avec la réalité clinique, puisque les antidépresseurs et les anxiolytiques sont majoritairement prescrits chez l’adulte humain. Les expérimentations débuteront avec des rats âgés de 8 semaines.

Les animaux utilisés portent la mutation responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne, pris à 1,5 mois et à 6 mois pour couvrir un stade précoce et un stade tardif de la maladie. 180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour des analyses histologiques et moléculaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une injection abdominale de molécules activant le système immunitaire, quatre injections hebdomadaires d'un médicament contre le stress et quatre ponctions sanguines réparties sur 21 jours. Les nuisances décrites se limitent à de la fatigue, de la fièvre, un malaise léger à la piqûre et une douleur au point de prélèvement, sans rien qui explique le classement en gravité sévère, et l'espèce n'est jamais nommée autrement que comme "un mammifère appartenant à la même classe que l'être humain".

Objectifs

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est causée par une anomalie génétique, que génère l’absence d’une protéine essentielle pour le fonctionnement du muscle. Lors de l'usure normale, les muscles atteints de DMD se réparent mal et diminuent progressivement de volume et de force. Le système immunitaire détecte la présence de composants musculaires endommagés et généralement les élimine. Cependant, dans la DMD, ces composants persistent anormalement. Cette étude vise à comprendre l'impact à long terme de cette persistance sur la réponse immunitaire. Nous utilisons un modèle animal, porteur de la même anomalie génétique que celle responsable de la DMD, comme substitut aux patients atteints de cette maladie. Le modèle animal utilisé dans cette étude a montré une diminution de certains types d'anticorps (protéines produites par le système immunitaire qui reconnaissent et neutralisent les substances étrangères) dans le sang. Afin de comprendre les causes de ce phénomène, nous souhaiterions administrer aux animaux, des molécules activatrices du système immunitaire pour étudier en détail comment le processus de production d'anticorps en réponse à ces molécules diffère entre les animaux atteints de DMD et les animaux sains.

Bénéfices attendus

Cette étude sera importante pour les patients atteints de DMD pour plusieurs raisons. Elle pourrait donner les outils pour améliorer les stratégies médicales pour le traitement de la maladie, reconnaissables par le système immunitaire pour corriger les anomalies génétiques. De plus, les résultats de cette étude contribueront à l'élaboration de meilleures recommandations vaccinales pour les patients atteints de DMD.

Procédures

Dans ce projet, tous les animaux recevront : - une injection dans la zone abdominale avec des molécules activatrices du système immunitaire (moins de 1 minute par injection). - quatre injections avec une médicament pour réduire le stress (une fois par semaine reparties en 21 jours, moins de 1 minute par injection). - quatre ponctions pour prélèvement sanguin (une fois par semaine reparties en 21 jours, environ de 1 minute chaque fois).

Impact sur les animaux

La vaccination peut provoquer un léger inconfort dans les jours qui suivent, notamment de la fatigue et de la fièvre. L’injection elle-même peut générer un malaise léger en raison de la piqûre, ainsi que le stress généré par la contention. De plus, des prélèvements sanguins peuvent engendrer un certain inconfort chez les animaux, notamment une douleur au point de prélèvement sanguin.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Dans cette étude, nous utilisons un modèle animal présentant la même anomalie génétique que les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Ceci nous permet de simuler plus précisément les processus biologiques complexes entre les différents composants de l'organisme, à l'origine de la maladie. Il est impossible de simuler cela sans utiliser un modèle animal.

Réduction

Grâce aux données de nos expériences précédentes, nous avons pu calculer le nombre minimal d'animaux nécessaires à cette étude pour obtenir des données concluantes et fiables. Ceci nous permet de limiter la souffrance animale. Une phase pilote à plus petite échelle, avec un nombre réduit d'animaux, sera menée au préalable afin de vérifier l'adéquation du protocole expérimental à la collecte de données. Cela évite tout gaspillage de vie animale si le protocole s'avère inadéquat pour l'obtention de données concluantes et fiables. Enfin, un maximum de données et d'observations sera collecté lors des expériences afin d'éviter de les répéter ultérieurement.

Raffinement

Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés en douceur très régulièrement. Les animaux sont hébergés à deux ou plus et le milieu est enrichi. La douleur est prise en charge tout au long des procédures, y compris de manière préventive avant les traitements, grâce à l’utilisation de molécules destinées à la sédation et anti-douleur. Afin d’anticiper tout signe de douleur, des critères de suivi du bien-être ont été établis et sont évalués quotidiennement en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Ces critères portent sur l’aspect général des animaux (pelage et yeux), leur comportement (mobilité) et l’état général de l’animal (masse corporelle). En cas de signes de douleur, des mesures sont prises : surveillance renforcée (biquotidienne) et mesures médicamenteuses visant à atténuer ou supprimer la douleur.

Choix des espèces

L’espèce choisie est un mammifère appartenant à la même classe que l'être humain. Cette proximité évolutive en fait un modèle apprécié. Il partage de nombreux aspects anatomiques et physiologiques avec l’humain, notamment pour la constitution et le fonctionnement des organes ainsi que les processus métaboliques. Les récents outils génétiques ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculaires. Ce modèle animal mime ce type de maladies humaines de manière très fidèle et il est un excellent complément aux autres modèles. Nous utilisons notamment des animaux âgés de 1,5 et 6 mois, car ces âges correspondent respectivement aux stades précoce et tardif de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Grâce à eux, nous pourrons comparer les réponses du système immunitaire entre ces deux stades de la maladie.

12 096 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une infection respiratoire leur est provoquée par une administration unique de virus ou de bactéries dans les voies aériennes sous anesthésie, puis des traitements sont administrés jusqu'à deux fois par jour pendant plusieurs semaines. Le porteur annonce une perte de poids, une baisse d'activité, une respiration rapide ou difficile et, dans les cas les plus graves, des complications pulmonaires ou générales, effets qu'il déclare "nécessaires" à l'évaluation des traitements. Les effectifs qu'il détaille, sept groupes de six à douze animaux par étude, ne sont jamais rapportés aux 12 096 souris annoncées, et ni les pathogènes ni les molécules testées ne sont nommés.

Objectifs

Les infections respiratoires constituent un problème majeur de santé publique, à l’origine d’un grand nombre d’hospitalisations et de décès chaque année. Elles regroupent différentes entités cliniques, d’origine bactérienne ou virale, pouvant évoluer vers des formes sévères telles que les pneumonies ou les syndromes de détresse respiratoire aiguë. Parmi elles, les pneumonies acquises sous ventilation mécanique (PAVM) représentent une complication fréquente et grave chez les patients en réanimation, caractérisée par une inflammation pulmonaire aiguë et la colonisation des voies respiratoires profondes par des agents pathogènes opportunistes, souvent hyper- virulents et/ou multi-résistants. Les options thérapeutiques actuelles demeurent limitées et parfois inefficaces face à l’antibiorésistance croissante. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux traitements ou de repositionner des molécules existantes afin d’améliorer la prise en charge des infections respiratoires sévères. Le présent projet s’inscrit dans ce cadre et a pour objectif de développer et caractériser des modèles précliniques d’infection respiratoire bactérienne et virale permettant l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. Ces modèles ont pour finalité de reproduire différentes situations cliniques : mimer une infection physiologique par voie respiratoire haute ou reproduire des infections pulmonaires profondes de type PAVM. Ces études permettront d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules dans des contextes infectieux variés, de documenter leurs effets sur la charge bactérienne, la réponse inflammatoire et la fonction respiratoire, et de sélectionner les candidats les plus prometteurs pour la poursuite du développement préclinique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à étudier et valider, dans un contexte physiopathologique pertinent, l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques ou de molécules repositionnées dans le traitement des infections respiratoires bactériennes et virales, incluant les pneumonies acquises sous ventilation mécanique. Les bénéfices attendus concernent la mise au point de modèles précliniques d’infection respiratoire permettant d’évaluer chez l'animal l’efficacité de ces molécules sur des infections pulmonaires induites par des souches d’intérêt clinique, et de comparer leur efficacité à celles des traitements de référence. Ces études permettront également de mieux comprendre leurs mécanismes d’action à travers l’analyse de la charge bactérienne, des biomarqueurs inflammatoires et de la réponse pulmonaire. À terme, ce projet contribuera à identifier des candidats thérapeutiques prometteurs susceptibles de réduire la sévérité et la durée des infections respiratoires, d’améliorer la fonction pulmonaire et de diminuer la mortalité associée à ces pathologies.

Procédures

Les animaux participeront à une étude visant à reproduire une maladie respiratoire, puis à tester l’efficacité de différents traitements. Pour induire la maladie, les animaux recevront une administration unique de virus ou bactérie pathogènes au niveau des voies respiratoires. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie afin de limiter toute douleur ou inconfort et durera quelques minutes. Certains animaux recevront uniquement une solution sans principe actif afin de servir de groupe de comparaison. Les traitements étudiés pourront être administrés avant ou après l’apparition de la maladie, sur une durée pouvant aller de quelques jours à plusieurs semaines. La fréquence d’administration pourra varier de quelques fois par semaine à une ou deux fois par jour selon les besoins de l’étude. Les modes d’administration pourront varier en fonction du composé et de la posologie envisagée. Ces manipulations peuvent entraîner un stress lié à la manipulation ainsi qu’un inconfort léger et transitoire. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l’étude, sous anesthésie, à intervalles espacés et dans des volumes respectant les recommandations en vigueur. Les animaux seront surveillés pendant leur réveil après chaque intervention. À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires, après anesthésie, afin de permettre des analyses complémentaires.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de l’étude, les animaux développeront une infection respiratoire. Cela pourra entraîner des signes de maladie tels qu’une perte de poids, une diminution de l’activité, une respiration plus rapide ou difficile, ainsi qu’un état de fatigue. Dans les cas les plus sévères, l’infection pourra provoquer des complications au niveau des poumons ou affecter plus largement l’organisme. Ces effets sont attendus dans ce type de modèle et sont nécessaires pour permettre l’évaluation des traitements étudiés. Les traitements testés ne devraient pas entraîner d’effets indésirables particuliers, car les doses utilisées sont connues pour être bien tolérées.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Les poumons et le sang seront prélevés à des fins d’analyses.

Remplacement

L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules dans le traitement des infections respiratoires bactériennes et virales nécessite de disposer de modèles animaux capables de reproduire la complexité de la pathologie humaine, incluant la réponse immunitaire, l’inflammation pulmonaire, l’élimination de l’agent pathogène et les lésions tissulaires associées. Bien que des essais sur cellules soient réalisés en amont pour évaluer la toxicité, la réponse inflammatoire cellulaire et l’activité antimicrobienne ou antivirale des composés, ces approches ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions entre les pathogènes, le système immunitaire et les organes cibles. L’utilisation du modèle souris reste indispensable pour évaluer de manière intégrée les effets du traitement sur l’infection, l’inflammation et la fonction pulmonaire. Les procédures proposées présentent donc un caractère de stricte nécessité scientifique et ne peuvent être remplacées par des méthodes alternatives ne faisant pas appel à l’animal vivant.

Réduction

Pour chaque étude pilote, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les concentrations d’inoculum testées (3 concentrations) selon les souches, seront choisies en s’appuyant sur les modèles infectieux déjà décrits dans la littérature. Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour obtenir une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité des traitements. L’analyse des données impliquera la comparaison de 7 groupes (4 groupes pour les pilotes) de 6 à 12 animaux pour chaque étude et bénéficiera d'une analyse statistique appropriée.

Raffinement

Pour chaque souche bactérienne ou virale testée, une étude pilote sera menée sur un petit nombre d'animaux afin d'optimiser les études ultérieures. Les conditions d’hébergement respecteront les exigences réglementaires pour le respect de l’animal ; 5 à 6 souris par cage selon le poids de l’animal, avec nourriture et eau à disposition et présence d’un enrichissement. Les procédures seront réalisées dans une pièce calme, différente de la pièce d’hébergement. Pour limiter le stress, la peur et l’angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l’expérimentateur) avant le début de l’étude, leur environnement sera enrichi avec du matériel de nidification et de divertissement afin que les animaux puissent exprimer leur comportement naturel. Une manipulation des animaux à l'aide d'un tunnel ou avec les mains en coupe sera privilégiée pour limiter la contention des souris par la queue. Pour minimiser l'impact sur les souris, une étude pilote sera menée sur un petit nombre d'animaux afin d'optimiser les études ultérieures. Toutes les procédures d’infection seront réalisées sous anesthésie générale afin de bien maîtriser le geste et prévenir toute douleur ou inconfort. L’anesthésie sera induite par inhalation (induction et maintien au masque) ou par une injection d'un couple anesthésiant/analgésique. Dans ce dernier cas, l’anesthésie sera interrompue au bout d’environ 30 minutes, afin de favoriser un réveil rapide et limiter la durée d’exposition anesthésique. Les manipulations seront effectuées par du personnel formé et habilité, maîtrisant les techniques d’administration et de surveillance anesthésique. Les animaux anesthésiés seront surveillés jusqu’à leur réveil. L’administration dans les poumons, nécessitant la mise en place d’une sonde, sera réalisée avec précaution afin de limiter les lésions locales et les risques d’irritation, à l’aide d’un endoscope à fibre optique. Cette stratégie de raffinement vise à assurer une maîtrise rigoureuse de la douleur et du stress, à limiter les nuisances tout en maintenant la validité scientifique et la reproductibilité des modèles d’infection respiratoire mis en œuvre.

Choix des espèces

La souris a été choisie car elle constitue un modèle de référence pour l’étude des infections respiratoires bactériennes et virales. Sa réponse immunitaire bien caractérisée, sa reproductibilité expérimentale et sa taille adaptée permettent d’obtenir des résultats fiables tout en limitant la quantité de composé administrée et les nuisances associées. Les animaux seront âgés de 6 à 8 semaines au minimum, au début de l’étude, en accord avec la littérature existante pour effectuer ces différents modèles. De plus, à cet âge, le système immunitaire de ces animaux est totalement développé.

Une encéphalomyélite est provoquée par une injection sous la peau accompagnée de deux injections intrapéritonéales, puis 1 750 souris subissent gavages, prélèvements sanguins répétés et ponctions de liquide céphalorachidien, toutes tuées à l'issue par ponction cardiaque, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. L'objectif est de tester des molécules candidates contre la sclérose en plaques, dont l'arrivée en clinique reste renvoyée à un "terme" non daté. Le porteur décrit des déficits moteurs progressifs et une perte de poids qui "pourra être importante", l'incapacité complète à se déplacer constituant un point limite, et prévoit de réhydrater par injection sous-cutanée les souris qui n'atteignent plus l'eau. Il affirme dans le même temps que ces déficits moteurs ne comportent aucune douleur associée.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans la recherche d’une nouvelle approche diagnostique ou d’un nouveau traitement pour la sclérose en plaques, une maladie qui touche le système nerveux central, en particulier le cerveau, les nerfs optiques et la moelle épinière. Dans cette pathologie, la transmission des influx nerveux est altérée, ce qui se manifeste par des symptômes très variables : engourdissement d’un membre, troubles de la vision, sensations de décharge électrique dans un membre ou le dos, troubles des mouvements. La sclérose en plaques évolue par poussées au cours desquelles les symptômes réapparaissent, mais aussi accompagnés de nouveaux symptômes. Au bout de quelques années, les poussées laissent des séquelles qui peuvent devenir très invalidantes (altération du contrôle des mouvements, de la perception sensorielle, de la mémoire, de la parole).

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur la sclérose en plaques. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour lesquelles les options sont pour le moment limitées.

Procédures

Induction de la maladie : au maximum 1 administration sous cutanée et deux administrations intrapéritonéale (

Impact sur les animaux

Une petite plaie pourra apparaître au niveau du site d’injection du CFA. Dans ce projet nous nous attendons à des déficits moteurs progressifs chez les animaux, sans douleur associée. Cependant les déficits moteurs empêchant complètement le déplacement seront des points limites. Une paralysie des sphincters n’est en général pas observée à part dans des cas très rares. Les animaux présenteront une perte de poids qui pourra être importante. Les administrations de produit et prélèvements et contentions associées pourront induire un stress léger de quelques minutes. Du fait de leur difficulté à se déplacer, les animaux pourront présenter de la déshydratation qui sera gérée par des injections sous cutanée de fluides de réhydratation.

Devenir

Après la procédure, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront, dans la mesure du possible, été au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité apparente. Elles auront si possible aussi été sélectionnées sur leurs propriétés pharmacocinétiques in vivo. Cependant, l’ensemble de ces données est insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée in vivo en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.

Réduction

Sur la base de nos expériences préalables et d’analyse des résultats par un test ANOVA, nous avons conclu qu’un nombre de 15 animaux par groupe est nécessaire si des paramètres variables sont mesurés (dosage de composé, scores cliniques). On pourra réduire jusqu’à 8 animaux pour une étude préliminaire. En moyenne, nous utilisons 10 animaux par groupe.

Raffinement

Dans le cadre de ce modèle, les animaux induits présenteront des déficits moteurs et de la perte de poids. Le poids sera suivi tous les jours et les pertes de poids persistantes ou importantes seront des points limites justifiant une euthanasie. Une déshydratation pourra résulter des déficits moteurs et de l’inflammation. Les animaux déshydratés seront réhydratés (NaCl ou RL SC). Les déficits moteurs seront quantifiés quotidiennement, afin de procéder à l’euthanasie des animaux dont l’état ne leur permettra plus d’aller chercher de l’eau et de la nourriture. La grille de scoring est détaillée dans la procédure. Des croquettes seront déposées en fond de cage ainsi que de la nourriture gélifiée. Des bâtons à ronger sont présents dans toutes les cages. Une paralysie des sphincters n’est pas attendue dans la plupart des cas mais ce point sera surveillé et une incapacité à uriner constituera un point limite.

Choix des espèces

La souris est l’espèce utilisée pour étudier la démyélinisation des neurones. Différents modèles induits de sclérose en plaques ont été décrits avec leurs avantages respectifs (Methods Mol Biol – 2012; 900: 381-401). Sur des souris de fond génétique SJL/J ou C57BL/6, l’induction de la sclérose en plaques par injection de protéines ou peptides provoquant une encéphalomyélite est considérée prédictive de la maladie humaine, car les altérations observées dans le système nerveux central ont une très grande similitude avec celles observées chez les patients atteints de sclérose en plaques. Des animaux sevrés (jeunes adultes de plus de 6 semaines) seront utilisés, ces modèles étant bien décrits chez les animaux adultes. Les adultes de plus de 10 semaines répondent mieux à l’induction, et seront privilégiés.

Les souris utilisées portent une mutation du gène Mecp2 qui installe chez les mâles, dès trente jours, apnées, hyperventilation, réduction de la mobilité, sensibilité accrue au stress et perte de poids. 454 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une biopsie d'identification, une injection de thérapie génique sous anesthésie gazeuse, puis des tests comportementaux dont certains durent jusqu'à 48 heures. Toutes sont tuées sous anesthésie profonde pour le prélèvement des organes, l'objet réel du projet étant de mesurer si un nouveau vecteur viral atteint le cerveau sans toucher le foie.

Objectifs

Le syndrome de Rett est une maladie génétique rare qui touche le développement du cerveau. Elle affecte presque exclusivement les filles et entraîne un handicap intellectuel sévère et progressif. Dans la grande majorité des cas, la maladie est causée par une anomalie d’un gène appelé MECP2. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de guérir le syndrome de Rett. Les prises en charge actuelles visent surtout à réduire les symptômes afin d’améliorer la qualité de vie des patientes. Ces symptômes incluent notamment des difficultés à bouger volontairement, des troubles de la respiration, du sommeil et de l’alimentation. En 2007, des chercheurs ont montré qu’il était possible de corriger la maladie chez des souris atteintes, même à un stade avancé. Cette découverte a suscité beaucoup d’espoir et a ouvert la voie au développement de thérapies géniques, qui consistent à apporter une version saine du gène défectueux dans les cellules à l’aide d’un virus modifié. Cependant, traiter le cerveau reste difficile en raison d’une barrière naturelle qui le protège des substances étrangères. Les virus utilisés jusqu’à présent atteignent peu efficacement le cerveau et peuvent provoquer des effets indésirables, notamment au niveau du foie. Récemment, un nouveau type de virus a été développé pour cibler plus efficacement le cerveau tout en limitant les effets ailleurs dans l’organisme. Cette étude a pour objectif d’évaluer ce nouveau virus, appelé AAV.Cap-B10, comme traitement potentiel du syndrome de Rett chez des souris, en analysant à la fois son efficacité et sa sécurité.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester l’efficacité d’un nouveau virus conçu pour agir uniquement sur le cerveau, sans affecter les autres organes. Ce virus est utilisé comme outil pour apporter un gène thérapeutique dans le cadre d’un traitement par thérapie génique d’une maladie du système nerveux. Si le virus se révèle capable d’atteindre le cerveau de manière efficace et uniforme, ces résultats pourront être utiles à d’autres équipes travaillant sur le traitement de différentes maladies du cerveau. Par ailleurs, si le traitement montre des effets positifs, cette étude constituera une étape clé avant de poursuivre les recherches sur un modèle plus proche de la maladie humaine, puis d’envisager des essais cliniques chez les patientes.

Procédures

Les animaux seront soumis à: - une biopsie pour identification et classement des animaux (une dizaine de secondes – 1 fois) - une anesthésie générale gazeuse au cours de laquelle sera réalisée l'injection pour la thérapie génique (durée environ 10min - 1 fois) - des tests comportementaux non invasifs (durée variable selon les tests de 5minutes à 48h – 1 à 3 fois par tests selon les groupes) - une anesthésie générale profonde pour la mise à mort (durée 30min – 1 fois)

Impact sur les animaux

Dans ce modèle de souris, les mâles et les femelles déclarent plusieurs symptômes mimant ceux présents dans le syndrome de Rett. Les mâles montrent une apparition sévère des symptômes de manière précoce (environ 30 jours après la naissance). Chez les femelles les symptômes apparaissent plus tardivement (vers 5mois) et sont moins sévères, la souris est progressivement atteinte. Les effets indésirables attendus chez ces souris comprennent : - une altération des fonctions respiratoires conduisant à des apnées ou de l’hyperventilation - une altération des fonctions motrices conduisant à une réduction de la mobilité - une sensibilité accrue au stress et une perte de poids seulement chez les mâles (les femelles présentent à l’inverse une prise de poids). La manipulation des animaux pour les tests de comportement peut induire du stress chez les animaux.

Devenir

Les animaux de l’étude sont mis à mort en fin de procédure afin de prélever les différents organes nécessaires à la suite de l’étude.

Remplacement

La pathologie nécessite l’étude du cerveau et se caractérise par un polyhandicap sévère. Pour l’étudier sous toutes ses dimensions un modèle de culture cellulaire n’est pas envisageable. Il est donc nécessaire d'avoir recours à un modèle animal de la pathologie pour espérer produire des résultats qui seront transférables chez l’homme. L'expérimentation sur l'animal permettra d'acquérir le recul et les compétences requises à une recherche translationnelle, c’est-à-dire que l’on souhaite que les résultats soient directement applicables à l’homme.

Réduction

Les différences entre les animaux sont limitées grâce à l’utilisation de souris génétiquement identiques. Le nombre de souris utilisées a été choisi à partir de nos études précédentes et de calculs statistiques, afin d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le moins d’animaux possible. En première intention, les procédures seront réalisées sur la moitié des animaux prévue. Les résultats seront analysés de manière statistique. Si une différence claire et significative est observée entre les groupes, il ne sera pas nécessaire d’augmenter le nombre d’animaux dans l’étude.

Raffinement

L’hébergement est adapté aux besoins physiques et physiologiques des animaux et permet l’expression de leur gamme normale de comportements. Les souris sont hébergées au maximum par 5 dans des cages enrichies (litière, dôme et bandelettes en carton) avec nourriture et eau à volonté, dans une pièce thermo-contrôlée en alternance jour/nuit. Les souris étant particulièrement sujettes au stress, la manipulation des animaux et le change des cages seront faits par des personnes compétentes et sensibilisées à la contention low stress (approches qui visent à réduire au maximum le stress) et à la fragilité de la lignée. Une période d’habituation à l’expérimentateur et aux tests de comportements est prévue le cas échéant. L’anesthésie, sous forme gazeuse, suit les protocoles standards et sera accompagnée d’une analgésie et d’un suivi post-opératoire approprié. Des points limites clairs sont définis et évalués via une grille de suivi du phénotype des animaux afin de mettre en place les soins adaptés le plus précocement possible (antiseptiques, antalgique, anti inflammatoire). En parallèle, l'état général de nos animaux ainsi que l'état de la cage, de la nourriture et de l'eau seront surveillés quotidiennement. Une période d’habituation avec l’expérimentateur et aux tests comportementaux le cas échéants est prévue afin de réduire le stress de nos animaux.

Choix des espèces

La souris permet actuellement de disposer facilement et rapidement d’un modèle mammifère de maladie génétique par manipulation du génome. L'intérêt général du modèle souris, utilisé comme modèle pré-clinique, repose essentiellement sur la proximité physiologique et pathologique avec l'espèce humaine. Utiliser ce modèle augmente les chances de réussite vers le passage à l’Homme. La souris génétiquement modifiée sur le gène Mecp2 est le modèle le plus largement utilisé par les laboratoires de recherche dans les études sur le Syndrome de Rett. Il est largement caractérisé dans la littérature ce qui permet une bonne compréhension des animaux. Les souris seront incluses dans l’essai préclinique à 30 jours. Période à laquelle apparaissent les premiers symptômes chez les mâles et donc est plus proche de ce qui se passerait chez l’homme. L’apparition des premiers symptômes étant nécessaire au diagnostic de la pathologie. Les femelles et mâles utilisés pour la reproduction seront mis en contact durant la période de fertilité optimale respectivement de 2 à 8 mois et de 2 mois à 1 an afin d’obtenir des mâles et des femelles malades nécessaires à l’étude. Les deux premiers mois correspondent au temps nécessaire à l’acquisition de la maturité sexuelle.