Procédures sévères

Le nerf sciatique est mis à nu par incision cutanée trois à huit fois par animal, une vingtaine de minutes à chaque fois. 1 530 souris porteuses d'une tumeur du colon reçoivent une chimiothérapie qui provoque une neuropathie périphérique, 1 440 d'entre elles dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur qualifie les douleurs des pattes de "sensations d'inconfort", tout en précisant qu'elles peuvent apparaître dès les premiers jours et "ne disparaîtront pas". Toutes sont tuées pour prélever cerveau, nerfs sciatiques, peau des pattes, ganglions et tumeur, et les tests censés évaluer leur douleur, environ trois fois par semaine pendant deux à huit semaines, ne sont pas nommés.

Objectifs

Nous avons mis au point un modèle murin de neuropathie périphérique induite par la chimiothérapie sur des souris. Nos résultats suggèrent que l’administration de molécules vasodilatatrices améliore les symptômes d’une neuropathie périphérique chimiquement induite. Afin d’évaluer cette piste thérapeutique, il est important de vérifier qu’elle n’interfère pas avec l’efficacité antitumorale de la chimiothérapie. Pour ce faire, nous souhaitons induire une neuropathie périphérique chez des souris présentant une tumeur abdominale provoquée par une injection de cellules cancéreuses du colon murin. Ce projet permettra donc de statuer sur l’utilisation de ces molécules vasodilatatrices dans le traitement des symptômes neuropathiques induits par la chimiothérapie aux stades aigus et chroniques.

Bénéfices attendus

Si nous prouvons dans ces expériences que l’administration conjointe d’une chimiothérapie et de molécules vasodilatatrices, seules ou en combinaison, n’interfère pas avec l’efficacité du traitement anti-cancéreux, alors l’utilisation de ces molécules vasodilatatrices dans le traitement des symptômes neuropathiques induits par une chimiothérapie aux stades aigus et chroniques pourra être envisagée. Cela permettra aux patients de mieux supporté les traitements anti cancéreux et pourra éventuellement, en évitant l’abandon des soins, augmenter le pronostic des patients.

Procédures

Les animaux recevront une injection de cellules tumorales par 3 voies différentes. Pour deux d’entre elles, une seule injection rapide dans l’abdomen de l’animal sera suffisante. Pour la dernière, la procédure nécessitera l’endormissement de l’animal et une petite procédure chirurgicale d’environ 20 minutes. Ensuite, les animaux recevront différentes molécules d’intérêt dans le traitement des douleurs. Ces injections sont rapides, tous les jours ou tous les deux jours pendant 2 à 8 semaines. Enfin, l’administration de chimiothérapie sera effectuée une fois tous les deux jours pendant 2 semaines ou une fois par semaine pendant 8 semaines. Afin de suivre la progression tumorale, les animaux recevront entre 3 et 8 injections d’un produit permettant la visualisation de la tumeur. Les animaux seront soumis à une incision cutanée afin d’exposer le nerf sciatique 3 à 8 fois pendant une vingtaine de minutes. Enfin, les animaux seront soumis à différents tests comportementaux permettant d’évaluer leur douleur. Ces tests seront effectués en moyenne 3 fois par semaine pendant 2 à 8 semaines et auront une durée d'environ 15 minutes pour chaque animal.

Impact sur les animaux

Les souris recevant une dose cumulée de chimiothérapie, nous pouvons nous attendre à une petite perte de poids de nos animaux. Les souris traitées à la chimiothérapie développeront une neuropathie périphérique avec des sensations d’inconfort au niveau des pattes notamment. Ces sensations douloureuses pourront être ressenties dès les premiers jours de la procédure et ne disparaitront pas. Une sensation d’inconfort pourra être ressentie après l’incision cutanée nécessaire à la réalisation du laser doppler. La manipulation des animaux lors des différentes administrations pourra engendrer un léger stress chez les animaux. Le développement des tumeurs pourra, en fonction du modèle, engendrer une gêne causée par la présence d’une masse tumorale au niveau de l’abdomen ou une gêne post-chirurgicale au niveau des sutures au niveau de l’abdomen. Les tests comportementaux utilisés pour évaluer la douleur pourront également engendrer du stress et de la gêne chez les animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l’issue de chacune des procédures et nous prélèverons les organes (cerveaux, nerfs sciatiques, peaux de pattes, ganglions dorsaux, tumeur) afin de conduire des études post mortem.

Remplacement

Ce projet modélise une pathologie humaine, la neuropathie périphérique chimiquement induite à un stade chronique et l’effet d’une potentielle solution thérapeutique. Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres comportementaux et physiologiques ; il n’est pas possible de s’affranchir de l’expérimentation animale.

Réduction

Le nombre d’animaux a été dimensionné pour permettre l’obtention de résultats statistiquement valides en prenant en compte les différents risques inhérents aux types d’expériences réalisées.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une semaine ou plus. Les incisions nécessaires seront effectuées avec une analgésie et une anesthésie appropriées. Les animaux seront suivis grâce à une grille de score permettant la mise en place de points limites précoces permettant la prise en charge de toute douleur ou souffrance de façon rapide. Certaines expériences ont été raffinées grâce à un suivi par fluorescence non invasif.

Choix des espèces

Nous utiliserons pour ces expériences des souris males immunocompétents, espèces largement utilisées dans la recherche en cancérologie pour sa capacité d’incrémenter l’incidence tumorale après injection des cellules cancéreuses. La neuropathie périphérique chimiquement induite est un effet secondaire de nombreux traitement anti-cancéreux. C’est donc une pathologie qui touche majoritairement les adultes. Nous travaillons alors chez la souris adulte, âgée entre de 3 et 6 mois.

Exposées sept minutes aux rayons X, infectées par Toxoplasma gondii, gavées une fois par jour pendant deux semaines et soumises à des injections hebdomadaires, les souris de ce projet subissent aussi jusqu'à deux prélèvements sanguins. 1 680 souris vont être utilisées, dont 1 605 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leur cerveau et leurs organes lymphoïdes. Le projet porte sur les lymphocytes T résidents mémoires qui contrôlent la persistance du parasite dans le cerveau, avec des retombées annoncées pour les personnes immunodéprimées exposées à une encéphalite toxoplasmique. Pour décrire ce que subissent ces souris, le porteur retient une perte de poids pouvant atteindre 20 % entre le septième et le quinzième jour, puis une phase chronique qu'il qualifie de généralement asymptomatique, sans expliquer ce qui justifie de classer 1 605 d'entre elles en souffrance sévère.

Objectifs

Le parasite Toxoplasma gondii (Toxo) peut infecter une large gamme d’animaux , dont la souris (hôte dit naturel) et l’homme (hôte dit accidentel). Chez l’Homme, il est responsable d’encéphalites (inflammation du système nerveux central) chez les sujets immunodéprimés et de malformations chez le fœtus. Les lymphocytes T (LT) CD8 jouent un rôle primordial dans la lutte contre les pathogènes intracellulaires tels que Toxo. Nous avons récemment demontré que la différenciation des LT CD8 en LT dit résidents mémoires des tissus, aussi appelés Trm, était requise pour contrôler la persistence du parasite au sein du cerveau lors de la phase chronique de l’infection. La compréhension de la réponse immunitaire médiée par les Trm contre Toxo est donc essentielle au developpement de nouvelles thérapies contre ce type de pathogène chronique qui établit une latence à long-terme chez son hôte et peut se ré-activer de manière souvent fatale chez les sujets immunodéprimés. Nos résultats préliminaires ont identifié des voies de signalisation qui pourraient contribuer à la persistence et aux fonctions protectrices des Trm dans le cerveau. Dans ce projet, nous utiliserons l’infection chez la souris par le parasite Toxo pour étudier le rôle de molécules impliquées dans le developpement et la persistance des Trm dans le système nerveux central. En particulier nous déterminerons les conséquences de l’élimination de molécules cibles dans les Trm sur le contrôle de l’infection. Ainsi, les résultats attendus de notre étude aideront au développement de nouvelles thérapies ciblées et plus efficaces contre de nombreuses infections chroniques, mais aussi potentiellement dans le cancer où la présence de Trm a été montrée comme étant un indicateur de bon prognostic et de réponse à l’immunothérapie du cancer.

Bénéfices attendus

Sous sa forme latente, le parasite Toxo présent dans le cerveau d'une personne exposée peut se réactiver et causer une encéphalite en cas de défaillance immunitaire. Notre projet permettra d'identifier des mécanismes de protection immunitaire contre l'infection chronique du cerveau par T. gondii et de mieux comprendre comment les réactions immunitaires influencent le fonctionnement cérébral. Ainsi ce projet pourrait améliorer la prise en charge de personnes à risque d'encéphalite toxoplasmique en cas d'immunodépression (SIDA, cancer...) mais aussi plus généralement les résultats attendus de notre étude aideront au développement de nouvelles thérapies contre les infections chroniques.

Procédures

Les souris recevront une exposition aux rayons X pendant environ 7 minutes. Elles subiront des injections intraveineuses et/ou intrapéritonéales (1 injection toutes les semaines pour un maximum de 4 semaines), des administrations orales (gavage) de médicaments une fois par jour pour un maximum deux semaines, et des prélèvements de sang (maximum 2 prélèvements espacés de 4 semaines). Toutes les injections ne durent que quelques secondes et s'effectuent sur animaux anesthesiés à l'exception des injections d'anticorps et des gavages qui s’effectuent sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

La phase aiguë de l'infection par T. gondii est habituellement symptomatique entre Jour 7 et Jour 15 (phase aiguë de la toxoplasmose) et les souris peuvent perdre jusqu’à 20% de leur poids initial. S’en suit la phase chronique qui est généralement asymptomatique avec le parasite latent.

Devenir

Tous les animaux intégrés dans chaque procédure expérimentale seront mis à mort en fin d’étude afin de prélever les organes (Cerveau, organes lymphoides secondaires) nécessaires aux analyses phénotypique et fonctionnelles des cellules immunitaires et en particulier des Trm mais aussi des mesures de charges parasitaires et d'inflammation.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Lorsque cela est possible, des expériences in vitro utilisant des lymphocytes T et des lignées cellulaires infectées par T. gondii sont réalisées. De plus, au lieu d'être propagé in vivo dans des souris comme c'était le cas historiquement, le parasite est cultivé sur des fibroblastes humains. Cependant, ces techniques ne permettent pas d’étudier l’impact des lymphocytes T sur le contrôle du parasite et la neuroinflammation, et n’interviennent qu’en complément de l’expérimentation animale. La complexité des systèmes immunitaires et nerveux, et du tissu cérébral, autant dans sa composition cellulaire que son architecture, fait qu’il est impossible de simuler (sous forme de modélisation informatique ou d’expériences en culture cellulaire) la ‘connectique’ des populations cellulaires mises en jeu. Il n’est donc actuellement pas possible de répondre aux objectifs proposés dans ce projet par des méthodes excluant totalement l’utilisation du modèle animal.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Nous avons également pu valider certaines approches expérimentales in vitro permettant d’optimiser l’utilisation des animaux. Afin d’assurer la fiabilité de nos résultats, nous travaillerons avec des groupes tests et contrôles d’au minimum 5 animaux et répéterons nos expériences 3 fois. Le nombre d’animaux utilisés correspond dans nos expériences et dans celles des groupes travaillant sur des modèles équivalents au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Ceci garantira la valeur statistique de l'étude en intégrant les variations expérimentales et les variations inter-individus. Les tests statistiques varient suivant les expériences et sont réalisés avec un logiciel de statistique adapté.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prenons ceci en compte grâce au suivi rapproché quotidien des animaux qui évaluera leur état général (prise de nourriture, toilettage, mouvements), l’aide à l’alimentation en cas de besoin, l’enrichissement de leur environnement et le respect de l’aspect social du groupe (pas d’isolement ni de changement de cage). L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal selon les points limites d’arrêt de la procédure définis dans notre fiche de scoring pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les signes cliniques attendus de l’infection sont : - En phase aiguë (J7-15) : perte de poids et mobilité réduite. Les animaux seront mis à mort sous 24h si ils atteignent un des score limite défini sur notre fiche de scoring. Il sera nécessaire de respecter un délai de 24h car le développement d’une réponse immunitaire permet dans bon nombre de cas une amélioration rapide de l’état général et la transition vers la phase chronique moins symptomatique. - En phase chronique (>J15) : ataxie / syndrome vestibulaire. Les animaux seront euthanasiés en cas de présence de l’un de ces signes. La procédure ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires, car ils risquent d’interférer avec les processus inflammatoires au cours de notre expérimentation.

Choix des espèces

T. gondii peut infecter tout animal homéotherme mais les rongeurs sont des hôtes naturels du parasite. Compte-tenu des nombreux outils d'analyse de la réponse immunitaire qui existent chez la souris, cette espèce est pertinente pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires des interactions hôte-parasite. De plus, la physiopathologie de la toxoplasmose chronique chez la souris reproduit plusieurs caractéristiques retrouvées chez l’homme : rôle protecteur de l’immunité cellulaire médiée par les lymphocytes T, kystes persistant dans le cerveau, phénomène d’encéphalite, modifications comportementales. Des souris adultes, âgées de 2 à 5 mois (afin de participer à l’effort de réduction car la susceptibilité à l’infection varie peu à ces âges), seront utilisées afin de pouvoir étudier les effets des manipulations sur un système nerveux central et immunitaire mature. Dans le cas des transferts de moelle osseuse, la reconstitution du système hématopoïétique prend 8 à 10 semaines, puis les souris subiront la procédure d'infection par Toxo et seront suivies 11 semaines après infection, donc l’âge maximal d’utilisation des souris sera de 30 semaines.

Séparés de leur mère, gavés de lait artificiel quatre fois par jour et exposés à un manque d'oxygène dix minutes trois fois par jour pendant trois jours, des souriceaux de huit jours comptent parmi les 699 souris de ce projet, toutes tuées, dont 371 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les adultes reçoivent pendant cinq jours, sur trois cycles, un composé dans l'eau de boisson sucrée qui provoque une inflammation intestinale, une perte de poids et des diarrhées, ou un gavage unique après quatre heures de jeûne. Le porteur qualifie le gavage d'inconfortable mais non douloureux, et les épisodes d'hypoxie de sources de stress bien que courts. L'objectif reste fondamental, comprendre le rôle des cellules souches dans le renouvellement de l'intestin, les applications pour les patients étant qualifiées de potentielles.

Objectifs

La régénération et le renouvellement tissulaire sont orchestrés par les cellules souches, qui se différencient et s'auto-renouvellent. L'équilibre entre l'auto-renouvellement, la prolifération et la différentiation dépend du microenvironnement des cellules souches. Ici, nous utilisons un tissu à fort renouvellement, l'intestin et ses cellules souches résidentes, comme modèle pour étudier la régénération.

Bénéfices attendus

Les découvertes issues de ce projet de recherche fera progresser significativement notre compréhension de la biologie intestinale et d'offrir des applications translationnelles potentielles pour améliorer les résultats pour les patients dans divers contextes médicaux.

Procédures

Les souris seront soumises à un traitement dans l'eau de boisson sucrée pendant 5 jours sur 3 cycles, une seule courte injection d'un composé chimique pendant 15 secondes ou un seul gavage d'une minute d'un composé chimique après un jeun de 4 heures. Une petite quantité de sang sera prélevée quelques minutes avant la fin de la procédure sous analgésie et anesthésie générale Les jeunes souris seront nourries de lait artificiel par gavage 4 fois par jour (1 minute) pendant 3 jours consécutifs et exposées à de l'hypoxie (10 min) 3 fois par jour pendant 3 jours.

Impact sur les animaux

La séparation de la mère et les épisodes d'hypoxie bien que courts peuvent être source de stress pour les souris. Le gavage par sonde adaptée à la taille de l'animal est considéré comme inconfortable mais non douloureux. Les souris seront soumises à un protocole induisant une légère perte de poids et des potentielles diarrhées. L'injection peut engendrer une douleur modérée mais locale. Le sang sera prélevé sous analgésie et anesthésie générale.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour prélèvement d'intestin et analyses dans le cadre de notre étude.

Remplacement

L'intestin est un organe complexe impliquant de nombreux composants : bactéries, circulation sanguine et lymphatique, neurones, muscles et système immunitaire. Le but de ce projet est d'identifier le rôle des cellules souches dans l'homéostasie, le développement et la régénaration de l’intestin. Réduire le projet à un système in vitro pourrait nous priver de découvertes pertinentes liées à la complexité des interactions systémique présentes dans l'intestin et il est donc essentiel d'étudier les cellules dans leurs conditions physiologiques.

Réduction

Nous utilisons autant que possible des animaux de mêmes portées afin de limiter la variabilité. Chaque souris fera l'objet de multiples analyses et les tissus prélevés seront exploités pour plusieurs types d'expériences, maximisant ainsi les données obtenues par animal. Nous utilisons des modèles cellulaire qui permettent de reproduire partiellement l'intestin en culture. Enfin, des outils statistiques seront systématiquement appliqués pour déterminer le nombre minimal de souris nécessaire et assurer la signification statistique de nos résultats.

Raffinement

L'introduction par voie orale de composé chimique ou de lait est fait avec une sonde et un volume adapté à la taille de l'animal. Les injections sont faites avec une aiguille adaptée à la taille de l'animal. Le sang sera prélevé sous analgésie et anesthésie générale. Pour limiter la perte de poids, les souris ont à disposition de la nourriture humidifiées pendant toute la durée du traitement. Les jeunes souris sont gardées dans un incubateur pour maintenir leur température corporelle à 37°C. Les épisodes d'hypoxie sont courts et limités au minimum et se font en présence de poches de gel chaudes. Les animaux sont gardés en groupe dans un environnement enrichi, surveillés et pesés tous les jours et manipulés par des zootechniciens et manipulateurs formés. Une grille de score pour évaluer l'état général des souris est mise en place et en cas d'atteinte de points limites irréversible, l'animal sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris de laboratoire est un modèle largement reconnu et particulièrement avantageux pour nos recherches car des protocoles mimant la régénération tissulaire et les maladies inflammatoires de l'intestin ont été établis et validés. Enfin, la grande similarité génétique, métabolique et immunitaire de la souris avec l'Homme, notamment au niveau de son système intestinal, en fait un excellent modèle translationnel, promettant des avancées inestimables pour la compréhension des fonctions intestinales en santé comme en maladie. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 14 semaines pour étudier les maladies chroniques intestinales affectant les adultes et des jeunes souris de 8 jours pour étudier les maladies inflammatoires touchant les jeunes enfants.

4 296 souris vont être utilisées, toutes tuées, dont 312 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune pouvant subir jusqu'à six séances de microscopie de deux heures et trois semaines d'isolement en cage individuelle. Elles reçoivent une injection de cellules leucémiques, une implantation de tissu sous la peau, des prélèvements de sang ou de moelle osseuse chaque semaine jusqu'à la fin de l'expérience, et des traitements par gavage ou injection quotidienne. Le porteur reconnaît qu'aux stades avancés les animaux perdent leur tonicité et présentent des difficultés de locomotion, et demande une dérogation à l'hébergement en groupe qu'il justifie par la "nécessité" d'éviter blessures et stress. Les bénéfices annoncés, des traitements plus ciblés et mieux tolérés contre certaines leucémies, restent au conditionnel.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre comment certains cancers du sang, comme les leucémies, interagissent avec les vaisseaux sanguins dans leur tissu. L’objectif est d’identifier les anomalies présentes dans cet environnement lors du développement de la maladie. En utilisant des modèles de souris et des outils d’imagerie avancés, on veut repérer les mécanismes qui favorisent la croissance des cellules cancéreuses et tester de nouvelles approches pour les bloquer. Le projet sera réalisé dans 3 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet pourraient permettre d’améliorer l’efficacité des traitements contre certaines leucémies, en ciblant l’environnement tumoral. Comprendre comment l'environnement vasculaire influence la progression de la maladie pourrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques, plus ciblées et mieux tolérées par les patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de cellules leucémiques (1 fois, duree:

Impact sur les animaux

Les seances d'imagerie répétées peuvent entraîner un stress modéré chez les animaux, notamment en raison des manipulations et du transport associés aux séances d’imagerie. L’implantation des systèmes utilisés pour l’imagerie peut gêner légèrement le comportement de l’animal, sans toutefois compromettre sa mobilité ou son alimentation. L'hébergement individuel pendant une durée maximale de trois semaines peut induire un stress lié à l’isolement. À un stade avancé de la maladie, les animaux peuvent présenter des signes de souffrance (perte de tonicité, difficultés de locomotion, altération de l’état général). Les injections en sous-cutané, intra-vein, intra-peritoné peuvent cause une gene legere aux souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélèvement

Remplacement

Pour « Remplacer », nous avons mis en place un système de culture 3D qui reproduit le tissu leucemique humain et permet certaines expériences sans utiliser d’animaux. Afin de limiter le nombre de souris utilisées, nous veillons à ce que toutes les expériences possiblement réalisables in vitro sur système de culture 3D le soient. Cependant, celui-ci ne mimant que les interactions locales et pas systemiques, le développement de modèle in vivo reste nécessaire.

Réduction

L’étude directe des tumeurs humaines étant très limitée, nous utilisons des souris immunodéficientes pour mieux comprendre les leucémies humaines. Ce modèle est aujourd’hui le seul qui permette d’étudier ces maladies de manière fiable. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons développé des modèles d’organoïdes de leucémie humaine greffés chez ces souris. Ces greffes sont plus efficaces et plus reproductibles que les méthodes classiques, ce qui permet d’utiliser moins de souris par expérience. Nous utilisons également des techniques d’imagerie qui permettent de suivre l’évolution de la leucémie au cours du temps chez un même animal. Cela évite de devoir euthanasier les souris à chaque étape de l’étude. Les expériences sont réalisées avec des souris mâles et femelles, car le sexe n’influence pas le développement de la leucémie dans nos modèles. Enfin, le nombre de souris nécessaires est calculé à l’avance à l’aide d’outils statistiques afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant au maximum l’utilisation des animaux.

Raffinement

Pour éviter toute souffrance, les procédures d’imagerie et l’implantation d’organoïdes se feront sous anesthésie générale et avec administration d’analgésique. De plus, afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux souris, leur état fera l’objet d’une surveillance continue. Les souris seront hébergées dans des cages adaptées, incluant des éléments d’enrichissement appropriés. Enfin des points limites spécifiques ont été mis en place. Une dérogation à l’hébergement en groupe est demandée pour certains animaux. Cette dérogation est scientifiquement justifiée par la nécessité d’éviter toute blessure ou stress. Des mesures compensatoires seront mises en œuvre pour limiter l’impact de l’isolement sur le bien-être des animaux.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour les expériences menées pour la recherche en oncologie thérapeutique du cancer. En effet, la connaissance complète du génome de la souris permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt, ainsi qu’un grand nombre de modèles de cancers. De plus, la grande homologie avec l’Homme permet d’envisager de transposer les résultats obtenus chez la souris vers des applications cliniques. Nous utiliserons des souris adultes de 6-12 semaines. Cela représente l’âge permettant une bonne prise de greffe, et qui laisse le temps a la maladie de se développer sans que la souris vieillisse.

Une partie des souris porte une mutation qui détruit progressivement leur fonction rénale et les fait maigrir, l'autre reçoit un régime qui produit le même effet. 1 636 souris au total vont être utilisées, toutes tuées, dont 512 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des mesures toutes les deux semaines, des prélèvements sanguins sous anesthésie, jusqu'à sept jours d'isolement en cage métabolique et, pour certaines, deux injections par jour pendant quinze jours. Le porteur qualifie chacune de ces nuisances de légère et affirme que l'insuffisance rénale ne provoque ni douleur ni stress avant les stades avancés, tout en indiquant que les animaux seront gardés plusieurs mois, jusqu'à ce qu'ils aient développé cette insuffisance accompagnée d'une cachexie.

Objectifs

La cachexie est un syndrome d’amaigrissement sévère et involontaire qui ne peut pas être corrigé simplement par une approche nutritionnelle, et qui réduit fortement la qualité et l’espérance de vie des patients. Elle touche souvent les patients à des stades avancés de maladies chroniques telles que le cancer, les maladies rénales, cardiaques et pulmonaires ou maladies infectieuses. Jusqu'à présent la plupart des études se sont concentrées sur la cachexie associée au cancer, les autres types de cachexie, et en particulier celle associée aux maladies rénales chroniques (MRC), ont été peu étudiées. Les maladies rénales constituent un grave problème de santé publique, puisqu'elles touchent plus de 850 millions de personnes et représentent l'une des dix principales causes de décès prématurés dans le monde. À un stade avancé de la maladie rénale, notamment chez les patients sous dialyse, un syndrome appelé cachexie rénale peut apparaître. Elle se caractérise par une perte de masse maigre et/ou grasse menant à une altération fonctionnelle des patients. Il n’existe aujourd’hui aucune norme de soin pour la cachexie rénale et une meilleure compréhension des altérations métaboliques menant à son développement représente un enjeu crucial. L’objectif de ce projet est d'identifier de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce et de nouvelles cibles thérapeutiques pour une meilleure prise en charge de la cachexie rénale. A l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle in vitro qui permette de reproduire la complexité de la physiopathologie de la cachexie rénale, ce qui rend indispensable le recours à des modèles animaux pour appréhender les interactions biologiques complexes associées à cette pathologie. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

La cachexie rénale est un syndrome grave qui touche de nombreux patients atteints d’insuffisance rénale chronique. Elle réduit l’espérance de vie, entraîne une fatigue importante, des hospitalisations fréquentes, et rend difficile une vie sociale et professionnelle normale. Elle contribue donc au très fort impact économique des maladies rénales en Europe, qui est à la hauteur de 140 milliards d’euros par an. Ce projet de recherche vise à court terme à mieux comprendre la cachexie rénale et à développer des outils de diagnostic. À plus long terme, il pourrait mener à de nouveaux traitements, et ainsi améliorer la qualité de vie et la survie des patients.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur, les animaux subiront des mesures de composition corporelle (3 minutes/animal), de force musculaire (5 minutes/ animal) et de fonction rénale (45 minutes/animal) au maximum toutes les 2 semaines à partir de l’âge de 6 semaines. Ces mesures se font chez les animaux vigiles et sont non-invasives, les animaux pourront cependant être anesthésiés pendant quelques minutes pour certains gestes techniques. Des prélèvements sanguins (2 minutes) seront réalisés sous anesthésie toutes les 2 semaines également. Les animaux seront mis en cages métaboliques une fois pendant une durée maximum de 7 jours. Certains lots d’animaux recevront des traitements : soit 3 injections par semaine pendant une durée maximale de 2 mois ; soit 2 injections par jour pendant une durée maximale de 15 jours ; soit une injection unique. Certains animaux seront mis sous régime particulier. Dans le second établissement utilisateur, seules les procédures terminales seront réalisées.

Impact sur les animaux

Certains animaux de sont porteurs d’une mutation génétique responsable du développement d’une maladie rénale chronique. Celle-ci provoque une détérioration de leur fonction rénale et un amaigrissement, qui sont les critères recherchés dans notre projet. D’autres groupes d’animaux sont soumis à un régime alimentaire qui induit également une détérioration de leur fonction rénale et un amaigrissement. Le poids des animaux et leur état général seront suivis attentivement. L’insuffisance rénale ne provoque pas de douleur, ni de stress avant des stades avancés au cours desquels une baisse de l’alimentation et une altération de l’état général peuvent apparaitre. Tous les animaux seront soumis à : (1) suivi régulier de leur poids : léger stress lié à leur manipulation de la cage à la balance et vice-versa (2) prise de sang à la queue : léger stress et risque de saignement (3) mesure de leur composition corporelle: léger stress lié à leur contention transitoire (3 minutes) (4) mesures du métabolisme : léger stress lié à l'isolement (7 jours au maximum) dans une cage individuelle (5) mesure de la fonction rénale: légère douleur liée à l’injection, et léger stress lié à la présence du capteur pendant 1h maximum (6) traitements pharmacologiques : léger stress dû à la contention + légère douleur liée à l’injection

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vus de l'analyse de leur sang, leur urine et leurs organes.

Remplacement

La cachexie est un syndrôme multifactoriel, initiée par le tissu affecté (ici le rein), qui va conduire à l’altération métabolique et à la dysfonction de nombreux tissus vitaux. Ces tissus vont à leur tour sécréter de nombreux médiateurs pro-cachectiques, initiant un cercle vicieux qui aggrave la fonte des tissus musculaires et adipeux. De telles interactions inter-tissulaires dans un contexte d’insuffisance rénale sont donc impossibles à reproduire in vitro. Une approche complémentaire ex vivo sur des cellules primaires en culture est également utilisée, elle permet d’obtenir une grande quantité de cellules à partir d’un nombre restreint d’animaux

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 1636 souris. Les résultats seront interprétés en utilisant des tests statistiques.

Raffinement

Les études sont optimisées d’après la littérature et les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés, par groupes de 2 à 5 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement par les zootechniciens et plusieurs fois par semaine par les expérimentateurs afin de s’assurer de leur bien-être . Une grille de scoring et des points limites ont été établis. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (des anesthésiques et antalgiques seront utilisés pour les gestes qui le nécessitent, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les animaux sont transportés dans leur cage d'origine afin de minimiser le stress, pour un transport d'une durée de moins de 10 minutes.

Choix des espèces

Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale et la cachexie. Pour l’un des 2 modèles, nous utiliserons des souris âgées de 6 semaines au début de l'expérience, afin d’effectuer des mesures en conditions basales avant tout amaigrissement et perte de fonction rénale. Pour l’autre modèle, nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines au début du protocole. A cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques chez l’adulte. Nous garderons les animaux jusqu’à ce qu’ils aient développé une insuffisance rénale accompagnée d’une cachexie (processus se mettant en place sur plusieurs mois).

6 192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 5 040 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 1 152 un niveau modéré. Elles reçoivent deux injections de vaccin à ARNm à trois semaines d'intervalle sous anesthésie, une partie recevant en plus un anticorps trois fois par semaine pendant quatre semaines à l'état vigile, avant une exposition à la bactérie de la tuberculose par aérosol. Le porteur décrit des effets indésirables "légers" liés aux injections, et pour les souris infectées une perte de poids, une baisse d'activité et des troubles respiratoires chez les individus "insuffisamment protégés par la vaccination". L'effectif est présenté comme un maximum, réduit en cours de route par un schéma "en entonnoir", sans que le nombre de souris par groupe soit indiqué.

Objectifs

Le projet vise à développer des stratégies de vaccination à base d’ARNm pour lutter contre la tuberculose (TB), une maladie qui reste un défi majeur de santé publique mondiale. Actuellement, la TB est responsable de près de 1,5 millions de décès chaque année, en particulier dans les pays à faible et moyen revenu. Le vaccin BCG existant offre une protection partielle chez les jeunes enfants mais montre une efficacité limitée contre la TB pulmonaire chez les adolescents et les adultes. Ce projet repose sur l’exploitation de la plateforme vaccinale d’ARNm et de ses succès récents pour concevoir un vaccin plus efficace contre la TB. L’objectif principal du projet est d’explorer le potentiel de la vaccination ARNm pour stimuler des réponses robustes des cellules T, essentielles pour combattre l'infection par Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Les vaccins à ARNm, bien qu'ayant prouvé leur efficacité contre des agents pathogènes viraux tels que le SARS-CoV-2, n'ont pas encore été pleinement exploités contre les bactéries et notamment Mtb. Le projet innove en adaptant cette technologie pour cibler spécifiquement la TB, en utilisant des antigènes de Mtb identifiés pour leur capacité à déclencher des réponses immunitaires protectrices chez les personnes ayant contrôlé l'infection.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet pourraient contribuer à des avancées majeures dans la lutte contre la TB, en offrant une alternative vaccinale capable d’induire une immunité. Les données obtenues permettront non seulement d’évaluer l’immunogénicité et l’efficacité protectrice des candidats vaccins ARNm, mais aussi d’identifier des corrélats de protection, essentiels pour guider les essais cliniques futurs. Ce projet se distingue par son approche collaborative entre équipes sud-africaines et françaises, avec des expertises complémentaires en conception et formulation de vaccins à ARNm et en études d’immunogénicité et de protection en modèles murins. En outre, le projet prévoit une large diffusion des résultats, notamment par des publications scientifiques et des présentations lors de conférences. La collaboration avec des institutions de renommée internationale assurera la transition des candidats vaccins les plus prometteurs vers des essais précliniques ou cliniques.

Procédures

Les animaux recevront une vaccination (deux injections à 3 semaines d'intervalle dans une étape qui dure quelques minutes et qui est réalisée chez l’animal endormi). Une partie des souris recevra en addition l’administration répétée d'un anticorps thérapeutique, réalisée sur des animaux vigiles de façon répétée (3 fois par semaine) pendant 4 semaines. Certaines souris seront exposées à la bactérie responsable de la tuberculose : ceci se produit sur des animaux vigiles par l’utilisation d’aérosol et se déroule en une fois en quelques minutes.

Impact sur les animaux

Chez les animaux recevant une vaccination, des effets indésirables légers sont attendus, principalement liés à l’injection et à l’anesthésie, pouvant inclure un stress transitoire et une irritation locale au point d’injection. L’administration d’anticorps peut également provoquer un stress léger lié à la contention nécessaire. Chez les animaux infectés par Mycobacterium tuberculosis, les nuisances attendues sont principalement liées au développement progressif de la pathologie pulmonaire expérimentale. Elles peuvent inclure une perte pondérale, une diminution d’activité ou des troubles respiratoires chez certains individus sensibles ou insuffisamment protégés par la vaccination. De manière générale, les animaux peuvent présenter un stress léger lors des manipulations nécessaires aux différentes étapes du protocole.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure ou si leur état le nécessite, conformément à la réglementation en vigueur. Cette intervention sera réalisée par du personnel formé, dans des conditions garantissant une prise en charge rapide et sans souffrance. Cette étape est nécessaire pour permettre la collecte de tissus et d’organes dans des conditions optimales en vue des analyses prévues à l’étude. Aucune réutilisation n’est envisagée, car les procédures mises en œuvre ne permettent pas un nouvel usage des animaux.

Remplacement

Nous nous intéressons dans ces procédures à l’impact de la vaccination dans la tuberculose. La vaccination nécessite un système intégré dans lequel la circulation sanguine, la présence de ganglions lymphatiques et les poumons sont nécessaires (ce qui exclu les modèles multicellulaires du type "organoïde"). Il n’existe aucun modèle cellulaire de culture ex vivo à ce jour qui recapitule cette complexité d’interactions. De ce fait, afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire et un tissu pulmonaire suffisamment proche de l’homme. Ainsi notre projet l’utilisation d’un organisme entier telles les souris vivantes.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé sur la base des données préliminaires afin de garantir des résultats fiables tout en limitant leur utilisation au strict minimum. Le nombre utilisé est un nombre maximal dans la mesure où nous appliquons un schéma en entonnoir qui permet de ne sélectionner que les conditions expérimentales les plus pertinentes au fur et à mesure de l’avancement du projet. Des analyses multiples sur un même animal réduisent la variabilité et le nombre total de souris nécessaires. Nos expériences antérieures ont permis d’affiner les tailles de groupe et d’ajuster les procédures afin de garantir la puissance statistique tout en limitant strictement le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans ce projet, plusieurs mesures spécifiques sont mises en place pour réduire au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux. Les injections de vaccin et les procédures nécessitant une immobilisation sont réalisées sous anesthésie adaptée pour éviter la douleur et limiter l’angoisse. Après chaque vaccination, les animaux bénéficient d’une surveillance renforcée du point d’injection et de leur état général, afin de détecter rapidement toute réaction inhabituelle. Pour les phases d’infection expérimentale, une attention particulière est portée à la respiration, au comportement et au poids des souris, car ces paramètres peuvent refléter l’évolution de la maladie. Des points limites stricts, définis spécifiquement pour ce projet, permettent d’interrompre immédiatement la participation d’un animal si des signes de souffrance sont détectés. Cette approche garantit qu’aucun animal ne poursuit une procédure s’il présente un état incompatible avec son bien-être

Choix des espèces

Il existe de nombreux modèles de tuberculose chez l'animal : du primate non-humain au poisson zèbre en passantpar les rongeurs. Nous utilisons la souris car ce modèle est prédictif de ce qui se passe chez l'homme en termes d'immunité et de pathologie. En effet, depuis l'identification d'une mutation, on y trouve des lésions pulmonaires plus proches de celles trouvées chez l’Homme. C'est ainsi que notre projet utilisera des souris sensibles ou résistantes qui pourront être analysées avec les mêmes outils moléculaires établis, très performants et informatifs tout en présentant des lésions et une sensibilité différentielle à l'infection. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes âgées entre 6 et 12 semaines au début des procédures. Ace stade de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature.