Procédures sévères
Evaluation de la performance diagnostique de produits de contraste IRM sur un modèle de métastases cérébrales chez la souris – MODIFICATION
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
Les souris utilisées sont immunodéficientes, dépourvues de système immunitaire fonctionnel pour que les cellules tumorales humaines injectées dans leur cœur ne soient pas rejetées. 144 souris vont être utilisées, dont 80 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Après l'injection intracardiaque, elles passent des séances d'IRM d'une heure à une heure quinze sous anesthésie, jusqu'à la douzième semaine, pour comparer deux produits de contraste chez un même animal à 24 heures d'intervalle. Le porteur décrit des tremblements, une incoordination, des paralysies partielles et, au-delà de quatre semaines, un envahissement métastatique massif du cerveau avec un "risque élevé de souffrance sévère et de décès spontané", tandis que les souris ne développant aucune lésion visible seront tuées à six semaines et leurs tissus utilisés comme témoins de bioanalyse.
Objectifs
L’imagerie IRM (imagerie par résonnance magnétique) avec administration d’un agent de contraste permet de mieux détecter de nombreuses pathologies cérébrales, notamment en cancérologie, en en rehaussant le signal de la lésion. Outre le dépistage de la maladie et la pose du diagnostic, l’IRM avec agent de contraste permet le suivi de l’évolution de la pathologie et le suivi de l’efficacité thérapeutique mise en place pour le patient. L’enjeu est particulièrement important dans la détection de métastases cérébrales où le pronostic du patient (par exemple : taux de survie à 5 ans) est étroitement corrélé au stade de développement tumoral. Un diagnostic le plus précoce possible de l’ensemble des lésions a un impact direct sur la bonne prise en charge du patient. Le nombre de tumeurs et/ou de métastases ainsi que les caractéristiques de ces lésions (infiltrantes, vascularisées…), leur localisation et l’identification de leurs marges tumorales sont d’autant d’éléments importants pour proposer le meilleur traitement au patient (chirurgie, radiothérapie ciblée, etc..). Dans cet objectif final, le projet vise à évaluer les performances diagnostiques d’un nouvel agent de contraste IRM dans la détection précoce de tumeurs et/ou de métastases cérébrales. Les agents de contraste faisant partie de la classe des médicaments injectables, il s’agira de trouver le meilleur compromis entre la nature et la dose de produit de contraste injectée et l’apport diagnostique pour le patient. Le présent projet sera conduit sur un modèle de souris reproduisant la maladie. Des produits au stade prototype ou déjà commercialisés et considérés à l’heure actuelle comme des références serviront de comparatifs. Cette étude préclinique nous permettra d’obtenir des éléments de réponse avec des paramètres quantitatifs (rehaussement de contraste, nombre et temporalité des lésions détectées) et d’estimer au plus juste la dose qui apportera le meilleur compromis entre performance de détection des lésions et réduction de l’agent de contraste administrée au patient.
Bénéfices attendus
A l’issue de ce projet, nous aurons une idée cliniquement pertinente de la performance diagnostique du produit testé et de la dose à administrer (comparativement à des produits de référence) pour une détection précoce des métastases cérébrales tout en proposant la dose efficace la plus faible possible (compromis entre dose de gadolinium administrée au patient et efficacité du rehaussement à détecter, caractériser et suivre l’efficacité du traitement mis en place). Nous aurons une idée précise, pour une dose donnée, si le nombre de métastases détectées est augmenté par rapport au produit de référence, si la taille minimale de détection et ou le délai d’apparition est réduit, permettant un diagnostic plus précoce, et évaluerons la facilité de délimitation tumorale. Ces résultats permettront d’éclairer les choix de la dose à tester en étude clinique dans l’objectif de mettre à disposition des radiologues un produit de contraste plus performant, en termes de détection et de précocité de détection, améliorant ainsi la prise en charge des patients et, potentiellement, leur taux de survie à 5 ans.
Procédures
Toutes les procédures seront réalisées sur des animaux anesthésiés et sédatés. Le projet se déroulera en trois phases : Phase A – Mise en place du modèle expérimental. Chaque animal recevra une intervention unique, d’une durée d’environ 10 à 15 minutes, visant à simuler un processus de dissémination tumorale. Cette étape sera réalisée une seule fois par animal, au début de l’étude. Phase B – Suivi par imagerie cérébrale. À partir de la semaine 2 et jusqu’à la semaine [MODIF] 12, les animaux seront suivis par imagerie cérébrale [MODIF] diagnostique jusqu'à apparition de lésions, puis une imagerie cross-over à 24h d'intervalle sera effectuée pour une comparaison entre 2 produits sur un même animal. Chaque séance durera environ 1h à 1h15 par animal, incluant la préparation, l’installation et l’acquisition des images. Ce suivi permettra d’observer l’évolution des lésions et de comparer différents protocoles d’imagerie. Une semaine supplémentaire de suivi pourra être ajoutée selon l’état de santé des animaux. Phase C – Fin de l’étude. L’euthanasie sera pratiquée : • à la fin du suivi par imagerie, • ou plus tôt en cas de problème ou selon les critères de fin d’étude.
Impact sur les animaux
L’administration de médicaments, tels que les analgésiques morphiniques ou l’anesthésie générale, chez l’animal vigile peut provoquer une douleur aiguë au moment de l’injection, ainsi qu’un stress lié à la contention. L’injection intra-cardiaque, utilisée pour l’induction du modèle, est une procédure invasive pouvant entraîner des nuisances importantes. Elle est susceptible de provoquer des douleurs transitoires, des arythmies, des lésions myocardiques, des réactions inflammatoires ou infectieuses, ainsi que des hémorragies internes. Au cours de la phase de développement des métastases cérébrales, les animaux peuvent présenter des troubles neurologiques modérés à sévères : tremblements, incoordination, paralysies partielles, apathie, diminution de la prise alimentaire, perte de poids et déshydratation. Ces signes traduisent une altération progressive de l’état général. L’imagerie par IRM, nécessitant des anesthésies répétées et prolongées, peut induire une hypothermie et une déshydratation. Ces effets sont d’intensité modérée mais peuvent s’accumuler au fil des séances, entraînant une réduction des prises alimentaires et hydriques. Enfin, au-delà de quatre semaines après l’injection tumorale, un envahissement métastatique massif du cerveau peut survenir, provoquant une dégradation rapide de l’état de l’animal, avec un risque élevé de souffrance sévère et de décès spontané.
Devenir
Les souris ayant développé des lésions métastatiques au niveau cérébral (ou dans d’autres territoires si cela arrivait) seront euthanasiées à l’issue du suivi par imagerie IRM, ou à l’atteinte des points limites. Eventuellement, le cerveau des animaux sera prélevé et une analyse histologique ou imagerie élémentaire/moléculaire de coupes cérébrales seront réalisées. Les souris n’ayant pas eu de pousse métastatique (visible en IRM) au bout de 6 semaines post-induction seront euthanasiées et des tissus prélevés pour être utilisés comme matrices biologiques témoins (vierges de certains produits) ou pour des mises au point de bioanalyses.
Remplacement
Si les paramètres physico-chimiques d’un agent de contraste peuvent être déterminés in vitro, l’ensemble des paramètres d’internalisation (entrée dans les cellules cérébrales) et d’extravasation (sortie des vaisseaux) / élimination dans une lésion tumorale sont directement dépendants des caractéristiques intrinsèques de la lésion étudiée et ne peuvent donc être évalués que sur des modèles in vivo. En effet, l’accès à celle-ci dépend directement de l’état d’ouverture de la barrière sang-cerveau et de sa localisation dans le territoire cérébral, ainsi que des caractéristiques propres à chaque lésion (perméabilité, taille, état de vascularisation, tortuosité des vaisseaux, grade, structure du tissu… etc…).
Réduction
L’étude, réalisée en cross-over (comparaison des performances diagnostiques de deux agents de contraste ou doses différents chez un même animal à 24h d’intervalle) permet de diminuer le nombre d’animaux de moitiéen permettant également d’augmenter la puissance statistique d’analyse comparative car : - Chaque lésion métastatique est son propre témoin entre deux comparaisons, permettant de comparer les deux produits sur des lésions avec exactement les même propriétés (taille, perméabilité, accessibilité, nécrose, type…) - Un animal peut présenter plusieurs métastases cérébrales augmentant ainsi le nombre de lésions métastatiques analysé sans augmenter le nombre d’animaux Enfin, selon notre retour d’expérience, le rendement d’animaux répondeur étant variable, l’étude sera réalisée par lot d’implantation de seulement n = 12 animaux à la fois, avec une phase de mise au point afin d’ajuster ce chiffre, de façon à s’approcher au plus juste de l’effectif attendu, c’est-à-dire n = 8 animaux avec lésion(s) métastatique(s) au niveau cérébral. Les animaux ne présentant pas de lésions métastatiques ni signes cliniques pourront servir de matrices biologiques en vue de mises au point d’imagerie moléculaire ou élémentaire.
Raffinement
L’implantation tumorale mise au point sous échographie évite toute ouverture de la peau au niveau du crâne, réduisant de façon importante la souffrance et favorisant la récupération de l’animal. Elle ne sera effectuée qu’une seule fois, avec un volume faible. Par rapport à l’étude antérieure, le protocole d’imagerie a été optimisé afin de réduire les temps d’acquisition des séquences IRM, permettant une anesthésie totale plus brève (de la pose de la voie intraveineuse au réveil, environ 1h contre 1h30 lors de la précédente étude), tout en conservant une bonne qualité de détection des lésions en imagerie réhaussée. D’autre part, une administration d’anti-douleur sera mise en place avant toute intervention invasive afin d’assurer une bonne analgésie. L’administration d’anti-douleur pourra être renouvelée si l’état des animaux le nécessite. Lors des anesthésies générales, les muqueuses oculaires des animaux seront protégées par du gel oculaire pour prévenir de la déshydration. Un appareil de mesure de la respiration nous permettra de suivre la profondeur de l’anesthésie qui sera adaptée en fonction de la réponse de chaque animal. Afin de lutter contre une hypothermie éventuelle, une plaque thermostatée ou un circuit d’eau chaude thermostatée passant sous l’animal seront utilisés lors des anesthésies. Lors des phases de réveil, les animaux seront placés sous lampe rouge (chauffante). Pour le suivi clinique des animaux, une grille de scoring avec différents paliers sera mise en place. Au besoin, nous consulterons un vétérinaire et des mesures seront prises : système particulier d’alimentation ou d’hydratation, analgésie supplémentaire, traitement médicamenteux, etc. Enfin, par retour d’expérience, l’étude menée en interne en 2014 a montré qu’un suivi journalier rigoureux à l’aide de la grille de scoring minimisait fortement les dommages inhérents au modèle et que l’imagerie IRM permettait de détecter les lésions cérébrales avant que celles-ci n’engendrent une souffrance animale sévère ou un décès spontané.
Choix des espèces
Le modèle murin reste le plus utilisé dans la recherche en neurologie et cancérologie et largement reconnu pour apporter robustesse et prédictivité. Les grosses métastases observées chez la souris sont très comparables (tailles, vascularisation, localisation spatiale) à de petites métastases humaines. Sa faible taille remplit tous les critères d’accessibilité pour les administrations d’agents de contraste, taille suffisante pour les implantations tumorales et analyses robustes des images acquises en imagerie IRM. L’attraction importante des cellules pour le cerveau permet qu’aucune lésion tumorale ne soit observée dans d’autres organes. Ce modèle repose sur des souris immunodéficientes, c’est-à-dire qu’elles de possèdent pas ou peu de système immunitaire fonctionnel. Cela évite le rejet des cellules humaines implantées, ce qui est indispensable pour que ces cellules puissent survivre, proliférer et former des métastases dans l’animal et qui serait impossible avec un modèle de souris ayant une immunité classique. Les animaux seront adultes (au minimum âgés de 6 semaines) au moment de l’induction du modèle. En effet, la population d’étude visée est l’adulte.
Déterminer le mécanisme cellulaire de protection d’un vaccin contre le virus du Nil Occidental EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Exposées à la piqûre de plusieurs moustiques infectés à la fois, parce que leur taille le permet et que cela "maximise l'effet de l'infection", 1 540 souris vont être utilisées, dont 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Leur immunité cellulaire est d'abord altérée par des injections, puis elles reçoivent le vaccin candidat contre le virus du Nil occidental avant d'être infectées. Le porteur mentionne une douleur passagère aux points d'injection et des "troubles liés à l'infection par le virus", sans détailler ce que produit chez la souris une maladie qui atteint le système nerveux. Une partie est tuée pour prélever peau et ganglions lymphatiques, le reste parce que la réglementation interdit de garder vivants des animaux infectés.
Objectifs
Le projet de recherche permettra de soutenir une demande d’essais cliniques pour un candidat vaccin contre le virus du Nil Occidental. C'est un virus transmis par les moustiques. Il circule surtout chez les oiseaux, qui servent de réservoir naturel. Chez l’être humain, la plupart des infections ne provoquent aucun symptôme (environ 80 % des cas). Cependant, environ 20 % des personnes peuvent avoir de la fièvre et se sentir mal pendant quelques jours. Dans moins de 1 % des cas, le virus peut toucher le système nerveux et provoquer des complications plus graves, comme des inflammations du cerveau ou des méninges, voire une paralysie soudaine ou encore la mort. Ces formes graves sont plus fréquentes chez les personnes âgées ou dont le système immunitaire est affaibli. Il est présent dans de nombreuses régions du monde dont l’Europe. Il n’existe actuellement pas de vaccin contre cette maladie et le vaccin candidat que nous proposons pourra répondre à un besoin en santé publique mondiale. Le projet se déroulera dans 2 EU.
Bénéfices attendus
Le bénéfice à court terme est la compréhension des mécanismes cellulaires de protection du vaccin candidat. A long terme, les résultats soutiendront le développement d’un vaccin contre ce virus transmis par les moustiques. Le vaccin qui découlera de ce projet a le potentiel de sauver la vie de milliers de personnes chaque année et d’atténuer le fardeau sanitaire, social et économique de cette maladie transmise par les moustiques.
Procédures
Dans un premier temps, nous optimiserons les conditions pour explorer les mécanismes de l’immunité responsable de la protection vaccinale. Des prélèvements seront effectués pour permettre l’analyse de la réponse immunitaire et des acteurs impliqués. Nous évaluerons ensuite l’effet des facteurs immunitaires sur la protection conférée par le vaccin. Des souris avec les mêmes types de déficiences immunitaires que précédemment seront injectées avec le vaccin, puis exposées à la piqûre de moustiques infectés par le virus. Dans l’EU2 seront réalisés les protocoles de vaccination, d’injection des traitements et les prélèvements. Dans l’EU1 seront réalisées les protocoles d’infection par piqûre de moustique et toutes les procédures sur des animaux infectés.
Impact sur les animaux
Douleur passagère au niveau du site d’injection des traitements altérant l’immunité cellulaire, du candidat vaccin et de l’anesthésique. Douleurs légères au point des prélèvements sanguins. La piqûre de moustique se fera sous anesthésie donc sans douleur. Une faible irritation peut être attendue aux points de piqûres des moustiques. Troubles liés à l’infection par le virus. Les souris seront surveillées quotidiennement pour évaluer leurs éventuels symptômes.
Devenir
Les animaux utilisés pour l'étude de la localisation des cellules immunitaires seront euthanasiés afin de permettre la collecte de leur peau et de leurs ganglions lymphatiques. Tous les animaux infectés seront euthanasiés à la fin des procédures, conformément à l’obligation légale.
Remplacement
Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. A ce jour, aucun modèle autre que le modèle animal ne permet d’évaluer la réponse immunitaire à un vaccin et la protection contre une infection par exposition à une piqûre de moustique infecté. Néanmoins, nous avons généré les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles cellulaires. Ces travaux antérieurs nous on permit d’identifier notre vaccin candidat.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris, nous avons calculé le nombre limite nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Des travaux préliminaires ont été réalisés pour calculer ce nombre au plus juste. De plus, nous effectuerons les expériences suivant un arbre décisionnel qui validera ou non la poursuite des expériences à chaque étape pour limiter le nombre de souris utilisé.
Raffinement
Les souris auront un temps d’acclimatation (7 jours) avec visite quotidienne pour limiter le stress lié à la manipulation. Les souris seront hébergées de 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements variés, tels que des tunnels en carton, des abris en carton et en bois, des copeaux de carton pour fabriquer un nid et du carton rigide à ronger. Elles seront anesthésiées durant l’exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Une grille de score évaluant l'état général des souris sera quotidiennement suivie. Cette grille permet d’observer différents signes de bien-être ou de malaise (comme l’apparence, l’activité, le comportement ou la perte de poids). Nous avons défini des seuils à ne pas dépasser pour garantir la santé et le bien-être des animaux. Si l’un de ces seuils est atteint, l’expérience sera immédiatement arrêtée afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Nous allons utiliser des souris avec lesquelles nous avons développé et évalué la stratégie vaccinale. Nous continuerons à documenter la protection conférée par notre vaccin candidat sur souris avant de tester le vaccin candidat sur des animaux plus grands pour soutenir une demande d’essais cliniques. Nous allons utiliser des souris adultes de 6-8 semaines car elles ont un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate. Leur taille permet aussi la piqûre simultanée par plusieurs moustiques, nécessaire pour maximiser l’effet de l’infection.
Etude des mécanismes physiopathologiques de maladies musculo-squelettiques chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Un prélèvement de tissu, trois injections, deux prises de sang, une radiographie et jusqu'à 22 tests comportementaux par animal : 2 334 souris subissent ces procédures, dont 791 dans un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leurs organes. Les femelles gestantes sont anesthésiées au gaz puis tuées par dislocation cervicale. Le porteur signale une tétanie et une mort subite possibles lors d'efforts ou de situations de stress, ainsi qu'une brûlure légère par le froid sur certaines souris, dans un projet portant sur des maladies musculo-squelettiques rares sans traitement. Les 22 tests comportementaux ne sont nommés nulle part.
Objectifs
Les maladies musculo-squelettiques sont principalement caractérisées par une petite taille, des extrémités courtes, une raideur articulaire et des atteintes musculaires. Elles sont liées à des mutations génétiques affectant des protéines essentielles au bon développement et fonctionnement d’un être vivant. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces protéines au cours du développement et leur implication dans les processus de croissance osseuse et musculaire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont i) une meilleure caractérisation des maladies musculo-squelettiques et ii) la validation d’essais thérapeutiques visant à réduire la fibrose et améliorer la force musculaire. L’observation d’un effet thérapeutique permettrait d’envisager un essai clinique et donc de valider une thérapie pour ces maladies qui n’en n’ont pas à ce jour.
Procédures
Identification et prélèvement de tissus (5 minutes). Trois injections (1 à 5 minutes) ; deux prélèvements de sang (1 à 5 minutes) ; un examen radiographique (5 minutes). Tests comportementaux (maximum 22 tests ; 1 à 5 minutes). Femelles gestantes : trois pesées (30 secondes) ; une anesthésie gazeuse (5 minutes) ; une dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de tissus peut entraîner une douleur légère et localisée de courte durée. Les injections et prélèvement peuvent entraîner une douleur légère et localisée de courte durée. Une sécheresse oculaire pourra être constatée pendant l’examen radiographique. Tétanie et mort subite possible lors d'efforts et situations de stress. Une légère brûlure par le froid pourrait être constatée sur les souris à J0 et J4.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement d’organes et analyses prévues.
Remplacement
Dans les maladies musculo-squelettiques, la mortalité précoce liée à l'association d'atteintes cardiaques, respiratoires et des voies aériennes supérieures, ne peut être étudiée que in vivo. Pour valider l'effet d’un traitement utilisant des cellules immunitaires reprogrammées sur la fibrose associée aux maladies musculo-squelettiques, un modèle murin mimant l’une de ces maladies sera utilisé ; aucun modèle in vitro n'est capable de développer cet aspect de la pathologie. Il n'existe pas de modèle in vitro de fibrose musculaire et l'interaction ainsi que l'élimination des cellules fibrotiques nécessitent un milieu physiologique où la réponse immunitaire peut avoir lieu.
Réduction
Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l’exploitation maximale des données obtenues. La mise en place de tests statistiques a permis de réduire au maximum le nombre de souris utilisées dans ce projet. Si le traitement ne permet pas d'améliorer le phénotype, les tests comportementaux ne seront pas réalisés.
Raffinement
Les souris bénéficieront d'un enrichissement de leur environnement et des mesures de raffinement ont été mises en place avec une surveillance quotidienne par les membres qualifiés de l'animalerie. L'application de points limites stricts et spécifiques au projet sera respectée par les responsables du projet qui tiendront une fiche d'observation pour chaque souris. Tous les gestes réalisés sur les souris se feront sous anesthésie.
Choix des espèces
La souris a une forte proximité génétique et de fonctionnement avec l’homme. Animaux grégaires, avec un cycle de reproduction et un développement rapide, les modèle souris utilisés pour ce projet, permettrons dans un organisme complet d’étudier les phénotypes et d’analyser les mécanismes biologiques impliqués dans certaines maladies musculo-squelettiques rares à phénotypes évolutifs et invalidants ; différents temps clés du développement seront étudiés (stades prénataux, juvéniles et adultes). De plus, aucun modèle in vitro n'est capable de développer ces aspects des pathologies étudiées.
Étude dans un organisme vivant du rôle de certaines molécules liées à l’inflammation pendant une maladie causée par des caillots sanguins
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Le cinquième jour, une incision est pratiquée au coin de la troisième côte et une seringue enfoncée jusqu'au retour de sang pour vider le cœur de l'animal, tué ensuite sous anesthésie. 168 souris vont être utilisées dans ce protocole de cinq jours classé en souffrance sévère, avec une anesthésie par jour, des injections intraveineuses et intrapéritonéales et deux prélèvements à la veine mandibulaire. Le porteur écrit que les animaux "ne subiront que très peu de contraintes" et résume les perturbations attendues à une douleur d'environ cinq minutes et à une fatigue de trois jours. Privées d'une protéine du sang, les souris forment des caillots qui bloquent la circulation et abîment leur cœur, organe prélevé après la mise à mort.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre le rôle exact de deux molécules, appelées pour simplification A et B, dans la gravité des problèmes sanguins et des lésions au cœur dans une maladie rare. Cette maladie, causée par un manque d’une protéine spécifique, provoque la formation de petits caillots dans les vaisseaux sanguins, ce qui peut bloquer la circulation et endommager des organes comme le cœur. Des recherches précédentes ont montré qu’un médicament qui bloque l’action à la fois de A et de B pouvait réduire les dommages au cœur et au cerveau dans un modèle de souris atteintes de cette maladie. Cela suggère que l’inflammation causée par A et B joue un rôle important dans les lésions observées. On sait aussi que A et B favorisent la libération de substances impliquées dans la formation des caillots et peuvent aggraver les baisses de cellules sanguines. Cependant, on ne sait pas encore précisément quel rôle joue chacune de ces deux molécules A et B. L’objectif du projet est donc de tester, chez la souris, l’efficacité de traitements qui ciblent spécifiquement A ou B ou une molécule liée l’apparition de A et B, pour prévenir les dommages dans le cœur au cours de cette maladie.
Bénéfices attendus
À ce jour, aucune étude n’a encore permis de déterminer clairement le rôle respectif de A et de B dans cette maladie. A court terme, les bénéfices de ce projet seront d'apporter des informations précises sur les éléments qui interviennent dans la maladie que nous étudions. A long terme, les données de ce projet pourront permettre de définir une thérapie plus précise pour les patients atteints de cette maladie qui souffrent souvent de complications cardio-vasculaires. En effet, si nous déterminons que A ou B est impliqué préférentiellement dans cette pathologie, nous pourrons envisager un traitement plus personnalisé aux patients lorsqu’ils développent des crises de cette pathologie, ce qui pourra éviter des complications cardio-vasculaires chez ces patients.
Procédures
La procédure expérimentale dure en totalité 5 jours. Une fois par jour, les animaux sont mis en cage d'inhalation pour induire une anesthésie. Ils seront soumis à de la contention et à une injection intraveineuse le premier, second et troisième jour. Une injection intrapéritonéale est également réalisée une fois par jour ces trois premiers jours durant la même analgésie. Le temps de ces deux injections est de 5 min. Les jours 4 et 5, les animaux sont également soumis à une analgésie durant laquelle une seule injection intrapéritonéale est faite. Le temps de cette injection est de 3 min. Le premier et le troisième jour, durant l'analgésie, un prélèvement au niveau de la veine mandibulaire est réalisé. Cette intervention est comprise dans les temps indiqués. Le jour 5, les animaux sont à nouveau anesthésiés. L'anesthésie est vérifiée en pinçant la queue de l'animal. Une injection intrapéritonéale est faite. Un prélèvement intracardiaque est également réalisé afin de récupérer le sang des souris. Pour cela, une incision est réalisée au coin de la troisième côte et une seringue est enfoncée jusqu'à retour de sang. Après récupération du sang par ce prélèvement, l'animal toujours sous anesthésie est euthanasié. La durée de cette intervention sans réveil 15 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Les perturbations anticipées pour les animaux se résument à la possibilité de ressentir de la douleur, associée à une injection veineuse rétro-orbitaire et de la gêne par la contention. La douleur est contrôlée par l’utilisation de gouttes analgésiques et d’injection intrapéritonéale d’analgésique si besoin, en fonction d’une grille de douleur établie préalablement et sur laquelle nous nous appuyons. Cette douleur peut être ressentie par l’animal sur une durée d’environ 5 min. En revanche, le déclanchement de la maladie chez les animaux peut conduire à un état de fatigue ressentie durant les trois premiers jours.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer les organes des animaux et réaliser de l'immuno-histochimie sur ces organes, c'est à dire une coupe des organes et des colorations de ces coupes d'organes.
Remplacement
Les systèmes d’études in vitro de cette maladie ne permettent pas de prendre en compte l’ensemble des éléments qui interviennent dans le développement de cette maladie. En effet, à ce jour, il est impossible de reproduire in vitro un vaisseau avec ce qui recouvre les vaisseaux, la totalité des cellules qui circulent dans le sang et les molécules solubles du plasma participant à l’activation des vaisseaux. L’utilisation de l’animal a pour but de reproduire des conditions physiopathologiques intégratives impossible à reproduire in vitro
Réduction
Le calcul d’effectif est déterminé avant l'étude afin d'être sûrs que nous n'utiliserons pas un trop grand nombre d'animaux mais seulement le nombre nécessaire à démontrer scientifiquement un intérêt à utiliser notre médicament dans notre modèle de maladie. Nous nous appuyons sur des logiciels spécifiques qui nous permettent de calculer ce nombre d'animaux et sur des critères de jugement qui sont bien mesurables et bien quantifiables chez la souris.
Raffinement
Les animaux ne subiront que très peu de contraintes et la douleur sera minimisée par l'utilisation d'analgésiques. Les cages seront enrichies avec du coton, un dôme et/ou un tunnel. De plus, la douleur et la souffrance seront évaluées lors des protocoles tous les jours et la souffrance évaluée par une grille permettant d'établir un score. Les animaux ne sont pas seuls dans les cages. Ils seront hébergés dans des cages comprenant au maximum 5 animaux du même sexe, afin d'éviter tout conflit entre eux. Ils sont hébergés avec de la nourriture et de l'eau à volonté. Les salles sont spécialement conçues dans une animalerie agréée avec une température vérifiée quotidiennement et stable, une ventilation continue, et une visite des animaux est organisée quotidiennement avant que l'expérience ne soit réalisée. Une personne est responsable du bien-être de ces animaux
Choix des espèces
Les souris constituent un modèle simple à étudier compte tenu de la taille et de sa disponibilité. Des études ont montré que ce modèle d'étude, la souris, est adapté pour étudier notre pathologie. En effet, la souris présente des similitudes génétiques avec l'homme puisque la souris partage une grande partie de ses gènes avec celui de l'homme. Cette similitude génétique permet d'étudier des processus biologiques fondamentaux et des maladies humaines chez la souris. En outre, les souris sont des animaux de laboratoire relativement petits, faciles à manipuler et à élever en grand nombre. Elle ont un cycle de vie court et l'âge de 12 semaines correspond à une souris jeune adulte. Nous choisissons cet âge étant donné que chez l'homme notre pathologie se développe plutôt chez les jeunes adultes. Nous devons donc choisir chez la souris un jeune âge également. Enfin, les précédentes études de la bibliographie justifient pleinement l'utilisation de souris pour notre pathologie, puisque c'est le modèle qui est le plus similaire à la pathologie développée chez l'homme.
Évaluation de l’effet antalgique de traitements innovants dans l’endométriose
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
- Système urogénital
Une sonde à ballonnet gonflée dans le côlon et le vagin, quatre fois trente secondes, et des filaments appliqués sur la patte tous les sept jours pour mesurer la douleur : 3 120 souris femelles subissent ces procédures, dont 1 044 dans un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. L'endométriose leur est provoquée par greffe de cellules endométriales prélevées sur des souris donneuses, elles-mêmes tuées pour retirer leur utérus. Douze molécules sont testées pour leur effet antalgique aigu, six étant ensuite retenues pour une administration prolongée. Le porteur reconnaît que le projet n'apportera aucun bénéfice à court terme aux deux millions de femmes concernées en France, et que l'induction de l'endométriose constitue "une nuisance à part entière".
Objectifs
En France, l'endométriose touche environ deux millions de femmes, soit une femme sur dix. Elle se caractérise par l'extension hors de la cavité utérine d'un tissu endométrial responsable, en outre, de douleurs aigües particulièrement invalidantes. L'émergence de nouvelles stratégies thérapeutiques visant à contrôler cette différenciation tissulaire ainsi que les douleurs qui en résultent sont une priorité de santé publique. Nous possédons différents composés pouvant moduler deux cibles impliquées dans la douleur : des composés agissant sur le récepteur des estrogènes, connue pour lier l'estradiol, et des composés agissant sur le système endocannabinoïde. Ces composés présentent des effets antalgiques dans d’autres modèles de douleurs et seraient impliquées dans l’endométriose. Nous n'avons pas encore exploré l'action de ces molécules sur l'endométriose mais nous suspectons fortement une action bénéfique de celles-ci sur l'endométriose. Nous souhaitons réaliser une étude qui permettra 1) de caractériser le modèle murin d’endométriose et valider sa pertinence par rapport à la clinique, 2) d’évaluer l’effet antalgique de 12 molécules administrées par voie systémique de manière aigue, ainsi que 3) l’effet de l’administration chronique par voie systémique des 6 molécules les plus antalgiques (3 molécules par cibles) sur l’inflammation, la douleur, la progression de la pathologie et les comorbidités associées.
Bénéfices attendus
Les résultats nous permettrons de montrer l’intérêt de différents composés en tant que traitements de l’endométriose permettant de soulager symptômes douloureux, la pathologie en elle-même et l’atteinte de la qualité de vie des patientes. En effet, il n’existe actuellement aucun traitement efficace hormis l’hystérectomie, impactant définitivement la fertilité des patientes. Bien que ce projet ne montre pas de bénéfice chez la patiente à court terme, il pourra en avoir à long terme. Bien que les composés évalués dans ce projet ont déjà été testés dans des modèles in vitro afin de ne sélectionner que les candidats ayant la meilleure réponse pharmacologique, cela ne prédit pas l’action thérapeutique. S'agissant d'étude sur la douleur, l’anxiété, la dépression, la locomotion et le bien-être général, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles du comportement par le biais de tests comportementaux. Les approches alternatives in vitro ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux pour ce projet. Ce type d'étude sur modèle animal est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.
Procédures
*L’ensemble des animaux subiront des injections pour administrer l’estradiol benzoate (chez les souris donneuses), les cellules endométriales et des composés à tester. La piqure d'aiguille pour l’injection est réalisée sur animal vigil et entraîne une douleur légère de courte durée. *L’application de filaments au niveau de la patte de l’animal vigile sera réalisée tous les 7 jours afin d’évaluer la douleur. Ce test est susceptible d’entrainer une douleur faible de quelques secondes chez l’animal. L’animal est libre de retirer sa patte. *Certains animaux subiront une distension colorectale et vaginale consistant, après insertion de sonde sous anesthésie gazeuse, à évaluer les contractions réflexes dues au gonflement du ballonnet. Cela sera réalisé une seule fois. Durée : 4 x 30 secondes.
Impact sur les animaux
L’induction de l’endométriose chez l’animal sera une nuisance à part entière, mais indispensable à la conduite de l’étude. La pathologie sera associée à des désordres nociceptifs qui seront évalués dans le cadre du projet. Elle pourra aussi être responsable d’une diminution du gain de poids des animaux. À noter que ce type d’étude ayant recours à des tests comportementaux pour suivre l’endométriose nécessite un bon état général des animaux. Il pourra être noté un inconfort, un stress lié aux injections.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort. En effet, la mise à mort des animaux donneurs est indispensable avant de prélever leur utérus. La mise à mort des animaux receveurs (modèle d'endométriose) sera nécessaire afin d'évaluer le développement de l'endométriose par le biais du prélèvement de tissus. Les 2 groupes ne subissant pas d’induction de modèles d’endométriose (36 animaux) seront également mis à mort pour prélèvement de la moelle épinière et observation de l’absence de lésions dans la cavité abdominal afin d’avoir une référence contre qui comparer les autres groupes.
Remplacement
L’étude de l’endométriose repose sur 2 types de modèles, les modèles précliniques in vitro, impliquant la culture de tissus humain et permettant d’évaluer l’action de composés sur la vascularisation et la survie des lésions endométriales, ainsi que sur des modèles in vivo, reposant sur l’utilisations de rats, souris ou primates, et permettant d’évaluer le bien être général par l’interaction des lésions avec le reste de l’organisme. Les composés évalués dans ce projet ont déjà été testés dans des modèles in vitro afin de ne sélectionner que les candidats ayant la meilleure réponse pharmacologique. S'agissant d'étude sur la douleur, l’anxiété, la dépression, la locomotion et le bien-être général, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles du comportement par le biais de tests comportementaux. Les approches alternatives in vitro ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux pour ce projet. Ce type d'étude sur modèle animal est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.
Réduction
Ces travaux ont été précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les molécules les plus prometteuses à des doses adaptées. Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. De plus le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes (effectif de n=12 par groupe). La mise en place du modèle d’endométriose fait l’objet d’une collaboration avec une autre équipe qui maitrise ce modèle, et les expérimentateurs de notre équipe ont été formé au sein de cette équipe. De plus, Une première expérimentation préliminaire est une étape de validation du modèle, permettant de caractériser le modèle murin et de vérifier sa pertinence clinique, afin d’éviter l’induction d’un modèle d’endométriose induisant un phénotype éloigné de ce qui est observé chez la femme. Plusieurs expérimentations sont des étapes de GoNoGo, c’est-à-dire que si les résultats de celles-ci sont négatifs (pas de douleur dans le modèle ou pas d’effet antalgique de chaque composé) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées. Les lésions et moelle épinières des animaux seront prélevés afin d’évaluer par coloration histologique et immuno histologique la progression de la pathologie et l’activité des neurones impliqué dans la douleur. De plus, les lésions et ganglions rachidiens de certains animaux seront également prélevés pour archivage et partage des tissus. Toutes les procédures seront réalisées sur des groupes randomisés avec un groupe témoins négatif (recevant du véhicule), et les toutes les procédures seront menées par un expérimentateur en aveugle. L’ensemble des résultats, y compris négatifs, feront l’objet d’une publication afin d’éviter la reproduction d’expérience.
Raffinement
Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet. Pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (température, hygrométrie, luminosité). Le nombre d’animaux est adapté à la taille de la cage et en adéquation avec la règlementation (5 souris de 20-30 g dans une cage de 530 cm2). De plus, le milieu est enrichi par du matériel de nidification (coton et sizzle), un abri (dôme carton) et des matériaux à ronger (bois tendre). L’hébergement en groupe est maintenu pour le bien-être animal. Une surveillance des conflits sera réalisée. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Les expérimentateurs sont tous titulaires du niveau « concepteur et réalisateur de projet » ainsi que de la formation de chirurgie sur rongeurs. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. De plus, le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs utilisent dès que possible la technique du cupping pour limiter l’anxiété des souris lors du transfert des animaux. Afin de limiter la souffrance liée au tatouage des animaux, ils sont identifiés par un marquage sur la queue réalisé une fois par semaine, suivi de la proposition de Régilait pour réduire le stress des animaux par renforcement positif. Enfin, le poids des animaux et leur aspect général (mobilité, comportement social/isolement, fréquence respiratoire, aspect de la fourrure, hydratation, réaction à la contention) sera suivi 3 fois par semaine à l’aide d’une grille d’évaluation.
Choix des espèces
La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur l’endométriose. D’autres travaux antérieurs internationaux sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures, sans utilisation de primates. Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de l’endométriose. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet. La souris femelle est utilisée dans toute les procédures car l’endométriose est une pathologie liée au sexe se développant chez les sujets de sexe féminin.
Etude des mécanismes conduisant au développement de la cachexie rénale (EU ½)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Gardées jusqu'à ce qu'elles développent une insuffisance rénale accompagnée d'un amaigrissement sévère, puis tuées pour analyse du sang, des urines et des organes, 1 636 souris vont être utilisées, dont 512 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent une mutation qui détériore leur fonction rénale ou reçoivent un régime au même effet, subissent des mesures toutes les deux semaines, jusqu'à sept jours seules en cage métabolique et des injections répétées jusqu'à deux fois par jour pendant quinze jours. Le porteur écrit que l'insuffisance rénale ne provoque ni douleur ni stress avant les stades avancés, stades que le projet cherche précisément à atteindre puisque la cachexie met plusieurs mois à s'installer. Il qualifie de légères toutes les nuisances listées, dans un projet où près d'un tiers des souris relève de la souffrance sévère.
Objectifs
La cachexie est un syndrome d’amaigrissement sévère et involontaire qui ne peut pas être corrigé simplement par une approche nutritionnelle, et qui réduit fortement la qualité et l’espérance de vie des patients. Elle touche souvent les patients à des stades avancés de maladies chroniques telles que le cancer, les maladies rénales, cardiaques et pulmonaires ou maladies infectieuses. Jusqu'à présent la plupart des études se sont concentrées sur la cachexie associée au cancer, les autres types de cachexie, et en particulier celle associée aux maladies rénales chroniques (MRC), ont été peu étudiées. Les maladies rénales constituent un grave problème de santé publique, puisqu'elles touchent plus de 850 millions de personnes et représentent l'une des dix principales causes de décès prématurés dans le monde. À un stade avancé de la maladie rénale, notamment chez les patients sous dialyse, un syndrome appelé cachexie rénale peut apparaître. Elle se caractérise par une perte de masse maigre et/ou grasse menant à une altération fonctionnelle des patients. Il n’existe aujourd’hui aucune norme de soin pour la cachexie rénale et une meilleure compréhension des altérations métaboliques menant à son développement représente un enjeu crucial. L’objectif de ce projet est d'identifier de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce et de nouvelles cibles thérapeutiques pour une meilleure prise en charge de la cachexie rénale. A l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle in vitro qui permette de reproduire la complexité de la physiopathologie de la cachexie rénale, ce qui rend indispensable le recours à des modèles animaux pour appréhender les interactions biologiques complexes associées à cette pathologie. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
La cachexie rénale est un syndrome grave qui touche de nombreux patients atteints d’insuffisance rénale chronique. Elle réduit l’espérance de vie, entraîne une fatigue importante, des hospitalisations fréquentes, et rend difficile une vie sociale et professionnelle normale. Elle contribue donc au très fort impact économique des maladies rénales en Europe, qui est à la hauteur de 140 milliards d’euros par an. Ce projet de recherche vise à court terme à mieux comprendre la cachexie rénale et à développer des outils de diagnostic. À plus long terme, il pourrait mener à de nouveaux traitements, et ainsi améliorer la qualité de vie et la survie des patients.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, les animaux subiront des mesures de composition corporelle (3 minutes/animal), de force musculaire (5 minutes/ animal) et de fonction rénale (45 minutes/animal) au maximum toutes les 2 semaines à partir de l’âge de 6 semaines. Ces mesures se font chez les animaux vigiles et sont non-invasives, les animaux pourront cependant être anesthésiés pendant quelques minutes pour certains gestes techniques. Des prélèvements sanguins (2 minutes) seront réalisés sous anesthésie toutes les 2 semaines également. Les animaux seront mis en cages métaboliques une fois pendant une durée maximum de 7 jours. Certains lots d’animaux recevront des traitements : soit 3 injections par semaine pendant une durée maximale de 2 mois ; soit 2 injections par jour pendant une durée maximale de 15 jours ; soit une injection unique. Certains animaux seront mis sous régime particulier. Dans le second établissement utilisateur, seules les procédures terminales seront réalisées.
Impact sur les animaux
Certains animaux de sont porteurs d’une mutation génétique responsable du développement d’une maladie rénale chronique. Celle-ci provoque une détérioration de leur fonction rénale et un amaigrissement, qui sont les critères recherchés dans notre projet. D’autres groupes d’animaux sont soumis à un régime alimentaire qui induit également une détérioration de leur fonction rénale et un amaigrissement. Le poids des animaux et leur état général seront suivis attentivement. L’insuffisance rénale ne provoque pas de douleur, ni de stress avant des stades avancés au cours desquels une baisse de l’alimentation et une altération de l’état général peuvent apparaitre. Tous les animaux seront soumis à : (1) suivi régulier de leur poids : léger stress lié à leur manipulation de la cage à la balance et vice-versa (2) prise de sang à la queue : léger stress et risque de saignement (3) mesure de leur composition corporelle: léger stress lié à leur contention transitoire (3 minutes) (4) mesures du métabolisme : léger stress lié à l'isolement (7 jours au maximum) dans une cage individuelle (5) mesure de la fonction rénale: légère douleur liée à l’injection, et léger stress lié à la présence du capteur pendant 1h maximum (6) traitements pharmacologiques : léger stress dû à la contention + légère douleur liée à l’injection
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vus de l'analyse de leur sang, leur urine et leurs organes.
Remplacement
La cachexie est un syndrôme multifactoriel, initiée par le tissu affecté (ici le rein), qui va conduire à l’altération métabolique et à la dysfonction de nombreux tissus vitaux. Ces tissus vont à leur tour sécréter de nombreux médiateurs pro-cachectiques, initiant un cercle vicieux qui aggrave la fonte des tissus musculaires et adipeux. De telles interactions inter-tissulaires dans un contexte d’insuffisance rénale sont donc impossibles à reproduire in vitro. Une approche complémentaire ex vivo sur des cellules primaires en culture est également utilisée, elle permet d’obtenir une grande quantité de cellules à partir d’un nombre restreint d’animaux
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 1636 souris. Les résultats seront interprétés en utilisant des tests statistiques.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature et les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés, par groupes de 2 à 5 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement par les zootechniciens et plusieurs fois par semaine par les expérimentateurs afin de s’assurer de leur bien-être . Une grille de scoring et des points limites ont été établis. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (des anesthésiques et antalgiques seront utilisés pour les gestes qui le nécessitent, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les animaux sont transportés dans leur cage d'origine afin de minimiser le stress, pour un transport d'une durée de moins de 10 minutes.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale et la cachexie. Pour l’un des 2 modèles, nous utiliserons des souris âgées de 6 semaines au début de l'expérience, afin d’effectuer des mesures en conditions basales avant tout amaigrissement et perte de fonction rénale. Pour l’autre modèle, nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines au début du protocole. A cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques chez l’adulte. Nous garderons les animaux jusqu’à ce qu’ils aient développé une insuffisance rénale accompagnée d’une cachexie (processus se mettant en place sur plusieurs mois).
Evaluation de stratégies d’amélioration de la résistance de truites d’élevage à deux maladies bactériennes, la lactococcose et la furonculose
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Pour estimer si la résistance aux maladies bactériennes est héritable dans une lignée commerciale, 6 060 truites arc-en-ciel sont infectées par la furonculose et la lactococcose, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur indique que ces infections provoquent des signes cliniques et la mort d'une partie des poissons, et que les survivants seront tués à la fin de l'essai pour des raisons sanitaires. Aucune intervention n'est déclarée sur les poissons éveillés, la maladie faisant le travail, une grille de points limites servant à décider des mises à mort en cours d'essai. Les retombées annoncées sont une meilleure santé des poissons d'élevage et 2 à 10 % de survie gagnée par génération de sélection, dans une filière qui produit 35 000 tonnes de truites par an en France.
Objectifs
La furonculose et la lactococcose sont deux maladies bactériennes à forte prévalence en France qui affectent les salmonidés, et notamment la truite arc-en-ciel (TAC), à différents stades de vie. Elles peuvent provoquer de nombreuses pertes dans les élevages et nécessitent fréquemment un abattage des cheptel touchés. La furonculose est une maladie bien connue provoquée par Aeromonas salmonicida. La lactococcose, pathologie généralement des zones méridionales chaudes, est associée à un agent bactérien du genre Lactocoque (Lactococcus garvieae, Lactococcus petauri). Principalement retrouvées dans les piscicultures où la température des eaux dépasse les 16°C (furonculose) à 18°C (lactococcose), la fréquence de ces pathologies augmente ces dernières années dans un contexte global de réchauffement climatique. Les traitements antibiotiques et les vaccins existants présentent des efficacités limitées. Un des leviers utilisable pour améliorer la résistance de TACà ces pathogènes est la sélection génétique, qui se pratique déjà avec succès pour d’autres espèces piscicoles. Pour évaluer la faisabilité d’une telle approche, il est nécessaire de déterminer dans quelle mesure la résistance à ces pathogènes est un caractère héritable permettant de générer, sur plusieurs générations d’animaux, des progrès significatifs. Ces éléments sont à l’heure actuelle inconnues pour ces maladies. Le premier objectif de ce projet consiste à évaluer la résistance d’une lignée commerciale de truites arc-en-ciel à ces 2 pathogènes afin d’estimer les paramètres génétiques et les héritabilités associés. En complément de cette approche de génétique classique, un second objectif consistera à évaluer une méthode innovante de sélection des animaux sur la base de leur robustesse immunitaire à ces pathogènes, en identifiant des gènes dont l’expression est modifiée chez les individus les plus résistants.
Bénéfices attendus
Les retombées attendues sont une amélioration de la santé et du bien-être des poissons en élevage ainsi qu’une diminution de l’utilisation de médicaments. L’amélioration attendue de la survie est estimée entre 2 à 10% par génération de sélection en fonction de la composition des objectifs de sélection et des pressions de sélection appliquées.
Procédures
Il n'y a pas d'intervention prévue sur les animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les infections bactériennes vont induire des signes cliniques plus ou moins marqués et de la mortalité chez certains individus.
Devenir
Du fait de la nature des essais menés dans cette procédure et pour des raisons sanitaires, il n’est pas envisageable de retransporter les animaux dans leur ferme d’origine. En conséquence, les animaux survivants seront mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternative in vitro pour ce projet. L'évaluation de la résistance d'individus à un pathogène à des fins d’amélioration génétique progressive d’une population doit se faire sur des animaux vigiles capables de mettre en œuvre des systèmes de défense complexes (immunité).
Réduction
Le nombre de poissons utilisé est réduit au minimum requis par les méthodes d'évaluation génétique. En effet, les individus testés dans le projet servent à évaluer et classer leurs collatéraux restés en pisciculture. De ce fait, le meilleur compromis doit être trouvé entre un nombre faible de poissons testés et une classification précise de leurs collatéraux en ferme.
Raffinement
Un enrichissement des bassins est réalisé (couvercles pour permettre aux poissons d'avoir une zone d'ombre et de se cacher, bullage). Au cours des essais, les animaux font l’objet d’une évaluation quotidienne de leur état de santé en utilisant une grille de points limites adaptée qui permet de positionner, si nécessaire, des mises à mort compassionnelles.
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est l’espèce dulcicole la plus produite en France (35000 t/an) et en Europe. Les essais seront réalisés à un poids moyen entre 30 et 50g car c’est à partir de ce stade de vie que les poissons peuvent présenter des signes cliniques visibles pour les pathologies étudiées.
Intérêt thérapeutique de la prise en charge de l’hépatocarcinome cellulaire via un traitement par anticorps dans un modèle murin immunocompétent
- Recherche appliquée
- Cancers
Pour tester un anticorps censé renforcer les immunothérapies du cancer du foie, 360 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus. Chaque souris reçoit dans la veine de la queue une injection rapide d'un large volume de liquide qui déclenche un choc et fait pousser des tumeurs dans son foie, puis des injections d'anticorps deux fois par semaine et un prélèvement de sang terminal. Le porteur indique que les tumeurs volumineuses peuvent entraîner une gêne et des douleurs, et décrit le choc provoqué par l'injection comme un épisode dont l'animal récupère en moins d'une heure sans séquelle. Cette description s'accorde mal avec le niveau de souffrance sévère déclaré pour les 360 souris.
Objectifs
Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules immunitaires par notre anticorps permet de moduler leur activité. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire. Egalement, ce projet nous permettra d’évaluer la pertinence de l’utilisation de cette stratégie thérapeutique innovante dans d’autres cancers exprimant fortement la protéine.
Bénéfices attendus
Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Egalement, ce projet pourrait ouvrir vers de nouvelles pistes thérapeutiques pour prendre en charge les autres cancers exprimant fortement la protéine que nous avons identifiée.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une injection rapide d’un large volume de liquide. Cette injection entraine un choc chez l’animal, qui récupère en moins d’une heure et ne subit pas de séquelle à long terme. Cette procédure dure moins d’une minute. En fonction des groupes, les animaux seront anesthésiés ou vigiles. Certains animaux recevront un traitement par anticorps 2 fois par semaine pendant la durée totale du traitement, par injection réalisée sur animal vigile, cette injection est réalisée en moins d’une minute. Les animaux subiront un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisée en environ 1 minute.
Impact sur les animaux
La manipulation des animaux entraîne un stress physique modérée de courte durée. L’injection d’un large volume peut entrainer du stress et peut-être de la douleur à court terme mais l’animal récupère en général rapidement (5 à 10 minutes) et complètement au bout d’une heure. Notre modèle induit des tumeurs dans le foie, qui peuvent entrainer une gêne et des douleurs en cas de tumeurs volumineuse. Un stress physique lors de la manipulation et de la contention nécessaires à l’injection des traitements sont attendus. De même, les injections répétées peuvent parfois engendrer une douleur légère transitoire.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Les animaux seront soumis à une période d’acclimatation d’une semaine, puis habituées à la contention pendant une semaine avant le début des procédures afin de diminuer le stress lié aux injections.
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle développé d’injection hydrodynamique dans la veine de la queue est spécifique à la souris et permet le développement in situ de tumeurs hépatiques, sur la base d’un foie sain, très semblables aux tumeurs retrouvées chez les patients. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de minimum 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire et hépatique mature.
Étude du nouveau traitement anti-stress post-traumatique chez le rat
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Soumis à des chocs électriques inévitables de 1 mA pendant quatre secondes, 205 rats Wistar vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent ensuite une à deux injections de composés psychotropes sur animal vigile, puis passent le test du champ ouvert, le test de reconnaissance d'objet et un enregistrement de vocalisations ultrasonores, cinq à sept minutes par session. Le projet cherche deux molécules capables de favoriser la récupération après un traumatisme psychologique, piste rattachée aux substances à faible dose associées à une psychothérapie chez l'humain. Le porteur qualifie ce stress de modéré à intense mais sans séquelle physique, et rattache la mise à mort de tous les rats aux neuro-adaptations provoquées par les traitements, qui interdisent de les réutiliser.
Objectifs
Le trouble de stress post-traumatique est une réponse anormale à un traumatisme, qui touche une part importante de la population. Dans de nombreux cas, ce trouble est associé à d'autres pathologies psychiatriques, comme la dépression, ce qui complique sa prise en charge. Il est souvent décrit comme un dysfonctionnement de la mémoire, où le souvenir du traumatisme reste envahissant au lieu de s’atténuer naturellement. Les traitements actuels, notamment les antidépresseurs classiques, restent souvent peu efficaces, en particulier chez les patients souffrant de comorbidité. Face à ces limites, de nouvelles approches thérapeutiques sont explorées. Certaines substances agissant sur la plasticité cérébrale ont montré des effets prometteurs sur les symptômes du trouble de stress post-traumatique et de la dépression associée, notamment lorsqu’elles sont utilisées à faibles doses et en complément d’un accompagnement psychothérapeutique. Dans ce contexte, notre projet vise à étudier deux composés innovants susceptibles de favoriser la récupération après un traumatisme psychologique, sans provoquer d'effets indésirables majeurs. Nous utiliserons un modèle animal de trouble de stress post-traumatique afin de mieux comprendre les mécanismes en jeu et d’évaluer l’efficacité de ces composés.
Bénéfices attendus
Le trouble de stress post-traumatique est une réponse pathologique à un traumatisme, qui touche une part importante de la population. Dans la majorité des cas, il est associé à d’autres troubles psychiatriques, notamment la dépression, ce qui aggrave le pronostic et rend la prise en charge plus difficile. Ce trouble est souvent lié à un dysfonctionnement de la mémoire : le souvenir du traumatisme reste intense et persistant, au lieu de s’atténuer avec le temps. Les traitements actuels, principalement les antidépresseurs, ne sont pas toujours efficaces, en particulier chez les patients présentant une dépression comorbide. Cela souligne l’importance de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Certaines substances capables de stimuler la plasticité cérébrale ont montré des effets encourageants sur les symptômes résistants du trouble de stress post-traumatique et de la dépression associée, notamment lorsqu’elles sont utilisées à faibles doses et en complément d’une prise en charge psychothérapeutique. Notre projet vise à évaluer d’un composé innovant susceptible de favoriser la récupération après un traumatisme, en agissant sur les mécanismes de plasticité neuronale, sans provoquer d’effets secondaires majeurs. Nous utiliserons pour cela un modèle animal de trouble de stress post-traumatique, afin d’étudier leur efficacité et de mieux comprendre leur mode d’action. Les résultats seront également comparés à ceux obtenus avec un traitement de référence.
Procédures
Les rats seront tout d’abord exposés, ou non selon le groupe expérimental, à une session de stimuli inévitables, de faible intensité, destinés à induire un stress dans le cadre d’un modèle validé de trouble de stress post-traumatique. Cette session constitue l’étape de conditionnement au stress. Par la suite, les animaux recevront des injections de substances actives par voie intra-péritonéale et/ou sous-cutanée. Ces administrations seront réalisées sur des animaux vigiles (non anesthésiés), dans des conditions de contention manuelle douce. Chaque injection impliquera une contention brève, d’une durée estimée entre 10 et 20 secondes. Selon le groupe, les animaux recevront une à deux injections, à des temps définis (par exemple : immédiatement après le stress, ou après un délai de 24 à 48 h dans le cadre de l’évaluation d’un effet différé). Enfin, les animaux effectueront des tests comportementaux : a) le test du champ ouvert avec une durée de session de 5 minutes, b) le test de la reconnaissance d’objet avec une durée de session de 5 minutes, 3) le test de vocalisations ultrasonores avec une durée de session de 7 minutes. L’ensemble de ces interventions est conçu pour limiter le stress additionnel et garantir des conditions d’expérimentation reproductibles, tout en respectant le bien-être animal. Un suivi quotidien sera effectué afin de surveiller l’état de santé des animaux après chaque manipulation.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions selon les groupes expérimentaux, chacune étant associée à un niveau de nuisance spécifique : Stimuli inévitables : Tous les rats recevront une série de stimuli électriques brefs (1 mA, 4 sec) dans le cadre du protocole de stress. Cette procédure entraîne un stress modéré à intense, de courte durée, sans séquelle physique. Injections per os, intra-péritonéales et/ou sous-cutanées : Tous les animaux recevront une à deux injections, nécessitant une contention manuelle douce d’environ 10 à 20 secondes. Ces injections induisent une douleur légère et transitoire liée à la piqûre. Administration de substances psychotropes : Certains rats recevront des composés ayant un effet sur le système nerveux central. Cela peut entraîner un inconfort passager, observé par des comportements typiques comme la sédation, sans conséquence durable. Tests comportementaux (champ ouvert, reconnaissance d’objet, vocalisations ultrasonores) : Ces épreuves consistent à placer les animaux dans des environnements nouveaux. Elles induisent une légère anxiété transitoire, sans manipulation douloureuse ni contrainte physique. Toutes ces interventions seront réalisées dans le respect du bien-être animal, avec une surveillance quotidienne et des critères d’arrêt prédéfinis si une souffrance est détectée.
Devenir
La totalité des animaux seront mis à mort car l'administration des médicaments créant des neuro-adaptations, les animaux ne peuvent pas être réutilisés.
Remplacement
L’objectif de ce projet est de développer de nouveaux médicaments contre le trouble de stress post-traumatique destinés à un usage chez l’humain. L’étude préclinique doit donc inclure une administration chez l’animal entier, d’autant plus que les effets comportementaux de ces composés ne peuvent être évalués que chez un animal vigile. Des approches in vitro sont déjà mises en œuvre au laboratoire (évaluation de la neurogenèse, de la synaptogenèse, et électrophysiologie in vitro). Toutefois, le recours à des modèles complexes, c’est-à-dire à des animaux vivants, demeure indispensable pour analyser les réponses antidépressives induites par de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été défini avec soin afin de concilier la qualité scientifique des résultats et la réduction du nombre d’animaux. Les groupes expérimentaux sont constitués de 10 rats chacun (sauf le groupe contrôle). Cet effectif repose sur l’expérience acquise dans nos travaux antérieurs ainsi que sur les données disponibles dans la littérature pour ce type de modèle, en tenant compte de la variabilité attendue des paramètres étudiés. Ce choix est conforme aux recommandations méthodologiques généralement admises pour garantir une puissance statistique suffisante, tout en limitant le nombre d’animaux au strict minimum nécessaire, conformément au principe de réduction.
Raffinement
Des mesures de raffinement seront mises en œuvre afin de limiter au maximum la douleur, le stress et l’inconfort des animaux tout au long du projet. Chaque cage sera équipée d’un enrichissement environnemental standard comprenant un matériau de nidification végétal à base de fibres de coton, un abri opaque de type igloo et un bâtonnet en bois à ronger, afin de favoriser les comportements naturels et réduire le stress. En cas de difficulté alimentaire, notamment à la suite de procédures stressantes ou de traitements susceptibles d’entraîner une diminution transitoire de l’appétit, une alimentation de substitution facilement accessible sera proposée directement dans la cage. Les animaux feront l’objet d’une observation quotidienne, avec une attention particulière portée à l’état général, à l’apparence physique externe et aux comportements. Une grille de score clinique et comportementale sera utilisée afin d’évaluer objectivement le niveau de souffrance. Des points limites, définis à l’avance, permettront une intervention rapide (adaptation des conditions de prise en charge, traitement antalgique ou arrêt de la procédure) afin d’éviter toute souffrance inutile. En cas de douleur ou d’altération de l’état général, l’animal sera examiné par le vétérinaire référent et un traitement antalgique approprié sera mis en place. Si l’état de l’animal l’exige ou si les points limites sont atteints, une euthanasie sera pratiquée selon une méthode associant une anesthésie générale profonde suivie de l’administration d’un produit euthanasique, garantissant une perte de conscience rapide et l’absence de souffrance.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des modèles particulièrement pertinents en biologie psychiatrique grâce à la forte conservation des circuits neuronaux régulant émotions, stress et mémoire entre ces espèces et l’humain. Les principaux systèmes de neurotransmission et les mécanismes de plasticité synaptique liés aux troubles psychiatriques sont largement partagés, permettant une transposition fiable des résultats. Le rat possède des capacités comportementales et cognitives bien caractérisées, ce qui permet d’évaluer finement l’anxiété, la peur conditionnée, la mémoire émotionnelle et les réponses au stress. L’existence de paradigmes expérimentaux validés assure la comparabilité et la reproductibilité des données. Les rats Wistar sont privilégiés pour leur sensibilité aux épreuves émotionnelles. Lors du paradigme de stimuli inévitables, ils émettent davantage de vocalisations ultrasonores à 22 kHz que les Sprague-Dawley, reflétant une réponse émotionnelle plus marquée, ce qui les rend particulièrement adaptés pour l’étude des altérations affectives et l’évaluation des traitements. Des animaux adultes seront utilisés, en cohérence avec la réalité clinique, puisque les antidépresseurs et les anxiolytiques sont majoritairement prescrits chez l’adulte humain. Les expérimentations débuteront avec des rats âgés de 8 semaines.
Réponses immunitaires systémiques à la dystrophie musculaire de Duchenne.
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Les animaux utilisés portent la mutation responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne, pris à 1,5 mois et à 6 mois pour couvrir un stade précoce et un stade tardif de la maladie. 180 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour des analyses histologiques et moléculaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils reçoivent une injection abdominale de molécules activant le système immunitaire, quatre injections hebdomadaires d'un médicament contre le stress et quatre ponctions sanguines réparties sur 21 jours. Les nuisances décrites se limitent à de la fatigue, de la fièvre, un malaise léger à la piqûre et une douleur au point de prélèvement, sans rien qui explique le classement en gravité sévère, et l'espèce n'est jamais nommée autrement que comme "un mammifère appartenant à la même classe que l'être humain".
Objectifs
La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est causée par une anomalie génétique, que génère l’absence d’une protéine essentielle pour le fonctionnement du muscle. Lors de l'usure normale, les muscles atteints de DMD se réparent mal et diminuent progressivement de volume et de force. Le système immunitaire détecte la présence de composants musculaires endommagés et généralement les élimine. Cependant, dans la DMD, ces composants persistent anormalement. Cette étude vise à comprendre l'impact à long terme de cette persistance sur la réponse immunitaire. Nous utilisons un modèle animal, porteur de la même anomalie génétique que celle responsable de la DMD, comme substitut aux patients atteints de cette maladie. Le modèle animal utilisé dans cette étude a montré une diminution de certains types d'anticorps (protéines produites par le système immunitaire qui reconnaissent et neutralisent les substances étrangères) dans le sang. Afin de comprendre les causes de ce phénomène, nous souhaiterions administrer aux animaux, des molécules activatrices du système immunitaire pour étudier en détail comment le processus de production d'anticorps en réponse à ces molécules diffère entre les animaux atteints de DMD et les animaux sains.
Bénéfices attendus
Cette étude sera importante pour les patients atteints de DMD pour plusieurs raisons. Elle pourrait donner les outils pour améliorer les stratégies médicales pour le traitement de la maladie, reconnaissables par le système immunitaire pour corriger les anomalies génétiques. De plus, les résultats de cette étude contribueront à l'élaboration de meilleures recommandations vaccinales pour les patients atteints de DMD.
Procédures
Dans ce projet, tous les animaux recevront : - une injection dans la zone abdominale avec des molécules activatrices du système immunitaire (moins de 1 minute par injection). - quatre injections avec une médicament pour réduire le stress (une fois par semaine reparties en 21 jours, moins de 1 minute par injection). - quatre ponctions pour prélèvement sanguin (une fois par semaine reparties en 21 jours, environ de 1 minute chaque fois).
Impact sur les animaux
La vaccination peut provoquer un léger inconfort dans les jours qui suivent, notamment de la fatigue et de la fièvre. L’injection elle-même peut générer un malaise léger en raison de la piqûre, ainsi que le stress généré par la contention. De plus, des prélèvements sanguins peuvent engendrer un certain inconfort chez les animaux, notamment une douleur au point de prélèvement sanguin.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Dans cette étude, nous utilisons un modèle animal présentant la même anomalie génétique que les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Ceci nous permet de simuler plus précisément les processus biologiques complexes entre les différents composants de l'organisme, à l'origine de la maladie. Il est impossible de simuler cela sans utiliser un modèle animal.
Réduction
Grâce aux données de nos expériences précédentes, nous avons pu calculer le nombre minimal d'animaux nécessaires à cette étude pour obtenir des données concluantes et fiables. Ceci nous permet de limiter la souffrance animale. Une phase pilote à plus petite échelle, avec un nombre réduit d'animaux, sera menée au préalable afin de vérifier l'adéquation du protocole expérimental à la collecte de données. Cela évite tout gaspillage de vie animale si le protocole s'avère inadéquat pour l'obtention de données concluantes et fiables. Enfin, un maximum de données et d'observations sera collecté lors des expériences afin d'éviter de les répéter ultérieurement.
Raffinement
Les animaux sont habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés en douceur très régulièrement. Les animaux sont hébergés à deux ou plus et le milieu est enrichi. La douleur est prise en charge tout au long des procédures, y compris de manière préventive avant les traitements, grâce à l’utilisation de molécules destinées à la sédation et anti-douleur. Afin d’anticiper tout signe de douleur, des critères de suivi du bien-être ont été établis et sont évalués quotidiennement en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Ces critères portent sur l’aspect général des animaux (pelage et yeux), leur comportement (mobilité) et l’état général de l’animal (masse corporelle). En cas de signes de douleur, des mesures sont prises : surveillance renforcée (biquotidienne) et mesures médicamenteuses visant à atténuer ou supprimer la douleur.
Choix des espèces
L’espèce choisie est un mammifère appartenant à la même classe que l'être humain. Cette proximité évolutive en fait un modèle apprécié. Il partage de nombreux aspects anatomiques et physiologiques avec l’humain, notamment pour la constitution et le fonctionnement des organes ainsi que les processus métaboliques. Les récents outils génétiques ont permis d'en faire un modèle de choix pour l'analyse des troubles musculaires. Ce modèle animal mime ce type de maladies humaines de manière très fidèle et il est un excellent complément aux autres modèles. Nous utilisons notamment des animaux âgés de 1,5 et 6 mois, car ces âges correspondent respectivement aux stades précoce et tardif de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Grâce à eux, nous pourrons comparer les réponses du système immunitaire entre ces deux stades de la maladie.
Etude de l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements dans des modèles d’infection pulmonaire chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
12 096 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une infection respiratoire leur est provoquée par une administration unique de virus ou de bactéries dans les voies aériennes sous anesthésie, puis des traitements sont administrés jusqu'à deux fois par jour pendant plusieurs semaines. Le porteur annonce une perte de poids, une baisse d'activité, une respiration rapide ou difficile et, dans les cas les plus graves, des complications pulmonaires ou générales, effets qu'il déclare "nécessaires" à l'évaluation des traitements. Les effectifs qu'il détaille, sept groupes de six à douze animaux par étude, ne sont jamais rapportés aux 12 096 souris annoncées, et ni les pathogènes ni les molécules testées ne sont nommés.
Objectifs
Les infections respiratoires constituent un problème majeur de santé publique, à l’origine d’un grand nombre d’hospitalisations et de décès chaque année. Elles regroupent différentes entités cliniques, d’origine bactérienne ou virale, pouvant évoluer vers des formes sévères telles que les pneumonies ou les syndromes de détresse respiratoire aiguë. Parmi elles, les pneumonies acquises sous ventilation mécanique (PAVM) représentent une complication fréquente et grave chez les patients en réanimation, caractérisée par une inflammation pulmonaire aiguë et la colonisation des voies respiratoires profondes par des agents pathogènes opportunistes, souvent hyper- virulents et/ou multi-résistants. Les options thérapeutiques actuelles demeurent limitées et parfois inefficaces face à l’antibiorésistance croissante. Il est donc nécessaire de développer de nouveaux traitements ou de repositionner des molécules existantes afin d’améliorer la prise en charge des infections respiratoires sévères. Le présent projet s’inscrit dans ce cadre et a pour objectif de développer et caractériser des modèles précliniques d’infection respiratoire bactérienne et virale permettant l’évaluation de nouvelles approches thérapeutiques. Ces modèles ont pour finalité de reproduire différentes situations cliniques : mimer une infection physiologique par voie respiratoire haute ou reproduire des infections pulmonaires profondes de type PAVM. Ces études permettront d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules dans des contextes infectieux variés, de documenter leurs effets sur la charge bactérienne, la réponse inflammatoire et la fonction respiratoire, et de sélectionner les candidats les plus prometteurs pour la poursuite du développement préclinique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à étudier et valider, dans un contexte physiopathologique pertinent, l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques ou de molécules repositionnées dans le traitement des infections respiratoires bactériennes et virales, incluant les pneumonies acquises sous ventilation mécanique. Les bénéfices attendus concernent la mise au point de modèles précliniques d’infection respiratoire permettant d’évaluer chez l'animal l’efficacité de ces molécules sur des infections pulmonaires induites par des souches d’intérêt clinique, et de comparer leur efficacité à celles des traitements de référence. Ces études permettront également de mieux comprendre leurs mécanismes d’action à travers l’analyse de la charge bactérienne, des biomarqueurs inflammatoires et de la réponse pulmonaire. À terme, ce projet contribuera à identifier des candidats thérapeutiques prometteurs susceptibles de réduire la sévérité et la durée des infections respiratoires, d’améliorer la fonction pulmonaire et de diminuer la mortalité associée à ces pathologies.
Procédures
Les animaux participeront à une étude visant à reproduire une maladie respiratoire, puis à tester l’efficacité de différents traitements. Pour induire la maladie, les animaux recevront une administration unique de virus ou bactérie pathogènes au niveau des voies respiratoires. Cette intervention sera réalisée sous anesthésie afin de limiter toute douleur ou inconfort et durera quelques minutes. Certains animaux recevront uniquement une solution sans principe actif afin de servir de groupe de comparaison. Les traitements étudiés pourront être administrés avant ou après l’apparition de la maladie, sur une durée pouvant aller de quelques jours à plusieurs semaines. La fréquence d’administration pourra varier de quelques fois par semaine à une ou deux fois par jour selon les besoins de l’étude. Les modes d’administration pourront varier en fonction du composé et de la posologie envisagée. Ces manipulations peuvent entraîner un stress lié à la manipulation ainsi qu’un inconfort léger et transitoire. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l’étude, sous anesthésie, à intervalles espacés et dans des volumes respectant les recommandations en vigueur. Les animaux seront surveillés pendant leur réveil après chaque intervention. À la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés selon des méthodes réglementaires, après anesthésie, afin de permettre des analyses complémentaires.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de l’étude, les animaux développeront une infection respiratoire. Cela pourra entraîner des signes de maladie tels qu’une perte de poids, une diminution de l’activité, une respiration plus rapide ou difficile, ainsi qu’un état de fatigue. Dans les cas les plus sévères, l’infection pourra provoquer des complications au niveau des poumons ou affecter plus largement l’organisme. Ces effets sont attendus dans ce type de modèle et sont nécessaires pour permettre l’évaluation des traitements étudiés. Les traitements testés ne devraient pas entraîner d’effets indésirables particuliers, car les doses utilisées sont connues pour être bien tolérées.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Les poumons et le sang seront prélevés à des fins d’analyses.
Remplacement
L’étude de l’efficacité de nouvelles molécules dans le traitement des infections respiratoires bactériennes et virales nécessite de disposer de modèles animaux capables de reproduire la complexité de la pathologie humaine, incluant la réponse immunitaire, l’inflammation pulmonaire, l’élimination de l’agent pathogène et les lésions tissulaires associées. Bien que des essais sur cellules soient réalisés en amont pour évaluer la toxicité, la réponse inflammatoire cellulaire et l’activité antimicrobienne ou antivirale des composés, ces approches ne permettent pas de reproduire l’ensemble des interactions entre les pathogènes, le système immunitaire et les organes cibles. L’utilisation du modèle souris reste indispensable pour évaluer de manière intégrée les effets du traitement sur l’infection, l’inflammation et la fonction pulmonaire. Les procédures proposées présentent donc un caractère de stricte nécessité scientifique et ne peuvent être remplacées par des méthodes alternatives ne faisant pas appel à l’animal vivant.
Réduction
Pour chaque étude pilote, afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, les concentrations d’inoculum testées (3 concentrations) selon les souches, seront choisies en s’appuyant sur les modèles infectieux déjà décrits dans la littérature. Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour obtenir une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité des traitements. L’analyse des données impliquera la comparaison de 7 groupes (4 groupes pour les pilotes) de 6 à 12 animaux pour chaque étude et bénéficiera d'une analyse statistique appropriée.
Raffinement
Pour chaque souche bactérienne ou virale testée, une étude pilote sera menée sur un petit nombre d'animaux afin d'optimiser les études ultérieures. Les conditions d’hébergement respecteront les exigences réglementaires pour le respect de l’animal ; 5 à 6 souris par cage selon le poids de l’animal, avec nourriture et eau à disposition et présence d’un enrichissement. Les procédures seront réalisées dans une pièce calme, différente de la pièce d’hébergement. Pour limiter le stress, la peur et l’angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l’expérimentateur) avant le début de l’étude, leur environnement sera enrichi avec du matériel de nidification et de divertissement afin que les animaux puissent exprimer leur comportement naturel. Une manipulation des animaux à l'aide d'un tunnel ou avec les mains en coupe sera privilégiée pour limiter la contention des souris par la queue. Pour minimiser l'impact sur les souris, une étude pilote sera menée sur un petit nombre d'animaux afin d'optimiser les études ultérieures. Toutes les procédures d’infection seront réalisées sous anesthésie générale afin de bien maîtriser le geste et prévenir toute douleur ou inconfort. L’anesthésie sera induite par inhalation (induction et maintien au masque) ou par une injection d'un couple anesthésiant/analgésique. Dans ce dernier cas, l’anesthésie sera interrompue au bout d’environ 30 minutes, afin de favoriser un réveil rapide et limiter la durée d’exposition anesthésique. Les manipulations seront effectuées par du personnel formé et habilité, maîtrisant les techniques d’administration et de surveillance anesthésique. Les animaux anesthésiés seront surveillés jusqu’à leur réveil. L’administration dans les poumons, nécessitant la mise en place d’une sonde, sera réalisée avec précaution afin de limiter les lésions locales et les risques d’irritation, à l’aide d’un endoscope à fibre optique. Cette stratégie de raffinement vise à assurer une maîtrise rigoureuse de la douleur et du stress, à limiter les nuisances tout en maintenant la validité scientifique et la reproductibilité des modèles d’infection respiratoire mis en œuvre.
Choix des espèces
La souris a été choisie car elle constitue un modèle de référence pour l’étude des infections respiratoires bactériennes et virales. Sa réponse immunitaire bien caractérisée, sa reproductibilité expérimentale et sa taille adaptée permettent d’obtenir des résultats fiables tout en limitant la quantité de composé administrée et les nuisances associées. Les animaux seront âgés de 6 à 8 semaines au minimum, au début de l’étude, en accord avec la littérature existante pour effectuer ces différents modèles. De plus, à cet âge, le système immunitaire de ces animaux est totalement développé.
Etude des effets de l’inhibiteur d’épichaperome PU-H71 sur la réponse immunitaire
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les souris de ce projet sont immunodéprimées, choisies pour que seuls les effets des cellules CAR-T injectées restent visibles. 168 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 96 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une injection intrapéritonéale tous les trois jours, jusqu'à trois injections intraveineuses sous contention, trois prélèvements sanguins submandibulaires, une ponction de moelle osseuse et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que les souris témoins développeront la leucémie jusqu'à une restriction des mouvements des pattes arrière et une perte d'appétit, et rattache la mise à mort finale au prélèvement des organes.
Objectifs
Les lymphocytes T génétiquement modifiés (cellules CAR-T) représentent une nouvelle méthode de traitement de certains cancers du sang, qui utilise le système immunitaire du patient pour lutter contre les cellules cancéreuses. En modifiant ces cellules, on les rend capables de reconnaître et de détruire les cellules tumorales, tout en les aidant à se multiplier et à devenir plus efficaces. Ces traitements peuvent entraîner une rémission complète chez plus de 80 % des patients. Cependant, des rechutes surviennent encore souvent, car les cellules cancéreuses deviennent moins bien reconnues par les cellules CAR-T ou ces dernières s’épuisent avec le temps. Pour renforcer l’efficacité de cette thérapie sur le long terme, de nouvelles approches sont explorées. Parmi elles, les epichaperomes, des protéines présentes dans les cellules cancéreuses, attirent l’attention. Elles aident les cellules cancéreuses à survivre et créent un environnement qui freine les défenses immunitaires du corps. Des molécules capables de bloquer ces epichaperomes (« molécules bloqueuses »), sont actuellement testées. Chez un patient atteint de leucémie myéloïde aiguë, ce traitement avec une molécule bloqueuse a permis une rémission complète depuis plus d’un an. Il semble aussi renforcer la réponse immunitaire en facilitant la reconnaissance des cellules cancéreuses par le système immunitaire et en réduisant certains freins immunitaires. Ces résultats suggèrent qu’en combinant les cellules CAR-T avec cette molécule bloqueuse, on pourrait améliorer leur efficacité, en prolongeant leur action et en stimulant d’autres cellules immunitaires du patient. Le but de ce projet est donc d’évaluer l’effet de la moélcule sur la réponse immunitaire, à travers deux axes : Tester si cette molécule peut renforcer une réponse à la vaccination (effet "adjuvant"). Étudier si elle peut améliorer l’action des cellules CAR-T dans un modèle de leucémie aiguë lymphoblastique B.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à approfondir la compréhension des mécanismes par lesquels les inhibiteurs d'épichaperome, modulent les réponses des lymphocytes T. L'accent est mis sur leur impact sur les cellules CAR-T, dans la perspective d'une application clinique. L’objectif ultime est d’évaluer la pertinence d’une approche thérapeutique combinée, associant cellules CAR-T et inhibiteurs d’épichaperome, en vue d'essais cliniques chez l’homme.
Procédures
Injection en intraperitoneal sur souris vigile (1 injection tous les 3 jours moins de 10 s par injection). Injection en intra-veineuse sur souris vigile maintenue en boite de contention (1 à 3 injections selon les groupes de souris), moins de 10 secondes par injection. Prélevements sanguins en submandibulaire sur souris anesthésiée avec un volume n’excédant pas 75 µl tous les 10 jours et un maximum de 3 prélèvements au total par souris, durée de prélèvement moins de 5 secondes. 1 prélèvement de moelle osseuse sur souris anesthésiée, 10 secondes par prélèvement. Les animaux seront imagés sous anesthésie générale gazeuse avec injection en intra péritonéale d'une molécule luminescente (durée totale 15minutes).
Impact sur les animaux
Les prélèvements sanguins et les injections sont susceptibles d'induire une très légère douleur mais qui ne devraient pas induire de nuisances ou effets indésirables particuliers compte tenu des mesures préventives prises et des précautions apportées à leur mise en oeuvre. Il en va de même pour les prélèvements de moelle osseuse, qui peuvent entraîner une douleur — prise en charge grâce à des mesures préventives et des soins post-procédure — ainsi qu’un risque d’infection à surveiller mais qui est quasiment nul par le respect strict des règles d’asepsie. Pour le modéle LAL-B : Les souris contrôles vont développer la leucémie et l'avancée de la maladie va conduire à une restriction des mouvements des souris notamment des pattes arrières, une perte d'appétit et de poids. Une réaction de greffon contre l'hôte plusieurs semaines après l'injection des cellules CAR-T peut également se produire chez les souris, faisant partie des points limites de la procédure expérimentale.
Devenir
En raison des prélèvements d'organes en fin de procédure tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Nous avons déjà étudié l'effet de la molécule d'intérêt sur le phénotype et la fonctionnalité des lymphocytes T activés ainsi que des cellules CAR-T in vitro, en démontrant sa capacité à renforcer leur cytotoxicité vis-à-vis des cellules tumorales. Cette validation in vitro nous a permis de confirmer son impact positif sur la fonctionnalité des lymphocytes T et des cellules CAR-T. Toutefois, afin de nous rapprocher de conditions physiologiques plus complexes que celles offertes par les modèles in vitro, il est indispensable de poursuivre cette évaluation dans un modèle in vivo. Une telle approche est incontournable avant toute application clinique cheez l'homme. Le choix du modèle murin s’impose en raison de la connaissance approfondie de son système immunitaire, de la disponibilité d’outils analytiques sophistiqués pour étudier les réponses immunitaires, ainsi que de sa proximité phylogénétique avec l’humain, qui permet d’envisager plus aisément la transposition des stratégies thérapeutiques évaluées vers la clinique.
Réduction
Le nombre de souris a été réduit au minimum grâce à l’expérience acquise d’autres protocoles expérimentaux dans lesquels la réponse antitumorale des CAR-T cells chez des souris greffées de cellules leucémiques a été évaluée. Le nombre minimum de souris utilisées prend en compte les variabilités des mesures par bioluminescence du signal tumoral chez les souris (pouvant varier selon l’âge, le sexe, le délai de prise de greffe tumorale) et des réponses immunologiques observées durant ces protocoles. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement.
Raffinement
L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, statut SPF, où les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de cellulose et des fibres de coton. Pour les animaux présentant des difficultés de locomotion, la nourriture et l’eau seront apportés directement dans la cage sous forme de gel. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Toutes les interventions sur les souris seront réalisées sous hotte à flux laminaire pour éviter tout risque d'infection. Afin de répondre au principe de raffinement les prélèvements de sang seront effectués en sub-mandibulaire sous anesthésie générale. Les volumes de sang prélevés aux différentes étapes seront limités à 2 gouttes. Une analgésie par injection en sous-cutané (au niveau du genou) d'un analgésique sera mis en place 5 minutes avant le prélèvement de la moelle osseuse pour renforcer l’analgésie locale, ainsi qu'un traitement préventif par un analgésique administré en IP. Un maximum de 2 prélèvements par souris sera autorisé (1 prélèvement par fémur). En cas de douleur des souris (évaluation physique et comportementale) un anti douleur adapté sera injecté en sous-cutané, toutes les 6 à 12 heures durant 24 à 48 heures.
Choix des espèces
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin apporte des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. Le choix de la souris repose sur la connaissance du système immunitaire de cette espèce, sur l’abondance des outils d’analyse des réponses immunitaires à disposition et par sa proximité phylogénétique avec l'homme qui permet d’envisager la transposition en clinique des stratégies évaluées. L’utilisation d’animaux immunodéprimés nous permet de n’observer que les effets des cellules CAR-T sur la leucémie. Les mécanismes immunologiques observés dépendront donc des cellules injectées et non des cellules murines. Les animaux seront âgés entre 8 et 12 semaines (adultes) au début des protocoles, car il faut que le système immunitaire soit totalement mature. Le poids des souris varient entre 20 et 30g.