Procédures sévères
Nouvelles molécules impliquées dans le dialogue entre intestin et son microbiote : rôle dans le maintien de la santé intestinale à long terme.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
3 600 souris vont être utilisées, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour collecter leurs organes. Les expérimentateurs leur provoquent une colite par traitement chimique, qui entraîne diarrhées et perte de poids, et leur administrent des microARN par gavage une fois par semaine pendant douze semaines. Le porteur affirme qu'aucune culture cellulaire ne peut reproduire les interactions entre microbiote, système immunitaire, génétique et environnement, et renvoie les applications thérapeutiques contre les maladies inflammatoires de l'intestin à un usage futur. Dans un volet du projet, les expérimentateurs gavent chaque jour des souriceaux de sept à dix jours, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress supplémentaire liée à la contention de nouveau-nés.
Objectifs
Le côlon, comme l’ensemble du tube digestif, héberge une vaste communauté de micro-organismes appelée microbiote intestinal, qui joue un rôle essentiel dans la santé. Des études récentes ont montré que les conditions de colonisation de l’intestin juste après la naissance influencent fortement le développement futur de l’individu. Un déséquilibre précoce du microbiote, ou dysbiose, est ainsi associé à un risque accru de troubles intestinaux à l’âge adulte, notamment dans le cadre des Maladies Inflammatoires Chroniques de l’Intestin (MICI), comme la maladie de Crohn ou la rectocolite hémorragique. Les mécanismes par lesquels le microbiote agit à long terme sur la santé restent encore largement inconnus. Parmi les éléments impliqués, les microARN (miARN) — de petites molécules capables de modifier la lecture des gènes — jouent un rôle de plus en plus reconnu. Ils sont présents dans de nombreux compartiments biologiques, notamment les selles et le contenu intestinal, et sont associés à la régulation de fonctions clés de l’intestin. Plusieurs miARN ont été impliqués dans l’apparition de dysbiose et dans l’inflammation intestinale. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle des miARN dans le fonctionnement de l’intestin, en particulier dans leur interaction avec le microbiote. Il consiste en particulier en l’étude des effets des miARN à l’âge adulte dans différents modèles de colite (soit une inflammation du colon) expérimentale, tout en ajoutant un nouvel axe centré sur la période néonatale, qui est une étape critique dans l’établissement du microbiote. Nous explorerons comment des interventions sur les miARN pendant cette phase précoce peuvent modifier durablement la santé intestinale, et si ces modifications ont des effets à long terme sur l’équilibre du microbiote et la santé intestinale. Pour cela, nous utiliserons différents modèles murins, dans lesquels des miARN spécifiques seront administrés par voie orale, à différentes étapes de la vie, notamment chez le nouveau-né. Les conséquences seront évaluées à court et long terme, en observant notamment les modifications du microbiote et les réponses intestinales associées. Le projet s’étalera sur 5 années et nécessitera 3600 souris, âgées de la naissance jusqu’à 16 semaines, issues d’un fournisseur agréé. Toutes les procédures seront réalisées dans le strict respect des normes réglementaires, avec une euthanasie programmée à la fin de chaque expérimentation.
Bénéfices attendus
Ces travaux contribueront à la compréhension des mécanismes par lesquelles les miARN et le microbiote dialoguent et nous permettront de mettre en évidence de nouveaux outils thérapeutiques, les miARN, pour le traitement des maladies humaines associées à un problème d’inflammation chronique, comme c’est le cas des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI).
Procédures
Les animaux seront soumis à une ou plusieurs de ces interventions ayant pour but soit de créer une inflammation du colon chez les souris soit de la traiter, ou alors de suivre l’évolution de la colite et du microbiote chez chaque animal : - Les selles seront récoltées en disposant les animaux dans des petites boîtes en plastique pendant 30 à 60 min. Après que les animaux aient fait naturellement leurs besoins, ils seront replacés dans leur cage d’origine. - Un ou des gavages (selon la procédure : de miARN, d’anti-miRNA) seront effectués à l’aide d’une sonde souple non traumatique sur souris adultes éveillées, une fois par semaine pendant 12 semaines. Chaque gavage dure environ 10 secondes. - 1 gavage par jour sera effectué à l’aide d’une sonde souple non traumatique sur des souriceaux de soit 7 à 10 jours, soit 14 à 21 jours. Chaque gavage dure environ 20 secondes. - Les prélèvements de sang seront réalisés uniquement sur des animaux anesthésiés soit 15 jours avant l’euthanasie soit juste avant d’être euthanasié soit un seul prélèvement par animal. Ce geste dure environ 1 minute.
Impact sur les animaux
Des nuisances seront générées chez les animaux soumis à un traitement chimique, qui induit la colite. Les effets de la colite chez la souris sont l’apparition de diarrhées et une perte de poids. Il est aussi reconnu que les gavages utilisés par ailleurs dans certaines procédures, peuvent induire un stress chez les animaux. Le gavage des souriceaux dans la procédure 2 est reconnu comme pouvant occasionner un stress supplémentaire aux souriceaux lié à la manipulation et la contention de nouveaux nés.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure afin de collecter les organes en post-mortem pour analyse ultérieure.
Remplacement
L’utilisation de souris est nécessaire pour ce projet car les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin sont des maladies très complexes. Elles sont influencées par plusieurs éléments : le système immunitaire, les bactéries qui vivent dans l’intestin (microbiote), la génétique et l’environnement. Elles touchent plusieurs organes et provoquent une inflammation à la fois dans l’intestin et dans tout le corps. Pour comprendre comment l’environnement, le microbiote intestinal et le patrimoine génétique de l’animal interagissent, les souris de laboratoire sont le modèle le plus adapté. Actuellement, il n’existe pas de méthode alternative (comme des cultures de cellules) capable de reproduire ces interactions complexes entre les différents organes et facteurs impliqués. L’objectif final de cette recherche est de comprendre comment certaines petites molécules appelées microARNs peuvent influencer l’inflammation intestinale. Ces connaissances pourraient un jour permettre de développer de nouveaux traitements pour les personnes atteintes de MICI.
Réduction
Des expérimentations préliminaires, ont donc permis d’établir un nombre optimal d’animaux par groupe et réduit au maximum pour obtenir des résultats interprétables. De plus, l’utilisation d’un logiciel (Prism), a permis de définir le nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour avoir des résultats reproductibles et significatifs. Les données obtenues seront traitées en utilisant des tests statistiques.
Raffinement
Les souris seront observées tous les jours pendant toute la durée de l’étude, par du personnel formé. Si des signes de maladie apparaissent (comme une perte de poids, des selles anormales ou un changement de comportement), les soins apportés seront adaptés à leur état. Cela peut inclure la mise à disposition d’eau gélifiée pour éviter la déshydratation ou, si l’état de l’animal devient trop grave, l’arrêt de l’expérience et la mise à mort pour éviter toute souffrance inutile. L’apparition de la colite sera surveillée à l’aide d’un score standardisé prenant en compte le poids, l’aspect général, les signes cliniques visibles et le comportement. Ce score permet de détecter rapidement une aggravation et d’agir progressivement : Si le score dépasse un premier seuil, les observations seront faites plus souvent (deux fois par semaine, puis trois fois par semaine si le score continue d’augmenter). Si certains critères, comme la perte de poids ou la consistance des selles, atteignent un niveau critique, de l’eau gélifiée sera donnée aux animaux. Si l’état d’un animal dépasse le seuil défini comme « point limite », il sera mis à mort pour éviter toute souffrance. Enfin, les cages seront enrichies (coton, abris, alternance jour/nuit) pour permettre aux souris d’exprimer des comportements naturels et améliorer leur bien-être.
Choix des espèces
Des souris qui présentent des colites ou des lésions similaires aux MICI humaines de façon à imiter le développement, les symptômes et les complications de la maladie sont indispensables pour la réalisation de ce projet. Notons que les miARNs sont les mêmes chez la souris et l'Homme et que des travaux antérieurs de la littérature scientifique ont validé l'utilisation de souris comme modèle animal pour l'étude de la colite, et l'inflammation. Enfin, de nombreux réactifs et outils de recherche, nécessaires à cette recherche, sont spécifiques et ont été validés dans cette espèce. Les souris utilisées pour les expériences (mâles et femelles) auront de 7 jours à 112 jours de vie. Ceci correspond à l’âge optimal pour obtenir la meilleure reproductibilité de la colite et a été décidé en fonction de travaux antérieurs utilisant des modèles de colite murine.
Endothélium et immunité au cœur de l’effet FLASH après radiothérapie thoracique à ultra-haut débit de dose
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Transportées trente minutes vers le site d'irradiation, anesthésiées, irradiées au thorax, puis ramenées, 1 280 souris seront gardées une semaine, deux semaines, trois mois ou six mois avant d'être tuées pour prélèvements. 416 d'entre elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 416 un niveau modéré et 448 un niveau léger. Le porteur écrit que la radiothérapie est imperceptible et ne peut causer de souffrance, tout en décrivant une fibrose pulmonaire tardive qui provoque fatigue, atteinte de la mobilité et modification de la respiration chez environ 10 % des animaux. Il annonce un suivi quotidien et une mise à mort si les signes persistent plus de trois jours, sans préciser combien de souris atteindront les six mois d'observation.
Objectifs
La radiothérapie est un traitement souvent utilisé contre le cancer, car elle permet de détruire les cellules malades. Mais elle touche aussi les tissus sains autour de la tumeur, ce qui peut provoquer des effets secondaires parfois importants et limiter l’efficacité du traitement. Pour améliorer cela, une nouvelle méthode appelée radiothérapie FLASH attire beaucoup d’attention. Contrairement à la radiothérapie classique, elle envoie les rayons à une intensité très forte, mais pendant un temps très court. Les premières recherches montrent que cette technique pourrait mieux protéger les tissus sains tout en restant efficace contre la tumeur. Cet effet protecteur, appelé « effet FLASH », n’est pas encore bien compris. Parmi les explications possibles, le rôle du système immunitaire semble important. Il est possible que la réaction du corps aux rayons change selon la méthode utilisée. Ce projet cherche donc à savoir si la façon dont le système immunitaire réagit pourrait expliquer pourquoi la méthode FLASH provoque moins d’effets secondaires. L’étude se concentre sur les cellules qui tapissent l’intérieur des vaisseaux sanguins, appelées cellules endothéliales. Elles jouent un rôle clé dans les réactions aux rayons et dans la défense du corps. Elles aident aussi les cellules de défense à atteindre les zones abîmées. Nous voulons observer comment ces cellules réagissent à la radiothérapie FLASH chez la souris, en particulier dans les poumons, et voir si cette technique change leur comportement, leur capacité à attirer les cellules de défense et la nature de la réaction inflammatoire, par rapport à la radiothérapie classique. Ce travail s’appuie sur des recherches précédentes faites chez la souris avec des rayons classiques. Cette nouvelle étape aidera à mieux comprendre comment limiter les effets secondaires de la radiothérapie sans réduire son efficacité.
Bénéfices attendus
Ce projet cherche à mieux comprendre comment certaines cellules des vaisseaux sanguins des poumons réagissent à une nouvelle forme de radiothérapie appelée FLASH. Cette technique envoie des doses très fortes de rayons en un temps très court. Elle pourrait permettre de soigner les tumeurs tout en limitant les dégâts sur les tissus sains. L’objectif est d’observer, chez la souris, comment ces cellules réagissent après une irradiation FLASH et comment elles interagissent avec le système immunitaire. Cela aidera à savoir si cette méthode protège mieux les tissus sains. Ce projet apportera plusieurs bénéfices. Sur le plan scientifique, il permettra de mieux comprendre le rôle de ces cellules dans la réaction du corps à la radiothérapie, notamment leur influence sur l’activation et l’arrivée des cellules de défense. Comprendre leur rôle dans l’effet FLASH, c’est-à-dire la protection des tissus sains malgré un traitement efficace, pourrait ouvrir la voie à de nouvelles façons d’améliorer la radiothérapie. Ces découvertes pourraient aussi inspirer de nouveaux traitements qui protègent mieux les tissus sains tout en renforçant la défense du corps contre la tumeur. Ce projet pourrait aider à réduire les effets secondaires parfois graves de la radiothérapie, comme les cicatrices dans les poumons ou les inflammations chroniques, et ainsi améliorer la qualité de vie des patients. Sur le plan médical, mieux comprendre les mécanismes responsables des dommages causés par les rayons permettra de créer des traitements plus ciblés pour les éviter ou les soigner. Cela rendra la radiothérapie plus sûre et plus facile à supporter.
Procédures
Les animaux seront d’abord transportés vers le site d’irradiation (30 min). Les animaux seront anesthésiés et irradiés localement (durée max de 20 min par irradiation). Puis ils reviendront sur le site d’hébergement (30 min de transport). Les animaux seront gardés 1 semaine, 2 semaines, 3 mois ou 6 mois en cage d’hébergement dans les conditions classiques de l’animalerie avant euthanasie. Certains animaux seront imagés avec un scanner sous anesthésie juste avant l’euthanasie (durée max de 10-15 minutes). D’autres animaux seront analysés par échographie sous anesthésie à plusieurs temps après l’irradiation (suivi longitudinal, cinq fois en tout). Ces examens seront réalisés au site d’hébergement des animaux, la phase de transfert n’excédera donc pas 5 min. Aucune autre manipulation ne sera réalisée.
Impact sur les animaux
Lors des phases de transport vers le lieu d’irradiation ou vers les locaux d’imagerie, mais également lors de la préhension, de la contention ou de l’anesthésie, il est attendu d'observer des périodes de stress léger chez les animaux. La radiothérapie en elle-même est imperceptible et ne peut en soi causer de souffrance. Seuls les actes associés (manipulations) sont décelables. Dans les temps précoces, des rougeurs et irritations peuvent apparaitre au niveau cutané chez certains animaux. Le développement de fibrose au niveau pulmonaire dans les temps tardifs après irradiation peut engendrer une détresse telle que : atteinte de la mobilité, fatigue, modification de la respiration. Ces signes sont facilement détectables et concernent environ 10% des animaux.
Devenir
Euthanasie pour prélèvements post-mortem.
Remplacement
Pour l’instant, il n’existe pas de méthode sans utiliser d’animaux qui permette d’étudier précisément comment les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins réagissent dans leur environnement naturel. Cet environnement est important, car il influence leur comportement ainsi que la façon dont les cellules endothéliales attirent les cellules du système immunitaire. C’est pourquoi il est encore indispensable d’utiliser des animaux vivants pour cette étude. Toutefois, ce projet participe au développement d’un modèle en laboratoire, sans animaux, capable de prédire les risques de toxicité liés à la radiothérapie. Ce modèle utilisera des cellules cultivées en laboratoire pour simuler la réaction aux rayons, ce qui pourrait, à terme, diminuer voire remplacer certaines expériences sur les animaux. De plus, certaines idées issues de ce projet seront testées directement sur des modèles cellulaires en laboratoire, notamment pour étudier comment les cellules endothéliales interagissent avec les cellules immunitaires. Cela permettra de mieux cibler les expériences à faire ensuite sur les animaux, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires pour la suite des recherches.
Réduction
Les résultats des expériences sur les lésions pulmonaires causées par la radiothérapie dépendent beaucoup de la physiologie des animaux utilisés. Pour pouvoir faire des analyses fiables, il faut travailler avec un certain nombre d’animaux. Par exemple, pour les analyses des tissus au microscope, on a besoin de groupes d’environ 10 à 12 animaux. Pour étudier les molécules à l’aide d’une technique appelée cytométrie de flux, des groupes de 6 à 8 animaux suffisent. Pour des analyses plus fines, comme le séquençage de l’ARN à l’échelle de chaque cellule ou l’étude de l’expression des gènes dans les tissus, moins d’animaux sont nécessaires (entre 4 et 6), car ces méthodes étudient des milliers de cellules par échantillon, ce qui améliore la précision des résultats. Enfin, pour tester les interactions entre les cellules des vaisseaux sanguins et les cellules du système immunitaire, il faut aussi des groupes de 6 à 8 animaux afin de collecter assez de cellules pour les expériences.
Raffinement
Lors des séances d’irradiation, les souris seront anesthésiées pour qu’elles restent immobiles et ne ressentent aucune douleur. Pour certains examens nécessitant l’injection d’un produit dans le sang avant le prélèvement final, un analgésique sera administré afin de garantir l'absence de douleur chez l’animal. Pendant toute la durée de l’étude, elles seront logées dans de bonnes conditions, avec des jouets comme des tubes ou des caches, de la nourriture et de l’eau à volonté, ainsi qu’une température et une humidité contrôlées. Les animaux seront surveillés chaque jour pour s’assurer qu’ils restent en bonne santé. Ils seront pesés plusieurs fois par semaine au début, puis une fois par semaine pendant plusieurs mois, pour vérifier qu’ils ne perdent pas trop de poids. Nous observerons aussi leur comportement et leur état de santé, en vérifiant par exemple s’ils bougent normalement ou s’ils montrent des signes de souffrance, comme des difficultés à respirer. Si un animal présente des signes inquiétants pendant plus de trois jours, il sera euthanasié pour éviter toute souffrance.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 8 à 10 semaines, un âge correspondant à l’âge adulte, ce qui permet de limiter la variabilité liée à la croissance. Cette tranche d’âge est d’ailleurs celle couramment utilisée pour les modèles d’irradiation localisée. Pour garantir une certaine homogénéité, nous travaillerons avec des souris mâles, qui ont un poids d’environ 20 à 22 grammes à cet âge. Ce choix s’appuie aussi sur notre expérience préalable, puisque notre laboratoire dispose déjà d’un solide recul sur ce modèle chez les mâles. Nous prévoyons néanmoins d’étendre nos recherches aux femelles dans un projet futur, afin d’étudier les effets du débit de dose selon le sexe. La souris est un modèle bien connu et largement utilisé dans les études précliniques, notamment au sein de notre laboratoire pour étudier l’irradiation thoracique et le rôle des cellules endothéliales vasculaires dans les lésions radio-induites. Cette expérience accumulée nous assure une bonne maîtrise des conséquences de l’irradiation dans ce modèle.
Rôle d’une protéine de l’immunité innée dans le lupus
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
8 370 souris pour une étude qui, selon le porteur, se satisfait de dix animaux par groupe : 2 080 d'entre elles subiront des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les 6 290 autres un niveau modéré, et aucune ne sera maintenue en vie. Certaines reçoivent un produit pro-inflammatoire sur la peau chaque jour pendant huit jours, d'autres une irradiation suivie d'une injection de moelle, d'autres une greffe de cellules tumorales, avec jusqu'à vingt-cinq injections par animal. Les souris génétiquement modifiées développeront une maladie lupique avec augmentation de la taille de la rate, atteinte des reins, amaigrissement, poil terne, léthargie et parfois anémie. Sur le raffinement, le porteur mentionne une semaine d'acclimatation, du personnel compétent et des points limites, sans autre précision pour 8 370 animaux.
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’une nouvelle protéine dans le lupus, une pathologie autoimmune. Le lupus est une maladie auto-immune où le système immunitaire attaque par erreur le corps, touchant environ 5 millions de personnes dans le monde. Il peut provoquer une grande fatigue, des douleurs, des problèmes de peau ou d’organes vitaux, ce qui perturbe fortement la vie quotidienne des personnes atteintes. Selon les formes et la sévérité, les symptômes peuvent être discrets ou au contraire très invalidants, impactant durablement la santé et le bien‑être. Pour mettre au point des traitements, il faut comprendre quelles protéines de l’immunité participent à cette activation, car elles ne sont pas totalement connues. Dans le cadre d’un autre projet, nous avons récemment identifié une nouvelle protéine centrale dans l’activation de l’immunité. Ce projet a pour but de comprendre son rôle dans le lupus. A terme, il est possible que les résultats de cette étude permettent de mettre au point des thérapies permettant de réduire l’activation non-voulue de l’immunité chez ces patients. L’objectif de ce projet est de comprendre le rôle d’une nouvelle protéine immunitaire dans le lupus, une pathologie autoimmune.
Bénéfices attendus
Les mécanismes derrière la pathologie auto-immune lupus ne sont pas totalement compris. Nous avons récemment découvert une protéine nécessaire aux premières étapes d’activation du système immunitaire. Ce projet propose d’analyser son rôle chez la souris. À long terme, ce projet pourrait apporter la preuve que notre protéine d’intérêt joue un rôle dans l’organisme dans la pathologie lupus. Il a également pour but de tester l’effet thérapeutique d’une petite molécule démontrée comme inhibant l’activité de cette protéine d’intérêt en contexte lupique. Ce projet pourrait donc amener vers une nouvelle thérapie du lupus pour les patients.
Procédures
Toutes les interventions se font sur animaux éveillés. Toutes les injections correspondent à un geste d’une durée inférieure à 10s. Un 1er lot d’animaux sera injecté avec un produit activant la réponse immunitaire (1 fois au cours de l’expérience), puis pour partie injecté avec un produit inhibant la réponse immunitaire (1 fois au cours de l’expérience). Un produit pro-inflammatoire sera appliqué sur la peau d’un 2e groupe d’animaux (tous les jours, pendant 8 jours- durée du geste inférieur à 5 min). Ces animaux pourront être injectés avec un produit inhibant la réponse immunitaire (tous les jours pendant les 8 jours). Alternativement, certains animaux seront injectés avec un produit inhibant la réponse immunitaire quatre fois au cours des 8 jours d’expérience. Du sang sera prélevé 2 fois. Un 3e groupe de souris sera irradié, puis injecté avec de la moëlle épinière (1 fois au cours de l’expérience). Un produit pro-inflammatoire sera appliqué sur la peau des animaux comme précedemment. Du sang sera prélevé 2 fois. Un 4e lot d’animaux sera injecté avec un produit inhibant la réponse immunitaire (25 fois au cours de l’expérience, sur une durée de 5 semaines, 5 jours par semaine). Du sang sera prélevé 3 fois. Un 5e lot d’animaux sera injecté avec un produit activant la réponse immunitaire (1 fois au cours de l’expérience), puis injecté avec un produit inhibant la réponse immunitaire (13 fois au cours de l’expérience, une fois par jour pendant 13 jours, ou alternativement 25 fois au cours de l’expérience, sur une durée de 5 semaines, 5 jours par semaine). Alternativement, certains animaux seront injectés avec un produit inhibant la réponse immunitaire quatre fois au cours des 13 jours d’expérience. Du sang sera prélevé 2 fois. Dans un 6e lot d’animaux, des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience). Les animaux pourront être traités à raison de deux fois par semaine pendant un mois (administration des traitements aux animaux vigiles), ainsi qu’avec un produit inhibant la réponse immunitaire (25 fois au cours de l’expérience, sur une durée de 5 semaines, 5 jours par semaine). Du sang sera prélevé 3 fois.
Impact sur les animaux
L’injection de traitements ou de cellules tumorales au moyen d’une aiguille entraîne une douleur transitoire et courte (quelques secondes) due à la piqure elle-même. Pour les injections, les animaux seront immobilisés transitoirement, ce qui entrainera un stress limité et court. Les souris génétiquement modifiées développeront au cours du temps des symptômes de maladie lupique, incluant une augmentation de la taille de la rate, ainsi que des atteintes du rein résultant en l’apparition de protéine dans les urines. Des signes cliniques tels que amaigrissement, poil terne, léthargie, et parfois anémie sont attendus. Dans le modèle induit par injection de produit chimique, une réaction immunitaire locale avec rougeur au site d’injection peut survenir, ainsi qu’une accumulation de liquide dans la cavité abdominale. Ces effets sont caractéristiques de la pathologie auto-immune recherchée. Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs .Les animaux pourront perdre du poids, manger moins et avoir du mal à se déplacer.
Devenir
Aucun animal maintenu en vie. Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Des expériences en laboratoire ont montré que notre protéine immunitaire joue un rôle clé dans l’activation des défenses immunes de l’organisme. Quand cette protéine est absente, les cellules ne réagissent plus aux signaux censés déclencher une réponse immune. Le projet cherche maintenant à comprendre si cette protéine est impliquée dans le lupus, en utilisant des souris comme modèle vivant. Même si des méthodes alternatives comme la culture de cellules ont été utilisées, l’étude sur l’animal reste essentielle pour observer la réponse immunitaire dans son ensemble, telle qu’elle se produit dans un organisme complet et fonctionnel. La réponse immune implique de nombreux types de cellules différents, dans des organes particuliers et une temporalité précise. Cette complexité n’est pas observable avec des méthodes simplifiées impliquant de la culture cellulaire.
Réduction
Pour limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons prévu une première série de trois expériences destinées à vérifier si la protéine que nous étudions joue bien un rôle dans le mécanisme responsable du lupus. Cette étape fonctionne selon un principe de “go/no go” : si les résultats sont positifs (go), nous poursuivons avec trois expériences supplémentaires ; si les résultats sont négatifs (no go), nous arrêtons là, ce qui évite d’utiliser des animaux inutilement. Nous avons également réduit la taille des groupes au strict minimum. Notre expérience de laboratoire montre que 10 souris par groupe suffisent pour évaluer de façon fiable l’effet anti inflammatoire d’un gène ou d’un traitement. Avec ce nombre, nous pouvons détecter une différence claire entre deux groupes avec une très bonne précision statistique (90 % de chance de repérer un véritable effet et seulement 5 % de risque de se tromper). Enfin, pour certaines manipulations, nous récupérons autant d’organes que possible chez chaque animal afin de réaliser plusieurs analyses sur le même individu. Cette approche permet de répondre à un maximum de questions scientifiques tout en réduisant encore le nombre total d’animaux nécessaires.
Raffinement
Avant toute manipulation, les souris auront au minimum une semaine d’acclimatation afin de s’habituer à leur nouvel environnement. Elles sont manipulées par des personnels compétents afin de limiter au maximum le stress dû à la manipulation. Le bien être des souris sera suivi par le personnel de l’équipe de recherche. . Le suivi des animaux est basé sur des points limites généraux et spécifiques de la pathologie est effectué en utilisant pour évaluer de façon objective l’état des animaux.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche sur le lupus : souches murines parfaitement définies et modèles génétiquement modifiés, avec de grandes similarités entre les systèmes immunitaires humains et murins qui permet de transposer nos découvertes dans le modèle murin chez l’humain. De plus, nous avons documenté de manière robuste l’existence de notre protéine d’intérêt chez l’humain et chez la souris. Souris adultes ( >6 semaines) car leur réponse immune est active.
ROLE DU MICROBIOTE INTESTINAL SUR LA SENSIBILISATION CENTRALE A LA DOULEUR DANS LA POLYARTHRITE RHUMATOÏDE
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
420 souris vont être utilisées, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent par voie orale le microbiote intestinal de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, une fois par semaine pendant quatre semaines, puis les expérimentateurs leur provoquent une arthrite par injection de molécules inflammatoires. Chaque semaine, ils mesurent leur seuil de douleur par piqûre de filaments de nylon et par réaction au froid, et évaluent leurs comportements anxieux et dépressifs. Aucun antalgique ne leur sera donné, l'hypersensibilité à la douleur étant l'objet même de l'étude, et le porteur conclut que le recours à la souris relève ici de considérations "scientifiques, techniques et éthiques".
Objectifs
Chez les personnes atteintes de polyarthrite rhumatoïde, 20 à 30 % continuent d’avoir des douleurs même si leur maladie est bien traitée. Leur corps réagit plus facilement à la douleur que celui de personnes non malades, et elles ont aussi souvent plus d’anxiété et de dépression. La flore intestinale, c'est-à-dire les bactéries présentes dans nos intestins, joue un rôle dans la maladie, et on sait qu'un lien important existe entre l’intestin et le cerveau. Nous pensons donc que les modifications de la flore intestinale des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde favorisent la douleur chronique et la dépression, notamment chez les patients qui ont des symptômes qui persistent après traitement. Pour mieux comprendre comment tout cela fonctionne, nous allons étudier l’impact de leur flore intestinale en la transférant à des souris. Ensuite, nous observerons ces souris avec différents tests permettant d’évaluer leur sensibilité au toucher ou au froid, mais aussi des tests qui permettent d’évaluer l’anxiété ou la dépression. Nous testerons l’effet des microbiotes dans deux situations : chez des souris saines pour évaluer les effets déclencheurs des microbiotes, et en conditions pathologiques, c’est à dire chez des souris avec de l’arthrite pour évaluer cette fois les effets aggravateurs des microbiotes. Une fois prouvé le rôle du microbiote, nous identifierons quels éléments issus du microbiote intestinal sont responsables pour pouvoir les cibler et tenter de bloquer les mécanismes qui déclenchent ou aggravent la maladie. L’objectif final est d’identifier des composés du microbiote pouvant réduire la douleur ou les troubles anxio-dépressifs, afin d’ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients.
Bénéfices attendus
La douleur chronique et de la dépression restent difficiles à traiter chez certains patients, ce qui impacte fortement leur qualité de vie. Il est donc essentiel de comprendre l'origine de l’hypersensibilité à la douleur et de la dépression pour permettre le mieux les soigner. Une fois prouvé rôle de la flore intestinale, nous analyserons et comparerons les différents microbiotes pour identifier quelles sont les bactéries ou quelles sont les molécules produites pourraient expliquer l’hypersensibilité à la douleur et de la dépression. Ceci nous permettra ainsi de tester leur rôle protecteur chez les souris avant de les tester en clinique chez les patients. Ce projet permettra donc une véritable recherche translationnelle, du laboratoire au patient, avec pour objectif d’améliorer la qualité de vie des personnes atteintes de douleurs chroniques ou de dépression.
Procédures
Nous réalisons des greffes de microbiote intestinal en donnant aux souris par voie orale des préparations de microbiote de patients une fois par semaine pendant 4 semaines. Suite à la greffe de microbiote, les souris seront suivies chaque semaine grâce à des tests comportementaux pour mesurer les seuils de sensibilité (réaction au toucher par filaments de Nylon ou réaction à la température) et caractériser les comportements anxieux ou dépressifs. Chaque test dure entre 5 et 20 min. Dans certains cas, nous examinons aussi si le microbiote modifie la perméabilité de l’intestin ou le passage de substances vers le cerveau, en administrant des traceurs fluorescents par voie orale ou par injection. Ces expériences sont menées chez des souris saines et dans un modèle de polyarthrite, induite par l’injection de molécules inflammatoires, sous anesthésie légère par inhalation. Enfin, lorsque des molécules produites par le microbiote auront été identifiées (comme des dérivés du tryptophane, de la sérotonine, des métabolites de fibres ou des acides biliaires), nous les ajouterons dans l’eau de boisson des souris pour tester leur effet bénéfique dans les modèles les plus pertinents.
Impact sur les animaux
La sensibilité tactile et thermale et les comportements anxio-dépressifs étant les paramètres étudiés dans nos procédures, aucune médication antalgique ou analgésique systématique ne peuvent être appliquées car ils fausseraient nos résultats. Les principaux désagréments pour les animaux seront liés au modèle inflammatoire utilisé pour induire l’arthrite. L’arthrite provoquera des douleurs articulaires, des gonflements et des rougeurs au niveau des pattes. Cependant l’arthrite induite sera dite aigüe, c’est-à-dire de courte durée (maximum 2 semaines), avec retour à un état normal. Les animaux subiront également des piqures d’aiguilles, un stress léger passager lié aux manipulations. Toutes les injections seront pratiquées sous anesthésie légère par inhalation, d’une durée d’environ 5 minutes, afin de réduire au maximum la douleur et l’inconfort.
Devenir
La douleur étant étudiée, et donc induite, chez certains animaux, le devenir de ceux-ci en fin de procédure expérimentale sera systématiquement l’euthanasie afin de ne pas générer de douleur inutile. De plus, L’euthanasie permet également de réaliser les analyses post mortem nécessaires, notamment sur le cerveau et l’intestin, afin de compléter les données comportementales et d’approfondir la compréhension des mécanismes reliant microbiote, douleur et comportements anxio-dépressifs.
Remplacement
Ce projet vise à comprendre comment le microbiote intestinal influence la douleur et les comportements associés dans la polyarthrite rhumatoïde. A ce jour, il n'existe pas de modèle de substitution permettant d'étudier les interactions complexes entre microbiote, système immunitaire, système nerveux et comportement. Par ailleurs, la perception de douleur, ainsi que les réponses anxieuses ou dépressives, sont des phénomènes appréhendés par l’organisme conscient, et lui seul. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.
Réduction
Tout sera mis en œuvre pour réduire la variabilité interindividuelle dans nos groupes et assurer qu’un nombre minimal de souris sera utilisé pour démontrer un effet (animaux du même âge, mâles et femelles, période d’habituation à l’environnement et à l’expérimentateur). Un grand soin est apporté aux animaux afin de limiter au maximum le stress qui pourrait entraîner des biais importants dans la détermination du seuil de sensibilité tactile. Le nombre de souris par lot a été déterminé sur la base d’expérimentations antérieures, ce qui nous a permis de déterminer qu’un nombre de 20 souris par groupe (10 males et 10 femelles) est nécessaire pour observer une différence statistique et biologiquement pertinente. Ainsi nous utiliserons le minimum d’animaux requis pour observer des différences statistiques entre les groupes, afin que les tests effectués soient pertinents mais sans sur-utilisation d’animaux.
Raffinement
Notre objectif étant d’étudier l’hypersensibilité à la douleur, nous n’interviendrons pas tant que les niveaux de douleur observés restent dans les seuils attendus pour les modèles utilisés. En revanche, toutes les procédures sont conçues dans le respect de l’animal et avec pour objectif constant de réduire au maximum le stress et l’anxiété, afin de limiter l’inconfort à ce qui est strictement nécessaire au protocole et d’assurer le bien être des animaux. Cela passe par une étape d’habitation progressives des animaux (1 semaine à l’arrivée pour les locaux, puis 1 semaine pour les pièces d’expérimentation) et une manipulation douce par du personnel formé, avec là aussi une période d’habituation quotidienne des animaux aux expérimentateurs. L’enrichissement fourni comprend les matériaux réglementaires de nidification, auxquels est ajouté un igloo rouge, contribuant à améliorer leur confort et leur sentiment de sécurité. Tout au long du projet, l’objectif reste de limiter l’angoisse et la souffrance. Les animaux feront donc l’objet d’un suivi clinique régulier, plusieurs fois par semaine (et chaque jour en période inflammatoire), pour identifier rapidement toute douleur excessive, perte de poids, difficulté locomotrice ou comportement anormal. Une grille d’évaluation clinique, accompagnée des actions à mettre en œuvre, permettra une prise en charge immédiate et adaptée, afin d’éviter toute douleur inutile. De plus, la durée des expériences est volontairement limitée pour réduire l’exposition aux modèles inflammatoires et minimiser la souffrance.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de greffe de microbiote chez l’animal. Elle permet d’évaluer les effets d’un microbiote donné sur le comportement, la douleur, l’inflammation et les interactions neuro immunes de manière intégrée, ce qui n’est pas possible chez des espèces plus simples. Les souris utilisées seront adultes et auront entre 8 et 21 semaines afin que les animaux ne soient ni en croissance ni en phase de vieillissement.
Etude des mécanismes de l’inflammation dans un modèle d’arthrite chez la souris 3/3
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Une injection par semaine pendant seize semaines, six séances d'imagerie sous anesthésie et un transport hebdomadaire entre trois établissements : 1 025 souris vont être utilisées, dont 258 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le phénotype dommageable provoque des atteintes articulaires à partir de sept semaines, puis une mobilité réduite et une perte de poids à partir de dix. La plupart seront tuées pour prélever le sang, la rate, les ganglions et les pattes, celles qui portent le bon génotype étant conservées pour maintenir les lignées. Sur la réduction, le porteur se contente d'annoncer une analyse de puissance statistique et des tests adaptés, sans donner ni effectif par groupe ni justification du total de 1 025 animaux.
Objectifs
La polyarthrite est une pathologie très fréquente et invalidante qui représente un enjeu de santé publique. Cette maladie auto-immune provoque une inflammation durable des articulations, ce qui peut endommager les os et le cartilage, entraînant des déformations irréversibles. Nous voulons étudier les mécanismes inflammatoires mis en jeu en modifiant leur expression dans un modèle de souris génétiquement modifiée.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de mieux comprendre les mécanismes pathogènes à l'origine de la maladie et pourrait ainsi contribuer au développement de thérapies efficaces.
Procédures
Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage dans l’établissement 1, le suivi clinique et traitement dans l’établissement 2, l’imagerie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à une contention et à une injection réalisée une fois par semaine pendant 16 semaines, soit un total de 16 injections, chacune d’une durée approximative de 10 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à une imagerie (anesthésie générale) (au total 6 actes de 10 minutes).
Impact sur les animaux
Le phénotype dommageable va induire à partir de 7 semaines des potentielles atteintes articulaires, à partir de 10 semaines, une mobilité réduite et perte de poids. Les injections vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. Les anesthésies gazeuses pour réaliser l’échographie sont des actes stressants. Le transport répété des animaux entre les sites utilisateurs, de manière hebdomadaire sera stressant pour les animaux.
Devenir
Des animaux seront mis à mort car sans génotype d'interêt. Certains animaux seront mis à mort pour prélèvement de tissus spécifiques post-mortem : sang,rate et ganglions, pattes afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte générale et articulaire par différentes techniques. Certains animaux avec le bon génotype seront conservés pour le maintien des lignées.
Remplacement
Les cellules spécifiques du système immunitaire et les cellules de la membrane de l'articulation ont été traitées avec les différentes molécules étudiées et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale et permettra d’avoir un suivi longitudinal du développement inflammatoire et articulaire pour l'ensemble des animaux ainsi qu’une mise à mort de chaque animal au moment le plus informatif. Les souris seront transférées dans des cages de transport avec bords opaques, sans visibilité de l’extérieur, dans un environnement enrichi.
Choix des espèces
La souris développe des réactions immunitaires proches de celles observables chez l’homme. Les atteintes articulaires de la maladie sont similaires à celles observées chez l’homme. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées de 6 à 12 semaines pour l'étude menée sur cette maladie.
Protection antibactérienne et de réparation du foie lors d’une inflammation intestinale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
La surveillance s'intensifie à mesure que les souris perdent du poids, et une grille de score décide du moment de la mise à mort. 2 874 souris vont être utilisées, dont 1 140 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour analyses post-mortem. Elles reçoivent jusqu'à six administrations forcées en deux semaines, puis un produit inflammatoire dans l'eau de boisson par cycles d'une semaine sur deux, et pour une partie d'entre elles une chirurgie de quinze minutes. Le porteur décrit une diarrhée, du sang dans les selles et des signes de déshydratation, et affirme dans le même temps qu'aucun effet indésirable lié aux traitements n'est attendu.
Objectifs
Le foie sert comme une barrière qui protège l’organisme de la diffusion des bactéries qui colonisent et habitent dans l’intestin. Lors d’une maladie inflammatoire de l’intestin cette protection peut malheureusement être perdue. Des cellules du système immunitaire sont responsables de cette fonction barrière du foie, où Il y a, entre autres cellules immunitaires, des lymphocytes T résidentes qui ont des fonctions antibactériennes et de réparation tissulaire. Néanmoins, leur rôle barrière contre les bactéries de l’intestin n’est pas bien compris. L’objectif de ce projet est donc de découvrir quels lymphocytes sont important pour assurer la fonction barrière antibactérienne du foie et comment elles participent dans l’élimination des bactéries et la réparation tissulaire pendant inflammation intestinale.
Bénéfices attendus
Le foie confère une protection importante contre des bactéries intestinales qui réussissent à entrer dans la circulation. Cette translocation bactérienne est plus importante pendant des maladies intestinales inflammatoires lorsque la perméabilité intestinale est augmentée. Les cellules et mécanismes impliqués dans cette fonction du foie ne sont pas bien compris. Ce projet permettra de mieux comprendre les cellules du système immunitaire présentes dans le foie qui nous protègent des infections par des bactéries intestinales. Cela pourra inclure l’identification de nouvelles molécules avec des rôles antibactériens et de réparation des tissus qui, dans le long terme, pourraient être utilisées pour les thérapies dans des maladies infectieuses, notamment bactériennes, ou inflammatoires comme la colite.
Procédures
Dans un premier lot d’animaux, des souris vigiles (souris non anesthésiées) recevront un traitement à raison de maximum de 6 administrations au cours de 2 semaines. Chaque administration dure au max 1 minute avec contention de l’animal. Dans un second lot d’animaux les animaux vigiles recevront un traitement à raison d’ 1 fois par jour pendant une semaine. Chaque administration dure au max 1 minute avec contention de l’animal. Dans un troisième lot d’animaux, des souris vigiles recevront un premier traitement à raison de maximum de 6 administrations au cours de 2 semaines. Chaque administration dure au max 1 minute avec contention de l’animal. Puis les animaux recevront un second traitement administré dans l’eau de boisson pendant 1 semaine (traitement 1 semaine sur deux), 3 cycles de traitements. Pendant la dernière semaine de traitement les animaux vigiles recevront un troisième traitement à raison d’1fois par jour pendant 1 semaine. Chaque traitement dure au max 1 minute avec contention de l’animal. Dans un quatrième lot d’animaux, les souris recevront un traitement administré dans l’eau de boisson pendant 1 semaine (traitement 1 semaine sur deux), 3 cycles de traitements. Pendant la dernière semaine de traitement, les animaux subiront une chirurgie . Chaque chirurgie dure au maximum 15 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements sont liés aux gavages et aux injections (gène de courte durée). Aucun effet indésirable lié aux traitements n’est attendu. Lors de l’induction de l’inflammation intestinale les souris peuvent perdre du poids, avoir de la diarrhée ou sang dans les selles et présenter des signes de déshydratation. Ces signes cliniques se développent pendant la semaine d’induction d’inflammation et s’améliore pendant la semaine de récupération. Les chirurgies étant de courte durée, les animaux récupèrent vite et normalement ne montrent plus signes de douleur le lendemain de la chirurgie.
Devenir
Tous les animaux seront mises à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Ce projet étudie un phénomène qui implique la communication et migration de cellules et des bacteries entre plusieurs organes (intestin, foie et système immune) et les bactéries de l’intestin. Ce système complexe ne peut pas etre bien reproduit en culture. D’ailleur les cellules du système immune que nous etudions existent que chez les mamimeferes (souris, homme…) et ne sont pas presentes chez le zebrafish. Il n’y a donc pas d’autres modèles qui permettront de remplacer des souris.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris utilisées : - Un partage du groupe contrôle avec plusieurs groupes expérimentaux sera privilégié ; - Des expériences de validation de plusieurs modelés (e.g. efficacité des substances à tester, validation du succès des chirurgies…) avec des souris saines. Des critères de « go/no go » sont en place avant de passer sur les souris avec inflammation intestinale. Nous utiliserons de façon générale 18 souris par groupe expérimental (6 souris par répétitions pour un total de 3 répétitions). Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé pour permettre des analyses statistiques et une interprétation biologique des résultats valides.
Raffinement
Afin de limiter au maximum les nuisances sur l’animal : - Surveillance 3 fois par semaine pour surveiller l’état général des souris sous traitement inflammation. la fréquence de surveillance augmentera avec la chute de poids pour adapter au mieux la prise en charge - Si signes de déshydratation, les souris seront réhydratées. - Avant les chirurgies, l’expérimentateur viendra manipuler sans douleur les animaux pour qu’ils puissent s’habituer à la préhension. Cela permet de limiter le stress lié à l’expérimentation. - De l’alimentation gélifiée et de la nourriture imbibée d’eau sera disposée sur la litière facilement accessible pour les animaux après chirurgie ou si signes de déshydratation lors des inductions d’inflammation intestinale en plus d’une réhydratation parentérale. - L’analgésie sera garantie pendant la chirurgie et durant 2 jours après les chirurgies. - Crème vaseline oculaire déposée à l’aide d’un coton tige pour éviter l’assèchement de l’œil durant et après l’anesthésie. - Surveillance de l’animal dès le lendemain de la chirurgie puis 2 fois par semaine pour surveiller l’état général des souris. - Tous les souris seront évaluées régulièrement en relation avec une grille de score permettant d’évaluer la souffrance des animaux et indiquant les actions à suivre.
Choix des espèces
La souris est ici un modèle de choix du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins et la fonction barrière antibactérienne du foie. De plus, nous avons une bonne connaissance de son génome, ce qui nous permet de créer des souris génétiquement modifiées pour des gènes d’intérêts pour notre projet de recherche. Enfin, nous avons une expérience au laboratoire de plusieurs dizaines d’années sur l’étude du système immunitaire chez les souris.
Impact d’une manipulation des contrôles inhibiteurs des neurones dopaminergiques en modèles de maladie de Parkinson EU1/2 (MODIFICATION)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une biopsie de tissu est pratiquée sur des souriceaux éveillés vers le sixième jour après la naissance, puis les animaux subissent une chirurgie crânienne pouvant durer quatre heures. 1 396 souris vont être utilisées, 520 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 160 sous anesthésie sans réveil, et toutes tuées pour prélèvement de tissus. Le protocole prévoit jusqu'à 36 tests comportementaux par animal sur 20 semaines, 20 prélèvements sanguins à la queue et deux examens IRM de deux heures. Le porteur annonce une prise en charge de la douleur, tout en indiquant que les altérations des seuils de douleur provoquées par la lésion ne seront pas soulagées puisqu'elles constituent l'objet de l'étude.
Objectifs
La perte des neurones dopaminergiques dans la maladie de Parkinson s’accompagne d’un dysfonctionnement de certains circuits cérébraux et de symptômes moteurs et non-moteurs qui restent difficiles à prendre en charge. La lésion d’une région cérébrale incluant une structure qui est un contrôle de ces neurones dopaminergiques peut améliorer certains symptômes. L’identification récente d’un marqueur moléculaire sélectif de cette structure permet désormais d’étudier les conséquences d’une modulation de l’activité de cette structure dans un modèle de la maladie de Parkinson. L’objectif du projet est ainsi de tester si l’inhibition sélective de cette structure transitoire et chronique peut soulager les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs. Les patients Parkinsoniens présentent par ailleurs des altérations structurelles et fonctionnelles de leur réseaux cérébraux, visibles par imagerie par résonance magnétique (IRM). Ces altérations de la connectivité cérébrale pourraient être modifiées par l’inactivation de notre structure d’intérêt. L’identification des changements de connectivité cérébrale et la mise en évidence de l’implication de zones spécifiques au niveau du cerveau pourraient aider la recherche préclinique et clinique, et accélérer les stratégies thérapeutiques. Ce projet se déroule dans 2 Etablissements Utilisateur: EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
La structure cérébrale ciblée par ce projet exerce un contrôle inhibiteur sur les systèmes dopaminergiques, qui dégénèrent dans la maladie de Parkinson. Ce projet doit permettre de tester si une inhibition aigüe et chronique de cette structure peut améliorer les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs, apportant ainsi une preuve de concept sur le potentiel thérapeutique de cette cible anatomique. La maladie de Parkinson est la seconde maladie neurodégénérative la plus fréquente. Connue pour ses symptômes moteurs, cette maladie a aussi des conséquences délétères non-motrices, incluant douleur, troubles de l’humeur et déficits cognitifs. Les patients présentent en moyenne 14 symptômes dans les phases précoces de la maladie et plus de 20 dans des phases plus tardives, mettant en évidence le besoin de prendre cette complexité en considération dans la recherche préclinique.
Procédures
Les animaux sont soumis à une biopsie de tissu pour réaliser leur génotypage, cette biopsie est effectuée sur animal vigile autour de 6 jours postnatal, ou à défaut sur animal sous anesthésie à partir de 12 jours postnatal. Des animaux sont soumis à 1 chirurgie d’au maximum 1h30 ou 4h, et un maximum de 36 tests comportementaux de 10 à 45 minutes chaque, répartis sur 20 semaines avec au moins un jour de repos entre chaque test. Les animaux sont soumis à un prélèvement par semaine sur la veine caudale localisée sur la queue, d’une durée de 2 minutes par animal (20 prélèvements maximum). Les animaux sont soumis à deux examens IRM sous anesthésie, incluant chacun au plus une séquence d'IRM fonctionnelle de 16min, une d'IRM anatomique de 10 min et une d'IRM de diffusion de 60 min (TOTAL=2 heures maximum par examen) (EU2).
Impact sur les animaux
Une douleur légère et de courte durée peut être provoquée par la biopsie de tissus. La chirurgie peut entraîner une perte de poids transitoire, une douleur postopératoire modérée, une inflammation locale transitoire autour du dispositif des points de suture (peau du crâne). Les tests comportementaux peuvent s’accompagner d’un stress léger. Les lésions dopaminergiques modélisant la maladie de Parkinson peuvent entrainer une perte de poids sur les 10 premiers jours après la lésion. Des déficits moteurs liés à la modélisation de la maladie de Parkinson sont également attendus, ainsi que des altérations sensorielles des seuils de douleur qui ne peuvent être soulagées car c’est l’objet de l’étude. Le transport et l’environnement inconnu de la nouvelle animalerie peuvent également entrainer un stress chez les animaux au moment du changement d’EU.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus.
Remplacement
Compte tenu du sujet du projet, il est impossible de remplacer le modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les comportements étudiés et la connectivité cérébrale nécessitent un système nerveux complet et un animal entier, vivant et vigile. L’existence et la localisation de la structure cérébrale étudiée n’ont pour l’instant été établies que chez les mammifères, ne permettant donc pas en l’état actuel des connaissances d’utiliser un autre modèle animal. Toutefois, des tests in-vitro par spectrométrie de masse seront réalisés en amont de l’inhibition chronique de notre structure.
Réduction
Les expériences sont menées en cherchant à limiter le nombre d'animaux, tout en obtenant l’information scientifique recherchée. Pour les diverses expériences, ce nombre d'animaux nécessaire pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables est défini sur la base de notre expertise, de l'analyse de la littérature et de calculs de power analyse.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies (bâton, tunnel, coton et frisure) favorisant leur comportement naturel (ronger et faire des nids). Ils sont acclimatés aux conditions d’hébergement et habitués aux expérimentateurs. Ils sont habitués à la manipulation avant la chirurgie, ainsi qu’aux environnements des tests comportementaux avant leur réalisation. Les animaux seront suivis pour déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées, la température maintenue (tapis chauffant) et les yeux protégés par du gel oculaire. La lésion des neurones dopaminergiques est partielle, se rapprochant du stade précoce de la maladie de Parkinson. Après la chirurgie, une grille d’évaluation est utilisée pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargés du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance. Le transport entre les 2 EU se fera dans des cages sécurisées avec nourriture et eau gélifiée et une période de 1 semaine sera respectée avant le début des examens IRM. Durant celui-ci, une anesthésie sera utilisée pour réduire au maximum le stress de l'animal. Leurs yeux seront protégés du dessèchement par l’application d’un gel de protection. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage et maintenue par un système de chauffage du berceau de l’IRM et un tapis chauffant. En cas de chute de la température et/ou d’une respiration altérée, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM et pris en charge. Il sera placé dans une enceinte chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler sélectivement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que les études nécessitent des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés. Le génotypage est prioritairement effectué entre 6 et 8 jours, et la chirurgie à partir de 8 semaines d’âge.
Évaluation de nouvelles thérapies dans le domaine des maladies inflammatoires de l’intestin induit par l’indométacine
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 2880
5 760 rongeurs, 2 880 souris et 2 880 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 920 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une colite leur est provoquée par administration répétée d'indométacine, jusqu'à sept fois, par la bouche, sous la peau ou dans le ventre, puis ils reçoivent les composés à tester jusqu'à trois fois par jour pendant quinze jours par sonde gastrique, avec des prélèvements de sang dans l'orbite de l'œil et une ponction cardiaque terminale. Le porteur décrit des diarrhées, du sang dans les fèces et au rectum, et une mise à mort immédiate au-delà de 20 % de perte de poids en vingt-quatre heures. Les données serviront à fixer les doses des études toxicologiques puis des essais chez le volontaire sain, l'effectif de 5 760 animaux étant renvoyé à des "données de la littérature" et à des analyses de puissance.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux traitements sur un modèle de colite chez le rongeur induit par un anti-inflammatoire non stéroïdien utilisé pour soulager les douleur et l’inflammation dans l’arthrose, l’arthrite rhumatoïde, la goute et les tendinites mais conduit souvent à des effets secondaires indésirables gastro-intestinaux. En inhibant la production de prostaglandines, cet anti-inflammatoire réduit l’inflammation et la douleur, mais cette inhibition entraîne une altération de la barrière intestinale et une augmentation de la perméabilité, favorisant des lésions et une inflammation locale pouvant conduire à des complications : ulcères, perforations et saignements entrainant une urgence chirurgicale. Ainsi par ces observations, cet anti-inflammatoire est utilisée pour induire une colite expérimentale chez les rongeurs qui mime par certaines aspects les maladies chroniques inflammatoires de l’intestin comme la maladie de Crohn. Les informations qui seront générées par le biais de ces études seront utilisées pour préparer les phases précliniques et cliniques du développement pharmaceutique de ces nouveaux traitements. Ces informations comprennent entre autres : • Dose minimale produisant un effet thérapeutique • Dose minimale pour lequel l’effet thérapeutique est le plus élevé. • Déterminant pharmacocinétique qui conduit à l’efficacité thérapeutique. • Régime de doses pour les études toxicologiques exploratoires et règlementaires. • Régime de doses pour les essais cliniques chez le volontaire sain, puis chez le patient.
Bénéfices attendus
L’utilisation d’un modèle de colite chimiquement induite chez la souris présente un intérêt majeur en recherche préclinique. Ce modèle reproduit des lésions intestinales et une inflammation similaires à celles observées dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, comme la maladie de Crohn. La maladie de Crohn est une pathologie chronique incurable qui entraîne des lésions intestinales évoluant par poussées et rémissions, avec un fort impact sur la qualité de vie. Les traitements actuels, tels que les corticoïdes, immunosuppresseurs et biothérapies, présentent des limites importantes : échecs thérapeutiques fréquents, perte de réponse au fil du temps et effets secondaires sévères. De plus, la maladie s’accompagne souvent de complications psychologiques comme la dépression et l’anxiété, liées à la douleur, la fatigue et la stigmatisation sociale. Ce projet permettra d’évaluer l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques (anti-inflammatoires, immunomodulateurs, antioxydants, probiotiques) et d’étudier les mécanismes physiopathologiques impliqués, tels que l’altération de la barrière intestinale, le rôle des prostaglandines et l’impact du microbiote. Enfin, il contribue au développement de biomarqueurs pour le suivi de l’inflammation et de la réponse aux traitements, offrant ainsi une plateforme essentielle pour la découverte de stratégies innovantes contre les Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin.
Procédures
Les gestes techniques concernent tous les animaux. • Pesées : Durée 30 secondes, sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études soit jusqu’à 15 fois par animal . • Administration d’indométacine, 3 possibilités : o par voie orale : Durée 10 secondes, une à 7 fois sur animal vigile o par voie sous-cutanée : Durée 10 secondes, une à 7 fois sur animal vigile o par voie intrapéritonéale : Durée 10 secondes, une à 7 fois sur animal vigile • Prélèvement de sang par voie retro-orbitale au cours des procédures : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse, 1 fois par œil et par animal. Le prélèvement retro-orbital sera utilisé en dernier recours, seulement dans le cas où un volume plus large et un prélèvement rapide est nécessaire pour garantir l’intégrité des analytes. • Prélèvements de sang via la veine caudale : Durée 30 secondes, 3 fois par animal, sur animal vigile ou sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. • Prélèvements de sang terminaux par ponction cardiaque ou veine abdominale : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale profonde par injection ou gazeuse. • Administrations des composés à potentiel thérapeutiques (plusieurs choix possibles): o Par voir orale à l’aide d’une sonde gastrique : Durée 10 secondes sur animal vigile, jusqu’à 3 fois par jour, pendant 15 jours. o Par voie intrapéritonéale : Durée 10 secondes sur animal vigile, une fois par jour, jusqu’à 15 jours. o Sous-cutanée : Durée 10 secondes sur animal vigile, une fois par jour, pendant 15 jours. o Par voie intraveineuse retro-orbitale : Durée 30 secondes, sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. Une fois par œil et par animal. o Par voie intraveineuse via veine caudale : Durée 30 secondes, sur animal vigile ou sous anesthésie générale par injection ou gazeuse. Une fois par semaine pendant 2 semaines. • Test de perméabilité intestinale/administration de dextran par voie orale : Durée 10 secondes sur animal vigile, une fois toute les 2 semaines soit 1 à 2 fois par animal. • Mise à jeun avant administration orale de l’indométacine et mise à jeun pour le test de perméabilité intestinale. Durée 12h. Deux fois par animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus des modèles de colite sont une perte de poids, des diarrhées, la présence de sang au niveau des fèces et/ou du rectum. Une piloérection, une réduction de la mobilité et une perte de poids > à 20% en 24h ou 25% depuis le jour 0 justifieraient une mise à mort immédiate.
Devenir
Tous les animaux de la procédure seront mis à mort. L’évaluation de l’efficacité des composés à potentiel thérapeutique nécessite des analyses approfondies de différents tissus et du système immunitaire.
Remplacement
Il existe des modèles ex-vivo d’organoïdes intestinaux permettant un premier criblage pour évaluer l’efficacité des composés permettant de limiter le recours à l’animal dans les premières phases de développement. Cependant, ce système dépourvu d’autres organes et de structures immunologiques clés (ganglions mésentérique, rate, système lymphatique, hépatique, rénale et circulatoire) ne peut pas à ce jour constituer un environnement fiable pour prédire la pharmacologie in vivo. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des entités à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes impliquant entre autres la migration de cellules immunitaires vers l’intestin. Cependant, des tests in vitro et in silico qui permettent de prédire les profils pharmacocinétiques et les interactions avec la cible moléculaire d’intérêt seront utilisés en amont des études de ce projet. Ceci permettra de limiter le recours à l’animal.
Réduction
Les entités thérapeutiques auront préalablement été évaluées de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent par exemple de prédire le profil pharmacocinétique d’un composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme), de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex. un récepteur, un canal ionique, une enzyme). En outre, le profil pharmacocinétique chez le rongeur aura aussi été déterminé. De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. Ainsi, les tests sur animaux sont réduits au minimum nécessaire. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet (2880 souris et 2880 rats, total 5760) se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et des tests de détermination de la taille des groupes expérimentaux. Des analyses rétrospectives seront conduites pour s’assurer de la bonne adéquation du nombre d’animaux par groupe et de la puissance statistique recherché. Dans la plupart des cas, nous utiliserons l'approche conventionnelle du calcul de l'échantillon nécessaire pour une étude et qui repose sur quatre éléments (1) : l'erreur de type I, la puissance d'étude (80% au minimum), les suppositions dans le groupe contrôle pour la fréquence de réponse et la variabilité de celle-ci, et, enfin, l'effet attendu pour le traitement. L'erreur de type I (erreur alpha) consiste, dans une étude de supériorité d'un traitement versus un autre, à rejeter à tort l'hypothèse nulle (absence de différence) c'est-à-dire de conclure à tort qu'une différence existe entre les 2 traitements. Il sera accepté un risque de 5% comme c’est la convention en pharmacologie préclinique, soit une valeur p < 0,05.
Raffinement
Les animaux seront habitués à la manipulation avant le début des études en utilisant exclusivement des techniques non-aversives (ex : prélèvement de l’animal de sa cage avec l’aide d’un tunnel). Les procédures potentiellement douloureuses ou sources d’inconfort ou de stress se feront sous anesthésie générale. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique a minima journalière sur la durée de la procédure. Les locaux et systèmes d'hébergement suivront un programme de contrôle d’hygiène et sanitaire afin de prévenir tout biais. Les conditions d’ambiance seront contrôlées sur la durée des procédures. Un programme de soins adapté sera mis en œuvre pour l’ensemble des animaux affectés à ce projet, par ou sous l'autorité du vétérinaire. Un plan d'action incluant la communication sera établi et mis en place lors d'apparition d'évènements inattendus. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire car le stress lié à la manipulation non seulement affecte le bien être mais peu aussi impacter la réponse inflammatoire et immunitaire. Des critères d'arrêt anticipé seront mis en place pour chaque procédure afin de réduire tout inconfort, stress, souffrance ou douleur inutile.
Choix des espèces
La grande majorité des modèles et des techniques utilisés dans le cadre de la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez les espèces rats et souris. De nombreuses données sur les modèles de Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin chez le rongeur existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour l’avancement des projets. Adulte : Les données de la littérature indiquent que les rats (min. 5 semaines) et les souris (min. 7 semaines) adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine des Maladies Inflammatoires Chroniques de l'Intestin car ils disposent d'un système immunitaire mature.
Evaluation de la performance diagnostique de produits de contraste IRM sur un modèle de métastases cérébrales chez la souris – MODIFICATION
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Cancers
Les souris utilisées sont immunodéficientes, dépourvues de système immunitaire fonctionnel pour que les cellules tumorales humaines injectées dans leur cœur ne soient pas rejetées. 144 souris vont être utilisées, dont 80 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Après l'injection intracardiaque, elles passent des séances d'IRM d'une heure à une heure quinze sous anesthésie, jusqu'à la douzième semaine, pour comparer deux produits de contraste chez un même animal à 24 heures d'intervalle. Le porteur décrit des tremblements, une incoordination, des paralysies partielles et, au-delà de quatre semaines, un envahissement métastatique massif du cerveau avec un "risque élevé de souffrance sévère et de décès spontané", tandis que les souris ne développant aucune lésion visible seront tuées à six semaines et leurs tissus utilisés comme témoins de bioanalyse.
Objectifs
L’imagerie IRM (imagerie par résonnance magnétique) avec administration d’un agent de contraste permet de mieux détecter de nombreuses pathologies cérébrales, notamment en cancérologie, en en rehaussant le signal de la lésion. Outre le dépistage de la maladie et la pose du diagnostic, l’IRM avec agent de contraste permet le suivi de l’évolution de la pathologie et le suivi de l’efficacité thérapeutique mise en place pour le patient. L’enjeu est particulièrement important dans la détection de métastases cérébrales où le pronostic du patient (par exemple : taux de survie à 5 ans) est étroitement corrélé au stade de développement tumoral. Un diagnostic le plus précoce possible de l’ensemble des lésions a un impact direct sur la bonne prise en charge du patient. Le nombre de tumeurs et/ou de métastases ainsi que les caractéristiques de ces lésions (infiltrantes, vascularisées…), leur localisation et l’identification de leurs marges tumorales sont d’autant d’éléments importants pour proposer le meilleur traitement au patient (chirurgie, radiothérapie ciblée, etc..). Dans cet objectif final, le projet vise à évaluer les performances diagnostiques d’un nouvel agent de contraste IRM dans la détection précoce de tumeurs et/ou de métastases cérébrales. Les agents de contraste faisant partie de la classe des médicaments injectables, il s’agira de trouver le meilleur compromis entre la nature et la dose de produit de contraste injectée et l’apport diagnostique pour le patient. Le présent projet sera conduit sur un modèle de souris reproduisant la maladie. Des produits au stade prototype ou déjà commercialisés et considérés à l’heure actuelle comme des références serviront de comparatifs. Cette étude préclinique nous permettra d’obtenir des éléments de réponse avec des paramètres quantitatifs (rehaussement de contraste, nombre et temporalité des lésions détectées) et d’estimer au plus juste la dose qui apportera le meilleur compromis entre performance de détection des lésions et réduction de l’agent de contraste administrée au patient.
Bénéfices attendus
A l’issue de ce projet, nous aurons une idée cliniquement pertinente de la performance diagnostique du produit testé et de la dose à administrer (comparativement à des produits de référence) pour une détection précoce des métastases cérébrales tout en proposant la dose efficace la plus faible possible (compromis entre dose de gadolinium administrée au patient et efficacité du rehaussement à détecter, caractériser et suivre l’efficacité du traitement mis en place). Nous aurons une idée précise, pour une dose donnée, si le nombre de métastases détectées est augmenté par rapport au produit de référence, si la taille minimale de détection et ou le délai d’apparition est réduit, permettant un diagnostic plus précoce, et évaluerons la facilité de délimitation tumorale. Ces résultats permettront d’éclairer les choix de la dose à tester en étude clinique dans l’objectif de mettre à disposition des radiologues un produit de contraste plus performant, en termes de détection et de précocité de détection, améliorant ainsi la prise en charge des patients et, potentiellement, leur taux de survie à 5 ans.
Procédures
Toutes les procédures seront réalisées sur des animaux anesthésiés et sédatés. Le projet se déroulera en trois phases : Phase A – Mise en place du modèle expérimental. Chaque animal recevra une intervention unique, d’une durée d’environ 10 à 15 minutes, visant à simuler un processus de dissémination tumorale. Cette étape sera réalisée une seule fois par animal, au début de l’étude. Phase B – Suivi par imagerie cérébrale. À partir de la semaine 2 et jusqu’à la semaine [MODIF] 12, les animaux seront suivis par imagerie cérébrale [MODIF] diagnostique jusqu'à apparition de lésions, puis une imagerie cross-over à 24h d'intervalle sera effectuée pour une comparaison entre 2 produits sur un même animal. Chaque séance durera environ 1h à 1h15 par animal, incluant la préparation, l’installation et l’acquisition des images. Ce suivi permettra d’observer l’évolution des lésions et de comparer différents protocoles d’imagerie. Une semaine supplémentaire de suivi pourra être ajoutée selon l’état de santé des animaux. Phase C – Fin de l’étude. L’euthanasie sera pratiquée : • à la fin du suivi par imagerie, • ou plus tôt en cas de problème ou selon les critères de fin d’étude.
Impact sur les animaux
L’administration de médicaments, tels que les analgésiques morphiniques ou l’anesthésie générale, chez l’animal vigile peut provoquer une douleur aiguë au moment de l’injection, ainsi qu’un stress lié à la contention. L’injection intra-cardiaque, utilisée pour l’induction du modèle, est une procédure invasive pouvant entraîner des nuisances importantes. Elle est susceptible de provoquer des douleurs transitoires, des arythmies, des lésions myocardiques, des réactions inflammatoires ou infectieuses, ainsi que des hémorragies internes. Au cours de la phase de développement des métastases cérébrales, les animaux peuvent présenter des troubles neurologiques modérés à sévères : tremblements, incoordination, paralysies partielles, apathie, diminution de la prise alimentaire, perte de poids et déshydratation. Ces signes traduisent une altération progressive de l’état général. L’imagerie par IRM, nécessitant des anesthésies répétées et prolongées, peut induire une hypothermie et une déshydratation. Ces effets sont d’intensité modérée mais peuvent s’accumuler au fil des séances, entraînant une réduction des prises alimentaires et hydriques. Enfin, au-delà de quatre semaines après l’injection tumorale, un envahissement métastatique massif du cerveau peut survenir, provoquant une dégradation rapide de l’état de l’animal, avec un risque élevé de souffrance sévère et de décès spontané.
Devenir
Les souris ayant développé des lésions métastatiques au niveau cérébral (ou dans d’autres territoires si cela arrivait) seront euthanasiées à l’issue du suivi par imagerie IRM, ou à l’atteinte des points limites. Eventuellement, le cerveau des animaux sera prélevé et une analyse histologique ou imagerie élémentaire/moléculaire de coupes cérébrales seront réalisées. Les souris n’ayant pas eu de pousse métastatique (visible en IRM) au bout de 6 semaines post-induction seront euthanasiées et des tissus prélevés pour être utilisés comme matrices biologiques témoins (vierges de certains produits) ou pour des mises au point de bioanalyses.
Remplacement
Si les paramètres physico-chimiques d’un agent de contraste peuvent être déterminés in vitro, l’ensemble des paramètres d’internalisation (entrée dans les cellules cérébrales) et d’extravasation (sortie des vaisseaux) / élimination dans une lésion tumorale sont directement dépendants des caractéristiques intrinsèques de la lésion étudiée et ne peuvent donc être évalués que sur des modèles in vivo. En effet, l’accès à celle-ci dépend directement de l’état d’ouverture de la barrière sang-cerveau et de sa localisation dans le territoire cérébral, ainsi que des caractéristiques propres à chaque lésion (perméabilité, taille, état de vascularisation, tortuosité des vaisseaux, grade, structure du tissu… etc…).
Réduction
L’étude, réalisée en cross-over (comparaison des performances diagnostiques de deux agents de contraste ou doses différents chez un même animal à 24h d’intervalle) permet de diminuer le nombre d’animaux de moitiéen permettant également d’augmenter la puissance statistique d’analyse comparative car : - Chaque lésion métastatique est son propre témoin entre deux comparaisons, permettant de comparer les deux produits sur des lésions avec exactement les même propriétés (taille, perméabilité, accessibilité, nécrose, type…) - Un animal peut présenter plusieurs métastases cérébrales augmentant ainsi le nombre de lésions métastatiques analysé sans augmenter le nombre d’animaux Enfin, selon notre retour d’expérience, le rendement d’animaux répondeur étant variable, l’étude sera réalisée par lot d’implantation de seulement n = 12 animaux à la fois, avec une phase de mise au point afin d’ajuster ce chiffre, de façon à s’approcher au plus juste de l’effectif attendu, c’est-à-dire n = 8 animaux avec lésion(s) métastatique(s) au niveau cérébral. Les animaux ne présentant pas de lésions métastatiques ni signes cliniques pourront servir de matrices biologiques en vue de mises au point d’imagerie moléculaire ou élémentaire.
Raffinement
L’implantation tumorale mise au point sous échographie évite toute ouverture de la peau au niveau du crâne, réduisant de façon importante la souffrance et favorisant la récupération de l’animal. Elle ne sera effectuée qu’une seule fois, avec un volume faible. Par rapport à l’étude antérieure, le protocole d’imagerie a été optimisé afin de réduire les temps d’acquisition des séquences IRM, permettant une anesthésie totale plus brève (de la pose de la voie intraveineuse au réveil, environ 1h contre 1h30 lors de la précédente étude), tout en conservant une bonne qualité de détection des lésions en imagerie réhaussée. D’autre part, une administration d’anti-douleur sera mise en place avant toute intervention invasive afin d’assurer une bonne analgésie. L’administration d’anti-douleur pourra être renouvelée si l’état des animaux le nécessite. Lors des anesthésies générales, les muqueuses oculaires des animaux seront protégées par du gel oculaire pour prévenir de la déshydration. Un appareil de mesure de la respiration nous permettra de suivre la profondeur de l’anesthésie qui sera adaptée en fonction de la réponse de chaque animal. Afin de lutter contre une hypothermie éventuelle, une plaque thermostatée ou un circuit d’eau chaude thermostatée passant sous l’animal seront utilisés lors des anesthésies. Lors des phases de réveil, les animaux seront placés sous lampe rouge (chauffante). Pour le suivi clinique des animaux, une grille de scoring avec différents paliers sera mise en place. Au besoin, nous consulterons un vétérinaire et des mesures seront prises : système particulier d’alimentation ou d’hydratation, analgésie supplémentaire, traitement médicamenteux, etc. Enfin, par retour d’expérience, l’étude menée en interne en 2014 a montré qu’un suivi journalier rigoureux à l’aide de la grille de scoring minimisait fortement les dommages inhérents au modèle et que l’imagerie IRM permettait de détecter les lésions cérébrales avant que celles-ci n’engendrent une souffrance animale sévère ou un décès spontané.
Choix des espèces
Le modèle murin reste le plus utilisé dans la recherche en neurologie et cancérologie et largement reconnu pour apporter robustesse et prédictivité. Les grosses métastases observées chez la souris sont très comparables (tailles, vascularisation, localisation spatiale) à de petites métastases humaines. Sa faible taille remplit tous les critères d’accessibilité pour les administrations d’agents de contraste, taille suffisante pour les implantations tumorales et analyses robustes des images acquises en imagerie IRM. L’attraction importante des cellules pour le cerveau permet qu’aucune lésion tumorale ne soit observée dans d’autres organes. Ce modèle repose sur des souris immunodéficientes, c’est-à-dire qu’elles de possèdent pas ou peu de système immunitaire fonctionnel. Cela évite le rejet des cellules humaines implantées, ce qui est indispensable pour que ces cellules puissent survivre, proliférer et former des métastases dans l’animal et qui serait impossible avec un modèle de souris ayant une immunité classique. Les animaux seront adultes (au minimum âgés de 6 semaines) au moment de l’induction du modèle. En effet, la population d’étude visée est l’adulte.
Déterminer le mécanisme cellulaire de protection d’un vaccin contre le virus du Nil Occidental EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Exposées à la piqûre de plusieurs moustiques infectés à la fois, parce que leur taille le permet et que cela "maximise l'effet de l'infection", 1 540 souris vont être utilisées, dont 1 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Leur immunité cellulaire est d'abord altérée par des injections, puis elles reçoivent le vaccin candidat contre le virus du Nil occidental avant d'être infectées. Le porteur mentionne une douleur passagère aux points d'injection et des "troubles liés à l'infection par le virus", sans détailler ce que produit chez la souris une maladie qui atteint le système nerveux. Une partie est tuée pour prélever peau et ganglions lymphatiques, le reste parce que la réglementation interdit de garder vivants des animaux infectés.
Objectifs
Le projet de recherche permettra de soutenir une demande d’essais cliniques pour un candidat vaccin contre le virus du Nil Occidental. C'est un virus transmis par les moustiques. Il circule surtout chez les oiseaux, qui servent de réservoir naturel. Chez l’être humain, la plupart des infections ne provoquent aucun symptôme (environ 80 % des cas). Cependant, environ 20 % des personnes peuvent avoir de la fièvre et se sentir mal pendant quelques jours. Dans moins de 1 % des cas, le virus peut toucher le système nerveux et provoquer des complications plus graves, comme des inflammations du cerveau ou des méninges, voire une paralysie soudaine ou encore la mort. Ces formes graves sont plus fréquentes chez les personnes âgées ou dont le système immunitaire est affaibli. Il est présent dans de nombreuses régions du monde dont l’Europe. Il n’existe actuellement pas de vaccin contre cette maladie et le vaccin candidat que nous proposons pourra répondre à un besoin en santé publique mondiale. Le projet se déroulera dans 2 EU.
Bénéfices attendus
Le bénéfice à court terme est la compréhension des mécanismes cellulaires de protection du vaccin candidat. A long terme, les résultats soutiendront le développement d’un vaccin contre ce virus transmis par les moustiques. Le vaccin qui découlera de ce projet a le potentiel de sauver la vie de milliers de personnes chaque année et d’atténuer le fardeau sanitaire, social et économique de cette maladie transmise par les moustiques.
Procédures
Dans un premier temps, nous optimiserons les conditions pour explorer les mécanismes de l’immunité responsable de la protection vaccinale. Des prélèvements seront effectués pour permettre l’analyse de la réponse immunitaire et des acteurs impliqués. Nous évaluerons ensuite l’effet des facteurs immunitaires sur la protection conférée par le vaccin. Des souris avec les mêmes types de déficiences immunitaires que précédemment seront injectées avec le vaccin, puis exposées à la piqûre de moustiques infectés par le virus. Dans l’EU2 seront réalisés les protocoles de vaccination, d’injection des traitements et les prélèvements. Dans l’EU1 seront réalisées les protocoles d’infection par piqûre de moustique et toutes les procédures sur des animaux infectés.
Impact sur les animaux
Douleur passagère au niveau du site d’injection des traitements altérant l’immunité cellulaire, du candidat vaccin et de l’anesthésique. Douleurs légères au point des prélèvements sanguins. La piqûre de moustique se fera sous anesthésie donc sans douleur. Une faible irritation peut être attendue aux points de piqûres des moustiques. Troubles liés à l’infection par le virus. Les souris seront surveillées quotidiennement pour évaluer leurs éventuels symptômes.
Devenir
Les animaux utilisés pour l'étude de la localisation des cellules immunitaires seront euthanasiés afin de permettre la collecte de leur peau et de leurs ganglions lymphatiques. Tous les animaux infectés seront euthanasiés à la fin des procédures, conformément à l’obligation légale.
Remplacement
Dans notre cas, le modèle animal est incontournable. A ce jour, aucun modèle autre que le modèle animal ne permet d’évaluer la réponse immunitaire à un vaccin et la protection contre une infection par exposition à une piqûre de moustique infecté. Néanmoins, nous avons généré les données préliminaires nécessaires pour supporter notre hypothèse sur des modèles cellulaires. Ces travaux antérieurs nous on permit d’identifier notre vaccin candidat.
Réduction
Afin de réduire le nombre de souris, nous avons calculé le nombre limite nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Des travaux préliminaires ont été réalisés pour calculer ce nombre au plus juste. De plus, nous effectuerons les expériences suivant un arbre décisionnel qui validera ou non la poursuite des expériences à chaque étape pour limiter le nombre de souris utilisé.
Raffinement
Les souris auront un temps d’acclimatation (7 jours) avec visite quotidienne pour limiter le stress lié à la manipulation. Les souris seront hébergées de 3 à 5 individus/cage avec de la litière et des enrichissements variés, tels que des tunnels en carton, des abris en carton et en bois, des copeaux de carton pour fabriquer un nid et du carton rigide à ronger. Elles seront anesthésiées durant l’exposition aux moustiques pour limiter la gêne de la piqûre. Une grille de score évaluant l'état général des souris sera quotidiennement suivie. Cette grille permet d’observer différents signes de bien-être ou de malaise (comme l’apparence, l’activité, le comportement ou la perte de poids). Nous avons défini des seuils à ne pas dépasser pour garantir la santé et le bien-être des animaux. Si l’un de ces seuils est atteint, l’expérience sera immédiatement arrêtée afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Nous allons utiliser des souris avec lesquelles nous avons développé et évalué la stratégie vaccinale. Nous continuerons à documenter la protection conférée par notre vaccin candidat sur souris avant de tester le vaccin candidat sur des animaux plus grands pour soutenir une demande d’essais cliniques. Nous allons utiliser des souris adultes de 6-8 semaines car elles ont un système immunitaire mature permettant une réponse immunitaire adéquate. Leur taille permet aussi la piqûre simultanée par plusieurs moustiques, nécessaire pour maximiser l’effet de l’infection.
Etude des mécanismes physiopathologiques de maladies musculo-squelettiques chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Un prélèvement de tissu, trois injections, deux prises de sang, une radiographie et jusqu'à 22 tests comportementaux par animal : 2 334 souris subissent ces procédures, dont 791 dans un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leurs organes. Les femelles gestantes sont anesthésiées au gaz puis tuées par dislocation cervicale. Le porteur signale une tétanie et une mort subite possibles lors d'efforts ou de situations de stress, ainsi qu'une brûlure légère par le froid sur certaines souris, dans un projet portant sur des maladies musculo-squelettiques rares sans traitement. Les 22 tests comportementaux ne sont nommés nulle part.
Objectifs
Les maladies musculo-squelettiques sont principalement caractérisées par une petite taille, des extrémités courtes, une raideur articulaire et des atteintes musculaires. Elles sont liées à des mutations génétiques affectant des protéines essentielles au bon développement et fonctionnement d’un être vivant. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de ces protéines au cours du développement et leur implication dans les processus de croissance osseuse et musculaire.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont i) une meilleure caractérisation des maladies musculo-squelettiques et ii) la validation d’essais thérapeutiques visant à réduire la fibrose et améliorer la force musculaire. L’observation d’un effet thérapeutique permettrait d’envisager un essai clinique et donc de valider une thérapie pour ces maladies qui n’en n’ont pas à ce jour.
Procédures
Identification et prélèvement de tissus (5 minutes). Trois injections (1 à 5 minutes) ; deux prélèvements de sang (1 à 5 minutes) ; un examen radiographique (5 minutes). Tests comportementaux (maximum 22 tests ; 1 à 5 minutes). Femelles gestantes : trois pesées (30 secondes) ; une anesthésie gazeuse (5 minutes) ; une dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de tissus peut entraîner une douleur légère et localisée de courte durée. Les injections et prélèvement peuvent entraîner une douleur légère et localisée de courte durée. Une sécheresse oculaire pourra être constatée pendant l’examen radiographique. Tétanie et mort subite possible lors d'efforts et situations de stress. Une légère brûlure par le froid pourrait être constatée sur les souris à J0 et J4.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort pour prélèvement d’organes et analyses prévues.
Remplacement
Dans les maladies musculo-squelettiques, la mortalité précoce liée à l'association d'atteintes cardiaques, respiratoires et des voies aériennes supérieures, ne peut être étudiée que in vivo. Pour valider l'effet d’un traitement utilisant des cellules immunitaires reprogrammées sur la fibrose associée aux maladies musculo-squelettiques, un modèle murin mimant l’une de ces maladies sera utilisé ; aucun modèle in vitro n'est capable de développer cet aspect de la pathologie. Il n'existe pas de modèle in vitro de fibrose musculaire et l'interaction ainsi que l'élimination des cellules fibrotiques nécessitent un milieu physiologique où la réponse immunitaire peut avoir lieu.
Réduction
Ce projet se limite aux expériences considérées comme absolument indispensables et prévoit l’exploitation maximale des données obtenues. La mise en place de tests statistiques a permis de réduire au maximum le nombre de souris utilisées dans ce projet. Si le traitement ne permet pas d'améliorer le phénotype, les tests comportementaux ne seront pas réalisés.
Raffinement
Les souris bénéficieront d'un enrichissement de leur environnement et des mesures de raffinement ont été mises en place avec une surveillance quotidienne par les membres qualifiés de l'animalerie. L'application de points limites stricts et spécifiques au projet sera respectée par les responsables du projet qui tiendront une fiche d'observation pour chaque souris. Tous les gestes réalisés sur les souris se feront sous anesthésie.
Choix des espèces
La souris a une forte proximité génétique et de fonctionnement avec l’homme. Animaux grégaires, avec un cycle de reproduction et un développement rapide, les modèle souris utilisés pour ce projet, permettrons dans un organisme complet d’étudier les phénotypes et d’analyser les mécanismes biologiques impliqués dans certaines maladies musculo-squelettiques rares à phénotypes évolutifs et invalidants ; différents temps clés du développement seront étudiés (stades prénataux, juvéniles et adultes). De plus, aucun modèle in vitro n'est capable de développer ces aspects des pathologies étudiées.
Étude dans un organisme vivant du rôle de certaines molécules liées à l’inflammation pendant une maladie causée par des caillots sanguins
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Le cinquième jour, une incision est pratiquée au coin de la troisième côte et une seringue enfoncée jusqu'au retour de sang pour vider le cœur de l'animal, tué ensuite sous anesthésie. 168 souris vont être utilisées dans ce protocole de cinq jours classé en souffrance sévère, avec une anesthésie par jour, des injections intraveineuses et intrapéritonéales et deux prélèvements à la veine mandibulaire. Le porteur écrit que les animaux "ne subiront que très peu de contraintes" et résume les perturbations attendues à une douleur d'environ cinq minutes et à une fatigue de trois jours. Privées d'une protéine du sang, les souris forment des caillots qui bloquent la circulation et abîment leur cœur, organe prélevé après la mise à mort.
Objectifs
Ce projet cherche à comprendre le rôle exact de deux molécules, appelées pour simplification A et B, dans la gravité des problèmes sanguins et des lésions au cœur dans une maladie rare. Cette maladie, causée par un manque d’une protéine spécifique, provoque la formation de petits caillots dans les vaisseaux sanguins, ce qui peut bloquer la circulation et endommager des organes comme le cœur. Des recherches précédentes ont montré qu’un médicament qui bloque l’action à la fois de A et de B pouvait réduire les dommages au cœur et au cerveau dans un modèle de souris atteintes de cette maladie. Cela suggère que l’inflammation causée par A et B joue un rôle important dans les lésions observées. On sait aussi que A et B favorisent la libération de substances impliquées dans la formation des caillots et peuvent aggraver les baisses de cellules sanguines. Cependant, on ne sait pas encore précisément quel rôle joue chacune de ces deux molécules A et B. L’objectif du projet est donc de tester, chez la souris, l’efficacité de traitements qui ciblent spécifiquement A ou B ou une molécule liée l’apparition de A et B, pour prévenir les dommages dans le cœur au cours de cette maladie.
Bénéfices attendus
À ce jour, aucune étude n’a encore permis de déterminer clairement le rôle respectif de A et de B dans cette maladie. A court terme, les bénéfices de ce projet seront d'apporter des informations précises sur les éléments qui interviennent dans la maladie que nous étudions. A long terme, les données de ce projet pourront permettre de définir une thérapie plus précise pour les patients atteints de cette maladie qui souffrent souvent de complications cardio-vasculaires. En effet, si nous déterminons que A ou B est impliqué préférentiellement dans cette pathologie, nous pourrons envisager un traitement plus personnalisé aux patients lorsqu’ils développent des crises de cette pathologie, ce qui pourra éviter des complications cardio-vasculaires chez ces patients.
Procédures
La procédure expérimentale dure en totalité 5 jours. Une fois par jour, les animaux sont mis en cage d'inhalation pour induire une anesthésie. Ils seront soumis à de la contention et à une injection intraveineuse le premier, second et troisième jour. Une injection intrapéritonéale est également réalisée une fois par jour ces trois premiers jours durant la même analgésie. Le temps de ces deux injections est de 5 min. Les jours 4 et 5, les animaux sont également soumis à une analgésie durant laquelle une seule injection intrapéritonéale est faite. Le temps de cette injection est de 3 min. Le premier et le troisième jour, durant l'analgésie, un prélèvement au niveau de la veine mandibulaire est réalisé. Cette intervention est comprise dans les temps indiqués. Le jour 5, les animaux sont à nouveau anesthésiés. L'anesthésie est vérifiée en pinçant la queue de l'animal. Une injection intrapéritonéale est faite. Un prélèvement intracardiaque est également réalisé afin de récupérer le sang des souris. Pour cela, une incision est réalisée au coin de la troisième côte et une seringue est enfoncée jusqu'à retour de sang. Après récupération du sang par ce prélèvement, l'animal toujours sous anesthésie est euthanasié. La durée de cette intervention sans réveil 15 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Les perturbations anticipées pour les animaux se résument à la possibilité de ressentir de la douleur, associée à une injection veineuse rétro-orbitaire et de la gêne par la contention. La douleur est contrôlée par l’utilisation de gouttes analgésiques et d’injection intrapéritonéale d’analgésique si besoin, en fonction d’une grille de douleur établie préalablement et sur laquelle nous nous appuyons. Cette douleur peut être ressentie par l’animal sur une durée d’environ 5 min. En revanche, le déclanchement de la maladie chez les animaux peut conduire à un état de fatigue ressentie durant les trois premiers jours.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer les organes des animaux et réaliser de l'immuno-histochimie sur ces organes, c'est à dire une coupe des organes et des colorations de ces coupes d'organes.
Remplacement
Les systèmes d’études in vitro de cette maladie ne permettent pas de prendre en compte l’ensemble des éléments qui interviennent dans le développement de cette maladie. En effet, à ce jour, il est impossible de reproduire in vitro un vaisseau avec ce qui recouvre les vaisseaux, la totalité des cellules qui circulent dans le sang et les molécules solubles du plasma participant à l’activation des vaisseaux. L’utilisation de l’animal a pour but de reproduire des conditions physiopathologiques intégratives impossible à reproduire in vitro
Réduction
Le calcul d’effectif est déterminé avant l'étude afin d'être sûrs que nous n'utiliserons pas un trop grand nombre d'animaux mais seulement le nombre nécessaire à démontrer scientifiquement un intérêt à utiliser notre médicament dans notre modèle de maladie. Nous nous appuyons sur des logiciels spécifiques qui nous permettent de calculer ce nombre d'animaux et sur des critères de jugement qui sont bien mesurables et bien quantifiables chez la souris.
Raffinement
Les animaux ne subiront que très peu de contraintes et la douleur sera minimisée par l'utilisation d'analgésiques. Les cages seront enrichies avec du coton, un dôme et/ou un tunnel. De plus, la douleur et la souffrance seront évaluées lors des protocoles tous les jours et la souffrance évaluée par une grille permettant d'établir un score. Les animaux ne sont pas seuls dans les cages. Ils seront hébergés dans des cages comprenant au maximum 5 animaux du même sexe, afin d'éviter tout conflit entre eux. Ils sont hébergés avec de la nourriture et de l'eau à volonté. Les salles sont spécialement conçues dans une animalerie agréée avec une température vérifiée quotidiennement et stable, une ventilation continue, et une visite des animaux est organisée quotidiennement avant que l'expérience ne soit réalisée. Une personne est responsable du bien-être de ces animaux
Choix des espèces
Les souris constituent un modèle simple à étudier compte tenu de la taille et de sa disponibilité. Des études ont montré que ce modèle d'étude, la souris, est adapté pour étudier notre pathologie. En effet, la souris présente des similitudes génétiques avec l'homme puisque la souris partage une grande partie de ses gènes avec celui de l'homme. Cette similitude génétique permet d'étudier des processus biologiques fondamentaux et des maladies humaines chez la souris. En outre, les souris sont des animaux de laboratoire relativement petits, faciles à manipuler et à élever en grand nombre. Elle ont un cycle de vie court et l'âge de 12 semaines correspond à une souris jeune adulte. Nous choisissons cet âge étant donné que chez l'homme notre pathologie se développe plutôt chez les jeunes adultes. Nous devons donc choisir chez la souris un jeune âge également. Enfin, les précédentes études de la bibliographie justifient pleinement l'utilisation de souris pour notre pathologie, puisque c'est le modèle qui est le plus similaire à la pathologie développée chez l'homme.