Procédures sévères
Étude de l’efficacité d’une nouvelle émulsion « huile dans eau » pour traiter l’inflammation cutanée de souris présentant une dermatite atopique.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Les souris dont le score cutané, somme de l'érythème, de l'érosion, de la sécheresse et de la lichénification, atteint 10 sur 10 sont tuées immédiatement. 846 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Leur dos est rasé sous anesthésie, puis un produit inducteur de dermatite atopique y est appliqué huit fois en vingt-cinq jours, provoquant démangeaisons intenses, lésions et sécheresse cutanée pendant toute la durée de l'expérience. L'objet du projet est de tester une émulsion "huile dans eau" à deux principes actifs, que le porteur présente comme une "proposition pionnière" dans un domaine émergent.
Objectifs
La dermatite atopique est une affection cutanée majeure qui peut avoir un impact significatif sur la qualité de vie des personnes touchées ainsi que sur celle de leur famille. À ce jour, il n’existe aucun traitement définitif pour cette dermatose inflammatoire et ceux existants permettent d’améliorer les symptômes et de diminuer l’activité de celles- ci, parfois inefficaces ou encore avec des effets indésirables plus au moins importants. Il est donc important de développer de nouvelles formulations avec une meilleure efficacité thérapeutique et moins d’effets secondaires. L’objectif de ce projet consiste à développer un nouveau traitement topique (application sur la peau) pour la dermatite atopique (maladie inflammatoire de la peau). Ce traitement est sous forme d’émulsion contenant deux substances actives (substances avec un effet biologique) avec des effets anti-inflammatoires à la fois sur les cellules immunitaires et épidermiques. L’efficacité de ces traitements sera étudiée sur des souris avec une dermatite atopique induit par application cutanée d’un produit inducteur. L’efficacité de nos produits peut être liée à une diminution de l’activité du système immunitaire et une diminution de l’inflammation cutanée. L'efficacité de l'émulsion devrait également être due à une cinétique de libération progressive et continue des deux substances actives et à une pénétration tissulaire progressive associée à une action pharmacologique complémentaire à différents niveaux dans la peau. Aucun effort interdisciplinaire comparable n'est (ou n'a été) entrepris pour promouvoir de tels systèmes d'administration de médicaments locaux, contrôlés et novateurs pour le traitement des dermatoses cutanées. Ainsi, notre projet est une proposition pionnière dans un domaine de recherche nouveau et émergent.
Bénéfices attendus
Ce projet propose le développement d’un nouveau traitement topique sous forme d’émulsion contenant plusieurs principes actifs permettant d’avoir un effet plus efficace que les traitements existants. En effet, la synergie d’action entre les différentes substances actives ciblant à la fois du système immunitaire et les cellules cutanées devrait monter une meilleure efficacité thérapeutique que les « monothérapies » avec une seule substance active actuellement utilisées. De plus, ce système de libération prolongée des molécules actives permettrait d'avoir moins d’effets secondaires chez les patients et d’améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Pour induire un développement de lésions cutanées de type Dermatite Atopique (DA), la peau du dos des souris sera rasée à J-1 sous anesthésie gazeuse pour éviter toute blessure et stress . À partir du lendemain, les souris seront sensibilisées à J0 et J4 en appliquant un produit inducteur de la maladie et suivi d'un second traitement par ce produit à J7, J11, J14, J18, J21 et J25. En parallèle, nos différents traitements seront appliqués ces mêmes jours (jour 7, 11, 14, 18, 21 et 25) sur la peau de souris 2 heures avant la sensibilisation au produit inducteur. Au jour 28, toutes les souris seront euthanasiées. Des prélèvements sanguins submandibulaires (au niveau de la joue de la souris) seront réalisés juste avant l’euthanasie (il s’agit d’un geste rapide qui se réalise en quelques secondes qui s’effectue sans anesthésie).
Impact sur les animaux
L’application topique du produit inducteur de la maladie induit des symptômes de types DA. Ceci conduit à l’apparition de fortes démangeaisons, des lésions cutanées et sècheresse de la peau, liées à l’induction d’une forte inflammation cutanée. Ces différents effets indésirables pourraient provoquer un stress et une modification du comportement chez les souris, accompagnés ou non d’une perte de poids. De plus, les souris pourraient également subir un stress supplémentaire lié aux contentions multiples et répétées lors de l’application des produits. Ces effets pourraient être présents pendant toute la durée de l’expérimentation.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour une étude biologique et histologique sur les prélèvements sanguins et sur les biopsies de peau.
Remplacement
Les maladies de la peau humaine sont très complexes et les étudier nécessite des modèles permettant de reproduire les différents aspects de la maladie. Il n’existe à ce jour aucune méthode alternative permettant de reproduire ces maladies de peau telles que la Dermatite Atopique. En effet, le développement de cette maladie inflammatoire est complexe et fait intervenir plusieurs types de cellules ainsi que leur environnement tissulaire. L’utilisation de l’expérimentation sur des souris est donc indispensable pour l’étude de ces processus. De plus, nous souhaitons démontrer l’efficacité de nouveaux traitements par application sur la peau in vivo. Cette approche sur un mammifère vivant (en l’occurrence, la souris) permet de prévoir les éventuels effets négatifs des nouveaux produits et leurs effets bénéfiques. La réalisation de ce projet permettra d’entreprendre par la suite des études cliniques chez l’Homme.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des tests sur des cellules immunitaire et épidermiques ont été réalisés dans le but de déterminer au préalable les bonnes doses des différentes substances actives d’intérêt et de valider l’efficacité de nos différentes émulsions sur ces cellules avant leur application sur la souris. De plus, l’ensemble des techniques acquises au sein de notre équipe nous permet d’analyser plusieurs paramètres à partir d’un même individu, minimisant ainsi le nombre total de souris utilisées dans le projet. Grâce aux tests statistiques, nous avons déterminé le nombre exact de souris à utiliser dans ce projet pour obtenir des résultats statistiquement significatifs pour démonter l’efficacité de nos produits.
Raffinement
La procédure sera réalisée dans le respect total des règles du raffinement. Les expérimentations seront démarrées une semaine après la réception des animaux, ceci permettra leur acclimatation et leur habituation au sein de l'animalerie afin de diminuer au maximum leur état de stress. De plus, les souris seront surveillées quotidiennement par les expérimentateurs et/ou les animaliers, afin de consigner leur apparence physique externe (posture inhabituelle), leur comportement (niveau d’activité, diminution du comportement exploratoire), leur poids (amaigrissement ou stabilisation), leur fréquence respiratoire. En parallèle, un suivi clinique sera réalisé tous les jours par l’expérimentateur en mesurant différents paramètres, à savoir érythème, érosion, sécheresse et lichénification, Ces paramètres seront évalués avec des scores correspondant au degré de sévérité allant de « aucun » à « sévère ». Le score total sera calculé comme la somme des scores de chaque paramètre, avec un score maximal de 10. Les souris seront immédiatement euthanasiées si la limite de ce score est atteinte. Par ailleurs, les animaux seront logés en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles avec un enrichissement adapté du milieu (carrés de cotons, petits tunnels en carton). Il n’y a pas de limitations dans les apports de nourriture ou d’eau. Une grille de suivi des différents paramètres (grille générale) sera remplie au fur et à mesure de l’étude.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement est bien connu. Ceci nous permettra de surveiller l’état des souris et de détecter toute souffrance liée à l’expérimentation par une simple observation (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge adaptée (analgésie ou euthanasie des animaux). De plus, les souris sont le modèle classiquement utilisé pour étudier les maladies inflammatoires de la peau. Ceci permettra de comparer les résultats de notre étude aux études déjà effectuées par d’autre équipes. Les animaux utilisés seront âgés de 8 semaines. Il s’agit de l’âge de référence utilisé dans les modèles de maladies inflammatoires correspondant à un développement adulte jeune pour les souris.
Mécanismes moléculaires de la mémoire: rôle de la synthèse protéique dans le cerveau
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées au cerveau pendant deux heures en moyenne, puis isolées sept jours avant un test comportemental de cinq jours, 480 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. La chirurgie peut entraîner douleur, infection, déshydratation, hypothermie, mauvaise cicatrisation ou perte de poids. Le projet vise à comprendre le rôle de la synthèse de protéines dans la mémoire, avec l'espoir lointain de nouvelles cibles contre la maladie d'Alzheimer. Classé en souffrance sévère, il ne décrit pourtant les atteintes que comme une "douleur légère", un "stress" et un "ennui", et ne nomme aucun des tests d'apprentissage employés.
Objectifs
La mémoire humaine est un mécanisme biologique complexe qui permettent d’acquérir, de stocker et de retrouver des informations. Elle s’appuie sur des modifications structurelles et fonctionnelles dans les neurones (les cellules du cerveau). Ces modifications permettent de renforcer les communications entre les neurones. Pour que ces changements soient durables et que la mémoire fonctionne correctement, le cerveau doit fabriquer de nouvelles protéines. Ce projet permettra de mieux comprendre comment le cerveau stock et restaure des informations et quels protéines sont importantes pour la mémoire.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle du cerveau et de la synthèse de protéines dans la formation de la mémoire. A terme, approfondir la connaissance des ces mécanismes biologiques de la mémoire permettrait également d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter les troubles de la mémoire comme ceux observés dans la maladie d’Alzheimer
Procédures
1. procédure chirurgicale d'une durée moyenne de 2h. 2. Le test comportemental d'une durée de 5 jours avec la période d'isolement des souris (7 jours avant le test comportemental et pendant la durée du test). Les tests de comportements réalisés permettront d’évaluer les capacités d’apprentissage et de mémorisation chez le rongeur.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables relatifs aux différents gestes exercés sur les animaux sont les suivants : - la chirurgie pourrait entrainer de la douleur, un risque d’infection, une déshydratation, une hypothermie, une mauvaise cicatrisation ou une perte de poids chez l’animal. - Le comportement d'apprentissage pourrait induire une douleur légère, un stress chez l’animal. - l’isolement social pourrait induire une réponse de stress et de l'ennui chez l’animal
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure expérimentale. Cette étape est indispensable afin de pouvoir prélever les tissus cérébraux nécessaires aux analyses scientifiques prévues dans ce projet. Ces analyses biologiques ne peuvent pas être réalisées autrement et sont essentielles pour répondre aux objectifs de recherche.
Remplacement
Le but du projet est d’étudier le rôle des protéines dans la formation de la mémoire et de caractériser les changements d'activité des neurones mis en jeu pour la mémoire . La méthode la plus appropriée pour atteindre ces objectifs consiste à combiner des approches multiples permettant d’enregistrer l’activité des neurones et de quantifier les protéines produites chez l’animal ayant effectué un comportement de mémorisation. Cela nécessite donc le recours à l’animal. Aucun modèle "in vitro" ne peut reproduire la connectivité complexe de ces neurones chez des souris ayant acquis ce comportement.
Réduction
La taille des groupes a été déterminée à l'aide d'analyses statistiques basées sur des calculs de puissance . Ces analyses permettent de garantir que les groupes sont suffisamment grands pour détecter des différences significatives entre les conditions expérimentales tout en limitant le nombre d'animaux utilisés. Les paramètres utilisés incluent la taille d'effet anticipée, le seuil de signification statistique, ainsi que la puissance souhaitée de l'étude . Ces calculs ont été réalisés afin d'assurer un équilibre optimal entre robustesse scientifique et respect du bien-être animal en minimisant le nombre d’animaux requis. Ainsi, nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 480 animaux sur cinq ans.
Raffinement
Nous utilisons plusieurs procédures de raffinement, à savoir: 1/ l'utilisation d'animaux hébergés dans la même structure, que la zone expérimentale, ce qui diminuera les transports et donc limite le stress des animaux 2/ une manipulation des animaux par l'expérimentateur ainsi qu’une période d’acclimatation aux salles d’expérimentation permettront aussi de limiter le stress 3/un environnement plus enrichi lors de la période d’isolement . 4/ l'établissement de points limites 5/ La mise en place de soins adéquats si nécessaire pendant et après l’opération et l'utilisation de l’anesthésie/analgésie lors de chaque protocole.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. En effet, c'est un mammifère présentant une proximité phylogénique avec l'espèce humaine et certains de ces comportements,notamment dans les processus de mémorisation, peuvent être rapprochés de l'espèce humaine. Cette espèce est aussi un bon modèle de pathologiques neurologiques telle que la maladie d’Alzheimer qui peut être induite chez la souris. Pour ce projet, les souris arriveront âgées de 4 semaines. Les chirurgies auront lieu sur des animaux âgés de 5/6 semaines, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge où l’animal pourra récupérer après les protocoles de chirurgie. Le comportement et les differentes analyses seront réalisés au moins quatre semaines après la chirurgie.
Evaluation de la protection induite par des formulations vaccinales contre des pathogènes respiratoires chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Quatorze séries de prélèvements par animal en six mois, sang à la joue, fèces, salive provoquée, prélèvements vaginaux : 747 souris vont être utilisées, dont 432 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles sont vaccinées jusqu'à quatre fois, puis infectées par voie nasale avec la grippe, le virus respiratoire syncytial ou le métapneumovirus, et peuvent perdre jusqu'à 20 % de leur poids dans les sept jours qui suivent. Une injection intraveineuse d'anticorps marqué précède immédiatement la mise à mort, et toutes sont tuées pour prélever les tissus respiratoires. Le bénéfice annoncé, une protection durable des muqueuses que les vaccins actuels n'obtiennent pas, reste à démontrer, quand la perte de poids et l'infection, elles, sont attendues.
Objectifs
Les virus respiratoires, comme ceux causant la grippe ou la bronchiolite, provoquent des infections respiratoires aigües entraînant des pathologies légères à sévères chez l’humain. Très contagieux, ces pathogènes sont responsables d’épidémies saisonnières ou de pandémies, et ils continuent à etre une cause majeure de mortalité notamment chez les jeunes enfants et les personnes agées. Différents candidats vaccins contre les pathogènes respiratoires sont en cours de développement dans le laboratoire pour une administration par voie injectable, par voie nasale ou orale. En continuité avec un projet précédent visant à déterminer les formulations vaccinales qui induisent les plus fortes réponses immunitaires, le but de ce projet est d’étudier la protection conférée par ces candidats vaccins dans un modèle d’infection de souris jusqu’à 6 mois après la vaccination initiale. Ainsi, après la vaccination, les souris seront infectées avec une des souches de virus respiratoires comme Influenza, le virus respiratoire syncytial ou metapneumovirus afin de déterminer la protection conférée par les candidats vaccins.
Bénéfices attendus
Les vaccins contre les virus respiratoires permettent de réduire la sévérité de la maladie mais ils sont actuellement peu efficaces pour induire une réponse immunitaire dans les tissus respiratoires eux-memes permettant une protection à long-terme contre les infections et la transmission. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles stratégies vaccinales contre ces virus. Ce projet permettra de déterminer si nos formulations vaccinales administrées par voie intranasale, orale ou intramusculaire induisent de fortes réponses immunitaires protectrices. De plus, ce projet permettra d’apporter des nouvelles connaissances sur le développement des réponses durables au niveau des tissus nasaux et pulmonaires.
Procédures
- Le marquage des souris sera réalisé à leur arrivée. Ce geste dure quelques secondes. - Les souris seront vaccinées au maximum 4 fois. La durée maximum de la vaccination est de 3 mois. - Les prélèvements de sang au niveau de la joue est un geste qui dure 30 secondes quand il est réalisé par une personne expérimentée. - Les souris isolées pour le prélèvement des fèces seront maintenues dans des boîtes qui n’entravent pas leurs mouvements jusqu’à récupérer suffisamment de fèces, et ne seront pas gardées au-delà de 20 minutes dans ces boîtes. - Des prélèvements vaginaux seront réalisés. Ils durent environ 5 min. - Des prélèvements de salive seront effectués après injection d’une solution qui fait saliver la souris. Tous ces gestes seront réalisés avant chaque immunisation, 2 fois par mois jusqu’au 6ème mois et avant la mise à mort (14 fois dans la procédure durant 6 mois au maximum). - Les souris seront infectées avec un virus respiratoire par voie nasale. - Des lavages nasaux seront réalisés deux fois après l'infection . - Une injection intraveineuse avec un anticorps marqué sera réalisée juste avant la mise à mort. Cet anticorps permettra de marquer des cellules d’intérêt circulant dans le sang.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables peuvent survenir chez les souris après la vaccination comme une augmentation de la température du corps et une diminution de l’activité ainsi que du poids. Après infection, les animaux pourraient développer des signes de pathologies respiratoires, caractéristiques des infections à virus respiratoire : une perte de poids jusqu'à 20% dans les premiers 7 jours après administration nasale de virus, une accélération du rythme respiratoire, une perte d’activité légère entre 2 et 7 jours après administration nasale de virus.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux pour préléver des tissus afin d'analyser les réponses immunitaires et la protection.
Remplacement
La caractérisation des nouveaux candidats vaccins est réalisée dans un premier temps dans des modèles in vitro de cellules épitheliales humaines ou animales. Cependant, il n’existe pas de méthode in vitro pour tester l’efficacité des formulations vaccinales à induire une protection après infection. L’interaction entre le virus et l’intégralité du système immunitaire d’un organisme est beaucoup trop complexe pour être réduit à l’utilisation de lignées cellulaires et requiert l’utilisation du modèle animal pour évaluer la protection générée par des candidats vaccins.
Réduction
La réduction des animaux se fera principalement sur la mise en place des expériences qui seront optimisées afin d’inclure le maximum de groupes expérimentaux dans une seule expérience. Le design de ces expériences est basé sur des données préliminaires établies par nos collaborateurs en 2020 puis 2025.
Raffinement
Après une anesthésie chimique, un suivi accru sera fait jusqu’au réveil et la reprise d’activité de chaque animal. De plus, les souris seront observées dans les heures suivant la vaccination. La température corporelle et le poids des souris seront suivis après chaque vaccination. De plus, ce même suivi se fera pendant 14 jours après l’infection avec le virus au rythme de 1 fois par jour et pourra être augmenté à 2 fois par jour si besoin. Des points limites ont été définis selon différents critères biologiques et si ceux-ci sont atteints lors de la surveillance, l’animal sera mis à mort immédiatement.
Choix des espèces
La souris est le modèle le mieux adapté pour évaluer les réponses immunitaires et la protection induites par un candidat vaccin car la souris a une génétique proche de l’humain et c’est un modèle relativement aisé à mettre en place. Les expériences d’infection avec un virus seront réalisées sur des souris de plus de 7 semaines au début de l’expérience car avant 7 semaines les souris ne disposent pas d’un système immunitaire complétement développé.
Mise en évidence du rôle majeur du noyau dorsal du raphé et de ses circuits dans la dépression induite par la douleur neuropathique : Caractérisation neuroanatomique, fonctionnelle et moléculaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 460 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie de vingt minutes leur inflige une douleur neuropathique chronique que le porteur indique ne pas pouvoir soulager, puisqu'elle est l'objet même de l'étude. Suivent trois tests de douleur jusqu'à trois fois par semaine, puis, huit semaines après l'induction, six tests censés mesurer l'anxiété et la dépression, avec isolement et jeûne. L'objectif reste la compréhension des circuits cérébraux qui lient douleur chronique et dépression, et le porteur écrit qu'il lui est "indispensable" de travailler sur un animal entier, la souris étant selon lui "incontournable" en neurosciences.
Objectifs
La douleur chronique est fréquemment associée aux troubles émotionnels et cela affecte fortement la qualité de vie des patients. Elle représente un fardeau économique majeur sur la société, estimé à plus de 800 millions d’euros en Europe. Le taux de prévalence des troubles anxio-dépressifs est de l'ordre de 30 % chez les patients douloureux chroniques. Il est donc nécessaire de comprendre les circuits neuronaux qui sous-tendent cette comorbidité ainsi les potentiels cibles thérapeutiques. Grâce à l’utilisation de modèles animaux il est aujourd’hui montré que le décours temporel des comportements anxieux et/ou dépressif associés à une douleur neuropathique est hautement dépendant du sexe. De précédents résultats montrent l’implication de structures cérébrales clés. Nous souhaitons approfondir la caractérisation de ces réseaux en manipulant certains gènes ou populations neuronales. L’objectif est de mieux comprendre comment prévenir ou traiter la douleur et/ou la dépression. Ces travaux permettront d’éclairer les mécanismes génétiques et cellulaires impliqués dans le développement de cette comorbidité.
Bénéfices attendus
A l'issue de ce projet, nous serons dans la possibilité d’identifier des réseaux neuronaux et des marqueurs moléculaires impliqués dans la chronicisation de la douleur et le développement des troubles anxio-dépressifs en tenant compte du polymorphisme sexuel. Ces avancées permettront de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant cette comorbidité et sans doute la mise en place de stratégies thérapeutiques adaptées.
Procédures
Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Les chirurgies (d’une durée de 20 minutes) se déroulent sous anesthésie générale avec une administration d’anesthésie locale et d’un anti-inflammatoire en post-chirurgie. Les animaux subissent 3 tests évaluant la douleur de 20 minutes maximum par jour, 1 à 3 fois par semaine. A partir de 8 semaines post-induction de la douleur, les animaux seront évalués avec 6 tests évaluant les comportements de type anxio-dépressifs d'une durée de 5 à 10 min selon le test (avec 48h minimum entre chaque test). Les animaux subissent une chirurgie terminale sous anesthésie générale afin de procéder au prélèvement de tissu d’intérêt. Ce geste a une durée maximale de 15min.
Impact sur les animaux
La présence de la douleur chez le modèle animal est inévitable et ne peut pas être soulagée car c'est l'objet de l'étude. La douleur post-chirurgicale est aigue, transitoire et inflammatoire. Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48 h. Les animaux sont soumis à une douleur chronique avec le développement d’un état dépressif. Les animaux subissent une injection pour l’administration des composés pharmacologiques, induisant une légère douleur transitoire. L'isolement et le jeûne nécessaire aux tests de comportement provoquent un stress.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l’étude de la douleur et de la comorbidité anxiodépressive nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez un animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique interindividuelle.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe sociaux pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie générale et locale sont mises en place et selon les gestes chirurgicaux, des méthodes d’analgésie sont utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la structure chargée du bien-être des animaux à l'institut (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé sur le modèle animal, souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences.
Toxicité (subaiguë) par inhalation : étude sur 28 jours – Ligne directrice de l’OCDE n°412
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Enfermer des rats dans des tubes où ils ne sont pas libres de se mouvoir, plusieurs heures par jour, jusqu'à cinq jours par semaine pendant quatre semaines : le protocole suit la ligne directrice n°412 de l'OCDE, que les industriels appliquent avant de mettre une substance sur le marché. 1 050 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. S'y ajoutent le rasage du dos, jusqu'à seize prélèvements de sang sous anesthésie, deux examens ophtalmologiques et jusqu'à douze séjours de vingt-quatre heures en cage à métabolisme. Les substances qui seront testées ne sont pas connues, et le seul bénéfice avancé est de répondre à des "requis réglementaires" ou à des questionnements sanitaires.
Objectifs
Les industriels doivent montrer qu’ils maîtrisent les risques de l’exposition aux substances chimiques qu’ils utilisent et/ou souhaitent mettre sur le marché pour répondre à des exigences réglementaires et de sécurité. Les tests validés pour en caractériser les dangers suivent notamment les lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour les essais de produits chimiques. L’objectif de ces études est d’évaluer la toxicité subaiguë de l’exposition par inhalation à des substances chimiques chez le rongeur (rats). L’analyse des signes de toxicité in vivo et de paramètres ex vivo après l’exposition aux substances permettra de déterminer les potentielles atteintes physiologiques et d’évaluer leur dangerosité.
Bénéfices attendus
Ces études renseigneront sur les effets toxiques de l’exposition subaiguë à des substances chimiques pour répondre à des requis réglementaires ou des questionnements sanitaires.
Procédures
Observations cliniques et pesées (moins de 5 min) : au moins 2 fois/semaine, au maximum tous les jours. Rasage (moins de 5 min) : 1 fois avant l’exposition en mode « corps entier » ; contention manuelle des animaux vigiles et rasage d’une partie du dos à l’aide d’une tondeuse dédiée aux petits animaux. Habituation au placement dans les dispositifs d’exposition (jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs) : 1 fois avant la 1ère exposition ; placement des animaux vigiles dans les loges de l’enceinte d’exposition pour ceux exposés « corps entier », dans une aire où sont disposés des tubes d’exposition (1er et 2ème jour) et dans les tubes (3ème jour) pour ceux exposés par voie oro-nasale. Exposition en mode « corps entier » (au maximum 4h) : 7 ou 20 fois ; placement individuel des animaux vigiles dans les loges d’une enceinte dédiée et exposition. Exposition par voie oro-nasale (au maximum 4h) : 7 ou 20 fois ; placement des animaux vigiles dans les tubes d’exposition et exposition. Examen ophtalmologique (moins de 5 min) : 2 examens (avant l’exposition et la fin de l’étude) ; contention manuelle des animaux vigiles et observation des yeux. Prélèvement de sang (moins de 5 min) : 1 à 16 prélèvements (1 prélèvement/semaine/4 mois) ; anesthésie des animaux et prélèvement d’au maximum 1 mL de sang. Habituation au placement dans les cages à métabolisme (jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs) : 1 fois avant la 1ère collecte, et collecte d’excrétas (jusqu’à 24h) : 1 à 12 collectes (1 collecte/semaine/3 mois) ; placement des animaux vigiles dans les cages à métabolisme.
Impact sur les animaux
Rasage, examen ophtalmologique : stress lié à la contention ; Exposition en mode « corps entier » : stress lié au placement dans les dispositifs d’exposition, à l'impossibilité de se nourrir et à l'isolement ; Exposition par voie oro-nasale : stress lié à la contention impliquée par le placement dans les tubes d’exposition, à l'immobilisation, à l'impossibilité de se nourrir et s’abreuver, et à l'isolement ; Prélèvement de sang : stress lié à l’anesthésie et à la contention ; Collecte d’excrétas : stress lié au placement dans les cages à métabolisme et à l'isolement. De manière générale, la manipulation des animaux pourra modifier leurs réactions à la préhension et leur niveau d’activité, et une légère perte de poids pourra être observée dans les jours qui suivront l’exposition (effets habituellement relevés suite à une exposition aiguë par inhalation chez des animaux témoins de même souche, âge et sexe). L’exposition à la substance pourra également induire des effets locaux et systémiques susceptibles de faire souffrir les animaux. Des signes cliniques anormaux, affectant notamment la respiration, la peau et les muqueuses, pourront être observés. Les études ont été classées sévères relativement au cas où tous les animaux seront exposés aux substances à tester par voie oro-nasale. Suivant ce mode d’exposition, ils seront placés dans des tubes dans lesquels ils ne seront pas libres de se mouvoir 6h/jour jusqu’à 5 jours/semaine durant 4 semaines. Le choix du mode d’exposition qui sera mis en œuvre étant dépend des substances qui seront testées, et celles-ci n’étant à ce jour pas connues, le scenario le plus contraignant a été envisagé a priori pour chaque étude.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort aux temps d'euthanasie définis selon les objectifs d’étude à l’issue de chaque procédure.
Remplacement
Dans certains cas, les méthodes alternatives à l’expérimentation animale actuellement validées par la réglementation ne permettent pas à elles seules de déterminer les effets toxiques de l’exposition subaiguë à des substances chimiques par inhalation. Les études in vivo sont pour cette évaluation requises. Concernant le choix des animaux, le projet suivra les recommandations de la ligne directrice de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°412 (utilisation de rats mâles et/ou femelles) à l’âge adulte et de souches couramment utilisées en laboratoire.
Réduction
Le nombre d’animaux qui sera utilisé suivra les recommandations de la ligne directrice de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°412. Une analyse des données bibliographiques disponibles sur chaque substance d’essai et ses analogues sera réalisée préalablement aux expérimentations pour déterminer les concentrations d’intérêt à tester. Au plan statistique, les groupes seront comparés par les tests appropriés au traitement de chaque type de données et à leur distribution. Plusieurs paramètres seront évalués sur un même animal, permettant ainsi de minimiser le nombre de rats utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux seront enrichies pour favoriser leur bien-être. Ils seront hébergés à plusieurs par cage pour leur socialisation. Un animal sera isolé de ses congénères en cas de lésions, d’agressivité, de respiration anormale ou de comportement anormal. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et limiter le stress des expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier et du matériau en bois à ronger seront disposés dans leurs cages d’hébergement. Pour les animaux exposés « corps entier », après la tonte préalable à l’exposition, des friandises seront déposées dans leurs cages d’hébergement. Pour les animaux exposés par voie oro-nasale, des tubes semblables à ceux utilisés pour l’exposition seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour leur permettre de se familiariser avec le dispositif et se cacher. Préalablement à l’exposition, les animaux seront habitués au placement dans l’enceinte d’exposition, pour ceux exposés « corps entier », et à la contention imposée par le placement dans les tubes, pour ceux exposés par voie oro-nasale. Après chaque phase d’habituation, des friandises seront déposées dans leurs cages d’hébergement. L’eau de boisson sera supplémentée avec un complément de réhydratation et/ou des gels nutritifs seront mis à disposition dans les cages d’hébergement. En cas d’exposition « corps entier » dans une enceinte de plus d’1 m3, des biberons seront mis à disposition des animaux durant l’exposition. Préalablement à la collecte d’excrétas, les animaux seront habitués au placement dans les cages à métabolisme. Après chaque phase d’habituation, des friandises seront déposées dans leurs cages d’hébergement. Les animaux seront observés attentivement au plan clinique dans les heures qui suivront chaque exposition jusqu’à ce que leur bon état de santé soit avéré. Des critères de raffinement des gestes techniques qui seront pratiqués, des points limites relatifs à l’apparition de signes de douleur et des actions correctives visant à soulager les animaux ont été définis en adéquation avec les paramètres étudiés pour assurer leur bien-être. Des critères supplémentaires à ceux listés dans la présente demande pourront être définis au cas par cas suivant les informations toxicologiques disponibles sur la substance étudiée. Le cas échéant, ils seront indiqués dans le protocole d’essai associé.
Choix des espèces
Ces expérimentations seront réalisées chez le rat car sa physiologie est largement connue et car il constitue un modèle de prédiction des effets respiratoires et systémiques reconnu par la réglementation (cf. Document d'orientation de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°39). Ce projet suivra les recommandations de la ligne directrice de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°412 pour l’étude de la toxicité subaiguë par inhalation, d’utilisation du rat et de souche couramment utilisée en laboratoire, d’animaux jeunes adultes, âgés de 7 à 9 semaines le jour de la randomisation, et de femelles nullipares et non gravides.
Evaluation de nouvelles pistes thérapeutiques dans le traitement de la dysplasie corticale focale chez des modèles murins de la pathologie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un bout de queue prélevé sans anesthésie entre sept et dix jours, puis des crises d'épilepsie quotidiennes vers deux mois chez la moitié des animaux : 11 298 souris vont être utilisées, dont 5 176 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent ensuite jusqu'à dix injections, ou dix administrations orales, ou une injection intracérébrale sous anesthésie, puis passent six tests comportementaux que le porteur nomme, locomotion, exploration, cognition, anxiété, sociabilité et mémoire, ce dernier jusqu'à huit essais par jour pendant treize jours. Une partie subit en plus une chirurgie d'une heure pour implanter des électrodes cérébrales, suivie d'un hébergement individuel dont le porteur reconnaît qu'il génère du stress. Toutes sont tuées à l'issue, pour prélever des tissus ou parce que leur modification génétique interdit de les réutiliser.
Objectifs
Les dysplasies corticales focales sont des pathologies cérébrales du développement induisant des malformations du cerveau (malformations corticales), une épilepsie résistante aux traitements actuels et des troubles neurodéveloppementaux. Pour mieux comprendre et traiter ces maladies, nous utiliserons deux modèles de souris génétiquement modifiées reproduisant les symptômes de la pathologie. Notre objectif sera tout d’abord d’élever les animaux pour produire nos lots expérimentaux. Puis, ces lots permettront ensuite d’évaluer les effets de traitements innovants sur les différentes caractéristiques de la maladie.
Bénéfices attendus
L'épilepsie touche plus de 50 millions de personnes dans le monde. Les épilepsies focales sont parmi les plus fréquentes et sévères des épilepsies, et sont souvent liées à une malformation cérébrale, en particulier ce que l’on appelle les dysplasies corticales focales, sujet de ce projet. Ces dysplasies sont actuellement la cause la plus fréquente de chirurgie cérébrale pédiatrique du fait de la forte proportion de patients résistants aux traitements antiépileptiques actuels. A court terme ce projet pourrait permettre de valider de nouvelles cibles thérapeutiques et de valider l’efficacité de nouveaux traitements agissant sur ces cibles chez des modèles murins de la pathologie. A plus long terme, cela pourrait permettre d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques aux patients atteints de dysplasie corticale focale, moins risquées qu’un retrait chirurgical de la zone responsable des crises d’épilepsies.
Procédures
Pour identifier le patrimoine génétique de nos animaux, un petit prélèvement de l’extrémité de la queue sera effectué sur tous les souriceaux (moins d’1 min par animal, 1 seule fois, sans anesthésie car le jeune âge des animaux rend l’extrémité de leur queue peu sensible). La moitié des animaux que nous produirons développera un phénotype dommageable c’est-à-dire qu’ils présenteront les mêmes symptômes que ceux de la pathologie à partir de 2 mois environ (crises d’épilepsie, modifications du comportement). Tous les animaux recevront un traitement ou son placebo soit par injection (1 injection par jour maximum, tous les 1 à 3 jours pendant maximum 2 semaines, soit 10 injections maximum, moins d’une minute par injection), soit par voie orale (10 administrations réparties sur un maximum de 3 semaines, moins d’une minute par administration), soit par voie intracérébrale (une injection unique réalisée au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée, durée 1h maximum). Pour une partie des lot expérimentaux, avant la phase de traitement, puis après, une partie des animaux participera à des tests comportementaux (6 tests avec 24h minimum entre chaque test, répartis sur une durée maximale d’un mois, trois fois maximum). Le test 1 permettra d’évaluer la locomotion (1 essai, 20 min), le test 2 évaluera la capacité exploratoire (10 minutes par jour, 2 jours), le test 3 évaluera les capacités intellectuelles (1 essai, 8 min), le test 4 évaluera l’anxiété (1 essai, 5 min), le test 5 évaluera la sociabilité (1 heure, 1 fois), et enfin le test 6 évaluera les capacités de mémorisation (au maximum : 8 essais par jour de 90 secondes par essai, pendant 13 jours). Pour une partie des lot expérimentaux, avant la phase de traitement (ou de façon concomitante en cas de traitement par voie intracérébrale), une partie des animaux aura une procédure chirurgicale sous anesthésie générale avec une analgésie adaptée (durée 1h, une fois) pour implanter des électrodes au niveau du cerveau. L’activité électrique du cerveau des animaux sera ensuite mesurée en connectant (connexion simple et indolore) les électrodes à un système d’enregistrement (fait avant et, ou après la phase de traitement donc 2 fois 3 sessions de 5 jours consécutifs maximum, enregistrement en continu, 1 semaine minimum de repos entre chaque session de 5 jours). Les animaux seront vigiles lors des enregistrements, et pourront se déplacer librement durant le test.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont : Premièrement, une légère et brève douleur lors du prélèvement pour déterminer le patrimoine génétique des animaux, ainsi qu’un stress lors des manipulations nécessitant une contention. Deuxièmement, le développement de crises d’épilepsies avec plusieurs crises par jour, la possible survenue de mort due aux crises et des modifications du comportement (diminution de l’anxiété et des interactions sociales entre animaux) Ensuite, une légère et brève douleur lors de l’administration de traitement par injection, avec une possible apparition d’hématome ou d’œdème suite à la répétition des injections. De même, possible douleur au niveau de l’œsophage suite à l’administration de traitement par voie orale. Les animaux pourront également subir un stress dû à l’analyse comportementale et au changement d’environnement pour la réalisation des tests. Il y aura également un risque hypothermique à la suite d’un test impliquant que les animaux soient mouillés. Enfin, la chirurgie nécessaire à l’implantation locale d’électrode et, ou, au traitement intracérébral pourra induire une douleur, une gêne et un inconfort post-opératoire. L’anesthésie générale pratiquée pour cette chirurgie sera associée à un risque d’hypothermie (stress thermique) et un risque d’arrêt cardiorespiratoire. L’hébergement individuel des animaux prévus pour l’enregistrement de l’activité électrique du cerveau engendrera un stress pour les animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés pour prélever des tissus d’intérêt pour répondre à notre question scientifique ou parce qu’il n’est pas possible de les réutiliser ou de les replacer du fait de leur modification génétique.
Remplacement
Les études de tissus issus de chirurgies de patients ont permis de déterminer les gènes impliqués dans la pathologie, d'améliorer le diagnostic des patients, d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes à l’origine de la pathologie, et de créer des modèles animaux. Cependant, le faible nombre de tissus disponibles (environ une naissance sur 100 000) et le fait que ces tissus soient collectés après l’apparition des crises épileptiques limitent considérablement le champ des expérimentations possibles pour nos projets. Enfin, les études sur les patients de nouveaux traitements nécessitent une validation préalable sur des modèles proches de la physiologie humaine et reproduisant les crises épileptiques, comme les modèles de souris utilisés dans ce projet. Deuxièmement, la culture cellulaire seule ne suffit pas pour nos projets. Bien qu’elle ait permis de nombreuses avancées dans l’étude de ces pathologies (validation de mutations découvertes chez les patients, étude des mécanismes impliqués dans la pathologie, etc.), elle ne permet pas la création de modèles suffisamment complexes et représentatifs de l’ensemble des mécanismes en jeu in vivo. Elle ne permet pas non plus de reproduire les crises d'épilepsie observées chez les patients. Enfin, la modélisation informatique nécessite des données expérimentales encore manquantes. Les modèles de souris que nous utiliserons ont déjà été validés pour l’étude de cette pathologie et sont donc adaptés à la validation de nouvelles cibles thérapeutiques et à l’évaluation de l’efficacité de nouveaux traitements agissant sur ces cibles.
Réduction
Nous veillerons à générer le minimum d'animaux nécessaires pour leur utilisation dans des expériences visant à produire des conclusions scientifiques statistiquement fiables. Nous utiliserons au total dans ce projet un maximum de 11 298 animaux. La taille des effectifs par groupe a été établie grâce à un calcul de puissance et sera ajustée selon les premiers résultats obtenus. Ainsi, nous avons définis qu’un effectif de 10 à 15 animaux par groupes serait nécessaire en fonction des critères évalués. Nous procèderons à des tests statistiques sur les données obtenues pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Ils seront observés quotidiennement, et ceux susceptibles de développer un phénotype dommageable bénéficieront d’une surveillance spécifique. Pour chaque procédure, nous avons établie des points limites spécifiques pour éviter toute souffrance animale. Le geste de biopsie (prélèvement d’une petite quantité de tissus pour connaitre le statut génétique des animaux) sera de la plus petite taille possible. Le geste sera réalisé dans une pièce dédiée, au calme, avec du matériel propre et désinfecté entre chaque animal pour éviter toute infection ou contamination croisée. Les petits seront immédiatement replacés avec leur mère après le geste et il sera vérifié qu’ils soient bien repris en charge immédiatement après le retour en cage puis 20 minutes environ après. Pour les animaux recevant un traitement, nous les pèserons du premier au dernier jour de traitement afin de détecter une éventuelle perte de poids et d’adapter le volume administré. Pour les souris recevant une injection, la zone et la méthode ont été déterminées pour limiter au maximum les potentiels effets indésirables sur les animaux. Pour les souris recevant un traitement par voie orale, la prise dans l’eau de boisson ou dans du lait concentré-sucré avec une pipette sera préférée au maximum et le schéma thérapeutique pourra être réévalué en cours de traitement pour limiter au maximum la souffrance des animaux. Les tests comportementaux seront précédés d’une période d’habituation à l’expérimentateur. Les tests seront effectués du moins au plus stressant et avec une période d’habituation à la pièce avant chaque test. Nous observerons un temps de repos entre les traitements et les tests et inversement. Dans le cas du test impliquant de la nage, la température de l’eau sera rigoureusement vérifiée et les animaux seront séchés entre chaque phase du test. Pour la procédure chirurgicale, nous prendrons en compte le risque d’hypothermie en maintenant la température des animaux pour toute la durée de l’anesthésie. La douleur sera prévenue par analgésie et anesthésie. Après la chirurgie, l’expérimentateur réalisera une surveillance spécifique quotidienne durant 5 jours, puis une fois par semaine. Un enrichissement supplémentaire sera fourni aux animaux hébergés seuls en post-chirurgie, ils seront également surveillés spécifiquement pour détecter tout signe clinique en lien avec cet hébergement.
Choix des espèces
Ce projet nécessitera de travailler sur la souris. Ce choix a été motivé par des raisons scientifiques car le projet porte sur une pathologie génétique ce qui implique de générer un modèle reproduisant les mutations génétiques observées chez les patients. La souris fait partie des espèces permettant ce type de modifications. De plus, l’utilisation de cette espèce permet l’obtention rapide de groupe d’individus homogènes diminuant la variabilité de nos résultats et permettant de réduire le nombre d’animaux utilisés. Enfin, les souris ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des crises épileptiques. Plusieurs modèles de souris ont déjà été créés et étudiés pour modéliser les crises d’épilepsies. Les souris ont donc été explorées de manière exhaustive, permettant une solide base scientifique. Ce projet nécessitant l’administration de traitements, nous utiliserons donc des souris adultes. Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux sera fait à l’âge de 7 à 10 jours. Cet âge précoce permet d’une part de profiter de la cicatrisation rapide des jeunes animaux et d’autre part de connaitre leur génotype très tôt et donc pouvoir inclure les animaux dans les procédures dès leur sevrage.
Comprendre les causes de l’arrêt respiratoire dans le syndrome d’Ondine (maladie génétique qui touche le contrôle de la respiration) grâce à des souris génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
- Système respiratoire
Les souriceaux de ce projet naissent avec une mutation qui les empêche de respirer normalement, apnées, respiration faible et absence de réaction à l'excès de gaz carbonique dans le sang. 464 souris vont être utilisées, 180 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 264 modéré et 20 léger, toutes tuées à l'issue. Chaque nouveau-né est séparé de sa mère jusqu'à une heure pour les mesures cardio-respiratoires, subit le prélèvement de deux à trois millimètres de queue avant son quatrième jour de vie pour le génotypage, et est manipulé toutes les deux heures le jour de sa naissance pour vérifier sa vitalité. Les souriceaux sont tués par décapitation au quatrième jour, ou plus tôt si un point limite est atteint, le porteur ayant retenu comme critères le score d'adaptation à la vie extra-utérine et le comportement de la mère envers sa portée.
Objectifs
Nous voulons comprendre comment et pouquoi des mutations aboutissent au syndrome d'Ondine. Cette maladie se manifeste à la naissance par une apnée, une respiration faible et une absence de rélfexe respiratoire (pas d'augmentation de la respiration à une élévation de la teneur en gaz carbonique dans le sang). Ces problèmes se manifestent pendant le sommeil ce qui est dangeureux pour le nouveau-né. Il s'agit d'identifier les structures qui ne se forment pas et/ou les structures qui sont malformées à l'expression de la mutation et leurs conséquences sur la respiration.
Bénéfices attendus
Le projet pourrait avoir un impact fondamental par l’identification des circuits neuronaux impliqués dans les déficits respiratoires du syndrome d'Ondine. Le projet pourrait également apporter de nouvelles connaissances sur les structures du cerveau impliquées dans le maintien de la respiration pendant le sommeil, informations critiques à la compréhension du développement du syndrome d'Ondine et plus largement des pathologies respiratoires du sommeil comme les apnées obstructives.
Procédures
1/ Séparation maternelle d'une heure pour la mesure cardio-respiratoire 2/ Le prèlèvement d'un morceau de queue de 2-3 mm et d'une durée de 3 secondes pour l'identification du statut génétique est réalisée avant quatre jours de vie (souriceau sans poils) 3/ vérification de la vitalité du souriceaux (durée : 1 min par souriceau) le jour de naissance toutes les deux heures sur 6h d'observations puis deux fois par jour. Aucune necessité de recourir à de l'anesthésie.
Impact sur les animaux
1/ angoisse à la séparation maternelle d'une heure pour les mesures respiratoires 2/ Douleur au prèlèvement de 2-3mm de queue pour l'identification du statut génétique 3/ détresse respiratoire liée à la mutation 4/ angoisse à la vérification de la vitalité du souriceau (1 min par souriceau) 3 fois en 6h (le jour de naissance et 2 fois par jour juqu'à P4. 5/Stress lié à la detresse respiratoire engendrée par mutation.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Les souriceaux sont euthanasiés par décapitation à la fin de la procédure (4 jours de vie) ou en cas d'atteinte de point limite. S'il y a un besoin de prélèvement d'organes notamment du cerveau sur les souriceaux nouveau-nés, ça sera en postmortem.
Remplacement
Dans le cas du syndrome d’Ondine, il n’y a actuellement pas de prise en charge pharmacologique. Cependant, les modèles génétiques murins sont disponibles pour élaborer et/ou affiner les stratégies thérapeutiques. Si les avancées obtenues par les recherches sur les cultures cellulaires permettent d'éclaircir les mécanismes et les conséquences de la mutation à l'échelle moléculaire et cellulaire, une validation sur des animaux en développement est nécessaire pour comprendre la maladie et les conséquences fonctionnelles sur un organisme entier. L’utilisation de l’animal ne peut alors être évitée.
Réduction
Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la grande variabilité inter-individuelle et d'une éventuelle mortalité à la naissance, nous avons déterminé un lot expérimental de 30 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Les études publiées sur les variables respiratoires valident l’effectif de 30 animaux par groupe pour obtenir une puissance statistique satisfaisante. Cet effectif sera réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses.
Raffinement
Des points limites adaptés à l’âge des souriceaux sont décrits et comportent le score d’adaptation à la vie extra-utérine pour le souriceau et le comportement de la mère envers sa portée. Pour les mesures, nous utilisons une technique non invasive (animal non anesthésié) et contrôlée (durée de la mesure, température constante dans les chambres de mesure) pour minimiser une possible angoisse des animaux. La durée de séparation maternelle le temps d’une mesure est d’une heure au maximum. Les cages avec les portées sont enrichies en cellulose douce pour le nid. De plus, l’équipe de l’animalerie effectue une surveillance réglementaire quotidienne des espaces d'hébergement et de toutes les cages.
Choix des espèces
La souris constitue un modèle pour l'étude du développement du cerveau humain. Plus largement, la souris génétiquement modifée contribue à la compréhension d'une maladie génétique. Dans le cas du syndrome d'Ondine, les modèles animaux existants sont murins. C’est une maladie qui se manifeste dès la naissance. Nous avons des outils adaptés pouvant prendre en charge les modèles murins dès la naissance permettant ainsi de tester et d’évaluer des stratégies thérapeutiques. De plus, le recours aux modèles animaux en développement constitue une des recommandations de l'Agence Européenne du médicament pour évaluer les médicaments à visée pédiatrique. Les souriceaux sont étudiés dans la période juste avant et après leur naissance, jusqu'à leurs 4 premiers jours de vie.
Evaluation de la résistance de truites d’élevage à une maladie virale pour une amélioration progressive par sélection génétique
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Des alevins de truite arc-en-ciel de 0,5 à 1 gramme sont infectés par le virus de la nécrose pancréatique infectieuse, au stade où ils y sont le plus vulnérables. 8 250 d'entre eux vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, l'infection devant provoquer des signes cliniques et la mort d'une partie des poissons, les survivants étant tués à la fin de l'essai parce que les règles sanitaires interdisent de les renvoyer dans leur ferme d'origine. Le porteur écrit qu'aucune intervention n'est prévue sur les animaux vigiles, ce qui laisse hors du compte l'infection elle-même. Les retombées annoncées, une meilleure santé des poissons d'élevage et une "avance technologique" pour les entreprises françaises, se chiffrent à 2 à 10 % de survie gagnée par génération de sélection.
Objectifs
La nécrose pancréatique infectieuse (NPI) est une maladie virale à forte prévalence en Europe qui affecte principalement les jeunes alevins de truites arc-en-ciel (TAC), générant de nombreuses pertes dans les élevages. Contagieuse, elle peut se transmettre de manière horizontale (d’un animal porteur à un animal sain) ou de manière verticale (les mères porteuses du virus pouvant le transmettre à leurs œufs). Les traitements prophylaxiques étant peu ou pas efficaces, un des leviers existant pour améliorer la résistance de truites à ce pathogène est la sélection génétique. Le couple virus de la Nécrose Pancréatique Infectieuse / Truite a déjà fait l’objet de travaux de Recherche & Développement permettant de générer les paramètres génétiques de la résistance au pathogène. Ce projet s’inscrit dans la continuité des travaux précédents, le processus d’amélioration de la résistance aux pathogènes devant être mené sur plusieurs générations successives afin que la sélection sur un caractère précis soit efficace et porte ses fruits. La truite étant mature à partir de 2 ans, il faut au minimum 4 ans pour tester 2 générations successives. Le premier objectif de ce projet est de déterminer le niveau de résistance au virus de la NPI (vNPI) de la génération actuelle de truitelles de l’écloserie partenaire du projet. Les données recueillies permettront d’estimer l’héritabilité de la résistance au vNPI et seront corrélées avec d’autres données générées par ailleurs. Les projet sera réitéré sur 3 générations successives.
Bénéfices attendus
Les retombées attendues sont une amélioration de la santé et du bien-être des poissons en élevage ainsi qu’une diminution de l’utilisation des médicaments. Ces essais novateurs permettront aux entreprises françaises de bénéficier d’une avance technologique face aux investissements publics étrangers concurrents dans un secteur compétitif et très dynamique, en bénéficiant des avancées des technologies de pointe permettant d’étudier de manière globale les molécules biologiques (comme l’ADN, l’ARN ou les protéines) présentes dans les cellules des organismes. L’amélioration attendue de la survie est estimée entre 2 à 10% par génération de sélection en fonction de la composition des objectifs de sélection et des pressions de sélection appliquées.
Procédures
Il n'y a pas d'intervention prévue sur les animaux vigiles.
Impact sur les animaux
L’infection virale va induire des signes cliniques plus ou moins marqués et de la mortalité chez certains individus.
Devenir
Du fait de la nature des essais menés dans ce projet et pour des raisons sanitaires, il n’est pas envisageable de transporter les animaux dans leur ferme d’origine. En conséquence, à la fin de la procédure les animaux survivants seront mis à mort.
Remplacement
Il n'existe pas d'alternative in vitro pour ce projet. L'évaluation de la résistance d'individus à un pathogène à des fins d’amélioration génétique progressive d’une population doit se faire sur des animaux vigiles capables de mettre en œuvre des systèmes de défense complexes (immunité).
Réduction
Le nombre de poissons utilisé est réduit au minimum requis par les méthodes d'évaluation génétique. Les individus testés dans le projet servent à évaluer et classer leurs collatéraux restés en pisciculture. De ce fait, le meilleur compromis doit être trouvé entre un nombre faible de poissons testés et une classification précise de leurs collatéraux en ferme.
Raffinement
Un enrichissement des bassins est réalisé (couvercles pour permettre aux poissons d'avoir une zone d'ombre et de se cacher, bullage). Au cours des tests, une surveillance accrue est réalisée afin d'observer l'apparition des signes cliniques et, de positionner des mises à mort compassionnelles en fonction de la gravité des signes cliniques observés (par exemple : en cas d'absence de réponse aux stimulis).
Choix des espèces
La truite arc-en-ciel (Oncorhynchus mykiss) est l’espèce d'eau douce la plus produite en France (35000 t/an) et en Europe. Elle est très sensible au pathogène étudié dans ce projet. Les essais seront réalisés environ 2 semaines après le début du nourrissage des alevins, soit à 0,5g-1g car c’est à ce stade de mise en place du système digestif qu’ils sont le plus vulnérable au pathogène.
Cibler les mégacaryocytes hébergeant des virus pour une restauration immunologique efficace dans les syndromes post-infectieux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
920 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 553 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 367 d'un niveau léger. Les unes reçoivent le SARS-CoV-2 par instillation nasale sous anesthésie et perdent environ 12 % de leur poids en quatre jours, une sur dix mourant de l'infection à la dose retenue. Les autres reçoivent les virus Mayaro ou Chikungunya en sous-cutané et développent un gonflement de la patte injectée. Le prélèvement de sang se fait par voie rétro-orbitale et chaque animal est tué immédiatement après, le porteur indiquant que les organes recherchés ne peuvent pas être obtenus autrement.
Objectifs
Les syndromes infectieux post-aigus (PAIS) sont des maladies qui apparaissent après une infection, quand la phase la plus forte de la maladie est terminée. Ces maladies peuvent durer longtemps et rendre la vie difficile à ceux qui en souffrent. Même si on connaît ces syndromes depuis longtemps, on ne comprend pas encore bien comment ils fonctionnent ni comment les soigner. Un exemple connu est le COVID long, qui touche certaines personnes après une infection au coronavirus. Le virus SARS-CoV-2, responsable du COVID-19, provoque d’abord des problèmes respiratoires, mais chez certains, il reste présent dans le corps et cause des symptômes qui durent plusieurs mois. D’autres virus, comme le Mayaro et le Chikungunya, présents surtout dans les régions tropicales, peuvent aussi provoquer ce genre de maladies chroniques. Ils pourraient même arriver en Europe. Notre objectif est de mieux comprendre comment ces virus restent dans le corps, en particulier dans certaines cellules. Nous nous intéressons notamment aux mégacaryocytes, des cellules surtout connues pour produire des plaquettes sanguines, mais qui pourraient aussi jouer un rôle dans la défense contre les infections. Mieux comprendre ces mécanismes pourrait aider à trouver des solutions pour améliorer la vie des personnes touchées par ces maladies.
Bénéfices attendus
Certaines cellules du sang, comme les plaquettes et les mégacaryocytes, peuvent servir de cachette à des virus. Notre équipe va donc étudier le rôle de ces cellules dans des modèles de souris atteintes de COVID long et lors d’infections par les virus Mayaro et Chikungunya (en collaboration avec l’Université Fédérale de Rio de Janeiro, au Brésil). Nous pensons qu’en ciblant ces cellules, il serait possible de renforcer le système immunitaire et d’améliorer la santé des personnes qui souffrent de symptômes persistants après une infection virale. Pour l’instant, il n’existe pas de modèles en laboratoire alternatifs à l’experimentation animale qui permettent de reproduire exactement ce qui se passe dans le corps humain à long term, après une infection. C’est pourquoi nous utilisons des souris pour mieux comprendre comment ces virus agissent et comment ils provoquent des maladies chroniques. Ces modèles sont essentiels pour tester de nouvelles idées et développer des traitements efficaces contre ces syndromes post-infectieux.
Procédures
(1) Infection du virus du COVID-19 (SARS2) par voie nasale. L’instillation nasale du virus sera réalisée sous anesthésie générale obtenue par inhalation d’isoflurane. La durée totale de la procédure, comprenant l’anesthésie, est d’environ 2 à 3 minutes. (2) Infection de MAYV/CHIKV par voie sous-cutanée. Cette procédure, effectuée sous anesthésie générale par inhalation d’isoflurane, dure environ 2 minutes, incluant l’installation, l’anesthésie et l’injection sous-cutanée. (3) Prélèvement sanguin par voie rétro‑orbitale. Une analgésie locale sera réalisée par le dépôt d’une goutte de collyre à base de tétracaïne. Une anesthésie générale sera obtenue par inhalation d’isoflurane. L’ensemble de la procédure dure environ 3 minutes. Les animaux seront euthanasiés immédiatement après ce prélèvement.
Impact sur les animaux
Lorsqu’on infecte les souris avec le SARS2, elles perdent du poids (environ 12 % en quatre jours) et environ 1 souris sur 10 peut mourir à cette dose. Ce modèle permet d’étudier comment le virus provoque des maladies graves, comme des atteintes aux poumons, chez l’humain. Pour les virus Mayaro et Chikungunya, lorsqu’on les injecte à des souris, celles-ci présentent un gonflement de la patte (là où le virus est injecté) et perdent aussi du poids dans les jours qui suivent. Cependant, le risque de décès avec ces virus est très faible. Ces modèles animaux sont donc utiles pour comprendre comment ces virus agissent sur le corps et pour tester de futurs traitements
Devenir
L’ensemble des animaux utilisés dans chaque procédure sera euthanasié à terme, y compris ceux affectés aux groupes contrôles. Cette étape est indispensable car l’étude nécessite le prélèvement de tissus et d’organes spécifiques, afin d’analyser la réponse immunitaire, la persistance virale et les mécanismes pathologiques induits par l’infection. Les échantillons d’organes ne peuvent être obtenus autrement. La durée maximale de maintien en vie des animaux après le début des expériences sera d’un (1) mois.
Remplacement
Pour étudier ces maladies, il existe des modèles en laboratoire comme les organoïdes (mini-organes créés à partir de cellules). Cependant, ces modèles ne sont pas encore assez avancés ou adaptés pour notre recherche, car les syndromes post-infectieux touchent plusieurs organes à la fois. C’est pourquoi nous avons besoin d’étudier l’effet des virus sur des animaux entiers, pour mieux comprendre ce qui se passe dans tout le corps.
Réduction
Nous faisons très attention à utiliser le moins d’animaux possible tout en obtenant des résultats fiables. Pour chaque expérience, nous utiliserons seulement le nombre minimum de souris nécessaire pour que les résultats soient valides et puissent être analysés correctement. Le nombre d’animaux a été déterminé à partir d’une approche statistique permettant de garantir la puissance nécessaire des expériences. Les expériences seront répétées trois fois, avec six souris par groupe. Au total, nous aurons besoin de 550 souris d’une première lignée de souris pour l’étude du SARS2, et 370 d’une autre lignée de souris pour l’étude du MAYV/CHIKV, y compris celles utilisées pour préparer les expériences et maintenir les lignées. Cela nous permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Nous mettons tout en œuvre pour garantir le bien-être des animaux. Cela passe par des procédures précises, une formation du personnel, un suivi quotidien de la santé des animaux, et l’utilisation de méthodes les moins douloureuses possible. Si un animal montre des signes de souffrance, il sera pris en charge rapidement, et une euthanasie pourra être pratiquée si nécessaire pour éviter toute douleur inutile. Chaque animal sera observé chaque jour, et son état de santé sera noté selon une grille précise pour s’assurer qu’il ne souffre pas.
Choix des espèces
La souris est un animal très utilisé pour étudier comment notre corps réagit aux infections virales, car son système immunitaire ressemble beaucoup à celui de l’humain. De plus, il est très difficile d’obtenir certains tissus, comme la moelle osseuse, chez l’humain pendant une infection, alors que c’est possible chez la souris. Cela nous permet d’en apprendre plus sur les réactions du corps face à ces virus. Il existe aussi de nombreux outils scientifiques adaptés à la souris, ce qui rend l’analyse des réactions immunitaires plus facile et plus précise. Dans nos recherches, nous infecterons des souris femelles de la lignée Balb/c avec le virus du COVID-19 à l’âge de 8 semaines, car à cet âge, leur système immunitaire est complètement développé.Pour les virus Mayaro et Chikungunya, nous utiliserons des souris femelles de la lignée 129/sv âgées de 3 semaines, car elles présentent alors des symptômes similaires à ceux observés chez les humains malades. Cela nous aide à mieux comprendre comment ces maladies se développent et à chercher des solutions pour les traiter.
Interaction d’une bactérie pathogène avec l’intestin chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Des souriceaux de quatorze jours reçoivent par gavage une bactérie responsable de sepsis et de méningites chez les nouveau-nés. 157 souris vont être utilisées, dont 141 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue, les mères après leurs petits parce que l'exposition à la bactérie interdit de les réutiliser. Les mères gestantes passent en outre environ sept jours en hébergement individuel. Pour 141 animaux classés en souffrance sévère, le porteur ne décrit les atteintes attendues qu'en une phrase, un stress et une douleur dans les 24 heures suivant l'inoculation, sans dire quels signes cliniques l'infection provoque ni à quel stade elle est arrêtée.
Objectifs
Certaines bactéries pathogènes peuvent être présentes dans les voies vaginales et digestives des individus. Alors que le portage est asymptomatique chez l’adulte, elles peuvent causer des infections graves chez les nouveau-nés (sepsis, méningite). L’infection peut survenir au cours de la première semaine de vie (syndrome précoce) ou plus tardivement (syndrome tardif, 7 à 89 jours de vie). Au cours des syndromes tardifs, l’infection survient après le franchissement de la barrière intestinale par les bactéries, et plus précisément après la traversée de cellules spécialisées. Le but de ce projet est d'identifier et d'analyser à l'aide d'un modèle murin d’infection néonatale tardive, i) les cellules immunitaires recrutées après l'infection et ii) la réponse des différentes cellules de l'intestin à l’infection.
Bénéfices attendus
Nos résultats fourniront des informations précieuses sur les cellules et les gènes impliqués dans le franchissement de la barrière intestinale par les bactéries pathogènes, ainsi que la réponse immunitaire intestinale à l'infection. À terme, le projet permettra d’identifier de nouvelles cibles pour le développement de stratégies préventives et thérapeutiques contre les infections néonatales bactériennes.
Procédures
Toutes les souris gestantes adultes seront en hébergement individuel pour une durée d'environ 7 jours. Tous les souriceaux seront soumis à un gavage oral d'une durée de 5 à 10 secondes réalisé sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
L'hébergement individuel est susceptible d'entraîner un léger stress et des modification du comportement. Le développement des bactéries sera susceptible de générer un stress et de la douleur chez l’animal dans les 24h qui suivent l’inoculation.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure. Des prélèvements post-mortem seront effectués chez les souriceaux pour analyse. Les mères ayant été exposées à une bactérie pathogène (niveau A2) ne pourront pas être réutilisées et seront mises à mort après mise à mort de l'ensemble de leurs souriceaux.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas de récapituler la complexité de la barrière intestinale ni d'étudier l'ensemble des types cellulaires présents.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum en homogénéisant strictement les conditions expérimentales. Nous utiliserons des animaux obtenus chez le même fournisseur afin de limiter au maximum la variabilité expérimentale.
Raffinement
Les animaux seront observés quotidiennement par les expérimentateurs pour détecter tout signe anormal de douleur, de souffrance ou de stress et nous avons raffiné la méthodologie par l’introduction de points limites entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire l’infection néonatale bactérienne, du franchissement de la barrière intestinale jusqu’à la dissémination par voie sanguine et la méningite. Le modèle souris permet d'étudier les différents organes impliqués dans la physiopathologie de l'infection humaine. Nous utiliserons des souris adultes gestantes car c'est une étude sur leur progéniture avant sevrage. Nous utiliserons des souriceaux de 14 jours à un stade de développement équivalent à celui de nouveau-nés humains âgés de 7 à 89 jours de vie.
Etude de l’interaction entre le dysfonctionnement métabolique et l’inflammation chronique dans un modèle murin de la dégénérescence maculaire liée à l’âge
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
6 500 souris vont être utilisées, chacune pouvant subir jusqu'à six électrorétinogrammes de 30 à 45 minutes et six imageries de la rétine sous anesthésie générale, 500 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 1 750 modéré et 4 250 léger. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes entiers. Un lot est hébergé jusqu'à quatre mois sous lumière intense, cotons de nidification retirés de la cage pour les empêcher de se cacher de la lumière, un autre subit l'ablation du nerf vague combinée ou non à celle de la rate, un autre des injections dans l'œil au risque d'inflammation et de micro-saignements. Le porteur écrit avoir limité les effectifs au maximum et fixe cinq animaux par groupe comme minimum statistique, sans expliquer par quel enchaînement de groupes on parvient à 6 500 souris.
Objectifs
La dégénérescence maculaire liée à l'âge (DMLA) est une maladie de la rétine provoquée par une dégénérescence progressive de la partie centrale de la rétine, qui apparaît le plus souvent à partir de 65 ans. En France, environ 1,5 million de personnes seraient atteintes de DMLA. Dans cette pathologie, un processus inflammatoire caractérisé par l’infiltration et l’accumulation de cellules inflammatoires et un processus de dysfonctionnement métabolique participent de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Ce projet permettra de comprendre comment ces processus essentiels interagissent, améliorant ainsi notre compréhension de la pathogenèse de la DMLA. De plus, il permettra d’évaluer si le traitement de la réponse inflammatoire pourrait avoir un effet thérapeutique lorsque la cause principale de la maladie est un dysfonctionnement métabolique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’améliorer notre compréhension de la pathogenèse de la DMLA (dégénérescence maculaire liée à l’âge). De plus, il permettra d’évaluer si le traitement de la réponse inflammatoire pourrait avoir un effet thérapeutique lorsque la cause principale de la maladie est un dysfonctionnement métabolique.
Procédures
Un lot d’animaux subira des explorations fonctionnelles de la rétine : enregistrements d’électrorétinogrammes (30 à 45 minutes, jusqu’à 6 fois) sous anesthésie générale avec analgésique, une imagerie rétinienne (10 minutes, jusqu’à 6 fois) sous anesthésie générale. Un lot d’animaux sera hébergé sous une lumière intense (jusqu’à 4 mois maximum) et subira des explorations fonctionnelles de la rétine : enregistrements d’électrorétinogrammes (30 à 45 minutes, jusqu’à 3 fois) sous anesthésie générale avec analgésique, une imagerie rétinienne (10 minutes, jusqu’à 3 fois) sous anesthésie générale. Un lot d’animaux subira une chirurgie d’ablation du nerf vague combinée ou non à une ablation de la rate (durée de l’intervention 10 minutes) sous anesthésie générale et analgésiques administrés en préopératoire et postopératoire. Un lot d’animaux recevra des régimes alimentaires spécialement formulés pendant 4 semaines et subira des explorations fonctionnelles de la rétine : enregistrements d’électrorétinogrammes (30 à 45 minutes, jusqu’à 2 fois) sous anesthésie générale avec analgésique, une imagerie rétinienne (10 minutes, jusqu’à 2 fois) sous anesthésie générale. Un lot d’animaux sera soumis à une injection de molécules thérapeutiques par voie intraoculaire sous anesthésie générale avec analgésique (durée : moins de 5 minutes).
Impact sur les animaux
Lors des anesthésies, il y a un risque de mauvaise réaction à l’anesthésiant (difficultés respiratoires, anxiété), un risque d’hypothermie ainsi qu’un risque d’arrêt cardiaque. Lors des injections intraoculaires, il y a un risque d’inflammation localisée (œil rouge) et de micro saignements visibles instantanément lors du geste. Lors de la procédure d’illumination, les animaux peuvent ressentir un stress lié à l’exposition à une lumière de (animaux agités pendant moins d’une heure), et leurs fonctions visuelles peuvent baisser au cours du temps. Lors des imageries de l’œil, les animaux peuvent également ressentir un stress lié à la préhension et contention lors de l’administration des collyres (durée de quelques secondes seulement). Lors du changement d’alimentation (mise à disposition des croquettes spécifiques à notre projet), les souris peuvent subir une perte de poids transitoire en réponse au changement de nourriture. Une hémorragie peut se produire au cours des chirurgies, ce qui peut entrainer le décès de l’animal. Après les chirurgies, les sutures pourraient s’irriter ou être retirées prématurément par l’animal. Après l’opération, il peut y avoir des douleurs postopératoires.
Devenir
Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem. Cela implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux, car nous avons besoin de prélever des organes entiers pour les analyser dans leur globalité.
Remplacement
Les études in vitro ne permettent pas l’étude des signes cliniques de la pathologie de l’œil en particulier ; la souris est une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude. Ces modèles permettent d’étudier la maladie dans un organisme entier, qui ne peut pas être reproduit en utilisant des cellules isolées.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser 6500 animaux pour réaliser cette étude. Nous avons limité au maximum le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement interprétables au regard de nos précédentes expériences d’autres projets de recherche (variabilité inter- animal/ inter - expériences). Le nombre de 5 animaux défini par groupe est le minimum requis pour l'application de tests statistiques de significativité fiables et l'obtention de résultats interprétables et fiables, selon nos expériences antérieures. Pour les injections intraoculaires, nous prévoyons d’injecter le traitement dans un œil ; l’œil controlatéral servira de contrôle ce qui permettra de limiter la variabilité entre animal et de réduire ainsi le nombre d’animaux de l’étude.
Raffinement
Les animaux en provenance de l’extérieur observent une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant d’entrer en expérimentation. Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation pour l’espèce concernée (cages ventilées standard avec enrichissement). Le nombre de souris par cage est limité à 5 individus adultes. Lors de la mise des animaux sous illumination, les animaux sont placés dans une pièce différente, mais restent dans leurs cages de stabulation normale, selon les mêmes conditions, hormis la luminosité et les cotons qui sont retirés pour éviter que les animaux ne se cachent de lumière. Ils auront accès illimité à l’eau et à la nourriture. Des points limites ont été définis et les animaux sont examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les expérimentateurs. Toute observation anormale ou point limite atteint sera noté dans le logiciel de gestion des animaux et nous suivrons l’échelle décisionnelle définie par les membres de la structure bien-être de notre établissement utilisateur. L'euthanasie de l'animal serait un dernier recours. Le personnel assure le suivi du bien-être des animaux à l’aide d’un système d’étiquettes et de pastilles. Des points limites précoces et prédictifs ont été mis en place pour s'assurer de réduire la souffrance et la détresse des animaux au maximum. Les animaux bénéficieront si besoin d'une anesthésie générale fixe ou gazeuse ainsi qu'une anesthésie locale de la cornée et l'humidité cornéenne sera maintenue à l'aide d'une goutte de gel ophtalmique. Après la chirurgie nous mettons à disposition une gelée post-opératoire nutritive avec des croquettes mouillées dans le fond de la cage pour aider à l’alimentation et à l’hydratation. En plus de l’analgésie préopératoire, des injections d’analgésiques postopératoires seront administrée après la chirurgie pour toute douleur postopératoire potentielle. Le poids corporel des animaux sera mesuré la veille, deux jours après et une semaine après la chirurgie. Une grille de scoring a été créée pour suivre les poids des animaux et les autres observations postopératoires. Le poids des animaux nourris avec des croquettes formulées avec un composé sera également surveillé chaque semaine pendant toute la durée de l’alimentation (mise en place d’une fiche de suivi pour vérifier ce paramètre).
Choix des espèces
Les souris sont utilisées pour ces expériences car elles constituent un modèle bien établi pour étudier la réponse inflammatoire participant de manière importante à la dégénérescence de la rétine. Nous utilisons des modèles génétiquement modifiés qui sont plus susceptibles à l’induction d’une inflammation pathogène, mimant la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Les animaux sont âgés de 8 semaines minimum à leur entrée dans la procédure expérimentale. C’est l’âge à partir duquel le système immunitaire et vasculaire de la souris est mature et donc à partir duquel elle est susceptible de développer la maladie étudiée.
Exploration de la perméabilité de la barrière hémato encéphalique au cours de l’encéphalopathie associée au sepsis et l’accélération du déclin cognitif post-sepsis chez la souris – EU 2/2
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Porteuses de mutations qui leur font développer une maladie neurodégénérative avec l'âge, les souris de ce projet reçoivent en plus un sepsis provoqué par chirurgie, à six mois ou à douze mois. 200 d'entre elles vont être utilisées, 96 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 64 modéré et 40 léger, toutes tuées à l'issue. Après l'opération, elles présentent pendant 24 à 48 heures une baisse d'activité, le poil hérissé et parfois des diarrhées liquides, avant d'être transportées vers un second établissement pour une imagerie cérébrale sous anesthésie profonde. Les souris qui servent à produire les cohortes sont tuées à la fin de leur période de reproduction, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent pas être réutilisées du fait de leurs modifications génétiques.
Objectifs
Le sepsis est un syndrome clinique fréquent et potentiellement mortel provoqué par un dérèglement de la réponse à l'infection. Au diagnostic, une altération de l’état de vigilance également appelé encéphalopathie associée au sepsis (EAS), est fortement associé au risque de mortalité. En outre, les troubles cognitifs à long terme sont l'une des séquelles majeures observées chez les survivants du sepsis, entraînant une réduction substantielle de la qualité de vie et une augmentation des coûts de santé. En effet, malgré une amélioration substantielle de la survie hospitalière des patients présentant un sepsis ou un choc septique, le suivi à long terme des patients révèle que 30 à 50 pourcents des survivants auront des altérations cognitives un an après la sortie de réanimation avec un retentissement significatif sur le retour à l’emploi, les activités de la vie quotidienne et la qualité de vie. Ces altérations persistantes ont donc un impact sociétale majeur. Cependant, l'association mécanistique entre les infections systémiques sévères, l’EAS et l’accélération du déclin cognitif n'est pas encore claire. L’hyperperméabilité de la barrière hémato encéphalique est une des voies biologiques les plus probablement impliqué dans cette dysfonction cérébrale aigue et chronique précipitant potentiellement l’apparition de démences neurodégénératives. Une meilleure compréhension des mécanismes responsables de ces déficits pourrait influencer la prise en charge et le pronostic des patients atteints de sepsis. Ce projet se déroule sur deux établissements afin de disposer d'équipement d'imagerie adapté à la question scientifique.
Bénéfices attendus
Dans l’ensemble, ce projet vise à mieux comprendre le rôle de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique dans la physiopathologie des troubles neurologiques aigue et neurodégénératifs associés au sepsis, dans le but de développer et d’évaluer des approches innovantes d’immunothérapie pouvant modifier l’évolution naturelle de la maladie ainsi que des biomarqueurs immunitaires sanguins à valeur diagnostique et/ou pronostique. Les données actuelles suggèrent que la barrière hémato encéphalique (BHE) est l’élément clé qui intègre les signaux du cerveau et de la périphérie au cours du sepsis. Une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologique de l’interface entre le compartiment sanguin systémique et le système nerveux central pourrait influencer la prise en charge thérapeutique et le pronostic des patients atteints de sepsis.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale permettant d’induire le modèle de sepsis sous anesthésie générale et analgésie pré et post-opératoire associé à un traitement antibiotique (15-20 minutes/animal, 1 fois) dans un premier établissement. Par la suite, les animaux seront transférés dans un second établissement et impliqués dans un examen d’imagerie effectuée sous anesthésie générale avec injection d’un radiotraceur (30 min d'anesthésie au total). A l’issue de ces étapes les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire.
Impact sur les animaux
Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). Concernant la procédure chirurgicale elle-même, la phase post-opératoire précoce est à risque de manifestations correspondant à un syndrome douloureux lié à l’acte technique par lui-même : posture voutée, fourrure sale, décharge oculaire. Concernant le modèle de sepsis, il peut potentiellement engendrer des symptômes d’inconfort et des modifications du comportement en situation de pathologie. Ce « comportement maladie » est un ensemble coordonné de changements de comportement adaptatifs qui se développent chez les animaux malades au cours d'une infection ou d’un état inflammatoire non septique. Au cours des 24 premières heures suivant l’induction d’un sepsis les animaux présentent habituellement une réduction de leur mouvement exploratoire, une réduction globale d’activité et ont habituellement le poil hérissé. Certains animaux présentent des diarrhées liquidiennes associée à ce syndrome inflammatoire. Ces symptômes régressent progressivement au-delà de 24 à 48 heures. La réalisation de l’imagerie cérébrale se fait sous anesthésie générale profonde pour éviter tout mouvement qui générait l’acquisition d’image. Cette anesthésie présente un risque de stress thermique et d’arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
Les souris impliquées dans la production des cohortes seront euthanasiées à la fin de la période de reproductive et ne pourront être réutilisés du fait de leurs modifications génétiques. Les souris analysées dans le cadre de ce projet seront euthanasiées à la fin des actes in vivo et l’ensemble des tissus récupérés pour les différentes analyses afin de répondre à la question scientifique.
Remplacement
Un organisme vivant intégré est nécessaire pour étudier les anomalies de fonctionnement de la barrière hémato-encéphalique lors des phases d’encéphalopathie aigue et de dégénérescence cognitive retardée associés au sepsis. A l’heure actuelle il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu lors d’une réaction inflammatoire du système nerveux central et systémique. L’exploration de conséquences à long terme nécessite par ailleurs un suivi longitudinal individuel des animaux, qu’il n’est pas possible de modéliser in silico.
Réduction
Nous utiliserons un maximum de 200 animaux sur la durée du projet. La standardisation des procédures expérimentales et des conditions d’hébergement des animaux est une préoccupation majeure pour limiter les facteurs de biais expérimentaux et limiter le nombre d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives. Les procédures expérimentales ont été affinées pour limiter au maximum l'utilisation des souris : - Les modèles de choc septique utilisés sont ceux dont la reproductibilité est la plus élevée - Chaque expérience sera dessinée pour favoriser la comparaison entre deux groupes de manière à conserver une puissance statistique suffisante pour un faible effectif d’animaux. - Les organes prélevés feront l’objet des multiples analyses. - Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. - Les animaux utilisés proviennent de lignées consanguines avec un fond génétique contrôlé afin de limiter la variation expérimentale et donc le nombre d’animaux. A noter qu’il est possible que la méthode d’imagerie utilisée ne mette en évidence aucun signal pathologique. Aussi, s’il s’avère que notre hypothèse de travail est erronée et qu’aucun résultat pertinent n’est mis en évidence après 2 séries de 20 animaux l’étude sera suspendu avant d’atteindre le nombre maximal d’animaux.
Raffinement
Les procédures de ce projet ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats, tout en respectant le bien-être animal, et en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau à volonté. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maisons de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, soins, suivi). La principale contrainte concerne la chirurgie mise en œuvre pour induire le modèle sepsis. Une attention particulière sera portée à cette étape sensible du projet : anesthésie locale/générale, analgésie, asepsie, plateau chauffant, soins pré- et post-opératoires. Les animaux disposent d’une litière douce en postopératoire, associée à de la nourriture molle pour faciliter la récupération et la réhydratation. Pour le transport entre les deux établissements, celui-ci sera effectuée dans une boite de transport filtrée adapté au modèle animal et contenant de l’eau, de l’aliment et de l’enrichissement pour limiter le stress lié à cette étape. Enfin, l’imagerie sera effectuée sous anesthésie profonde contrôlé avec maintien de la température pour réduire le stress thermique associé à l’anesthésie générale. Afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins), et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : La souris Mus musculus musculus est l’espèce de choix pour notre protocole expérimental pour de multiples raisons : - Grande conservation des mécanismes de l’immunité innée et adaptative entre les mammifères. - Espèce largement caractérisée et validée pour l’étude des réponses immunitaires. - Espèce chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux de sepsis et de pathologies neurodégénératives étudiées dans ce projet. - Expérience des investigateurs en expérimentation animale sur modèle murin. - Plateforme d’imagerie du petit animal adaptée aux modèles murins. Nous utiliserons plusieurs modèles transgéniques développant des déficits cognitifs (modèles de Maladie d’Alzheimer). Justification des stades de développement : Nous utiliserons uniquement des animaux adultes. L’induction du sepsis aura lieu à 6 mois (précoce) ou 12 mois (tardif). L’âge de 6 mois, correspond sur le plan immunologique à une phase de stabilité immunitaire qui reste asymptomatique (pas encore de déclin cognitif marqué). L’âge de 12 mois, correspond à un stade bien plus avancé de pathologie neurodégénérative associé à une phase de vieillissement immunitaire. Ce stade sera étudié dans un second temps et permettra d’évaluer la perméabilité de la barrière hémato encéphalique (BHE) à un stade de démence établie.