Procédures sévères

Greffe d'une tumeur dans le cerveau, jusqu'à 51 séances d'imagerie, 28 prélèvements de sang, 56 injections, 8 ouvertures de la barrière hémato-encéphalique, une résection tumorale et de la radiothérapie : un même animal peut subir tout cela. 3 510 souris et 705 rats vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère pour 3 015 d'entre eux et modéré pour 1 200. Le porteur décrit pourtant un hébergement assurant "une qualité de vie optimale tout au long de l'étude", chez des animaux immunodéficients dont la tumeur cérébrale provoque des troubles neurologiques et des difficultés de déplacement. Tous sont tués à un temps défini ou dès l'atteinte des points limites, pour des prélèvements post mortem, certains ayant été transportés vivants entre deux établissements pour accéder aux appareils d'imagerie.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales primitives et en particulier les glioblastomes sont des cancers très résistants aux traitements anti-tumoraux conventionnels (chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie cytotoxique). En effet, la survie globale médiane des patients est comprise entre 12 et 24 mois. De nouveaux traitements sont donc indispensables pour améliorer le pronostic des patients souffrant de glioblastome. Les traitements candidats sont évalués dans le cadre d’essais cliniques longs et coûteux, et le plus souvent négatifs, avant leur approbation pour une utilisation en pratique clinique chez les patients. Compte tenu du nombre important de traitements candidats, notre projet vise l’accélération de l’évaluation de ces traitements innovants candidats et leur hiérarchisation en vue d’essais cliniques chez l’Homme. En effet, une évaluation préclinique rigoureuse permet de réduire le taux d’attrition des essais cliniques. (MODIFICATION) Le projet nécessite une modification sans augmentation du nombre d'animaux car le projet se déroulera dans deux établissements en raison de la nécessité d'utiliser des appareils d'imagerie spécifiques disponibles seulement dans le second établissement.

Bénéfices attendus

Les gliomes et en particulier les glioblastomes (GBM) sont les cancers cérébraux les plus fréquents et les plus graves chez l’adulte. Le pronostic des patients souffrant de glioblastome est réservé (12-24 mois de survie médiane) malgré des traitements lourds. De nouveaux traitements sont donc nécessaires. Le projet présenté ici vise donc à évaluer de nouvelles thérapies dans un contexte le plus biologiquement pertinent grâce à nos modèles de glioblastome qui sont en quelque sorte des avatars de patients atteint de cette maladie. Ultimement, nous visons à identifier de nouveaux traitements actifs contre le glioblastome qui pourront être évalués dans le cadre d'études cliniques chez l'homme.

Procédures

Les animaux auront tous une greffe tumorale cérébrale (30minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) ou une greffe tumorale cutanée (1minute, 1x, animal anesthésié). Tous les animaux auront un suivi par prélèvement sanguin (2minutes, 28x maximum, animal vigile ou anesthésié et analgésié si l'animal est en fin de procédure) et certains par imagerie également (5minutes à 4h, 51x maximum, animal anesthésié). (MODIFICATION) Certaines imageries nécessiteront un transfert d'un établissement à un autre (transfert de 10 minutes, 1 fois, animal vigile). Une partie des animaux auront également des traitements administrés par injections simples (1min, 56x maximum, animal vigile) ou par injections nécessitant une chirurgie (30min maximum, 1x, animal anesthésié et analgésié). Les administrations pourront être couplées à une ouverture de la barrière hémato encéphalique (pour que le traitement atteigne le cerveau) (1h maximum, 8x, animal anesthésié) ou à une résection tumorale (30 minutes, 1x, animal anesthésié et analgésié) et;ou à de la radiothérapie (10 minutes, 1 fois, animal anesthésié).

Impact sur les animaux

La greffe de cellule tumorale induit une croissance tumorale qui peut donner des troubles neurologiques ou des difficultés de déplacement. Les chirurgies pourront engendrer une douleur modérée post opératoire ainsi que des risques d’infection. Les anesthésies peuvent engendrer une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse respiratoire. Les traitements pourront avoir des effets secondaires comme des diarrhées ou des inflammations aux sites d’injection engendrant une perte de poids. Les piqûres peuvent induire une douleur légère de courte durée au point d’injection. Les prélèvements sanguins pourraient induire une douleur légère de courte durée ainsi qu’un hématome. Les imageries pourront induire un léger stress chez les animaux. (MODIFICATION) Certaines imageries devront être réalisées dans un autre établissement, les animaux pourront ressentir un stress lié au transport entre les deux établissements et aux changements d'environnement. Le phénotype dommageable des animaux immunodéficients ou immunodéprimés induit une sensibilité accrue aux infections.

Devenir

Pour toutes les procédures, tous les animaux sont euthanasiés à un temps défini (ie quelques jours/heures post traitement etc) ou dès qu’ils atteignent les points limites décrits afin de faire des prélèvements post mortem.

Remplacement

Chez l’Homme, les tumeurs cérébrales sont des tumeurs complexes. Il existe, en plus des cellules tumorales, un microenvironnement qui joue un rôle clé dans le comportement spontané ou sous traitement des cellules tumorales. Ce microenvironnement est lui-même dépendant du macroenvironnement c'est-à-dire de l’organisme hôte. Il est impossible de reconstituer ce contexte (microenvironnement et macroenvironnement) interagissant avec les cellules tumorales in vitro ; que ce soit par le biais de cultures de cellules tumorales issues de patients ou bien de culture 2D ou encore 3D. Ces approches in vitro sont réalisées en amont des procédures in vivo pour justifier l'intérêt scientifique. De plus, cet environnement module la biodisponibilité d’une molécule thérapeutique au sein de la tumeur. Aussi, positionner les cellules tumorales cérébrales chez l’animal, dans un microenvironnement tissulaire et moléculaire complexe (cérébral) constitue un modèle d’étude pertinent. Ce dernier se rapproche au maximum des conditions observées chez les patients souffrant de tumeur cérébrale et chez qui les cellules cancéreuses prolifèrent dans du tissu nerveux central complexe.

Réduction

4215 animaux seront utilisés dans ce projet. Les efforts fournis afin de réduire le nombre d'animaux utilisés sont: i) Seuls les composés efficaces in vitro par rapport aux traitements standards, seront testés in vivo. ii) Les cellules tumorales cérébrales greffées chez l’animal sont visibles par fluorescence ce qui permet de suivre le développement tumoral, cela évite l'euthanasie à différents temps et réduit donc le nombre d’animaux utilisé (iii) La fluorescence des tumeurs permet également de suivre l’efficacité des traitements testés en temps réel ce qui apporte une information supplémentaire à la survie. (iv) Une étude statistique détermine le nombre d’animaux nécessaire minimum pour atteindre un niveau de significativité acceptable. Cela permet de limiter le nombre d’animaux et d’éviter les études ne permettant pas de répondre à une question posée par manque de puissance statistique.

Raffinement

Durant toute la durée de leur vie, les animaux sont logés en groupe afin de favoriser leur bien-être social, l’isolement étant évité autant que possible. Cette approche groupée est cruciale, car les souris, comme de nombreux rongeurs, sont des animaux sociaux et leur isolement peut entrainer un stress psychologique et des comportements anormaux. Elles sont hébergées sur des portoirs ventilés, qui permettent une circulation d'air optimale et un environnement propre. Chaque cage est équipée d’un système d'abreuvement automatique garantissant un accès constant à l’eau et d’un approvisionnement ad libitum en nourriture, ce qui répond à leurs besoins nutritionnels et hydriques tout en permettant une gestion optimale des ressources. Le milieu de vie est enrichi avec au moins deux éléments, tels que des objets manipulables ou des matériaux permettant d'explorer et de satisfaire les comportements naturels des souris, comme le grattage, le fouissage ou la nidification. Cet enrichissement environnemental est essentiel pour prévenir l’apparition de comportements stéréotypés liés à l'ennui ou au stress et pour assurer une qualité de vie optimale tout au long de l’étude. Les animaux sont suivis quotidiennement par des vétérinaires et du personnel qualifié. Lors de procédures susceptibles de provoquer des douleurs modérées à sévères, comme des interventions chirurgicales, les animaux reçoivent une anesthésie générale appropriée et en complément, un analgésique leur est administré en préopératoire et postopératoire pour prévenir toute douleur et minimiser l'inflammation. Pour prévenir les risques d'infections des souris immunodéprimées, les animaux sont hébergés dans des cages propres avec litière, aliment et enrichissement irradiés ainsi que de l'eau osmosée pour boisson. Les injections seront toujours réduite au minimum suivant le composé testé (fréquence et volume), l'alternance des sites sera privilégiée quand cela est possible et les animaux seront anesthésiés si nécessaire pour leur bien être. Un système de points limites est mis en place pour évaluer leur bien-être et détecter rapidement tout signe de souffrance ou d’inconfort, tant à court qu'à long terme. Ces points limites prennent en compte des critères variés : l’observation du comportement, l'aspect général de l’animal, son niveau d'activité, ainsi que son poids corporel. Si un animal présente des signes de détresse, des mesures immédiates sont prises pour garantir son confort et sa santé.

Choix des espèces

Les souris sont choisies dans nos études thérapeutiques en raison de leur petite taille et de leur poids faible. Cette caractéristique permet l’utilisation de quantités réduites de composés cytotoxiques. De plus, ces modèles permettent l’utilisation de volumes expérimentaux limités, facilitant ainsi les études tout en respectant les principes de réduction des animaux dans la recherche. Les souches de rongeurs telles que les souris immunodéficientes sont particulièrement utiles pour leur incapacité à rejeter les cellules tumorales humaines. En parallèle, les souches immunocompétentes sont indispensables pour étudier la croissance tumorale dans un contexte immunologique complet. Les modèles animaux immunodéprimés sont utiles pour explorer l’impact d’un système immunitaire humanisé dans les réponses thérapeutiques contre les cancers. Enfin, les rats, sont choisis ici pour des scénarios nécessitant une plus grande précision chirurgicale. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte entre 8 semaines et 15 mois car le glioblastome est une tumeur de l’adulte chez l’Homme.

Soumis à une cryolésion du cœur ou à l'amputation de leurs nageoires, 1 704 poissons zèbres vont subir des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, auxquels s'ajoutent 888 poissons génotypés par prélèvement de quelques millimètres de nageoire caudale, soit 2 592 individus en tout. Tous sont tués pour que leur cœur, leurs nageoires et d'autres tissus soient prélevés. L'objectif déclaré est d'identifier les programmes de cellules T qui stimulent ou freinent la régénération des organes, le poisson zèbre reformant son cœur là où les mammifères produisent une cicatrice définitive. Le porteur limite les effets indésirables aux douze premières heures, tout en décrivant des poissons anxieux ou résignés qui cessent de s'alimenter, et d'autres à la nage erratique qui "meurent généralement en quelques heures" et sont alors tués.

Objectifs

Les mammifères, y compris les humains, sont généralement incapables de régénérer leurs organes, ce qui constitue un obstacle aux nouvelles stratégies thérapeutiques pour plusieurs événements traumatiques et maladies dégénératives (infarctus du myocarde, ostéoporose, fracture osseuse, entre autres). Cette incapacité à se régénérer contribue à une diminution à long terme de la fonction des organes et à une augmentation de la morbidité, et devient particulièrement importante dans les populations âgées. Après un infarctus du myocarde, par exemple, le tissu mort est remplacé en permanence par du tissu cicatriciel, ce qui diminue la fonction cardiaque. D'autres maladies dégénératives, comme l'ostéoporose, qui est de plus en plus répandue dans les populations âgées et qui est associée à des conditions pro-inflammatoires, diminuent également la qualité de vie et constituent un fardeau important pour la santé. Contrairement aux mammifères, le poisson zèbre peut régénérer entièrement ses organes, y compris le cœur et la nageoire, et retrouver leur fonction. Alors que la régénération du cœur implique la formation d'un tissu cicatriciel transitoire qui se résorbe avec la formation de nouveaux muscles, la régénération de la nageoire ne s'accompagne d'aucune formation de tissu cicatriciel.

Bénéfices attendus

Ce projet propose d'identifier les programmes de cellules T qui stimulent la régénération des organes et ceux qui l'inhibent. Cela permettra d'identifier des stratégies immunomodulatrices pour stimuler la régénération des tissus tout en minimisant les dommages causés aux tissus après une blessure.

Procédures

Un nombre de 1776 animaux seront soumis au génotypage, où quelques millimètres de la nageoire caudale seront prélevés sous anesthésie pour extraire l'ADN génomique et identifier les individus porteurs des mutations souhaitées. Parmi ceux-ci, certains individus (888) seront soumis à une cryoblessure cardiaque pour étudier le processus de régénération et la réponse immunitaire correspondante. L'intervention elle-même dure environ 2 minutes. Le processus de régénération sera suivi pendant les 7 à 14 premiers jours, avec un petit nombre d'animaux (48) suivis jusqu'aux stades de régénération tardive et complète. Le 888 animaux restants (le nombre équivalent d'animaux hétérozygotes) sera seulement génotypé et ne sera pas soumis à la cryoblessure ou à tout autre traitement. Un nombre de 816 animaux seront soumis à une amputation des nageoires. La procédure prend quelques secondes et le processus de régénération sera suivi jusqu'à 14 jours. Les autres interventions légères comprennent l'imagerie en direct (jusqu'à 10 minutes), la coloration des os en direct (15 minutes) et l'incorporation d'EdU par injection (quelques secondes pour la procédure ; 24 heures jusqu'à l'analyse). En résumé, 888 poissons seront soumis à des traitements considérés comme modérés (génotypage uniquement) et 1704 seront soumis à des traitements considérés comme sévères, notamment des cryolésions (888) ou une amputation des nageoires (816).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indesirables chez le poisson concerné : - La cryoblessure pour étudier la régénération cardiaque. Les effets indésirables potentiels surviennent généralement dans les 12 premières heures suivant la blessure. Il s'agit notamment de l'hyperventilation et de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Occasionnellement, un petit nombre d'animaux peut présenter une nage erratique (c'est-à-dire des poussées de nage verticale) immédiatement après l'opération. Ces animaux meurent généralement en quelques heures et sont donc immédiatement euthanasiés lorsque ce comportement est observé.

Devenir

Tous les poissons utilisés dans cette étude seront euthanasiés après la dernière intervention, car nous devons prélever le cœur ou la nageoire caudale (et d'autres tissus) pour étudier/évaluer les cellules et les composants moléculaires (réponse immunitaire et marqueurs de régénération), ce qui nécessite de prélever du tissu pour un traitement ultérieur après l'euthanasie du poisson.

Remplacement

Dans le cadre de ce protocole, nous prévoyons d'étudier la réponse immunitaire et la capacité de régénération, en utilisant une combinaison de plusieurs outils transgéniques. Ces outils génétiques, ainsi que le pouvoir exploratoire du modèle du poisson zèbre, le rendent unique pour ces processus de manière intégrée chez les mêmes individus. En raison de la nature systémique et physiologique de la réponse régénérative, ainsi que de la réponse immunitaire, des modèles plus simples tels que les systèmes in vitro et organoïdes sont incapables de répondre aux questions scientifiques de ce projet.

Réduction

Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe et de la durée des protocoles, des groupes de 6 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction).

Raffinement

Les procédures seront réalisées dans le respect du bien être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% conduira à l'arrêt du protocole expérimental (principe de raffinement).

Choix des espèces

Le poisson zèbre, ou Danio rerio, est génétiquement modifiable, ce qui permet de réaliser des études à grande échelle de même portée plus rapidement et à un coût bien moindre qu'avec les rongeurs. En outre, les approches invasives, un grand nombre d'événements biologiques peuvent être quantifiés par des approches non invasives, y compris l'imagerie en direct. Aujourd'hui, un très grand nombre de lignées transgéniques et mutantes ont été générées et sont à la disposition de la communauté scientifique, apportant des réponses à des questions biomédicales réelles et pertinentes. En tant que laboratoire académique, nous avons facilement accès à un grand nombre de lignées transgéniques (peu coûteuses). Le poisson zèbre est également un modèle pertinent pour l'étude des dysfonctionnements liés à l'âge, et récapitule de manière similaire aux rongeurs les processus physiopathologiques du vieillissement observés chez l'homme.

683 souris vont être utilisées, 400 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 283 un niveau modéré, toutes tuées pour l'analyse de leurs tissus. Une partie porte une mutation qui provoque une scoliose, une cyphose, une atrophie musculaire et une durée de vie raccourcie. Chaque semaine pendant neuf semaines, elles reçoivent une injection dans l'orbite de l'œil sous anesthésie, sont retournées sur le dos une minute pour le test de posture, et passent jusqu'à vingt-deux heures seules en cage pour la mesure de leur activité locomotrice, avant une mesure de force sous anesthésie profonde. Le porteur écrit qu'aucune méthode alternative n'évalue ces peptides sur "l'organisme entier" et que l'évaluation in vivo est un "prérequis indispensable" avant toute application clinique.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer la toxicité et l'efficacité de peptides thérapeutiques dans le traitement des myopathies centronucléaires et de la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT). En effet, aucun traitement curatif n'est disponible sur le marché actuellement pour ces deux maladies qui sont fortement invalidantes. Les myopathies centronucléaires sont des maladies génétiques rares qui affectent notamment la fonction des muscles squelettiques qui se caractérise par une faiblesse musculaire généralisée. Selon les formes graves, les symptômes apparaissent dès la naissance, mais peuvent se développer à tout moment de la vie avec une espérance de vie drastiquement réduite. La CMT est une maladie génétique qui affecte les nerfs périphériques et qui se manifeste par une faiblesse musculaire progressive avec des premiers symptômes pouvant apparaitre au cours de l’enfance.

Bénéfices attendus

Nous espérons identifier un ou plusieurs peptides thérapeutiques efficaces et non toxiques dans nos modèles murins qui constituerai(en)t alors une piste thérapeutique pour les patients atteints de la maladie de Charcot-Marie-Tooth ou d'une myopathie centronucléaire.

Procédures

Une injection rétro-orbitale d’une durée maximale de 30 secondes sous anesthésie sera réalisée une fois par semaine pendant 9 semaines. Un anesthésique local sera déposée sur l'oeil, 2 minutes avant l'injection. Des prélèvements sanguins seront réalisés à 3 semaines d'âge, 8 semaines d'âge et avant la mise à mort. Les prélèvements sanguins seront compensés par une injection équivalente de sérum physiologique. Des tests de comportement peu invasifs qui permettront d’évaluer les performances et capacités motrices de l’animal (activité locomotrice, posture) seront réalisés une fois par semaine chez l’animal vivant à partir de 3 semaines jusqu’à l’âge de 17 semaines maximum. Le test de posture sera réalisé une fois par semaine, avec un temps de repos minimal de 10 minutes entre chaque essai, pour une durée maximale d’une minute par essai. L’activité locomotrice spontanée de l’animal sera acquise pendant 22h au maximum, période au cours de laquelle les animaux seront hébergés individuellement, sans toutefois subir un isolement sensoriel (pas d'isolement olfactif, ni auditif). Un à deux prélèvements de sang (sur animal vigile) seront réalisés sur 180 animaux. La production de force sera mesurée sur une durée maximale de 30 minutes et les souris recevront une anesthésie profonde et un anti-douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes.

Impact sur les animaux

Une partie des animaux sont porteurs de la mutation qui entraine une perte de poids, une scoliose et une cyphose, une atrophie musculaire, une faiblesse musculaire et une durée de vie réduite par rapport à des animaux contrôles. Pour ces animaux, seuls les mâles sont affectés. L’injection rétro-orbitale et les prélèvements sanguins seront à l’origine d’une douleur légère au point de piqûre et la contention manuelle de l’animal génèrera un stress léger/inconfort. Le test d’activité locomotrice nécessite un isolement pendant 22 heures ce qui peut provoquer un stress chez l’animal, cependant il ne s'agit pas d'un isolement sensoriel (pas d'isolement olfactif, ni auditif). Le test de posture entraine un stress lors du retournement de l’animal pendant une minute maximum. Une anesthésie profonde d’un anesthésique et d’un anti-douleur sera à l’origine d’une douleur légère au point de piqûre et la contention manuelle de l’animal génèrera un stress léger/inconfort.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de collecter les tissus pour réaliser des analyses moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique des peptides pour les myopathies centronucléaires et la maladie de Charcot-Marie-Tooth, le modèle murin est privilégié. L’efficacité ainsi que la toxicité des peptides candidats ont déjà été évaluées sur différents types de cellules. L’utilisation d’un modèle cellulaire permet d'avoir une première idée de l'efficacité mais ne permet pas d’évaluer les effets sur la contractilité du muscle, ni d’évaluer les effets sur l’ensemble de l’organisme. La nécessité de pouvoir réaliser des mesures de force repose sur l’importance d’évaluer la faiblesse musculaire, caractéristique clinique principale des myopathies centronucléaires et de la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Ces mesures de force sont également impossibles à réaliser sur fibres musculaires de biopsies humaines compte tenu de la rareté de ces maladies et des limites liées à l’analyse des biopsies musculaires chez l’Homme. L’utilisation d’un modèle animal est donc primordiale. D’autre part, il n’existe pas de méthode alternative qui permette d’évaluer l’efficacité de ces peptides sur l’organisme entier et dans des conditions in vivo. Dans ce contexte, il convient de signaler que l’évaluation in vivo de potentielles thérapies est un prérequis indispensable avant toute application clinique.

Réduction

Uniquement les peptides démontrant une faible toxicité et une efficacité sur cellule seront testés sur modèles animaux. La toxicité sera ensuite déterminée sur un faible nombre de souris saines et uniquement les candidats faiblement ou non toxiques seront utilisés sur un plus grand nombre d’animaux pour une preuve d’efficacité. Cela limitera significativement le nombre d’animaux nécessaires à l’ensemble de l’étude. Les travaux antérieurs ont démontré qu’un échantillon de 15 animaux par groupe est requis pour garantir la fiabilité des tests statistiques, qui consisteront à comparer les différents groupes d’animaux et les différents traitements entre eux.

Raffinement

Les nouveau-nés seront hébergés avec leurs parents jusqu’au sevrage. L’analyse de la capacité à se retourner et à se mouvoir, la couleur de la peau, la présence d'une poche de lait seront évalués chez le nouveau-né tous les 2 à 3 jours. A partir du sevrage, les animaux seront hébergés en groupe. Le milieu sera enrichi avec des nids et des tunnels. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés 2 à 3 fois par semaine. Dès lors qu’une perte de poids sera notée, les animaux seront pesés quotidiennement. Si des difficultés de locomotion apparaissent, de la nourriture gélifiée sera placé dans la cage. La plupart des expérimentations seront réalisées à l’aide de tests permettant une exploration peu invasive de la fonction musculaire dans des conditions physiologiques in vivo ce qui limite le développement de la douleur. Afin de diminuer le stress lié aux différents tests, une session de familiarisation sera effectuée pour chaque test avant le début du suivi. Pour les mesures de force in situ, l’animal sera anesthésié par injection intrapéritonéale d’un mélange de produits anesthésiants induisant une anesthésie profonde et analgésiants permettant d’éliminer le stress et la douleur liés à la procédure. L’animal sera placé sur une plaque chauffante tout au long de la procédure afin de maintenir la température corporelle à sa valeur basale. Un contrôle visuel de la respiration sera effectué.

Choix des espèces

Les modèles murins utilisés reproduisent les différentes formes de la pathologie humaine en termes de mutation, de gène muté et de sévérité clinique. Dans cette étude, deux modèles seront étudiés. Un modèle qui développe des symptômes sévères de myopathie à partir de 4 semaines après la naissance avec une étude de 3 à 9 semaines. Un deuxième modèle vers 8 semaines d’âge, avec des animaux qui présentent des symptômes légers et une étude de 8 à 17 semaines. Si le traitement améliore le phénotype, les animaux générés développeront moins ou pas de symptômes.

Les souris utilisées sont immunodéprimées et humanisées entre un et trois jours de vie, pour qu'elles acceptent des cellules immunitaires humaines sans les rejeter. Elles sont 24, dont 16 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes seront tuées. Le protocole leur ligature et perfore le cæcum sous anesthésie pour déclencher un choc septique, dont le porteur indique qu'il conduit à la mort de la souris en vingt-quatre heures, le critère mesuré étant justement la survie en heures. Le projet est présenté comme exploratoire, destiné à produire les données préliminaires nécessaires au calcul d'effectif d'un protocole ultérieur : le bénéfice thérapeutique reste une hypothèse à moyen terme.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier l’efficacité pré-clinique de l’injection d’un médicament cellulaire de thérapie innovante sur la modulation du choc septique par le suivi clinique (la survie, en heure, après induction d’un choc septique), et l’analyse histologique et biologique post-mortem des dommages tissulaires. La transplantation repose sur l'utilisation de cellules immunitaires, produites selon des normes médicales. L'idée est que ces cellules aident à controler l'inflammation et à réguler le système himunitaires pendant le choc septique. Le projet nécessite l’utilisation de souris immunodéprimées, humanisées, capables d’accepter ces cellules immunitaires humaines.

Bénéfices attendus

A ce jour, aucun modèle in vitro (2 ou 3 dimensions) ni in silico ne permet de reproduire le choc septique et donc de tester de nouvelles thérapeutiques. Ainsi, le bénéfice attendu à moyen terme de ce projet exploratoire sera de faire la preuve de concept de l'utilisation des cellules immunitaires humaines dans le contexte du choc septique. Ce projet permettra : 1/ De confirmer chez l'animal l'efficacité du produit de thérapie cellulaire. 2/ Développer une étude expérimentale confirmant ce projet exploratoire pour utiliser à terme les cellules immunitaires humaines comme nouveau produit de thérapie cellulaire dans le traitement du choc septique.

Procédures

-Une injection de cellules humaines issues de donneurs sains (injection en 5 secondes) -Un prélèvement sanguin au niveau de la veine caudale entre 8 et 12 semaines de vie pour vérifier la prise de greffe (prélèvement de 5 secondes) -Une anesthésie générale gazeuse associée à l'opération provoquant le choc septique (LCP), d’un prélèvement de sang de faible volume à la veine de la queue , suivi d’une injection intraveineuse de cellules immunitaires humaines ou de sérum physiologique (15 minutes en tout sous anesthésie).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont: 1/La piqûre d'aiguille pour l’injection et le prélèvement qui entraîne une douleur légère de courte durée. 2/L'induction d'un choc septique qui conduit à un stress, ainsi qu'une diminution de l’activité, une perte de poids, et la mort de la souris en 24H.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort pour confirmer les données cliniques.

Remplacement

Les connaissances sur le mécanisme d'action des cellules thérapeutiques myéloïdes suppressives humaines ont été caractérisées dans un premier temps in vitro. Toutefois, pour proposer ces cellules comme médicament de thérapie innovante chez l'Homme, une étude pré- clinique robuste dans un modèle murin est indispensable. En effet, dans le choc septique (pathologie multi-organes) aucun modèle "in silico" ou "in vitro’ en laboratoire n'est à ce jour disponible pour évaluer l'impact d'une thérapie cellulaire, ainsi le seul modèle validé est le modèle murin.

Réduction

Ce projet étant exploratoire et vise donc à poduire des données préliminaires nécéssaires au calcul du nombre de souris dans un prochain protocole expérimental, le nombre de souris a donc été réduit au minimum à 8 par groupe. Afin d’écarter un éventuel effet sexe, mâles et femelles seront utilisés.

Raffinement

Les souris seront hébergées et expérimentées dans un secteur exempt d'organismes pathogènes et opportunistes spécifiques adapté aux animaux en déficience du système immunitaire (portoir ventilé, cages avec capot et filtre, nourriture irradiée, eau de boisson autoclavée), avec tous les éléments d’enrichissement nécessaires au bien-être et à la nidification (autoclavés). Une prise en charge de la douleur est prévue par administration régulière d’antalgique. Leur état clinique sera surveillé quotidiennement et un score d’évaluation sera utilisé. Les points limites sont clairement définis, conduisant à un arbre décisionnel pour l'arrêt anticipé de la souffrance.

Choix des espèces

La souris immunodéprimée est en élevage à l’animalerie centrale. Elle permet l’élaboration d’un modèle humanisé avec développement de cellules sanguines humaines, car cette souris immunodéprimée ne rejette pas les cellules humaines. La ligature perforation du caceum reste à ce jour, la meilleure procédure pour tester in vitro le choc septique. Ainsi l'utilisation d'un modèle murin de NSG humanisé de choc septique permettra de tester l’efficacité de cellules immunitaires humaines comme nouveau produit de thérapie cellulaire. Les souris seront humanisées entre 1 et 3 jours de vie puis un choc septique sera induit chez les souris entre 8 à 12 semaines après vérification de la prise de greffe à partir d'une goutte de sang prélevée au niveau de la veine de la queue de la souris et analyse en cytométrie en flux. Ces critères permettent de garantir une prise de greffe de cellules sanguines humaines dans > 90% des cas, et sont en accord avec la littérature. Le choc septique sera induit chez les souris humanisées âgées entre 8 à 12 semaines de vie.

Injectées de cellules tumorales pour 9 704 d'entre elles, puis traitées par une injection quotidienne pendant cinq jours, 9 934 souris vont être utilisées et toutes tuées pour prélever sang et organes. 824 sont anesthésiées deux fois par semaine pendant trente minutes pour un suivi des métastases par imagerie, 3 900 subissent des prélèvements sanguins, et 2 240 reçoivent une seconde injection de cellules tumorales soixante jours après la première. Le porteur écrit avoir écarté tout analgésique parce qu'il pourrait modifier les réponses immunitaires étudiées, et compte sur des points limites pour arrêter les procédures. Toutes les atteintes décrites sont qualifiées de légères et de courte durée, sans que rien n'explique pourquoi 300 souris relèvent d'un niveau de souffrance sévère et 9 634 d'un niveau modéré.

Objectifs

Les cytokines (messagers du système immunitaire) et les thérapies cellulaires ont montré des résultats prometteurs dans le traitement de divers cancers. Cependant, l’efficacité de ces thérapies peut être considérablement influencée par l’environnement chimique extracellulaire (acidité, concentration élevée de certaines molécules, température, …) En effet, l'environnement qui entoure la tumeur est caractérisé par des propriétés chimiques uniques (comme une acidité élevée) qui peuvent avoir un impact sur le fonctionnement des cytokines et des cellules immunitaires. Il a été démontré que l’environnement acide altère l’activité de certaines cytokines et nuit à l’efficacité des thérapies cellulaires. De même, la concentration élevée de certaines molécules dans l’environnement des cellules peuvent moduler la fonction des cellules immunitaires et influencer l’efficacité des immunothérapies. Comprendre comment ces facteurs modulent les messagers du système immunitaire (ou cytokines) et l’activité cellulaire est crucial pour développer des stratégies thérapeutiques plus efficaces. Notre laboratoire se concentre sur l'étude de l'impact de l'environnement chimique extracellulaire sur la fonction de deux cytokines en particulier et sur les thérapies cellulaires. Nous visons à créer de nouvelles variantes de cytokines et de thérapies cellulaires optimisées pour fonctionner dans des microenvironnements spécifiques, caractéristiques des tumeurs, afin d'améliorer leur efficacité thérapeutique. Ainsi, en développant des variantes de cytokines conçues pour fonctionner de manière optimale dans ces microenvironnements spécifiques, nous visons à surmonter les limitations imposées par le microenvironnement tumoral et à améliorer l’efficacité des cytokines et des thérapies cellulaires.

Bénéfices attendus

Cette étude fournira des informations précieuses sur le rôle de l’environnement chimique extracellulaire dans l’efficacité des cytokines et des thérapies cellulaires dans le traitement du cancer. En comprenant d’abord comment les cytokines classiques (normales) sont affectées par le microenvironnement entourant les cellules, nous serons mieux placés pour concevoir et développer des cytokines modifiées qui seront adaptées pour fonctionner de manière optimale dans des microenvironnements spécifiques. Les résultats de cette étude pourraient conduire au développement de nouvelles stratégies visant à améliorer l’efficacité des cytokines et des thérapies cellulaires, bénéficiant ainsi aux patients atteints de cancer. De plus, comprendre l’impact de cet environnement sur la fonction des cellules immunitaires et l’efficacité du traitement contribuera à notre connaissance de l’immunologie tumorale et guidera la conception d’immunothérapies plus efficaces.

Procédures

Après leur arrivée et acclimatation (7 jours), les 9934 souris seront manipulées tous les 2 jours pendant 2 semaines avant le début des procédures pour réduire leur stress et les habituer à la manipulation humaine. Nous évaluerons d'abord la sûreté de nos traitements. Pour cela, 90 souris recevront les traitements à raison d'une injection par jour pendant 5 jours (1 min) puis 1 injection d'indicateur de toxicité sous anesthésie gazeuse (10 min). Ce projet comporte plusieurs parties dont plusieurs étapes sont communes. 9704 souris recevront une injection de cellules tumorales ou métastatiques (1 min). Puis, afin d'étudier les caractéristiques de notre traitement, les 9560 souris recevront ce dernier (ou placebo) par injection à raison d'une injection par jour pendant 5 jours (1 min). Parmi ces animaux, 2240 souris (140 naïfs et 2100 déjà exposées aux cellules tumorales) recevront une nouvelle injection de cellules tumorales 60 jours après la première (1 min). De plus, 824 souris recevront une injection 2 fois par semaine sous anesthésie gazeuse (anesthésie: 30 min) afin de suivre le développement des métastases par imagerie. Des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse seront réalisés sur 3900 souris (3520 prélèvements uniques + 380 prélèvements 1 fois par semaine jusqu'à la fin du protocole, 3 min) En parallèle, l'ensemble de ces souris seront testées pour différents paramètres afin d'évaluer le mode de fonctionnement et l'efficacité de nos traitements. Test 1 : 1820 souris recevront 2 injections de traitement ou placebo à 3 jours d'intervalle (30 sec) Test 2 : 390 souris recevront le traitement ou placebo soit par injection 1 fois par jour pendant 11 jours soit par 1 injection tous les 3 jours jusqu'à la fin de l'expérience (30 sec) Test 3 : 900 souris recevront 2 injections de molécule d'intérêt (ou placebo) à 6 jours d'intervalle et 2700 souris recevront 1 injection de molécule d'intérêt (ou placebo) 2 fois par semaine jusqu'à la fin (30 sec) Test 4 : 50 souris recevront 1 injection d'une molécule permettant d'étudier la tumeur 13 jours après l'injection des cellules (30 sec) Test 5 : 720 souris recevront 1 injection 3 jours avant les traitements puis 2 fois par semaine jusqu'à la fin (30 sec). Test 6 : 160 souris seront irradiées 2 fois à 3h d'intervalle (irradiation: 10 min) puis 13 jours après l'injection des cellules et 1 jour avant le début de nos traitements, 160 animaux recevront 1 injection de cellules immunitaires (1 min)

Impact sur les animaux

Les injections de cellules tumorales entraîneront une douleur et un stress légers de courte durée et conduiront, en fonction du modèle, au développement de tumeurs pouvant entraver la liberté de mouvement des animaux. L'évolution de la pathologie induite (développement tumoral) pourrait causer une perte d'appétit et le cas échéant, une perte de poids. Les thérapeutiques envisagées seront administrées par injection ce qui entraînera une douleur et un stress légers de courte durée mais répétés à chaque administration de traitement. Les prélèvements sanguins seront source de stress pour les animaux lors de la contention et causeront une douleur et un stress légers de courte durée au moment de l'acte qui sera unique ou répété en fonction du modèle étudié.

Devenir

Pour l’ensemble des procédures, les animaux seront mis à mort. En effet, la récupération d’échantillons (sang, organes) est essentielle pour déterminer l’efficacité de nos thérapies.

Remplacement

Dans la mesure du possible, nous menons des études in vitro poussées pour caractériser au mieux l'activité et le profil de sécurité de nos traitements d'intérêt avant de proposer des expériences sur les animaux. Ces études comportent l'évaluation de nos traitements d'intérêt dans différents environnement, leurs effets sur différents types cellulaires et leur absence de toxicité sur les cellules. En tirant parti de ces systèmes utilisant des cellules, nous générons des données précliniques robustes sur les mécanismes d'action, la puissance et les profils de sécurité de nos traitements d'intérêt fournissant ainsi une base scientifique solide pour les études in vivo proposées. Cette approche s'aligne sur le principe de remplacement car nous utilisons avec succès des méthodes sur cellules pour remplacer une partie importante des études sur les animaux qui auraient autrement été nécessaires.

Réduction

Pour chaque test que nous effectuons chez l'animal, nous recueillons un très grand nombre de données et d'informations à travers différents paramètres d'analyse. Cette approche permet d’obtenir un maximum d’informations pour chaque animal réduisant ainsi le nombre total requis d’animaux. Nous avons effectué des analyses statistiques pour déterminer le nombre minimum de souris requis par groupe pour obtenir des résultats robustes sur la base de nos données in vitro et in vivo déjà obtenues et des études publiées utilisant des modèles similaires. Pour l’analyse de nos données, nous prévoyons d'utiliser des méthodes statistiques appropriées pour analyser les différences entre les groupes de traitement. Nous utiliserons également des modèles statistiques afin de procéder au mieux à l’analyse des résultats obtenus.

Raffinement

Nous nous engageons à affiner nos protocoles et nos pratiques pour maximiser le bien-être des animaux et minimiser la souffrance et la détresse. Nos stratégies de raffinement englobent de multiples aspects du soin des animaux. Avant toute procédure, les animaux seront acclimatés un minimum de 7 jours dans leur zone d’hébergement. De plus, des actes d’habituation seront réalisés par les expérimentateurs afin de familiariser les animaux à la manipulation humaine. Tout acte pouvant entraîner souffrance, détresse ou stress sera réalisé sous anesthésie. Notre équipe examine attentivement le potentiel d'inconfort associé à chaque intervention et prend des mesures pour atténuer ces effets. Cela garantit que les animaux ne subissent pas de douleur ou de détresse inutile. Nous travaillerons également en étroite collaboration avec le personnel de l’établissement utilisateur ainsi que la structure de bien-être animal y étant rattachée afin de minimiser la souffrance et la détresse. Cela implique de maintenir des conditions environnementales appropriées et de fournir un espace et des ressources adéquats. L'enrichissement de l'environnement fera partie intégrante de notre programme de soins aux animaux. Des éléments et des structures d'enrichissement seront fournis pour permettre aux souris de présenter des comportements naturels, améliorant ainsi leur bien-être et favorisant des résultats expérimentaux plus pertinents sur le plan biologique. L’utilisation d’analgésiques a été écartée dans ce protocole car ces derniers pourraient moduler les réponses immunitaires étudiées (effets décrits dans la littérature). Pour cela, des points limites stricts et spécifiques pour chaque procédure ont été déterminés et dès l'apparition de l'un d'entre eux, les animaux seront immédiatement mis à mort afin de limiter tout stress ou souffrance.

Choix des espèces

Nous nous sommes concentrés sur le modèle murin qui a l’avantage de présenter des similitudes avec le modèle humain et pour lequel nous disposons d’un large panel d’outils moléculaires pour son étude. Le modèle murin est un modèle de choix pour l’étude du développement tumoral et de la réponse immunitaire. De plus, il s’agit du modèle le plus utilisé dans la communauté scientifique permettant ainsi les échanges internationaux des résultats. Les données disponibles dans la littérature faisant référence aux modèles de cancers que nous utilisons impliquent l'utilisation de souris âgées de 6 à 8 semaines d'âge. De plus, ces modèles sont bien établis au laboratoire, nous souhaitons donc garder les mêmes conditions expérimentales.