Procédures sévères
Etude de la vascularisation au cours de la démyélinisation dans un modèle murin de sclérose en plaques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, 70 d'entre elles dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 30 d'un niveau léger. Une encéphalomyélite auto-immune leur est provoquée par deux administrations sous anesthésie, puis une injection sur animal vigile deux jours plus tard. Les troubles de la marche, de la coordination, la faiblesse musculaire et la perte de poids s'installent en deux semaines et culminent trois à cinq jours. L'objectif reste descriptif, caractériser la chronologie des modulations de la vascularisation cérébrale, et le porteur affirme que ce travail exige l'"organisme entier" parce que les modèles ex vivo ne rendent pas les échanges entre tissu nerveux et cellules immunitaires du sang.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie neurodégénérative chronique du système nerveux central (SNC) caractérisée par une démyélinisation et une dégénérescence axonale. La forme la plus courante de la maladie est la forme récurrente-rémittente (RRMS), dans laquelle des poussées répétées de symptômes neurologiques sont suivies de périodes de récupération partielle ou complète. Les altérations de la structure et de la fonction du système vasculaire jouent un rôle essentiel dans les troubles neurodégénératifs chroniques telle que la sclérose en plaques. Au début de la maladie, la barrière hémato-encéphalique perd son imperméabilité, ce qui permet l'infiltration ultérieure de cellules immunitaires périphériques qui provoquent une démyélinisation neuronale et des dommages axonaux. Des études récentes réalisées en imagerie cérébrale sur des cohortes de patients atteints de SEP ont décrit le remodelage vasculaire pendant la formation et l'évolution des lésions). En particulier, une augmentation du débit sanguin cérébral précède l'apparition des lésions et la démyélinisation. Les mécanismes cellulaires impliqués dans le remodelage vasculaire dans les maladies démyélinisantes n'ont pas encore été entièrement définis. L’objectif de ce projet sera donc de caractériser précisément les modulations de la vascularisation et leur chronologie dans un modèle murin de la SEP, notamment l’étude de l’angiogénèse, la prolifération des cellules endothéliales et vasculaire et l'expression de facteurs d’hypoxie dès l’apparition des premiers symptômes.
Bénéfices attendus
La sclérose en plaque (SEP) est la seconde cause de handicap chez l’adulte jeune en France, elle touche plus de 120 000 personnes en France, et plus de 2 millions dans le monde. Il n’existe présentement aucun traitement curatif pour cette pathologie. Ce projet permettra d'étudier des processus pathologiques et réparateurs dans un modèle murin de Sclérose en plaques dans l'organisme entier et ainsi compléter et valider des mécanismes qui semblent d’intérêt dans la pathologie d’après les études IRM récemment obtenues chez l’homme. Cela pourrait permettre notamment de mieux comprendre le rôle de la vascularisation et sa modulation dans la physiopathologie de la SEP.
Procédures
Les animaux, sous anesthésie générale, recevront deux administrations d’un produit pour la mise en place de notre modèle pathologique et du groupe contrôle (10 minutes maximum). 2 jours après ils recevront une deuxième injection (une fois, durée inférieure à 1 minute par animal, vigile). Afin de tester la perméabilité cérébrale, nous injecterons une molécule 1h avant l’euthanasie des animaux (une fois, durée inférieure à 1 minute par animal, sous anesthésie générale).
Impact sur les animaux
Après induction de notre modèle pathologique, les souris peuvent développer des troubles de la marche, de la coordination, une faiblesse musculaire et une perte de poids. Ces symptômes s’installent progressivement au bout de 2 semaines environ et atteignent un pic durant 3-5 jours, puis sont suivis d’une récupération partielle ou complète en quelques jours. L’anesthésie gazeuse mise en place pour minimiser le stress lié à la manipulation lors de l’induction de la pathologie sera très courte (inférieure à 10 minutes) et sera donc associée à un risque infime de détresse cardio-respiratoire et d’hypothermie. Les injections génèreront un stress et une brève et légère douleur au point d’injection. Lors des injections d’induction de la pathologie, il existe également un risque de lésion cutanée du point d’injection dû à la molécule injectée, prise en charge par la stérilisation du lieu d’injection avant manipulation.
Devenir
Des analyses seront réalisées post mortem, ce qui implique l’euthanasie de l’ensemble des animaux pour le prélèvement des tissus d’intérêt.
Remplacement
Dans un effort de remplacement, nous travaillons en première approche avec des modèles ex vivo. Les modèles murins in vivo sont nécessaires pour l’étude fondamentale de la sclérose en plaques, car ils permettent d'étudier la réparation tissulaire dans un contexte intégré, impliquant des interactions entre tissus nerveux et cellules immunitaires sanguines, ainsi que les apports métaboliques en lien avec le réseau sanguin, qui sont des composantes essentielles à étudier de cette pathologie, d’après les travaux en imagerie effectués chez le patient.
Réduction
Des approches statistiques permettront d’optimiser le nombre d’animaux utilisés, estimés à 100 maximum, et de ne pas sur-dimensionner le nombre d’animaux étudiés lors de nos expériences : ce nombre sera calculé pour chaque groupe d’expériences à l’aide d’un calcul statistique après la première expérience. Les données obtenues seront analysées avec les tests statistiques appropriés.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Un environnement enrichi leur est fourni, comprenant nidification (coton de nidification, kraft), et bâtonnet à ronger. Nous respecterons une période d’acclimatation d’une semaine à l’arrivée des animaux dans l’animalerie avant toute inclusion dans la procédure. Les animaux sont observés quotidiennement, en cas d’anomalie celle-ci est transmise à l’équipe de recherche, à la structure chargée du bien-être animal (SBEA) et au vétérinaire afin de mettre en place une prise en charge rapide et adaptée pour éviter toute souffrance de l’animal. Ils seront également surveillés de manière spécifique par l’équipe dès l’induction de la pathologie : afin de suivre l’évolution des signes cliniques une grille de score adaptée à notre modèle est utilisée quotidiennement voir bi-quotidiennement lors de la phase aiguë de la pathologie. Nous mettrons en place une assistance nutritionnelle dès l’apparition de difficultés motrices (alimentation humide ou en gelée, facilement accessible dans la cage). L’induction de la pathologie sera réalisée sous anesthésie pour minimiser le stress et la douleur des animaux. On s’assurera du maintien de la température physiologique des animaux tout au long de l’anesthésie (chambres d’induction et de réveil chauffées, tapis chauffant) et on appliquera un gel oculaire pour éviter toute sécheresse oculaire. L’injection intraveineuse avant euthanasie sera également réalisée sous anesthésie générale afin de réduire le stress induit pour les animaux. L’euthanasie médicamenteuse sera ensuite réalisée après une pré-sédation des animaux pour éviter tout stress ou douleur lors de l’injection létale. Des points limites seront définis et respectés pour éviter toute souffrance animale non nécessaire pour la procédure.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues et sont relativement proche de l'Homme. Le modèle de l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE) chez la souris est un modèle classique de sclérose en plaques (SEP), permettant de reproduire en partie l’aspect inflammatoire observé chez les patients, et qui apporte une approche intégrée des déficits observés dans la pathologie. Il s’agit donc d’un modèle particulièrement adapté pour notre objectif scientifique de suivi de l’évolution de la vascularisation au cours du développement des lésions de SEP. Des animaux adultes de souche commerciale, âgés de 10-12 semaines au moment de l’induction de l’EAE (de même pour les contrôles), seront utilisés pour cette étude. Après une semaine d’acclimatation, les animaux sont tatoués. L’âge adulte est requis pour pouvoir induire l’EAE. L’usage de jeunes adultes reproduit par ailleurs les conditions d’initiation de la SEP chez l’humain et limite les risques d’artefacts liés au vieillissement de l’animal.
Comprendre les maladies de l’aorte à l’aide de modèles de souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une incision dans le dos, une mini-pompe implantée sous la peau, vingt-huit jours de perfusion d'angiotensine II pour faire gonfler l'aorte : 450 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour des analyses de tissus. Le suivi tient à une échographie cardiaque de dix minutes et à un transport à pied entre deux établissements. Le porteur résume les nuisances à un "léger stress" et à une suture "légèrement irritée", avant d'indiquer qu'une dissection de l'aorte et une mort subite peuvent survenir en fin de traitement. Il précise aussi que l'absence complète de l'un des quatre gènes étudiés tue les souriceaux à la naissance.
Objectifs
Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2). Les anévrysmes de l’aorte thoracique (AAT) sont un gonflement d'une region spécifique de l'aorte qui relie le coeur au reste du corps humain. Ce gonflement à pour conséquence une fragilsation importante du reste du réseau cardiaque. La rupture de l’aorte qui consiste en un dechirement de celle-ci est alors favorisée et mortelle. Aucun traitement n’est pour le moment disponible pour ralentir la progression de la pathologie en raison de connaissances insuffisantes sur les mécanismes impliqués. Le but de notre recherche est d’identifier les gènes impliqués dans les AAT (anévrysme aortique thoracique) car a ce jour, seuls 30 % des patients ont une cause génétique connue. Il a été identifié 4 gènes qui sont potentiellement impliqués dans les anévrysmes mais leur rôle exact reste à établir. Pour mieux comprendre leur implication dans les anévrysmes de l'aorte thoracique, des modèles murins ont été générés afin de pouvoir etudier leur mécanismes. Un modèle de souris par gène identifié sera mis en place pour lequel nous induirons par la suite un anévrysme de l'aorte à l'aide d'une molécule déjà connue de la littérature.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de valider des gènes impliquées dans les AAT et ainsi réduire le nombre de patient dont la cause génétique n'est à ce jour pas connue. L'identification du rôle de ces gènes nous amenera a mieux comprendre leur mécanisme et ainsi offrir un meilleur suivi de l'anévrysme aux patients. La connaissance approfondie des potentiels acteurs impliqués dans les anévrysmes nous permettra de prévenir les conséquences fatales de la progression de cette pathologie et potentiellement de développer des solutions thérapeutiques.
Procédures
Dans l'EU1, une incision sous la peau au niveau du dos sera réalisée sur animal anesthésié pour implanter une mini-pompe qui délivrera une molécule pendant 28 jours pour induire un anévrysme. La durée de l’acte est de 10 min. Au préalable, sur un groupe d’animaux, il sera administré pendant une semaine dans l’eau de boisson une molécule connue de la littérature pour augmenter l’apparition de l’anévrysme. Pour suivre l'évolution du développement des anévrysmes, une imagerie cardiaque sera effectuée dans l'EU2 soit 10 min par souris.
Impact sur les animaux
La mise en place des pompes à AngII (pompes avec Angiotensine II qui est un hypertenseur) peut induire un léger stress à la souris. La suture peut être irritée légèrement. En fin de traitement, une possible dissection aortique peut survenir et donc une mort subite. Les échographies sont rapides et bien supportées par les animaux. L'un des gènes étudiés entraine la mort de l'animal à la naissance lorsqu'il est totalement absent.
Devenir
tous les animaux sont euthanasiés et des prélèvements de tissus seront effectués post-mortem pour analyses.
Remplacement
Les prélèvements chez l'humain après opérations sont limités en nombre et en nature (seulement des petites parties de la paroi anévrysmale sont retirées par les chirurgiens). Cette pathologie est complexe et fait intervenir de nombreux compartiments du corps humain (vaisseaux, sang) mais aussi des paramètres mécaniques (pression, vitesse). Les animaux et les humains partagent une grande similarité aussi bein sur le plan anatomique, génétique que fonctionnel. De plus, le modèle murin nous permet d'être en mesure de travailler sur des modèles génétiquement modifiés et ainsi de pouvoir moduler et cibler un gène en particulier. Des expériences ont été menées sur des cellules humaines isolées afin de remplacer autant que possible l'utilisation de ces animaux. Cependant, la complexité des mécanismes à l'origine des anévrysmes requiert l'utilisation d'un organisme complet.
Réduction
Nous utilisons l'effectif minimal qui permet d'avoir une puissance statistique pour tester nos hypothèses. Un lot expérimental nécessite 10 souris pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Cet effectif est déduit de nos expériences précédentes. Toutefois, si nous constatons une différence statistiquement significative à un effectif plus faible, nous conclurons l'étude. La production d'animaux nécessaire sera réduite au minimum des besoins expérimentaux.
Raffinement
Nous raffinerons l'environnement des animaux par enrichissement de leur milieu de vie. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture ainsi que de la boisson. Nous veillerons à ce que les animaux ne soient pas laissé isoler dans les cages durant toutes les expériences afin de ne pas perturber les groupes souciaux. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés lors du projet pour couvrir les douleurs opératoires. De plus, les yeux seront couverts d'ocrygel pour eviter la déshydratation des yeux. Une surveillance quotidienne sera efféctué par l'expérimentateur ainsi que le personnel de l'animalerie, cette surveillance pourra être augmentée en cas de nécéssité. Le suivi sera quotidien. Nous établirons une grille d'évaluation des effets/nuisances susceptibles de toucher les animaux. Les critères observés seront l’apparence, le comportement, la mobilité et la perte poids. Les animaux recevront une injection d'un anti-douleur toutes les 8 heures pendant 2 jours en cas de besoin. En cas de déshydratation, les animaux recevront une injection de sérum physiologique au niveau de l’abdomen. Lors du transport des animaux de l'EU1 à l'EU2, nus ferons ce transport à pied (5min), à l'abri des regards, avec des hydrogels dans les cages et un peu de nourriture et des igloos en carton pour éviter le stress.
Choix des espèces
Les lignées murines impliquant les 4 gènes étudiés ont déjà été générées et nous y avons accès. De nombreux modèles murins ont déjà été décrits et développés pour les AAT nous permettant ainsi de comparer les modèles entre eux afin de mieux comprendre les mécanismes sous jacents. Les animaux seront utilisés au stade adulte (12 semaines), car les anévrismes de l’aorte thoracique se déclarent majoritairement chez l’Homme adulte et chez la souris à 12 semaines.
Formation à la technique microchirurgicale chez le rat
- Enseignement supérieur
Former 130 chirurgiens et vétérinaires par an à la suture sous microscope : 10 595 rats vont être utilisés, 8 165 opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, 2 430 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une ou deux chirurgies pouvant durer jusqu'à quatre heures, et tous sont tués à l'issue, le porteur invoquant l'impact qu'auraient les interventions pratiquées. Les rats sont choisis parce que le diamètre de leurs vaisseaux correspond à celui des artères digitales humaines suturées lors des réimplantations. Le porteur écrit que le recours aux rongeurs est "hélas nécessaire" faute de simulateur reproduisant les facteurs thrombogènes du flux sanguin, et signale une baisse de 16,5 % du nombre d'animaux depuis l'ajout de cinq séances préalables sur tissu inerte.
Objectifs
La microchirurgie (chirurgie sous microscope opératoire) est une technique utilisée dans de nombreuses disciplines chirurgicales dont la chirurgie de la main, la chirurgie plastique, en chirurgie orthopédique et traumatologique, en neurochirurgie et en chirurgie pédiatrique. Or pour être parfaitement maîtrisée, la technique microchirurgicale nécessite un entraînement long, régulier et progressif et cet apprentissage ne peut se faire qu’en laboratoire. La formation est obligatoire dans certaines disciplines chirurgicales, telle que la chirurgie de la main et la chirurgie plastique, mais elle est également très utile pour tous les internes en chirurgie, quelle que soit leur future spécialité. C’est une technique rigoureuse qui n’accepte aucune approximation. Cette rigueur et cette précision permettent au chirurgien l’acquisition d’une grande technicité qui lui sera très utile pendant toute sa carrière. L’utilisation des rongeurs dans la formation est hélas nécessaire car actuellement aucun simulateur n'est capable de reproduire la complexité des structures des organismes vivants (organes in-vivo, réseaux vasculaires complexes) ainsi que les facteurs thrombogènes du flux sanguin. L'objectif de ce projet est d'assurer la formation à la technique microchirurgicale de 130 chirurgiens et vétérinaires par an. A l'issue de la formation les apprenants doivent parfaitement maîtriser les techniques, aucune erreur n'étant acceptable chez le patient. Pour atteindre cet objectif nous utilisons la méthode pédagogique consistant à varier les exercices et à augmenter les difficultés techniques au fur et à mesure des séances.
Bénéfices attendus
Formation des chirurgiens et vétérinaires à la microchirurgie leur permettant de traiter des patients/animaux avec une grande maitrise technique.
Procédures
Les animaux seront soumis à une ou deux chirurgies sous anesthésie générale durant maximum 4h. Les animaux seront soumis à des injections pour l'analgésie (1 à 4 fois) et pour l'anesthésie (1 à 2 fois)
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à un stress léger lié à la préhension /contention et à l'injection pour l'administration de l'anesthésie.
Devenir
L'ensemble des animaux de ce projet seront mis à mort à l'issue des procédures chirurgicales en raison de l'impact que pourraient avoir les chirurgies réalisées.
Remplacement
Il a été institué 5 séances de travaux pratiques pour tous les étudiants sur tissu inerte avant l’utilisation d’animaux vivants (compresses, tube en plastique, cuisses et ailes de poulet, dissection sur sujet anatomique) ainsi qu’un visionnage de vidéos des techniques. Plusieurs dissections seront faites sur des animaux fraîchement décédés utilisés dans les autres procédures.
Réduction
Depuis la mise en place de travaux pratiques sur tissu inerte en début de formation, la réduction du nombre d’animaux est de 16,5% par rapport au précédent projet. Le nombre de séances a été défini pour permettre d’atteindre une formation complète des étudiants. De plus, l’apprenant ne peut s’inscrire à la formation longue diplômante que s’il a préalablement effectué une formation initiale
Raffinement
Les animaux sont maintenus en groupes sociaux. L’ensemble des procédures seront réalisées sous anesthésie, avec une analgésie adaptée et des points limites adaptés ont été instaurés.
Choix des espèces
La taille des vaisseaux des rats correspond parfaitement aux vaisseaux suturés sous microscope chez l’Homme, comme par exemple les vaisseaux des doigts lors de réimplantations digitales, en chirurgie pédiatrique ou lors de réalisation de lambeaux libres. Adulte de 2 à 3 mois. A ce stade de développement les animaux ont des vaisseaux de diamètres correspondants aux diamètres de certains petits vaisseaux humains qui doivent être suturés comme par exemple lors de réimplantation des extrémités digitales.
Rôle des senseurs métaboliques dans le comportement et la motivation alimentaires chez un modèle souris de dénutrition
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Trois à six semaines de restriction alimentaire, trois semaines d'isolement, deux séjours de cinq jours en cage métabolique : 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. S'y ajoutent la pose d'un implant crânien sous anesthésie, huit injections sous-cutanées, des prélèvements de sang à la queue deux à trois fois par semaine et une immobilisation par contention de deux à cinq minutes dans une machine IRM. L'objet est de tester si la ghréline et son antagoniste le LEAP-2 modifient la prise alimentaire. Le porteur reconnaît qu'il serait impossible de reproduire chez la souris les aspects multifactoriels de l'anorexie mentale et limite son ambition à un circuit cérébral de la récompense, tout en affirmant que les explorations comportementales sur animal vigile ne peuvent pas être remplacées par des approches in vitro.
Objectifs
L’anorexie mentale est un trouble du comportement alimentaire qui se caractérise par une restriction alimentaire et une activité physique compulsives aboutissant à une dénutrition chronique associées à de sévères complications. Parmi les troubles psychiatriques, l’anorexie mentale a le taux de mortalité le plus élevé et la compréhension de cette maladie ainsi que son évolution représente un enjeu de santé publique. On retrouve dans l’anorexie mentale un taux de rechute important notamment parce qu’elle implique des comportements de restriction alimentaire et d’hyperactivité physique compulsifs similaires aux comportements addictifs. L’objectif de ce projet, mené chez le modèle souris, est de mieux comprendre le rôle de la ghréline, une hormone digestive, et de son antagoniste, découvert récemment, le LEAP-2 (Liver Expressed Anti-microbial peptide-2) sur le cerveau. Tandis que la ghréline favorise l’initiation des comportements alimentaires et contrôle les aspects motivationnels et renforçateurs de l’alimentation, ses concentrations sanguines sont élevées dans l’anorexie mentale. Notre hypothèse est que le LEAP-2 pourrait avoir un effet inverse à la ghréline et inhiber la prise alimentaire dans l’anorexie mentale. Pour cela, nous allons tester dans quelle mesure la régulation des taux de ghréline et de LEAP-2 pourraient améliorer les symptômes de l’anorexie. Bien qu'il n'y ait pas de modèle parfait d'anorexie chez la souris, nous utilisons un protocole de restriction alimentaire mimant certaines caractéristiques de la pathologie. Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques impliqués dans l’anorexie et d’amener des pistes de traitement pour cette pathologie.
Bénéfices attendus
Dans ce projet, nous évaluerons comment un modèle souris innovant, rassemblant des facteurs de risque environnementaux de la maladie, peut apporter des éléments de compréhension des mécanismes neurobiologiques mis en jeu dans les anomalies du comportement alimentaire dans l’anorexie mentale. L'objectif à plus long terme de ce projet est d'identifier des biomarqueurs pertinents liés aux anomalies de la récompense, pouvant servir d'outils diagnostiques ou pronostiques en clinique. Il permettra également d'approfondir la compréhension du dialogue entre le métabolisme et les anomalies des processus de récompense dans l'anorexie, afin de fournir des connaissances utiles pour envisager de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
Biopsie de la queue pour génotypage (1 fois durée 5 secondes). Pose d'implants pour l'imagerie ou la délivrance de composés pharmacologiques sous anesthésie générale et analgésie: 1 fois, durée environ 45 minutes à 1 heure. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure de la glycémie: 2 à 3 fois par semaine en cours de restriction alimentaire, durée 5 secondes. Prélèvements de sang à la queue pour la mesure des marqueurs métaboliques : 1 fois au cours de la procédure, durée 60 secondes. Injections pharmacologiques sous-cutanées: 8 injections, durée 5 secondes. Durée de la restriction alimentaire : 3 à 6 semaines. Isolement dans des cages métaboliques (2 fois 5 jours).
Impact sur les animaux
Les animaux seront génotypés à l'aide d'une biopsie de queue faite vers 6 jours ce qui peut entraîner une légère douleur de courte durée. Les prises de glycémies basales sont effectuées en réalisant une petite incision au niveau de la queue pour prélever une goutte de sang, ce qui entraîne un stress transitoire chez les animaux. Le protocole de restriction alimentaire nécéssite un isolement des animaux pendant 3 semaines qui induit un stress. Ce protocole entraine également une perte de poids et une baisse de la glycémie. L’anesthésie des animaux lors de la chirurgie peut entraîner un stress. La chirurgie peut entrainer un saignement important au niveau du crâne de l'animal et entrainer une douleur et des problèmes de récupération. Le scan de la graisse corporelle est réalisée dans une machine IRM dans laquelle les souris doivent être immobilisées par contention pendant 2 à 5 minutes ce qui provoque un stress.
Devenir
Pour chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récupérer le cerveau afin de permettre des analyses biochimiques ou moléculaires de biomarqueurs en post-mortem dans les différentes structures cérébrales.
Remplacement
Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales complexes (cognition, comportement alimentaire, activité motrice) sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Les animaux non utilisés à l'issue du génotypage seront proposés au don. Lors du prélèvement des tissus, certains tissus non utilisés pourront être récupérés par d'autres membres du laboratoire.
Raffinement
Pour réduire le stress lié à l’isolement des animaux, ils sont hébergés en cages ouvertes permettant de sentir et entendre leurs congénères. La chirurgie s’effectue sur un coussin chauffant et une sonde permet de monitorer la température de ce dernier pour préserver l’animal de l’hypothermie. Lors de la chirurgie, des analgésiques sont utilisés en pré-opératoire et postopératoire pour limiter la douleur de l’animal. Au cours de la chirurgie, une solution est appliquée sur les yeux de l’animal pour les protéger de l’assèchement. Une injection sous cutanée de solution saline est effectuée en fin de chirurgie pour palier à la déshydratation de l’animal. A la fin de la chirurgie, les animaux sont placés sur un coussin chauffant jusqu’à leur réveil complet puis replacés avec leurs congénères en cage collective avec nourriture et eau à volonté. Pendant les 3 jours suivant la chirurgie les animaux sont surveillés journalièrement. Les animaux ont à disposition dans leur cage des aliments humidifiés pour facilité leur ingestion en cas de douleur. D’autre part, des grilles de points limites sont mis en place. En fonction des observations faites, des mesures sont prises, à savoir soit des soins quand ceux-ci peuvent être mis en place, soit la mise à mort de l'animal.
Choix des espèces
Le modèle souris est un modèle de choix pour l'exploration du comportement alimentaire et des comportements dirigés vers un but permettant l’étude d’altération du système de la récompense. Les régulations mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. Notre objectif ici n'est pas de reproduire les aspects multifactoriels de l'anorexie nerveuse dans un modèle murin, car cela serait impossible. Au lieu de cela, notre but est de disséquer un circuit neural spécifique (lié aux anomalies des voies de la récompense) qui pourrait expliquer une dimension particulière de la pathologie. L’anorexie mentale fait partie des pathologies neuropsychiatriques qui touchent principalement des sujets adolescents et jeunes adultes. Dans ce projet, les procédures sont réalisées chez des souris adolescentes ou adulte entre l'âge de 6 et 20 semaines.
Raffinement des méthodes d’administration, de prélèvement et des techniques chirurgicales chez les rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 3303
Cochons d'Inde : 1353
Former et entretenir les gestes techniques du personnel d'un laboratoire conduit à utiliser 3 499 souris, 3 303 rats et 1 353 cochons d'Inde, soit 8 155 animaux. 1 499 sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, 5 862 subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 794 un niveau sévère. 1 950 sont réutilisés, selon un barème où une procédure modérée vaut quatre points et où le cumul s'arrête à huit, ce qui autorise deux passages avant la mise à mort. Le porteur indique avoir envisagé les mannequins, la 3D et l'entraînement sur animal mort, avant de conclure que le geste sur animal vivant "reste un passage obligatoire", parce qu'il faut vérifier la réussite de la technique sur l'animal réveillé.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est d’assurer la formation et le maintien des compétences du personnel, en conformité avec les articles 5, 23 et 24 de la Directive 2010/63/UE du Parlement Européen et du conseil du 22 septembre 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques, afin de garantir la qualité des procédures expérimentales et le respect des principes des 3Rs (Réduction, Raffinement, Remplacement). Cette formation régulière est essentielle pour maîtriser les techniques expérimentales (administrations, prélèvements, interventions chirurgicales) et réduire les impacts sur les animaux. Elle repose sur l’utilisation d’un nombre limité d’animaux, conformément aux exigences réglementaires, et contribue directement à diminuer les erreurs, à raffiner les méthodes et à limiter l’utilisation d’animaux dans les phases principales des études. En parallèle, ce projet intègre une démarche continue de raffinement des procédures expérimentales, en veillant à améliorer les pratiques déjà mises en place. Ces améliorations sont basées sur une veille scientifique constante et visent à minimiser le stress et la douleur des animaux, tout en augmentant la fiabilité des résultats obtenus. Ce projet répond aux exigences des agences réglementaires (OCDE, EMA, ANSM) et s’inscrit pleinement dans le cadre légal européen visant à protéger les animaux utilisés à des fins scientifiques. Il garantit que chaque intervention soit effectuée par un personnel formé, compétent et conscient des enjeux éthiques. Ce projet associe formation obligatoire, maintien des compétences et amélioration des pratiques expérimentales, tout en répondant aux attentes réglementaires et en renforçant le bien-être animal dans les travaux de recherche préclinique
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont en lien avec l'amélioration du confort des animaux, la limitation des potentielles souffrances induites par les techniques mises en oeuvre (administrations, prélèvements, chirurgies) et la réduction du nombre global d'animaux utilisés en recherche grâce à l'application de ces techniques par un personnel maitrisant les gestes et formés à raffiner au quotidien leurs pratiques. Un technicien formé qui réalise des administrations de manière précise et avec plus de confiance qu'un technicien peu expérimenté, contribuera à diminuer les possibles erreurs et augmentera la qualité des administrations lors des études réalisées au sein du laboratoire. A la suite de ce projet, il en découlera une diminution du nombre d’animaux, un stress moindre ainsi qu'une baisse du niveau de douleur pour l’animal dans l'ensemble des projets appliqués dans l'établissement utilisateur. La formation du personnel est indispensable pour maîtriser les actes techniques, éviter la souffrance animale, limiter le risque d'erreur dans les procédures et l'utilisation d'animaux. Ainsi, une bonne maîtrise de l'acte permet le respect de la règle des 3R.
Procédures
Les techniques chirurgicales sont réalisées exclusivement sous anesthésie associée à un ou des composés antalgiques/analgésiques. La durée moyenne d'un acte chirurgical est comprise entre 5 et 90 minutes. Un seul acte chirurgical sera dispensé par animal. Les prélèvements de fluides pourront être effectués sur animal vigile ou sur un animal anesthésié selon la technique utilisée qui durera entre 1 et 10 minutes par animal. Le raffinement des techniques et la formation aux administrations sont effectués principalement sur animaux vigiles ou bien anesthésiés. Aussi bien pour les prélèvements que les administrations, chaque animal ne recevra pas plus de 8 actes classés Léger, ou 2 actes classés en modéré. A la suite de certaines techniques chirurgicales des observations comportementales peuvent être réalisées à une seule occasion, de 1 à 4 semaines après la chirurgie, sur une durée de 60 minutes maximum.
Impact sur les animaux
Les administrations, les prélèvements et les techniques chirurgicales entraînent un stress temporaire chez l'animal. Cet inconfort peut apparaitre lors des répétitions de prélèvements. Dans le cas des procédures chirurgicales, la technique réalisée entraine une sensibilité voire une douleur au niveau du site d'implantation, du site de lésion ou sur le trajet du cathéter, malgré la prise en charge péri-opératoire.
Devenir
Un suivi de l’utilisation des animaux est mis en place au sein de l’entreprise, et un score est établi afin d’empêcher une réutilisation excessive, notamment dans des procédures de sévérité modérée. A la suite des procédures modérées précitées, les scores de réutilisation s’incrémentent à chaque procédure appliquée à l’animal (procédure modérée : 4 points). La réutilisation est possible tant que le score cumulé est inférieur à 8 points (une procédure sévère est représentée par un score de 8 points) et que l'animal ne présente aucun signe de mal-être. La décision de la réutilisation revient aux vétérinaires. Au-delà, les animaux sont mis à mort. Les animaux soumis à des actes classifiés sans réveil (notamment car nécessitant une euthanasie de l'animal pour vérifier des repères anatomiques) ou à des chirurgies lourdes ayant un impact sur leur maintien en vie dans de bonnes conditions seront euthanasiés sous anesthésie sans retour à l'état conscient. Les animaux ayant subi une procédure de catégorie sévère sont euthanasiés, car leur maintien en vie dans de bonnes conditions n'est pas possible.
Remplacement
L'ensemble des projets du laboratoire rend incontournable le recours à l'utilisation d'animaux utiles à des fins scientifiques. Toutes les mesures de remplacement ont été envisagées dans le cadre de la formation (mannequins, 3D, bibliographie scientifique, geste technique approché sur animal mort issu d'une procédure expérimentale antérieure) qui reste un passage obligatoire. La mise en œuvre d'une administration, d'un prélèvement ou d’une technique chirurgicale passe nécessairement par une étape sur animal vivant (par exemple la formation aux prélèvements sanguins exige de vérifier la capacité à prélever sans hémolyse ; la formation à la chirurgie touchant aux vaisseaux exige l'entraînement sur animaux vivants pour apprendre le geste sur des vaisseaux non collapsés et vérifier la réussite de la technique sur l'animal réveillé).
Réduction
L'utilisation d'animaux n'aura lieu qu'en cas de nécessité (formation de nouveaux techniciens, reformation après une longue période sans réalisation de la technique). Par ailleurs, la formation utilisera dès que possible des animaux ayant déjà été soumis à une procédure légère ou modérée dans le cadre d'un autre projet scientifique (de façon à réduire l'utilisation d'animaux naïfs). Le nombre d'animaux sélectionnés sera déterminé afin de garantir une performance permettant de raffiner de manière globale les procédures mises en oeuvre sur les animaux dans l'EU, tous projets confondus. Ce projet s'inscrit dans un objectif de réduction du nombre total d'animaux utilisés dans l'ensemble des projets de l'établissement utilisateur, via une formation adéquate, un raffinement permettant de répondre aux questions en utilisant moins d'animaux et une réflexion sur les volumes minimum pertinents pour les analyses. Dans le cas des méthodes nouvelles, la faisabilité et l'impact seront évalués dès les premiers animaux au regard de l'attendu bibliographique.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en une veille constante de la littérature permettant de s'assurer de la qualité de nos méthodes grâce aux connaissances scientifiques acquises en continu. Par ailleurs, un suivi des points limites clairement définis et spécifiques à chaque procédure permet de stopper l'étude et/ou de décider la mise à mort de façon précoce de tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, une observation clinique quotidienne, un avis vétérinaire spécifique si nécessaire). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux. Celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, les chirurgies sont raffinées au maximum, par la mise à disposition d’oxygène ou d'air ambiant à concentration ajustable, de tapis chauffants et/ou de lampes chauffantes et de soins pré/postopératoires complets.
Choix des espèces
Ces espèces sont les espèces cibles des premières études précliniques. Elles sont requises par les principes fondamentaux de l'ICH (M3(R2) Études de sécurité non clinique pour la conduite des essais cliniques chez l'homme et l'autorisation de mise sur le marché des produits pharmaceutiques) et la nécessité scientifique/physiologique. La pertinence du choix des espèces animales est basée sur des caractéristiques anatomiques, physiologiques, ou pathophysiologiques et chaque espèce a ses avantages et inconvénients. Le choix final est basé sur un examen critique des données disponibles et des considérations éthiques. 90% des méthodes s’appliquent à l'animal adulte entre 6 semaines et 20 semaines de vie. Certaines méthodes s'appliquent à l'animal âgé ou jeune en raison de la taille de ces animaux pour être le plus représentatifs possibles des situations rencontrées en recherche animale (certains modèles nécessitant des études sur animaux de la période péri-natale jusqu'à un âge avancé).
Étude de l’impact de l’inflammation sur la sévérité du trouble du spectre autistique (TSA) chez des souris SHANK3 : Effet du LPS et intervention anti-inflammatoire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Quatre injections d'un agent inflammatoire pour 315 souriceaux, huit jours de gavage pour 180 autres, trois jours de test comportemental de dix minutes, puis l'exsanguination à quatorze ou trente-cinq jours de vie. 495 souris porteuses d'une mutation du gène SHANK3 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 315 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le projet cherche à savoir si des anti-inflammatoires atténuent les symptômes comportementaux associés à l'autisme dans ce modèle, mesurés par un test que le porteur ne nomme pas. Aucune souris ne dépasse cinq semaines de vie.
Objectifs
Le trouble du spectre autistique (TSA) est une pathologie neurodéveloppementale qui provoque des déficiences dans l’interaction sociale et des comportements répétitifs. En Europe, la prévalence des TSA est en augmentation, avec environ 1 enfant sur 100 recevant un diagnostic. Cette augmentation a des répercussions sociétales et financières majeures, le coût annuel des TSA dans l’Union européenne étant estimé à 258 milliards d’euros. Les programmes de santé européens, ainsi que des initiatives telles qu’ERA-NET et EURAS, mettent un fort accent sur le traitement des TSA. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement neurophysiologique et à la physiopathologie des TSA est l’objectif principal du projet pour ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques. En premier lieu on souhaite étudier les effets protecteurs des anti-inflammatoires dans un contexte pathologique, l’autisme. L’étude cherchera à savoir dans un deuxième temps si ces traitements anti-inflammatoires peuvent atténuer les symptômes comportementaux induits par l’inflammation comme l'autisme Cette étude permettra non seulement de tester une approche préventive contre l’aggravation des symptômes liés à l’autisme, mais aussi d'identifier les mécanismes par lesquels la modulation de la réponse inflammatoire peut corriger ou réduire les anomalies synaptiques et comportementales. Des mesures seront effectuées pour suivre l'évolution des marqueurs inflammatoires cérébraux et étudier la physiologie des neurones avec des mutations identifié dans le trouble du spectre de l'autisme
Bénéfices attendus
Le développement de modèles expérimentaux, tels que les souris portant des modifications génétiques SHANK3, pour tester l'effet des anti-inflammatoires, apporte des retombées significatives tant sur le plan scientifique que sur celui de la santé publique. Sur le plan scientifique, ces modèles permettent de mieux comprendre comment la modulation de l'inflammation peut influencer les symptômes associés à des mutations génétiques spécifiques. Les résultats de ces études ouvrent la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les processus inflammatoires, avec un potentiel pour améliorer les traitements existants pour les patients atteints de troubles du spectre autistique (TSA). Ces avancées pourraient mener au développement d'interventions pharmacologiques innovantes, offrant des options supplémentaires, particulièrement pour les patients dont les symptômes sont exacerbés par l'inflammation. En matière de santé publique, l'amélioration de l'efficacité des traitements pourrait réduire les coûts de prise en charge des TSA en diminuant la nécessité de soins intensifs et en améliorant la qualité de vie des patients. Une meilleure gestion des symptômes permettrait également de soulager considérablement les aidants qui s'occupent quotidiennement des patients atteints de TSA, réduisant leur charge mentale et physique, et contribuant ainsi à un mieux-être global, tant pour les patients que pour leurs familles. Ces progrès entraîneraient des économies substantielles pour les systèmes de santé.
Procédures
315 souriceaux auront 4 injections et 180 souriceaux auront 8 jours de Gavage (10 secondes par injection/gavage). Le test comportementale dure 3 jours avec un essai de 10 min par jour. Tous les animaux seront prélevés après exsanguination pour les études sur tranches aigues ou histologiques soit à P14 ou P35.
Impact sur les animaux
Les étapes du gavage et l'induction de l'inflammation par injection entraînent des effets indésirables sur les animaux : douleurs, inflammation du site d'injection. Le test comportemental chez la souris induit un peu de stress lié à la manipulation, à l’exposition à un nouvel parfois renforcé par la présence d’odeurs et de signaux sociaux. Les nuisances sont réduites grâce l’habituation et des conditions expérimentales adaptées qui sont mises en place
Devenir
Euthanasie pour étude histologique ou electrophysiologique
Remplacement
En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire de travail chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations synaptiques sont traitées exigent que l'animal soit intact.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les conditions de l'élevage seront standardisées et en adéquation avec le bien-être des animaux de façon à obtenir des groupes d'animaux les plus homogènes possibles et ainsi diminuer le nombre d'individus pour les analyses statistiques. Afin de réduire autant que possible les erreurs statistiques qui pourraient résulter d'un nombre insuffisant d'animaux, tout en limitant le nombre d’animaux, nos tests seront strictement basés sur un seuil de significativité de 0.05. Ce choix permet une analyse statistique robuste et adaptée à la complexité du plan expérimental. Le nombre d’animaux (n = 14–16 par condition expérimentale, en moyenne n=15) est basé sur des études antérieures de l’équipe montrant que ce nombre permet de détecter des différences d’au moins 20 % avec une puissance statistique ≥ 80 % et un seuil α = 0,05. Cette estimation tient compte de la variabilité biologique attendue dans les enregistrements électrophysiologiques et/ou les mesures comportementales. (3)Les deux sexes sont inclus pour assurer une meilleure représentativité biologique des résultats. Chaque groupe expérimental comprendra 7 à 8 mâles et 7 à 8 femelles, analysés séparément puis comparés pour évaluer les interactions liées au sexe
Raffinement
Les animaux sont surveillés chaque jour par les zootechniciens. Cette surveillance est renforcée par un deuxième suivi effectué par l’expérimentateur. Des critères de bien-être seront évalués : maternal care, état des souriceaux allure du poil, dos vouté, blessures dues à des bagarres entre congénères, lésions cutanées, agressivité ou repli, respiration accélérée/saccadée. Le constat de signes de souffrance sans lien avec les procédures expérimentales entraîne la création d’une « fiche individuelle de soin» (FIS), qui renseigne les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc…) et l’évolution des signes. La cage est alors signalée par une étiquette « animal à surveiller ». Cette fiche est fermée quand l’animal a récupéré ou qu’une décision de mise à mort a dû être prise. Un suivi spécifique établi pour les procédures d'injection/gavage seront décrits dans les procédures. Si l’animal montre des signes de souffrance, il recevra en sous-cutanée une injection quotidienne d’Inflacam ou morphenique jusqu’à disparition des signes de mal-être. Afin que la perfusion intracardiaque soit indolore, ce geste est précédé d’une injection d’une double dose d’analgésique et d’un anesthésiant. L’absence de réflexe est vérifiée avant toutes incisions afin de contrôler la profondeur de l’anesthésie de l’animal.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale dans un contexte pathologique. De plus, ce modèle nous permet d'utiliser les modèles transgéniques d'intérêt. Le projet sera réalisé sur des animaux durant le développement et à l'age adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.
Modèles aigus et chroniques d’insuffisance rénale induite par ischémie-reperfusion chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Rats : 936
Chaque animal subit une ou deux opérations sous anesthésie pour bloquer puis rétablir la circulation sanguine dans le rein, avec incision de la peau et du muscle, et reçoit des composés tous les jours pendant trois jours à quatre semaines. 3 186 souris et 936 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 836 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur énumère parmi les effets attendus la perte de poids, la déshydratation, l'inflammation de la suture, la prostration et les tremblements, puis écrit que l'ensemble de ces procédures "vise à garantir la fiabilité des modèles expérimentaux tout en assurant le respect du bien-être animal". Il justifie l'effectif de quinze animaux par groupe par "le risque de perte lors de la procédure chirurgicale".
Objectifs
10% de la population mondiale est atteinte de maladie rénale chronique. Cette condition pathologique caractérisée par de nombreuses atteintes du tissu rénal conduisant à la perte de fonction de l’organe. Il a été démontré que les problèmes cardiovasculaires et métaboliques, tels que l’hypertension et le diabète, mais également la prise de médicaments, accélère le développement d’insuffisance rénale à la suite de lésions aigües de l’organe. Ceci peut aboutir à des décès prématurés des patients atteints, nécessitant un traitement par dialyse et/ou greffe de rein. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie sont encore mal identifiés.
Bénéfices attendus
La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer un nouveau modèle expérimental in vivo qui exprime une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi, les tests précliniques d’efficacité de nouveaux médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur un modèle pertinent d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques.
Procédures
Le projet se déroulera en deux phases. La première, dite de validation, impliquera un nombre restreint d’animaux afin de mettre en place les conditions expérimentales basées sur des protocoles d’ischémie-reperfusion référencés dans la littérature. La seconde phase, consacrée aux tests, visera à évaluer l’efficacité de candidats médicaments par an. Tous les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation d’au moins 7 jours avant toute intervention. Selon les procédures, ils recevront différentes interventions et traitements : - Administrations de médicaments sur animaux vigiles par voie intrapéritonéale, sous-cutanée, intraveineuse, intramusculaire ou orale durant toute la période expérimentale (pouvant aller de trois jours à quatre semaines) - Des prélèvements sanguins et d'urine pourront être réalisés au moins une fois par semaine p - Chaque animal subira une ou deux interventions sous anesthésie et analgésie. Ils seront surveillés deux fois par jour post-opératoire jusqu’à la fin de l’expérimentation. - La fonction rénale pourra être évaluer, soit par la mesure de la production urinaire sur 24 h en cage métabolique, soit par la mesure de la filtration. - A la fin de l'étude, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie et des prélèvements (tissus et de fluides biologiques) seront réalisés pour analyses complémentaires. L’ensemble de ces procédures vise à garantir la fiabilité des modèles expérimentaux tout en assurant le respect du bien-être animal.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sont les suivants : - Stress à la contention, au traitement, au cage métabolique ; - Douleur légère et de courte de durée lors de l’injection de médicament ; - Perte de la fonction de rénale entrainant une réduction diminution de la tonicité et des problèmes urinaires ; - Douleurs post-opératoires en raison de l’incision cutanée et musculaire, mais aussi de l’acte chirurgical ; - Les effets indésirables en post-opératoire tels que la perte de poids, des démangaïsons, de l’inflammation au niveau de la suture, une déshydratation, une diminution de la locomotion, une prostration et tremblements.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Des prélèvements de fluides biologiques et de tissus seront réalisés pour des analyses complémentaires.
Remplacement
En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rat, souris), nous travaillons sur le développement de modèles in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiologique et les réponses systémiques aux candidats médicaments ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Les procédures chirurgicales et expérimentales seront basées sur les protocoles détaillés dans la littérature. Le nombre d’animaux par groupe sera réduit au maximum, permettant d’anticiper les différences interindividuelles et de réaliser des analyses descriptives et quantitatives. Pour la première phase de ce projet, concernant la validation des modèles et la mise en place des conditions expérimentales basées sur la littérature, un nombre restreint d'animaux (n=18) par procédure pour les deux espèces, si l’on considère trois groupes de 3 animaux (groupe contrôle, groupe opérée, groupe traité avec une molécule de référence). Un total de 72 animaux sera utilisé pour la première partie. Cette première phase permet également de s’assurer de la robustesse de la procédure et de l’habituation des manipulateurs, afin de s’assurer de la réussite des gestes pour la réalisation des procédures chirurgicales par la suite et donc de limiter le nombre d’animaux. Sur la deuxième phase de test de mécidaments, un nombre de 15 animaux par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène des interventions chirurgicale. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. Les effets des candidats médicaments seront évalués par comparaison avec les groupes traités par le solvant seul. Les animaux seront également randomisés afin d’éviter les biais. Les données enregistrées seront analysées par des tests statistiques appropriés.
Raffinement
Dans le cadre de ce projet, des mesures rigoureuses seront mises en place pour assurer le bien-être des animaux utilisés. Le personnel en charge rendra visite aux animaux durant leur période d’acclimatation afin de les habituer à la présence humaine et à la manipulation, réduisant ainsi leur stress. Les animaux seront logés en groupes sociaux stables de 2 à 5 individus, conformément à l’espèce et à la réglementation en vigueur. Les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie et analgésie pour limiter douleur et inconfort, accompagnée de sérum physiologique pour l’hydratation. Pendant la chirurgie, les paramètres physiologiques (température, fréquence cardiaque, respiratoire, muqueuses) seront surveillés. Les animaux seront installés sur un tapis chauffant pendant et après l’intervention pour prévenir l’hypothermie. Un suivi clinique sera réalisé 2 à 3 fois par jour après la chirurgie. La buprénorphine pourra être administrée par injection ou dans l’eau de boisson pendant les jours suivant l’opération, afin d’atténuer d’éventuelles douleurs. Pour favoriser l’alimentation, des aliments facilement accessibles (croquettes mouillées, gel) seront placés au fond des cages afin de limiter les mouvements post-opératoires. Une réhydratation sous-cutanée pourra également être administrée si nécessaire. Un système de scoring des signes cliniques et points limites spécifiques aux procédures sera appliqué. Les conditions d’hébergement respecteront les standards de bien-être : propreté des cages, accès libre à l’eau et à la nourriture, et enrichissement (igloo, safe crinklets, batonnet). De l’enrichissement supplémentaires pourra être ajouté (sopalin, croquette en fond de cage). Durant le traitement avec les candidats médicaments, une attention particulière sera portée au suivi de la masse corporelle et de l’état général (sutures, pelage, respiration, locomotion…).
Choix des espèces
Dans le cadre de l’étude de la fonction rénale après une ischémie-reperfusion, les rongeurs sont largement utilisés par la communauté scientifique. Un des avantages de ce type d’animal est qu’il répond très bien à la procédure ischémie-reperfusion et constitue un excellent mime pathophysiologique des conditions retrouvées chez l’Homme. Les animaux utilisés auront atteint l'âge adulte, c'est à dire plus de 8 semaines. Le choix de cet âge est basé sur les données de la littérature, qui ont identifié que 8 semaines représentent l'âge optimal pour la réussite de cette procédure chirurgicale.
Neuroprotection dans le syndrome de déficit en GLUT1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
680 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 640 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Dès quatorze jours de vie, une moitié reçoit des électrodes implantées dans le crâne au cours d'une opération de quatre-vingts minutes, d'autres une mini-pompe sous la peau renouvelée chaque mois, et tous subissent trois ponctions lombaires, des injections et des tests moteurs, de réflexes et de mémoire. Un test dit de dépression leur impose quatre jours de restriction alimentaire. Le projet teste des esters de cétones et du lactate comme sources d'énergie de remplacement, chez des rats porteurs d'une mutation qui prive leur cerveau de glucose. Le porteur explique avoir écarté la souris parce qu'elle ne fait pas de crises d'épilepsie, et parce que l'IRM donne une meilleure image sur un animal plus gros.
Objectifs
Le glucose est la principale source d’énergie du cerveau. Pour qu’il puisse atteindre les cellules cérébrales, il doit traverser certaines barrières naturelles grâce à des protéines spécialisées, notamment une appelée transporteur de glucose de type 1. Lorsque ce transporteur ne fonctionne pas correctement, le cerveau ne reçoit pas assez d’énergie. Cela provoque une maladie rare appelée syndrome de déficit en transport de glucose de type 1. Cette maladie débute généralement dans l’enfance et entraîne des crises d’épilepsie difficiles à traiter avec les médicaments classiques, un développement cérébral ralenti, de possibles malformations du crâne, et des troubles du mouvement comme des raideurs, des troubles de l’équilibre ou des mouvements involontaires. Actuellement, le traitement repose sur un régime alimentaire très particulier, appelé régime cétogène, qui fournit une autre source d’énergie au cerveau : les corps cétoniques. Mais ce régime ne fonctionne pas pour tous les patients, et il ne corrige pas les effets du manque d’énergie pendant les premières étapes du développement cérébral. Ce projet de recherche a pour objectif de tester de nouvelles sources d’énergie plus efficaces et plus faciles à administrer. Il s’agit notamment : d’esters de cétones, ajoutés dans l’eau de boisson, qui permettent d’atteindre rapidement un état favorable au fonctionnement du cerveau, et du lactate, administré de façon continue par une petite pompe implantée sous la peau. Ces traitements seront testés sur des rats porteurs d’une mutation qui réduit fortement l’expression du transporteur de glucose, afin de mieux comprendre leur efficacité et leur potentiel thérapeutique.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est de démontrer un effet protecteur sur le cerveau grâce à l’administration d’esters de cétones ou de lactate, en alternative au régime cétogène. Ce régime, bien que thérapeutique, est très contraignant et souvent mal toléré par les patients. Si ces nouvelles approches s’avèrent efficaces, elles pourraient représenter une solution plus simple et mieux acceptée. Cela ouvrirait la voie à l’élaboration de protocoles d’administration adaptés, avec pour objectif une amélioration significative de la qualité de vie des patients atteints du déficit en transport de glucose.
Procédures
Les animaux subiront les interventions suivantes : - biopsie de la queue pour génotypage : 1 fois, 5 min - mise en place du système d'enregistrement électroencéphalogramme, sous anesthésie gazeuse: procédure chirurgicale , réalisée 1 fois, durée 80 min - implantation des mini-pompes permettant de délivrer le lactate, sous anesthésie gazeuse :procédure chirurgicale, réalisée 1 fois par mois, 60 min. - injection intrapéritonéale : 2 fois, quelques secondes -ponction lombaire : prélèvement sur animaux anesthésiés , réalisés 3 fois, durée 10 min - prélèvements pour dosages biologiques : 4 fois, quelques secondes - La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements moteurs (1 fois, 10 min), de réflexes (3 fois, 5 min) et de mémoire (1 fois, 5 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (1 fois, test sur 4 jours)
Impact sur les animaux
La biopsie de la queue, réalisée pour le génotypage, provoque une douleur légère et de courte durée. L’implantation des mini-pompes ou des électrodes pour l’électroencéphalogramme, qui permet d’enregistrer l’activité électrique du cerveau, peut entraîner une douleur modérée. Les anesthésies nécessaires à ces enregistrements peuvent provoquer une variation du rythme cardiaque et, si elles sont prolongées, un risque de déshydratation. Les tests comportementaux peuvent induire du stress ou de l’anxiété. Enfin, lors du test évaluant des comportements de type dépressif, une restriction alimentaire est appliquée, pouvant entraîner une perte de poids et être une source d’inconfort pour l’animal (nuisance modérée).
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes
Remplacement
Des modèles cellulaires de déficit en GLUT1 existent, cependant, ces modèles s'affranchissent de la (patho)physiologie de l'organisme entier. Le but final de ce projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, ce projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur des molécules et de pouvoir envisager une application rapide chez l'Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle.
Réduction
Le recours à l’IRM, une technique d’imagerie non invasive, permet d’étudier les animaux sans avoir à les sacrifier, ce qui réduit le nombre total d’animaux nécessaires. Grâce à cette méthode, nous pouvons suivre l’évolution des mêmes animaux au fil du temps, tout en réalisant aussi des tests comportementaux sur eux. Le nombre d’animaux a été calculé à l’avance pour qu’il soit le plus faible possible, tout en assurant que les résultats soient fiables. Pour analyser les différences entre les groupes, nous utiliserons des méthodes statistiques reconnues.
Raffinement
Au niveau de l'hébergement, les animaux seront acclimatés à leur arrivée et seront élevés en cage collective, sur une litière en peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi d'un nid végétal, du coton et un tunnel en carton. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et/ou la personne en charge de l'expérimentation. Les chirurgies (implantation des pompes osmotiques, pour le groupe traité avec du lactate et mise en place des systèmes d'enregistrement EEG, ponction lombaire) seront réalisées sous anesthésie avec une antalgie adaptée. Les règles d’asepsie seront respectées. Une surveillance accrue, des soins post-opératoires et des mesures de gestion de la douleur seront réalisés. Une évaluation objectivée de l’état des animaux avec l’utilisation de grille d’évaluation/fiche de suivi, suivie de soins en cas de détection de souffrance seront mis en place. Pour les IRM sous anesthésie, un monitoring de la respiration sera mené afin de prévenir tout arrêt cardiorespiratoire. Tout au long de l’étude, les points limites adaptés et gradés seront appliqués, avec si nécessaire une prise de décision de mise à mort.
Choix des espèces
Il existe un modèle du syndrome de déficit en GLUT1 chez la souris mais ce modèle en présente pas de crises d'épilepsie. De plus, l'IRM est une technique non-invasive mais qui présente une faible sensibilité : plus les modèles sont gros et meilleure est sa résolution. Le rat est donc un modèle plus approprié que la souris Les animaux seront utilisés de 14 jours de vie à 60 jours. Les dispositifs d'EEG (la moitié des aniamux) seront implantés à 14 jours de vie afin de pouvoir monitorer dès le sevrage les effets des différents traitements. Les animaux seront suivis jusqu'à 60 jours pour mesurer les effets des différents traitements sur le court et le long terme afin d'optimiser le pouvoir translationnel du projet.
Implications des circuits du BNST dans le comportement d’anxiété en situation physiologique et pathologique: Etude éléctrophysiologique
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Opérées du crâne pour recevoir une injection de virus, implantées, puis maintenues sous anesthésie pendant quatre à huit heures pour l'enregistrement de leurs neurones, 2 176 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Certaines sont isolées de leurs congénères dès le sevrage à trois semaines et gardées seules jusqu'à l'âge adulte, d'autres soumises à un stress par contention. Le projet cartographie les circuits d'une structure cérébrale impliquée dans l'anxiété, chez des souris suivies jusqu'à dix-huit mois. Un animal encore douloureux trois jours après l'opération sera tué. Toutes sont tuées à l'issue, pour prélever leur cerveau.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans la thématique d’une dissection des circuits neuronaux à l’origine de l’anxiété. Les troubles de l’anxiété représentent un enjeu de société majeur. Aujourd’hui encore, le diagnostic des troubles de l’anxiété reste compliqué à poser notamment quand ces troubles sont associés à différentes comorbidités telles que la maladie de Parkinson rendant le diagnostic et la prise en charge des symptômes encore plus complexe Ce projet a pour objectif de mieux comprendre l’anxiété et potentiellement développer des stratégies pour diminuer les troubles de l’anxiété. Une de ces stratégies est de définir dans quelles circonstances les structures impliquées dans le contrôle de l’anxiété s’activent. Le noyau du lit de la strie terminale (BNST) joue un rôle central dans l’anxiété. Notre projet sera conduit chez des souris C57B6/J et des souris transgéniques afin de manipuler sélectivement différentes populations neuronales. De plus, le facteur « sexe » sera partie intégrante de notre projet puisqu’un dimorphisme sexuel dans le BNST chez l’homme et le rongeur ont pu être observé. Notre projet s’articulera autour de quatre objectifs pour étudier le fonctionnement et le rôle des différentes sous-populations du BNST dans le contrôle de l’anxiété et des comportements moteurs en situation physiologique et pathologique
Bénéfices attendus
Ce projet sera une caractérisation unique des circuits du BNST, structure clef dans le contrôle de l’anxiété en condition physiologique et pathologique. Nous pourrons ainsi déterminer si l’altération d’une sous-population ou d’une afférence spécifique du BNST pourrait être à l’origine de troubles anxieux notamment observés dans la maladie de Parkinson. A long terme, ce projet pourrait aider à améliorer le diagnostic des troubles anxieux et favoriser l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de réduire les symptômes anxieux des patients et en particulier ceux atteints de la maladie de Parkinson.
Procédures
Procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30min et 1H, - procédure chirurgicale avec implantation : entre 1H et 2H, Electrophysiologie in vivo sur animal anesthésié entre 4h et 8h, Electrophysiologie in vivo sur tête restreinte: 30 min de chirurgie
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent: 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie implantatoire , 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies et aux implants , 3/ un risque de stress à court terme induit par notre paradigme expérimental de tête restreinte 4/ un stress induit par notre protocole de stress par contention ou d’isolement social. Les expérimentateurs ont une solide expérience dans l'exécution des procédures décrite. L'effet indésirable attendu sur les animaux transgéniques restent néanmoins modéré sur cette lignée transgénique mimant les stade précoces de la maladie de Parkinson avec une présence de constipation et une baisse de coordination motrice à partir de 18 mois. Pour notre projet, nous étudierons cette lignée a différents âges (étude longitudinale jusqu’à 18 mois).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure pour des prélèvements pour des études histologiques
Remplacement
Le but du projet est de connaître la fonction de différentes sous-population neuronale du noyau du lit de la Strie terminale (BNST) et du reste de son circuit dans le contrôle de l’anxiété. La méthode la plus appropriée pour atteindre cet objectif consiste à combiner des approches d'injections stéréotaxiques, afin de faire exprimer des protéines capables d’activer ou d’inhiber l’activité neuronale combinées avec des d'enregistrements électrophysiologiques ou optique ex vivo sur tranches de cerveau, ou in vivo sur souris anesthésiée ou en tête restreinte et in vivo chez l’animal se comportant et nécessite donc le recours à l’animal. Aucun modèle "in vitro" ne peut reproduire la connectivité complexe des circuits du BNST.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable (le nombre d’animaux estimé permet d’effectuer des tests statistiques) et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude. Nous utiliserons ainsi 2176 animaux sur cinq ans. Nous travaillons sur des souris males et femelles issues des lignées transgéniques ainsi tous les animaux produits seront utilisés. La taille des groupes a été déterminée à l'aide d'analyses statistiques basées sur des calculs de puissance (power analysis). Ces analyses permettent de garantir que les groupes sont suffisamment grands pour détecter des différences significatives entre les conditions expérimentales tout en limitant le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Nous utilisons plusieurs procédures de raffinement, à savoir: 1/ choisir un modèle rongeur de la maladie de Parkinson à un stade précoce n’induisant pas de fort phénotype moteur nous permettant ainsi d’étudier le fonctionnement des circuits de l’anxiété 2/ l'utilisation d'animaux hébergés majoritairement dans la même structure ce qui ne nécessite aucun transport et donc limite le stress des animaux 3/ une manipulation des animaux par l'expérimentateur afin là aussi de limiter le stress 4/ l'établissement de points limites 5/ La mise en place de soins adéquats si nécessaire pendant et après l’opération et l'utilisation de l’anesthésie/analgésie lors de chaque protocole invasif. A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au coeur de nos préoccupations. Nos animaux transgéniques naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures chirurgicales. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Un analgésique sera administré afin de gérer la douleur péri-opératoire. Au cas où l’animal serait encore en souffrance 24 heures après l’injection d’antalgique postopératoire, une nouvelle injection aux mêmes doses et voie d’administration sera réalisée. Si la souffrance persiste au-delà de 3 jours, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des Vertébrés. En effet, c'est un mammifère présentant une proximité phylogénique avec l'espèce humaine et certains de ces comportements, notamment le comportement d’anxiété, les interactions sociales et la motricité volontaire, peuvent être rapprochés de l'espèce humaine. Cette espèce est aussi un bon modèle de pathologie neurologique telle que la maladie de Parkinson qui peut être induite chez la souris avec des surexpressions de la protéine alpha synucléine. Ce modèle possède aussi l'avantage de permettre des approches invasives (approches pharmacologiques, optogénétiques, pharmacogénétiques, électrophysiologiques et imagerie cellulaire) permettant d'étudier l'action de molécules ou d'une population neuronale sur le fonctionnement des circuits neuronaux de l’anxiété et les phénomènes synaptiques associés. Enfin, c'est chez cette espèce que sont faites des modifications génétiques permettant de cibler des populations neuronales précises que nous souhaitons étudier. Pour ce projet les chirurgies stéréotaxiques auront lieu sur des animaux âgés de 6 à 8 semaines, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge où l’animal sera plus à même de récupérer après les protocoles de chirurgie. Leur poids et leur taille sont stabilisés, la taille du cerveau homogène assurant une bonne reproductibilité des sites d’injection. Les enregistrements électrophysiologiques, les manipulations chémo/optogénétiques et l'imagerie calcique seront réalisés entre 15 et 49 jours après la dernière chirurgie. Pour les expériences d’interactions sociales, nous utiliserons des souris jeunes comme stimulus social entre P28- P35. Pour le protocole de stress, nous réaliserons un protocole de stress développemental que nous détaillerons ci-après où les souris expérimentales seront isolées après leur sevrage à P21 puis les souris seront utilisées à l'âge adulte (12 semaines) Pour l’étude longitudinale du phénotype anxieux chez les souris, nous utiliserons des souris âgées de 6 mois, 12 mois et 18 mois. Pour les expériences de comportement, d'enregistrement électrophysiologique et calcique, les souris seront adultes, au moins 11 semaines.
Prévention de l’épilepsie dans un modèle de souris.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des souriceaux sont biopsiés à la queue entre 4 et 7 jours de vie pour leur génotypage, des femelles gestantes reçoivent une injection par jour pendant trois jours et une chirurgie de 45 minutes sous anesthésie générale, et des embryons sont injectés. D'autres souris subissent une chirurgie d'une heure avec points de suture, une injection de 20 minutes sous anesthésie générale ou sept injections intrapéritonéales en deux semaines, et un test d'induction de l'épilepsie peut provoquer, selon le porteur, une "détresse". 2 494 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère. Les souris de la première procédure sont gardées en vie pour des accouplements, celles des autres procédures sont tuées pour des prélèvements, et 52 femelles doivent passer par la quatrième procédure. Il s'agit de comprendre le rôle d'une population transitoire de neurones dans la survenue des crises et de tester un nouveau traitement préventif. Le porteur ne précise ni la méthode d'induction des crises, ni le traitement testé, ni la répartition des 2 494 souris entre les procédures.
Objectifs
Le projet a pour objectif de mieux comprendre l’influence d’une population neuronale transitoire sur le développement de crise d’épilepsies. Nous voulons également tester un nouveau traitement potentiel pour protéger des crises d’épilepsie.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu du projet est de tester un nouveau traitement contre l’épilepsie et d’étendre nos connaissances sur le rôle de nos cellules neuronales d’intérêt sur leur survenance.
Procédures
- Les souriceaux, immobilisés pendant quelques secondes, subiront une biopsie à la queue (moins d'une seconde). - Les femelles gestantes subiront une injection d’une durée de 5 secondes une fois par jour pendant 3 jours et une intervention chirurgicale de 45 minutes sous anesthésie générale. - Les embryons subiront une injection d'une durée de 5 secondes. - Des animaux subiront une anesthésie générale suivie d'une injection pendant 20 minutes. - Des animaux subiront une intervention chirurgicale de 1 heure sous anesthésie générale et des points de sutures. - Des animaux subiront une injection (1x10 sec). Des animaux subiront 7 injections intrapéritonéales pendant 2 semaines (7 x 10sec).
Impact sur les animaux
- La biopsie à la queue provoque une douleur modérée. - Les injections peuvent induire une douleur légére et brève. - Les étapes d’anesthésie et de contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal. - Le test d’induction de l’épilepsie peut provoquer une détresse chez l’animal.
Devenir
Les animaux de la procédure 1 sont gardés en vie pour des accouplements ultérieurs et 52 femelles subiront la Procédure4. Les animaux des autres procédures seront mis à mort pour prélèvement.
Remplacement
Les questions abordées dans ce projet nécessitent un modèle animal. Le développement cérébral et l’épilepsie ne peuvent être étudiés qu’à l’échelle de l’organisme car aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité des interactions entre les types cellulaires du cerveau.
Réduction
Les effectifs ont été déterminés par une approche statistique, ainsi que par des expériences antérieures sur ce type d’études de modèles animaux. Ce nombre a été réduit au minimum nécessaire pour atteindre des résultats statistiquement significatifs. L’analyse statistique sera réalisée par un test statistique adéquat.
Raffinement
Tous les animaux vivent en groupes familiaux ou sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture illimitées. Lors des chirurgies, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées et reçoivent des injections d'antidouleurs avant et après l'opération. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation de la santé des animaux est mise en place. L’application stricte des points limites spécifiques aux expériences réalisées conduira à une prise en charge de la souffrance éventuelle des animaux.
Choix des espèces
La souris représente un organisme modèle de choix pour mener ces études sur le développement et le fonctionnement du système nerveux, principalement en raison de sa similarité avec l’Homme. Pour la biopsie, les souriceaux ont entre 4 et 7 jours ce qui permet de connaitre leur génotype avant le sevrage et le traitement commençant au 10ème jour. Les femelles gestantes sont des adultes de 2 à 6 mois. Les expérimentations sont menées sur des animaux aux stades de développement embryonnaire et postnataux où interviennent les phénomènes étudiés.
Essai thérapeutique sur un modèle préclinique murin de médulloblastome
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Jusqu'à vingt-cinq séances d'imagerie sous anesthésie gazeuse, neuf séances de radiothérapie et huit injections intrapéritonéales par animal : 96 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour des études de survie ou des analyses histologiques. Chacune reçoit d'abord une greffe intracérébrale de cellules tumorales, opération de trente minutes qui passe par une craniotomie et peut laisser des douleurs post-opératoires. La tumeur cérébrale provoque des lésions, une perte d'appétit et un amaigrissement, et la radiothérapie peut entraîner des troubles moteurs. Le porteur retient des souris nude immunodéficientes, qui acceptent la greffe de cellules humaines, et justifie l'effectif en une phrase, "le strict minimum requis pour l'obtention de résultats statistiquement significatifs".
Objectifs
L’objectif est de tester in vivo l'efficacité d’un anticorps anti-LVRF (Lymphatic and Vascular Resistance Factor) sur la progression du médulloblastome (tumeur cérébrale). La validation in vivo de l'efficacité de ce composé sur le développement de la tumeur pourrait permettre la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les médulloblastomes.
Bénéfices attendus
Les médulloblastomes sont les tumeurs cérébrales malignes les plus fréquentes chez les enfants. Ils représentent 20% des tumeurs du système nerveux central chez l'enfant. Malgré les traitements standards, la plupart des patients récidivent. Le taux de survie à 5 ans varie de 80% à 50%. Il est donc important de proposer aux patients de nouveaux traitements médicamenteux pour améliorer le résultat clinique. La validation in vivo de l'efficacité d'un traitement ciblant la protéine LVRF permettrait la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les médulloblastomes.
Procédures
Les animaux recevront une greffe intracérébrale de cellules tumorales (96 animaux, une seule intervention de 30 minutes environ sur animal sous anesthésie). La greffe intracérébrale est une procédure chirurgicale. Des animaux recevront une administration intrapéritonéale d’anticorps (96 animaux, intervention de 30 secondes environ sur animal vigile, 8 interventions/animal). Des animaux recevront une administration orale de composé anticancéreux ou de solvant (64 animaux, intervention de 30 secondes environ sur animal vigile, 5 interventions/animal). Des animaux recevront un traitement par radiothérapie (32 animaux, intervention de 30 minutes environ sur animal sous anesthésie, 9 interventions maximum/animal). Des animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) pour le suivi en imagerie de bioluminescence (96 animaux, intervention de 15 minutes environ, 25 interventions maximum/animal).
Impact sur les animaux
La manipulation, contention des animaux, les injections intrapéritonéales, les injections d'anesthésiques répétées, les injections d'analgésiques sont générateurs de stress pour les animaux. Les injections entrainent également une douleur légère de courte durée. La craniotomie peut générer des douleurs post-opératoires. La radiothérapie est susceptible de provoquer des troubles moteurs. La progression tumorale provoque des lésions cérébrales. La progression tumorale provoque à terme une perte d'appétit, donc une malnutrition et finalement une perte de poids. Des souris seront traitées par gavage. Les souris nude sont immunodéficientes.
Devenir
Pour chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés dans le cadre des études de survie, ou pour les analyses histologiques.
Remplacement
L'efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments sur la croissance tumorale des médulloblastomes nécessitent une approche expérimentale in vivo. En effet, il n’existe pas à ce jour de système suffisamment robuste pour mimer toute la complexité biologique et physiologique des médulloblastomes. Ce travail sur l'animal vivant s'inscrit dans la continuité d'expériences et de résultats que nous avons obtenu in vitro.
Réduction
Le nombre d'animaux sera limité au strict minimum requis pour l'obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
Pour le bien-être de l'animal, les souris seront logées avec un enrichissement (copeaux de bois, dômes) et en groupes de 5 individus par cage afin d’éviter le stress de l’isolement. Pour les administrations orales, nous utiliserons des sondes souples pour éviter la moindre irritation ou blessure. Des cages pourvues de couvercles filtrants seront disposées dans une armoire ventilée. Les animaux seront anesthésiés avant l’intervention chirurgicale. Avant chirurgie et en post- opératoire, une analgésie est prévue. Pour les administrations orales, nous utiliserons des sondes souples. Un anesthésique local sera injecté sur le site d’incision et appliqué aux points de pression de l’appareil stéréotaxique. Du sérum physiologique préchauffé sera injecté pour hydrater et réchauffer l’animal. Un onguent ophtalmique sera appliqué sur les yeux durant la chirurgie pour assurer leur hydratation. L’imagerie de bioluminescence sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Pour les administrations orales, nous utiliserons des sondes souples pour éviter la moindre irritation ou blessure. Des croquettes imbibées d’eau et de la gelée nutritive seront déposées dans la cage après la chirurgie pour faciliter la prise alimentaire. La détection de toute souffrance de l’animal sera assurée et le niveau de souffrance évalué en fonction d'une grille de score. En fonction des scores obtenus, il sera envisagé une analgésie ou l'euthanasie de l'animal.
Choix des espèces
Les données bibliographiques démontrent que le modèle murin est le plus adapté pour aborder les questions relatives aux tumeurs cérébrales. L'utilisation de lignées murines immunodéficientes permet la transplantation de cellules d'une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d'une espèce différente (souris). Les tumeurs de médulloblastome générées dans ce modèle animal sont particulièrement similaires aux tumeurs humaines. Les souris seront réceptionnées à l’animalerie à l’âge de 8 semaines et utilisées à l’âge de 9 semaines. En effet, nous souhaitons réaliser l’étude sur de jeunes souris adultes. A cet âge optimal de 9 semaines, l’organisme de l’animal est parfaitement mature sur le plan métabolique, hormonal et tissulaire, ce qui assure une bonne vascularisation tumorale après la greffe ainsi qu’une croissance tumorale plus régulière et prévisible.
Impact d’un peptide sur le comportement social et l’activité cérébrale chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Trois interventions chirurgicales crâniennes d'une heure à une heure trente, la pose d'un "chapeau" en ciment dentaire et un isolement social pouvant durer douze semaines attendent 108 mâles et 108 femelles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 336 souris sont concernées au total, 216 tuées pour des analyses histologiques et 120 souris dites visiteuses gardées vivantes pour d'autres projets, la moitié d'entre elles subissant en plus une restriction d'eau de onze heures. Le projet cherche à relier un peptide à l'activité d'un circuit cérébral et au comportement social, avec une ouverture annoncée vers la schizophrénie. Le porteur qualifie l'isolement de douze semaines d'"indispensable" à la motivation sociale des animaux, et annonce neuf passages en tâches comportementales, six de trente minutes et trois de dix minutes, sans dire lesquelles.
Objectifs
Ce projet de recherche porte sur le rôle physiologique d'un peptide et son impact sur l’activité cérébral d’un circuit entre deux zones du cerveau, l’hippocampe et le cortex frontal, qui participe au comportement social de la souris. Ce peptide est impliqué dans la plasticité et l’activité cérébrale ainsi que dans le comportement social. Grâce à des animaux transgéniques sur-exprimant ou sous-exprimant ce peptide , nous testerons comment de l’impact de ce peptide sur l’activité cérébrale dans ce circuit sous-tend les altérations des comportements sociaux et anxieux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre l'impact de la modulation de ce peptide sur l’activité du circuit cérébral entre les différentes parties de l’hippocampe et le cortex préfrontal. On pourra également confirmer que cette altération est à la base des altérations des comportements sociaux et anxieux dues à la modulation de l’expression de ce peptide . Finalement, cette modulation des comportements sociaux pourrait sous-tendre les troubles dans des maladies neuropsychiatriques telle que la Schizophrénie. Les résultats de cette étude permettront également d’évaluer l’intérêt de la modulation cérébrale par ce peptide comme cible thérapeutique possible dans ces pathologies.
Procédures
Les animaux expérimentaux (108 mâles et 108 femelles) seront soumis à trois procédures chirurgicale entre 1h00 à 1h30. Des tests comportementaux sont réalisés à l’âge adulte grâce à 9 passages dans des tâches (6 tâches de 30 min, trois tâches de 10min environs). Uniquement à l'âge adulte, un isolement de 12 semaines maximum sera réalisé. Les animaux visiteurs, qui sont un renforcement social dans nos comportements, seront soumis à trois tâches de 10 min avec au maximum deux restriction dans une zone de 20 x 10 cm. Une moitié de ces animaux visiteurs seront également soumis à une restriction hydrique de 11h.
Impact sur les animaux
Lors de ce projet la majeure nuisance sera un isolement à l'âge adulte qui entraîne un stress, mais est indispensable pour la motivation sociale des animaux. la chirurgie pourrait entrainer une douleur post-opératoire (douleur modérée et limitée dans le temps par une prise en charge antalgique). L'anesthésie est également une nuisance via les risques (déshydratation, hypothermie, dépression respiratoire), ainsi que la présence de chapeau en ciment dentaire qui pourrait gêner certains animaux. Pour une partie des animaux visiteurs, ils subiront une restriction hydrique de 11h.
Devenir
Dans la procédure, les animaux expérimentaux seront euthanasiés pour nous permettre de réaliser des analyses histologiques. Toutes les souris visiteurs mâles et femelles seront gardées en vie pour une possible utilisation dans d’autres projets
Remplacement
Ce projet de recherche porte sur le rôle du peptide Aeta sur l’activité cérébral et son impact sur le comportement social et anxieux chez la souris. Le comportement social ne peut pas encore être remplacé par des modélisations informatiques, ni par des études de neurones en culture.
Réduction
Au sein d'une même expérience sociale, nous passerons l’animal d’intérêt testé plusieurs fois pour avoir un maximum de mesure d’activité cérébrale avec un minimum d’animaux. De plus, nous passons deux fois les animaux "visiteurs" en tests sociaux pour éviter d'avoir autant d'animaux visiteurs que d'animaux expérimentaux. Le nombre d'animaux est choisi en lien avec nos expérimentations précédente et le fait que les comportements sociaux sont très variables. Les tests statistiques adhoc seront réalisés en fonction de la normalité ou non des distributions. Toutes les souris visiteurs mâles et femelles des procédures seront gardées en vie pour une possible utilisation dans d’autres projets. S’ils ont subi de l'agressivité, l'avis du vétérinaire référent sera sollicité.
Raffinement
Pour les chirurgies, les animaux sont anesthésiés globalement et également localement au niveau de la peau avant ouverture. Une analgésie opératoire et post-opératoire est également réalisée. Ensuite lors du suivi post-opératoire, une analgésie pourra être utilisée en fonction des signes de douleurs. Suite à la chirurgie, un suivi sera réalisé grâce à une grille de score avec des points limite adaptés. Afin de réduire les effets anxiogènes de l'isolement social, des objets permettant de faire un nid seront disposés dans les cages de vie. En ce qui concerne les gènes possibles en lien avec les chapeaux en ciment dentaire, nous observerons le comportement des animaux et adapterons l'enrichissement des cages pour éviter que les animaux s'y accrochent avec le chapeau
Choix des espèces
Le choix de la souris est dû au fait que la souris est un mammifère social dont des capacités cognitives et sociales sont adaptées aux questions posées dans le projet. De plus, la souris est choisie car les lignées modèles ont été développées chez cet animal Les animaux seront étudiés à l'âge adulte (à partir de 70 jours) pour voir l’activité cérébrale durant leur comportement social et anxieux établis.