Procédures sévères

Deux passages d'IRM par semaine sous anesthésie générale, pendant jusqu'à quatre-vingts jours, attendent chacune des 404 souris du projet. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et tuées pour récupérer leur cerveau. Après l'implantation d'un glioblastome humain dans le cerveau, 192 reçoivent une irradiation cérébrale de 15 Gy en une séance et 288 une injection intracrânienne de lymphocytes T modifiés, le porteur attendant une perte de poids, de motricité et de sensibilité. Les souris NSG sont choisies pour leur absence d'immunité, qui permet la greffe de cellules humaines et évite les réactions contre le traitement, et le porteur ajoute que le laboratoire partenaire maîtrise déjà ce modèle.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est une tumeur cérébrale maligne dont l’hétérogénéité et l’agressivité limitent l’efficacité du traitement. Parmis les nouveaux enjeux thérapeutiques, l’immunothérapie constitue une piste intéressante. A ce jour, la meilleure approche d’immunothérapie réside dans le transfert cellulaire adoptif, basé sur l’administration d’effecteurs cellulaires immunitaires spécifiques aux antigènes tumoraux afin de stimuler et promouvoir la prolifération, l’expansion et le maintien des fonctions effectrices immunitaires anti-tumorales. L’utilisation de cette technique avec des cellules T modifiées par des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) représente une piste thérapeutique pertinente contre les GBM. Ce projet a ainsi pour but d’évaluer l’efficacité préclinique d’un transfert adoptif de lymphocytes T Vγ9Vδ2-CAR (LTgd) expriment un CAR dirigé contre la forme acétylée du disialoganglioside GD2 (CAR-OAcGD2), cible prometteuse pour la thérapie par cellules CAR T contre les GBM. Le protocole d’injection du traitement par CAR-LT (ou solution saline) correspond à une injection intracrânienne intratumorale à un débit de 0.6µL/min. Cette procédure d’administration fait suite à une précédente saisine.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est une amélioration des stratégies thérapeutiques actuelles pour les tumeurs cérébrales (GBM).

Procédures

Les animaux sont soumis à plusieurs types d’interventions : - chirurgie : implantation de tumeurs cérébrales sous anesthésie générale, 20 minutes par animal maximum, réalisée une fois sur chaque animal. 404 animaux sont concernés. - imagerie IRM : pour suivie de la croissance tumorale : sous anesthésie générale, 10 minutes par animal maximum, réalisée deux fois par semaine jusqu’à 80 jours. 404 animaux sont concernés. - radiothérapie : irradiation cérébrale (15 Gy en une fraction) sous anesthésie générale, 15 minutes par animal maximum, réalisée une fois sur chaque animal. 192 animaux sont concernés. - injection intracrânienne du traitement sous anesthésie générale, 30 minutes par animal maximum, réalisée une fois sur chaque animal. 288 animaux sont concernés.

Impact sur les animaux

L’établissement du modèle de tumeur cérébrale est permis grâce à une procédure chirurgicale sévère qui peut induire des douleurs. Les animaux recevront une prise en charge analgésique pré- et post-opératoire et seront surveillés jusqu'à leur réveil, puis replacés dans leur cage et remis à l'animalerie. Les animaux seront surveillés quotidiennement. D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous nous attendons à observer une perte de poids, de motricité et de sensibilité chez les aniamux ayant développé un GBM, suite à l'injection (procédure sévère). Les séquences d’imagerie par IRM (procédure légère) n’induisent pas de douleur, de perte de poids ou de perturbation du comportement, mais elles peuvent induire un autre point limite qui est défini pendant l’acquisition IRM : c’est la diminution de la fréquence respiratoire en deçà de 30 respirations par minutes. S’il est atteint et que la diminution du pourcentage d’isoflurane ne suffit pas à augmenter la fréquence respiratoire, la procédure sera arrêtée. A chaque sortie des animaux de la zone EOPS, lors des séquences d'imagerie par IRM, un risque d'infection ou de contamination par les autres animaux n'ayant pas de phénotype dommageable existe. D'après l'expérience du laboratoire, la radiothérapie cérébrale (procédure légère) induit une perte de poids transitoire chez les animaux.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort dans le but de récupérer le cerveau pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Les tumeurs de type GBM sont connues pour être multi-compartimentales, hétérogènes et caractérisées par une immunosuppression forte. Au-delà du compartiment tumoral, d’autres composantes jouent un rôle essentiel dans la réponse au traitement, telles que la vascularisation, l’hypoxie et l’immunité. Leurs interactions réciproques avec les cellules tumorales influencent la réponse au traitement et la survie des patients. L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer ces différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de GBM afin de déterminer le comportement des cellules de ces lignées de GBM. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico.

Réduction

L’utilisation de méthodes d’imagerie non-invasives se conforme à la réglementation en vigueur dans le respect de la réduction du nombre d’animaux car elles permettent de suivre à différents temps l’évolution de la tumeur chez le même animal sans nécessité d’euthanasie de plusieurs animaux à chaque temps. Chaque animal constitue dans ce cas son prorpre contrôle et permet de réduire le nombre total d’animaux nécessaires pour l’étude. Pour pouvoir obtenir des analyses statistiques robustes, ces simulations ont été faites à l’aide d'un l’outil statistique en ligne et selon des données préliminaires acquises dans l’unité, pour lesquelles la survie du modèle murin de glioblastome du 1er groupe (tumeur) est de 28 jours et celle du 2ème groupe (tumeur + radiothérapie) est de 10 jours. Les paramètre saisis sur BiostaTGV sont les suivants : valeur de variabilité = 14 (écart type commun σ), risque de première espèce α = 0.05, puissance 1-β = 0.8, avec un test de nature bilatéral. Un nombre de 12 animaux par sous-groupe de traitement est donc nécessaire afin d'obtenir une différence significative avec une valeur statistique de 5 % pour un effet de 80 % du traitement. Ce nombre d’animaux est considéré comme maximum et pourra être revu à la baisse durant l’étude. Nous justifions également le nombre d’animaux par sous-groupe d’après l’expérience du laboratoire et la DAP issue du laboratoire collaborateur au projet.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de quatre individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéfécieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, craft). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. La mesure du poids sera faite trois fois par semaine. Les animaux disposeront de croquettes humidifiées dans le fond de leur cage ainsi que de complément alimentaire (DietGel Recovery) afin de limiter et compenser la perte de poids attendue suite aux procédures expérimentales. Les différences procédures ont été pensées de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés ainsi que par le choix de points limites cohérents. A chaque sortie des aniamux de la zone EOPS, une désinfection au phagospray est réalisée sur chaque matériel utilisé avant chaque expérimentation et pour chaque procédure.

Choix des espèces

Les modèles tumoraux in vivo sont nécessaires afin d’évaluer l’effet du traitement sur la progression de la tumeur tout en prenant en compte toutes les composantes du microenvironnement tumoral dont les interactions avec les cellules tumorales peuvent biaiser l’effet thérapeutique du traitement. Le développement de xénogreffes de tumeurs humaines nécessite l’utilisation d’individus immunodéficients afin d’éviter tout rejet de greffe. Nous utiliserons donc des souris immunodéprimées NSG. Notre traitement étant constitué de CAR-T, l’absence d’immunité de ces souris évitera les réactions croisées et dirigées contre les CAR-T. Ce modèle permettra donc la croissance de cellules tumorales humaines et la survie des cellules immunitaires humaines, permettant ainsi d’étudier l’effet du traitement sur un modèle de tumeur cérébrale reposant sur l’implantation de cellules de glioblastome d’origine humaine et reflétant l’hétérogénéité moléculaire des GBM observée en clinique. Le choix de la souris NSG est idéal car ce modèle étant déjà maîtrisé dans le laboratoire partenaire, il permettra d’obtenir des résultats fiables et reproductibles. Nous utiliserons des souris mâles et femelles, en lien avec les recommandations actuelles pour mieux représenter la réalité clinique car, si le sexe ratio du GBM est de 1.6 (en faveur des hommes), il touche aussi bien des femmes que des hommes. L’ensemble des animaux utiliés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 8 semaines en début de protocole. A ce stade, le cerveau est mature et cela permettra le développement de tumeurs plus reproductibles. Il sera possible de suivre l’évolution des animaux sur des temps plus longs.

1 170 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Des cellules tumorales leur sont injectées dans le cerveau, une partie subit trois semaines plus tard l'ouverture du crâne pour retirer la tumeur, reçoit dans la cavité des cellules immunitaires modifiées ou un implant, et donne deux prises de sang par semaine. Le porteur annonce une perte de poids pouvant dépasser 20 %, une tête inclinée et une perte progressive d'équilibre, et écrit que le retrait de la tumeur ne provoque pas de douleur puisque le cerveau n'a pas de terminaisons nerveuses. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne permet d'étudier une chirurgie associée à une immunothérapie, ce qui selon lui "justifie l'utilisation du modèle animal", le projet étant mené avec un groupe pharmaceutique.

Objectifs

Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale la plus fréquente et la plus agressive chez l'adulte. Malgré un traitement lourd associant chirurgie (résection pour réduire la taille de la tumeur), chimiothérapie et radiothérapie, la survie moyenne des patients est inférieure à 15 mois, en raison de la survenue quasi systématique de récidives. Le principal facteur explicatif de ces récidives est la repousse de cellules très invasives qui se sont propagées à partir de la masse tumorale et qui ne sont donc pas éliminées par la résection chirurgicale. Sur la base de ces données, il est urgent d'élaborer de nouvelles stratégies de traitement. Si l'immunothérapie (utilisation des cellules immunitaires contre le cancer) s'est révélée prometteuse dans de nombreux types de cancer, notamment le mélanome, le cancer de la prostate, le cancer du poumon non à petites cellules et le carcinome rénal, elle n'a pas pu concurrencer les autres traitements dans le cas du GBM, en raison du niveau anti-inflammatoire élevé de la tumeur. Il est donc essentiel de comprendre comment nous pouvons stimuler le système immunitaire pour surmonter cet échec et améliorer son efficacité. Sur la base de ces données et en collaboration avec un groupe pharmaceutique, qui dispose déjà de données préliminaires sur la pertinence de l'utilisation de cellules immunitaires contre le cancer, nous voulons étudier l'utilisation de cellules immunitaires pour augmenter la stimulation de la réponse immunitaire anti-tumorale Dans l'ensemble, cette étude vise à explorer l'utilisation de cellules immunitaires modifiées pour cibler les cellules tumorales après la résection par chirurgie, dans le but d'améliorer la survie et de contrôler la croissance de la tumeur. En injectant ces cellules immunitaires modifiées dans la cavité chirurgicale, nous espérons améliorer leur efficacité à tuer les cellules tumorales et à stimuler l’ensemble du système immunitaire.

Bénéfices attendus

Le glioblastome est la tumeur cérébrale agressive la plus fréquente chez l'adulte et l'un des cancers les plus mortels. Malgré des traitements intensifs tels que la chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie, la récidive est presque inévitable (90 %). Avec ce projet, notre objectif principal est d'acquérir des connaissances importantes qui peuvent être appliquées dans des contextes cliniques pour le traitement du GBM. Les options thérapeutiques pour ces tumeurs solides ont été relativement jusqu'à présent peu efficace .

Procédures

Dans cette étude, les animaux subiront plusieurs interventions afin d’évaluer l’efficacité d’un traitement basé sur des cellules immunitaires modifiées contre le glioblastome. Tout d’abord, une première intervention consistera en l’injection de cellules tumorales directement dans le cerveau des animaux sous anesthésie générale. Cette procédure, réalisée une seule fois par animal, durera environ 10 à 15 minutes. Trois semaines après l’injection des cellules tumorales, certains animaux subiront une résection chirurgicale de la tumeur, toujours sous anesthésie générale. Cette intervention, qui vise à mimer la prise en charge clinique du glioblastome chez l’humain, durera environ 30 à 45 minutes. Dans le cadre du traitement expérimental, des cellules immunitaires modifiées seront injectées soit directement dans la tumeur, soit dans la cavité laissée par la résection. Cette injection, réalisée une seule fois sous anesthésie brève, durera environ 5 minutes. Chez certains animaux, un implant biodégradable sera placé dans la cavité tumorale au moment de la résection. Cet implant permettra une libération contrôlée des cellules immunitaires et/ou de médicaments anti-inflammatoires pour améliorer l’efficacité du traitement. Parallèlement, des prélèvements sanguins seront effectués deux fois par semaine afin de mesurer l’évolution de la tumeur. Chaque prélèvement, réalisé en quelques secondes sur une veine de la queue, permettra de limiter le stress des animaux. Enfin les animaux seront opérés sous anesthésie générale profonde juste avant leur mise à mort pour remplacer le sang par une solution de fixation (durée de l’anesthésie : 15 min). Les animaux ne reprendront pas conscience après cette anesthésie.

Impact sur les animaux

Pendant l'injection des cellules tumorales :Suite à l’injection des cellules tumorales, les animaux peuvent présenter une douleur localisée au site d’injection apparaissant immédiatement après la procédure et pouvant persister jusqu’à 24 heures ; cette douleur sera contrôlée par l’administration d’analgésiques. Des troubles transitoires de l’équilibre et une légère diminution de l’activité motrice peuvent également être observés durant les premières 24 heures. Avec le développement de la tumeur cérébrale, attendu dans les 1 à 2 semaines suivant l’inoculation, une perte progressive de l’équilibre, une réduction de la mobilité, une inclinaison anormale de la tête et un amaigrissement peuvent apparaître. Ces signes tendent à s’aggraver avec la croissance tumorale et seront surveillés quotidiennement afin d’identifier le moment approprié pour appliquer les critères d’arrêt. Pendant la résection : l'os du crâne étant mal innervé, la craniotomie provoque une douleur modérée. Alors que l'incision de la peau provoque une douleur modérée, la résection de la tumeur elle-même ne provoque pas de douleur puisque le cerveau n'a pas de terminaisons nerveuses. À la suite de cette opération, l'animal peut présenter une réduction de ses mouvements et de sa mobilité, ainsi qu'une perte de coordination dans les heures qui suivent l'intervention. Une perte de poids peut également être observée dans les jours qui suivent l'opération. Injection de monocytes modifiés: À la suite de l’injection de ces cellules immunes modifées, une perte progressive de poids supérieure à 20 % et un pelage hirsute, notamment au niveau du museau, peuvent être observés. D’autres signes incluent une réduction de la mobilité et une posture anormale (par exemple tête inclinée), comme rapporté dans des modèles similaires dans la littérature. Ces signes traduisent une dégradation de l’état général et entraîneront l’euthanasie conformément aux critères d’arrêt afin d’éviter toute souffrance. Nous prévoyons un stress et une douleur minimes lors des injections intracrâniennes, La douleur associée aux prélèvements sanguins répétés sera équivalente à celle de l’introduction d’une aiguille et pourront provoquer un stress chez la souris.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Les résultats préliminaires obtenus en laboratoire et les données de la littérature nous amènent à penser que les changements de comportement des cellules tumorales après une intervention chirurgicale sont intimement dépendants de leur environnement. Cependant, le microenvironnement tumoral (toutes les cellules non tumorales autour de la masse tumorale) est un système complexe avec un nombre extrêmement élevé de paramètres, dont la plupart sont inconnus : il est actuellement impossible de recréer complètement cet environnement ex vivo. C'est pourquoi des études animales sont nécessaires. Notre hypothèse est que l'administration d'une thérapie par CAR-monocytes (cellules immunitaires modifiées) en utilisant la cavité chirurgicale renforcera la capacité du système immunitaire à combattre la tumeur et fournira une meilleure réponse au traitement standard par radiothérapie et chimiothérapie. Cette approche ne peut pas être étudiée de manière fiable par des modèles in vitro, car aucun ne permet de reproduire l'interaction complexe entre la cavité chirurgicale, le microenvironnement tumoral et la thérapie immunitaire. Cela justifie l’utilisation du modèle animal.. En outre, nos collaborateurs ont déjà utilisé des monocytes modifiés in vitro en co-culture 2D, testé avec des cellules GBM ce qui a permis de sélectionner les meilleurs candidats et de prouver leur efficacité contre les cellules tumorales. De plus, nous souhaitons évaluer l'effet d'une résection chirurgicale combinée à une immunothérapie utilisant des monocytes modifiés. A notre connaissance, aucun modèle in vitro ne permet d'étudier cette procédure sans utiliser d'animaux.

Réduction

Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons procédé à une analyse documentaire approfondie. En outre, notre expérience passée nous permet de limiter le nombre d'animaux. Plus précisément : 1. Nous avons identifié le nombre de cellules à injecter pour obtenir une tumeur de taille correcte. Nous n’aurons donc pas besoin de reproduire ces expériences 2. Nous avons appris à réséquer la tumeur, cette technique étant déjà pratiquée et maîtrisée dans notre laboratoire depuis plusieurs années. 3. Pour les traitements par CAR-Monocytes (cellules immunitaires modifiées), nous avons réalisé de nombreuses expériences in vitro avec l'aide de nos collaborateurs, ce qui nous a permis de déterminer les doses et le moment du traitement, réduisant ainsi de manière significative le nombre d'animaux utilisés. 4. Le suivi régulier de la progression de la tumeur par la mesure d'un marqueur sanguin nous permet de savoir quand réséquer la tumeur, réduisant ainsi également le nombre d'animaux utilisés. 5. Les analyses nécessitent une faible quantité de matériel, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires. 6. Pour ce projet, le nombre de souris utilisées a été soigneusement calculé afin d’obtenir des résultats fiables tout en utilisant le moins d’animaux possible. Le nombre de souris par groupe est donc réduit au strict minimum, en fonction du type d’expérience tout en garantissant que les résultats soient statistiquement solides.

Raffinement

Conformément aux recommandations internationales, notamment dans le domaine de l'oncologie, les animaux sont suivis individuellement plusieurs fois par semaine (2 à 3 fois) afin de s'assurer de leur bien-être. Celui-ci sera évalué à l'aide d'une grille de cotation. Les interventions invasives sont réalisées sous anesthésie générale et les animaux reçoivent systématiquement des traitements analgésiques appropriés pendant et après les opérations. Les interventions chirurgicales sont réalisées dans des conditions de stérilité maximale par un personnel spécialement formé. Les animaux bénéficient d'une prise en charge standardisée de la douleur et sont régulièrement suivis après l'opération. Après injection du traitement, les animaux seront suivis 2 à 3 fois par semaine pendant les deux premières semaines, puis une surveillance quotidienne sera mise en place dès le développement de la tumeur. Cette surveillance quotidienne sera assurée y compris les week-ends et les jours fériés. L’objectif est de détecter précocement toute perte de poids ou signe de souffrance. En cas de perte de poids détectée, une surveillance rapprochée avec pesées quotidiennes et soins complémentaires (hydratation, compléments alimentaires) sera assurée. Après injections du traitement, les animaux seront suivis quotidiennement (jours ouvrés donc 5j/semaine) afin d’évaluer la perte de poils, et pesés plusieurs fois par semaine. Si une perte de poids est détectée, l’animal sera alors surveillé de manière plus rapprochée avec une pesée quotidienne et des soins complémentaires effectués (hydratation, compléments alimentaires). Nous travaillons avec un personnel expérimenté dans l’observation et la gestion des souris, capable de reconnaître rapidement les signes de douleur ou de détresse. Le suivi est effectué de manière objective en s'appuyant sur la grille d'évaluation spécifique au projet. Si nécessaire, des soins supplémentaires, tels que des analgésiques ou réhydratation, compléments alimentaires seront apportés. Si aucun soulagement n’est possible, les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

Nous mènerons nos expériences en utilisant des souris, espèce de choix pour les études de cancérogenèse et les expériences menées en thérapeutique du cancer. Elles ont depuis longtemps servi à l'étude de thérapies antitumorales, notamment parce que leur physiologie est proche de celle de l'Homme. La connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris immunodéficientes, qui permettent l'implantation de cellules humaines sans rejet et offrent un modèle pertinent pour évaluer la croissance tumorale et les effets des traitements anticancéreux in vivo. Adultes de 7-8 semaines, un âge qui permet une bonne prise tumorale. De plus, les animaux à cet âge supportent mieux l’anesthésie et la chirurgie

Aucun antidouleur ne peut leur être administré, puisqu'il s'agit d'une étude de toxicité. 120 rates Wistar au maximum vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées puis autopsiées. Rasées sous anesthésie, elles reçoivent sur le dos et les flancs une dose unique et volontairement maximale de l'une des vingt substances à tester, maintenue au contact de la peau pendant vingt-quatre heures en cage individuelle, avant quatorze jours d'observation. Seules des femelles sont utilisées, le porteur les décrivant comme plus sensibles que les mâles aux effets toxiques, et justifiant l'ensemble par un projet "requis par la loi" pour lequel le remplacement "n'est pas envisageable".

Objectifs

La toxicité est la mesure de la capacité d’une substance à provoquer des effets néfastes et mauvais pour la santé ou la survie chez toute forme de vie (animale telles qu’un être humain, végétale, fongique, bactérienne), qu'il s'agisse de la vitalité de l'entité ou d'une de ses parties (ex : peau, foie, reins, poumons.... chez l'animal). La toxicité cutanée aiguë est l'effet néfaste qui se produit dans un court laps de temps et qui résulte de l'administration par application cutanée d'une dose unique d'une substance. Une étude de toxicité aiguë aboutit classiquement à la détermination de la dose maximale tolérée (DMT). La DMT cutanée est la valeur dérivée d'une dose unique de substance dont l'administration par application cutanée peut provoquer des signes clairs de toxicité mais sans effets toxiques graves ni de mortalité. C'est une technique exploratoire, permettant de "trier" les produits les plus toxiques et le but d’une étude de toxicité cutanée aiguë est d'évaluer les effets d'une exposition à une forte dose préalablement à la réalisation d’études d’efficacité. L’objectif de ce projet d’une durée de 5 ans, réalisé selon les exigences réglementaires, sera d’évaluer la toxicité éventuelle de 20 substances, naturelles et/ou chimiques, administrées par application cutanée en traitement unique avec une dose de départ choisie en fonction des connaissances sur chacune de ces substances. Ces études seront réalisées chez des rats femelles uniquement, considérées comme étant plus sensibles que les mâles aux effets potentiellement toxiques de substances. Chaque étude sera réalisée de façon séquentielle afin d’évaluer la toxicité des substances testées. Les animaux seront rasés préalablement à l’application cutanée de chacune des substances à tester qui seront maintenues au contact de la peau pendant 24 heures. Les animaux seront observés et évalués régulièrement pendant ces 24 heures et plus particulièrement pendant les 6 premières heures suivant l’application cutanée, et au bout de 24 heures tout résidu de substance sera éliminé. Les animaux seront ensuite observés quotidiennement au cours des 14 jours de suivi, week-end et jours fériés compris, afin de détecter tout signe de toxicité cutanée et générale, comportement anormal ou atteinte de point limite pouvant nécessiter leur euthanasie. Les animaux seront pesés régulièrement pendant les 14 jours de suivi jusqu’à leur euthanasie avant la réalisation d’une autopsie macroscopique.

Bénéfices attendus

Le développement de nouveaux produits de traitement et de dispositifs médicaux pour traiter des pathologies inflammatoires cutanées, ou pour permettre la cicatrisation de plaies cutanées, nécessite de s’assurer que ces futurs produits de traitement n’induiront aucun effet toxique cutanée suite à leur application. Il est donc nécessaire d’en faire leur évaluation toxicologique en testant des doses beaucoup plus élevées que celles qui seront utilisées chez l’Homme afin d’avoir un facteur de sécurité suffisant. Les études de toxicité cutanée aiguë permettent de prouver la sécurité pour la santé humaine de nouvelles substances pharmaceutiques et de les classer en fonction de leur niveau de danger pour ceux pour lesquels aucune estimation de valeur ponctuelle de toxicité n’est disponible. Elles constituent une première étape dans le développement pharmaceutique de ces nouvelles substances avant l’évaluation de leur efficacité dans des modèles précliniques au niveau cellulaire puis sur un organisme entier. L’enjeu social est donc de prouver l’absence éventuelle de toxicité de substances naturelles et/ou chimiques à visée pharmaceutique pour une utilisation future chez l’homme.

Procédures

La totalité des rats utilisés dans ce projet, entre 20 et 120 au maximum, sera soumise à 2 anesthésies de courte durée, 5 minutes environ, pour effectuer le rasage du dos et des flancs et 24 heures plus tard l’application cutanée des substances à évaluer et la mise en place d'un système de maintien pour conserver les substances au contact de la peau pendant 24 heures.

Impact sur les animaux

L’administration d’une forte dose unique de substance est susceptible d’induire des signes de toxicité cutanée, avec ou non une réversibilité, mais pas d’effets toxiques graves ni de mortalité. Cependant, de tels effets toxiques graves tels qu’une perte de poids importante, des signes cliniques de toxicité, voire une mortalité, ne peuvent être exclues. Ces effets pourraient être observés rapidement, le jour même de l’application cutanée d’une substance et dans les heures suivant celle-ci, ou avoir lieu sur un temps plus ou moins prolongé allant d’un à plusieurs jours après application cutanée de la substance. La mise en place d’un système de maintien au contact de la peau pendant 24 heures des substances testées nécessite le placement en cage individuelle pendant cette durée pour éviter le retrait de ce système de maintien par les autres congénères de la cage, et l’ingestion de substance par le rat traité ou par ses congénères.

Devenir

Procédure expérimentale n° 1 (seule procédure expérimentale) : les 120 rats au maximum nécessaires à la réalisation de ce projet seront euthanasiés avant la réalisation d’une autopsie macroscopique des organes et tissus pour s’assurer de l’innocuité des substances testées

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet, projet requis par la loi. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant d’évaluer la toxicité cutanée de substances sur un organisme entier et sur un temps prolongé. Cela ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de cette évaluation toxicologique de substances permettant d’obtenir des résultats prédictifs quant aux objectifs envisagés, selon les recommandations internationales en vigueur. La dose initiale de chacune des substances à évaluer sera choisie en fonction des connaissances sur chacune des substances à évaluer et sera la plus élevée possible. Cette dose initiale sera choisie comme spécifié dans la ligne directrice qui sera suivie en fonction des informations disponibles pour chacune des substances à évaluer. Suivant le nombre de doses à utiliser, 1 à 6 rats maximum seront nécessaires pour chacune des 20 substances à évaluer. Aucune analyse statistique ne sera effectuée pour l’ensemble de ce projet.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux après l’application cutanée des substances à évaluer. Les animaux seront ainsi observés très régulièrement pendant les 24 heures suivant l’application cutanée de chacune des 20 substances à évaluer, et plus particulièrement pendant les 6 premières heures. Ils seront ensuite observés quotidiennement au cours des 14 jours de suivi, week-end et jours fériés compris, afin de détecter tout signe de toxicité, tout comportement anormal ou atteinte de point limite. Les animaux seront pesés régulièrement pendant les 14 jours de suivi jusqu’à leur euthanasie avant la réalisation d’une autopsie macroscopique. Etant donné qu’il s’agit d’études de toxicité, aucune médication ne pourra être donnée aux animaux pour soulager leur éventuelle souffrance. Par contre si un animal présente un niveau de souffrance trop important se traduisant par des tremblements importants (convulsions), une paralysie, une immobilité complète, un arrêt de prise alimentaire…, il sera mis à mort en conformité avec les recommandations éthiques. Le jour et l’heure de son euthanasie seront notés avec le plus de précision possible et une autopsie macroscopique sera réalisée pour détecter toute anomalie en termes de forme, taille et couleur sur l’ensemble des organes et tissus des cavités abdominales et thoraciques et de la surface corporelle. Une analyse des organes et tissus anormaux observés, prélevés et fixés sera réalisée. Les rats seront hébergés collectivement dans des grandes cages transparentes, excepté pendant les 24 heures de contact des substances avec la peau où l’hébergement sera individuel, avec un enrichissement adapté. Les rats étant des animaux nocturnes, actifs donc la nuit, ils seront placés en cycle de lumière jour/nuit inversé (obscurité de 8h00 à 20h00) pour respecter leur rythme biologique et observer leur comportement pendant leur phase active.

Choix des espèces

Le rat est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet et celle qui est recommandée par la ligne directrice qui sera suivie pour mener de telles études de toxicité cutanée aiguë. Les animaux seront de jeunes rats âgés de 10-12 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 11-13 semaines pour le démarrage des expérimentations, avec un poids de 275-300 g. Cela correspond au poids de rat recommandé par la ligne directrice qui sera suivie pour mener de telles études.

Tester la toxicité de composés avant un éventuel passage chez l'être humain conduit ici à utiliser 3 276 souris et 2 184 rats, tous tués à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les substances sont administrées par injection ou par gavage, d'une fois par semaine à deux fois par jour, avec mise à jeun possible et jusqu'à cinq séances d'imagerie hebdomadaires. Le porteur décrit des prélèvements sanguins allant jusqu'à 15 % du volume sanguin total, une perte de poids possible, une léthargie et une altération de l'état général selon le composé testé. Il détaille un raffinement fait d'enrichissement et d'anesthésie, et précise dans le même texte qu'"aucune analgésie n'est possible au cours des études", parce qu'elle masquerait les symptômes de toxicité recherchés.

Objectifs

Le développement préclinique fait appel à l’expérimentation animale, qui est une étape indispensable à la connaissance d’un futur médicament avant de l’administrer à l’homme. Les recherches précliniques sont imposées par le Code de la santé publique comme préalable obligatoire à toute expérimentation sur la personne humaine (Article L1121-2). Ces études précliniques ont pour but d’évaluer l'efficacité, la pharmacocinétique et la toxicité du produit avant son éventuelle administration à l'Homme dans un contexte physiologique et pertinent. Ces résultats permettront de conclure sur l’intérêt de continuer ou non l’étude préclinique de ces traitements. Ce projet est une nouvelle soumission d’un projet précédemment accepté et arrivant à expiration auquel a été apporté quelques modifications, notamment l’ajout de modes d’administration supplémentaires du composé, l’ajout de modes de prélèvements de sang supplémentaires, la possibilité de mettre les animaux à jeun pour le traitement, ou le suivi de la distribution du produit dans le corps des animaux en usant d’imagerie non-invasive. Ce projet permettra de définir le niveau de toxicité du produit en ayant une indication sur la relation dose-réponse, la réversibilité des potentiels effets adverses observés et en déterminant la concentration sans effet nocif observé, afin de poursuivre ou non son étude préclinique. L’évaluation de cette toxicité se fera selon 2 procédures, la première visant à déterminer la dose maximale tolérée après administration unique chez le rat ou chez la souris, la seconde étudiant la toxicité de traitements en doses répétées chez le rat ou chez la souris, en suivant respectivement les lignes directrices OCDE 420 et 407.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer la toxicité du composé avant son éventuelle administration à l'Homme dans un contexte physiologique et pertinent. Ces résultats permettront de conclure sur l’intérêt de continuer ou non l’étude préclinique de ces traitements, et de répondre aux exigences du Code de la santé publique, fournissant un préalable nécessaire à toute expérimentation sur l’humain (Article L1121-2).

Procédures

Les animaux pourront être soumis à des administrations de composés par injection ou gavage, de manière aiguë (une seule administration) ou répétée sur une durée allant de quelques minutes à environ 15 minutes par séance (temps nécessaire à la contention, l’injection et l’observation immédiate). Le nombre d’administration dépendra de la molécule et de la voie d’administration considérée, cela pourra être une fois par semaine jusqu’à deux fois par jour. Des prélèvements sanguins pourront être réalisés au cours de l’étude, en utilisant un analgésique et un anesthésique, tout en respectant le volume maximal autorisé ainsi que le temps de récupération par animal. Chaque prélèvement dure environ 5 minutes. Des séances d’imagerie non invasive sous anesthésie gazeuse pourront être effectuées, avec un maximum de 5 par semaine et cela jusqu’à la fin de l’étude ou alternativement jusqu'à disparition du signal. Chaque séance dure environ 5 à 10 minutes, incluant l’induction, la mesure et le réveil. Enfin, une mise à jeun pourra être envisagée selon le protocole : pré-injection (pendant la nuit pour les rats, 3 à 4 heures pour les souris) et/ou post-injection (3 à 4 heures pour les rats, 1 à 2 heures pour les souris).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues dépendront du type d’administration employée. Ainsi, les injections peuvent provoquer une douleur transitoire ou une petite irritation au point de ponction. L’administration par gavage peut entraîner un inconfort, une irritation de l’œsophage et du stress lié à la contention. Les administrations répétées, quel que soit le mode, peuvent générer une appréhension de la manipulation et un stress accru. Deux types de prélèvements sanguins pourront être effectués : d’une part des prélèvements intermédiaires réalisés sous anesthésie, en mandibulaire ou en sublingual, qui peuvent causer une douleur passagère, une petite hémorragie locale ou un stress lié à la contention ; d’autre part des prélèvements terminaux réalisés sous anesthésie et analgésie, en rétro-orbital, réalisés uniquement en fin de procédure avant l’euthanasie des animaux. Selon la nature du composé testé, des effets indésirables systémiques peuvent également apparaître, tels qu’une perte de poids, une modification du pelage ou une altération de l’état général (léthargie, diminution de l’activité, troubles digestifs).

Devenir

Euthanasie : les organes seront recupérés pour évaluation de la toxicité organe-dépendante.

Remplacement

Notre projet se focalise sur un modèle intégré d’étude de toxicologie nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Ce système est indispensable pour reproduire la physiologie d’un organisme entier et imposé par le Code de la santé publique comme préalable obligatoire à toute expérimentation sur la personne humaine (Article L1121-2). Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur la toxicité du traitement. Pour les études en traitement aigu, l’analyse des données entraînera la comparaison au maximum de 7 groupes d’animaux (groupe contrôle négatif, groupes traitement avec jusqu’à 6 doses de produit testées). Chaque dose sera choisie en fonction de la toxicité observée après administration de la dose précédente (arbre décisionnel). Pour les études en traitement répété, l’analyse des données entrainera la comparaison de 6 groupes d’animaux (groupe contrôle négatif, groupe traitement avec dose faible, groupe avec dose intermédiaire, groupe traitement avec dose forte, groupe « recovery » contrôle négatif, groupe « recovery » traitement avec dose forte). Une analyse statistique sera réalisée à l’aide d’un test non paramétrique. Un nombre de 14 animaux par groupe (7 mâles et 7 femelles) est requis pour obtenir une puissance statistique minimale et connaitre l’impact du traitement en fonction du sexe.

Raffinement

Pour les produits injectés présentant des caractéristiques fluorescentes ou bioluminescentes, de l’imagerie non- invasive pourra être effectuée pour suivre le profil de distribution du produit, permettant d’augmenter la quantité d’informations recueillies sur l’animal sans dégrader le bien-être animal. Les conditions d’hébergement respecteront le respect de l’animal ; il y aura 2 à 3 rats ou 5 à 6 souris par cage selon le poids des animaux, avec nourriture et eau à disposition et présence d’un enrichissement. Lors de l’imagerie, comme lors des administrations du produit par les voies les plus invasives ou lors des prélèvements sanguins intermédiaires (15 % du volume sanguin total de l’animal, 1 fois au cours de l’étude), les animaux seront anesthésiés avec un inducteur chimique ou gazeux. Lors d’une anesthésie chimique, cette dernière sera antagonisée pour favoriser le réveil et la récupération des animaux. En revanche, aucune analgésie n’est possible au cours des études, puisqu’elle pourrait masquer l’apparition et/ou le maintien de symptômes liés à la toxicité du composé étudié. A la fin des procédures, lors des prélèvements de sang en rétro-orbital avant euthanasie, une analgésie sera en revanche réalisée par l’ajout d’un collyre analgésique en plus de l’anesthésie gazeuse. Un tableau de suivi a été mis en place permettant de définir les points limites adaptés.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d'étude très développés et caractérisés, étant donné leurs tailles et leurs spécificités. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études de toxicité en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Le choix de l'espèce utilisée dépendra en particulier de la molécule utilisée, des objectifs et des besoins de l'étude. Si une molécule s'avère efficace dans une espèce, celle-ci pourra être éventuellement testée dans l'autre espèce afin de montrer un efficacité espèce-indépendante. Les animaux seront âgés de 6 à 8 semaines au minimum, à un stade de jeune adulte pour permettre de déterminer l’impact du traitement sur des animaux à maturité sexuelle dont les organes et le système immunitaire sont pleinement développés.

Les rats qui survivent à l'inhalation sont tués aux temps prévus par la méthode, ceux qui meurent pendant l'essai servant à caler la concentration suivante. 720 rats vont ainsi être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Rasés sur le dos, ils sont enfermés seuls jusqu'à quatre heures dans une enceinte ou immobilisés dans un tube, sans pouvoir se nourrir ni boire, pendant qu'un produit chimique est diffusé. L'objectif déclaré est d'établir des valeurs seuils françaises de toxicité aiguë pour des substances qu'un site industriel pourrait rejeter accidentellement dans l'air, quand les données existantes sont jugées insuffisantes.

Objectifs

Ce projet a 2 objectifs : - Dans un 1er temps, définir un protocole d’essais chez le rongeur permettant l’établissement de valeurs seuils de toxicité aiguë françaises dans le cadre de l’exposition par inhalation à des substances chimiques émises accidentellement dans l’air par un site industriel, - Dans un 2ème temps, appliquer ce protocole pour établir des valeurs seuils de toxicité aiguë françaises pour des substances chimiques susceptibles d’être émises accidentellement dans l’air par un site industriel, dans le cas où les données toxicologiques existantes sur ces substances sont insuffisantes ou inadaptées. Au maximum, 5 études permettant de déterminer ces valeurs de référence pour 5 substances chimiques seront menées sur 5 ans.

Bénéfices attendus

Ces études devront permettre : - Dans un 1er temps, de définir un protocole d’essais chez le rongeur permettant l’établissement de valeurs seuils de toxicité aiguë françaises dans le cadre de l’exposition aiguë par inhalation à des substances chimiques émises accidentellement dans l’air par un site industriel, - Dans un 2ème temps, d’établir, en appliquant ce protocole, des valeurs seuils de toxicité aiguë françaises pour des substances chimiques susceptibles d’être émises accidentellement dans l’air par un site industriel, dans le cas où les données toxicologiques existantes sur ces substances sont insuffisantes ou inadaptées.

Procédures

Observations cliniques et pesées (moins de 5 min) : au moins 2 fois/semaine, au maximum tous les jours. Rasage (moins de 5 min) : 1 fois avant l’exposition en mode « corps entier » ; contention manuelle des animaux vigiles et rasage d’une partie du dos à l’aide d’une tondeuse dédiée aux petits animaux. Habituation au placement dans les dispositifs d’exposition (jusqu’à 30 min par jour durant 3 jours consécutifs) : 1 fois avant l’exposition ; placement des animaux vigiles dans les loges de l’enceinte d’exposition pour ceux exposés « corps entier », dans une aire où sont disposés des tubes d’exposition (1er et 2ème jour) et dans les tubes (3ème jour) pour ceux exposés par voie oro-nasale. Exposition en mode « corps entier » (au maximum 4h) : 1 fois ; placement individuel des animaux vigiles dans des loges dans une enceinte dédiée et exposition. Exposition par voie oro-nasale (au maximum 4h) : 1 fois ; placement des animaux vigiles dans les tubes d’exposition et exposition. Température rectale (moins de 5 min) : 1 fois après l’exposition ; contention manuelle des animaux vigiles et mesure de la température rectale. Comportement (15 min à 1h15/évaluation suivant les tests) : 1 fois après l’exposition ; placement des animaux vigiles dans des dispositifs de mesure de l’activité, de l’anxiété, des capacités de mémorisation, de coordination locomotrice et de la force musculaire, et enregistrement de leurs déplacements et aptitudes physiques. Pléthysmographie (moins de 1h15/évaluation) : 1 fois après l’exposition ; placement des animaux vigiles dans des enceintes de pléthysmographie corps entier et enregistrement de paramètres respiratoires. Mécanique pulmonaire (moins de 45 min) : 1 fois préalablement à la fin de l’étude ; administration d’un antalgique, anesthésie générale, anesthésie locale, acte chirurgical (trachéotomie), administration d’un myorelaxant et mesure de la mécanique pulmonaire.

Impact sur les animaux

Rasage : stress lié à la manipulation et à la contention ; Exposition en mode « corps entier », analyse comportementale/pléthysmographie : stress lié à la manipulation et au placement dans les dispositifs d’exposition ou de test, à l'impossibilité de se nourrir et de s’abreuver (suivant l’enceinte d’exposition utilisée), et à l'isolement durant au maximum 4h ; Exposition par voie oro-nasale : stress lié à la manipulation et à la contention du placement dans les tubes, à l'immobilisation, à l'impossibilité de se nourrir et s’abreuver, et à l'isolement durant au maximum 4h ; Mesure de la température rectale : stress lié à la manipulation, à la contention et à l’introduction de la sonde. De manière générale, la manipulation des animaux pourra modifier leurs réactions à la préhension et leur niveau d’activité, et une légère perte de poids pourra être observée dans les jours qui suivront l’exposition (effets habituellement relevés suite à une exposition aiguë par inhalation chez des animaux témoins de même souche, âge et sexe). L’exposition à la substance pourra également induire des effets locaux et systémiques susceptibles de faire souffrir les animaux. Des signes cliniques anormaux, affectant notamment la respiration, la peau et les muqueuses, pourront être observés.

Devenir

Conformément à la méthodologie de détermination de valeurs seuils de toxicité aiguë françaises, tous les animaux survivants aux expositions seront mis à mort au temps d’euthanasie définis à l’issue de chaque procédure.

Remplacement

Lorsque les données toxicologiques existantes sur des substances chimiques sont insuffisantes ou inadaptées pour établir des valeurs seuils de toxicité aiguë françaises, des essais de toxicité aiguë in vivo s'avèrent nécessaires. Concernant le choix des animaux, le projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°403, 433 et 436 (utilisation de rats mâles et femelles, ou uniquement d’un des deux sexes si des informations sur la toxicité de la substance le justifient) à l’âge adulte et de souches couramment utilisées en laboratoire.

Réduction

Le nombre d’animaux qui sera utilisé a été défini par rapport aux recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour l’évaluation de la toxicité aiguë par inhalation et aux exigences de la modélisation dose-réponse pour l'établissement des valeurs seuils de toxicité aiguë françaises. Des simulations ont été réalisées à l'aide d’un logiciel dédié à l’estimation de valeurs de référence pour l’évaluation des risques toxicologiques pour déterminer les modalités d’essai les plus adaptées. Une analyse des données bibliographiques disponibles sur la substance à tester et ses analogues sera réalisée préalablement à son étude pour déterminer les concentrations et les durées d’exposition pertinentes à tester. L’essai préliminaire et l’étude principale seront réalisés de manière séquentielle, par concentration. Les concentrations et les durées d’exposition à tester seront déterminés par les signes de toxicité et le taux de mortalité observés en utilisant le logiciel dédié.

Raffinement

Les conditions d’hébergement des animaux seront enrichies pour favoriser leur bien-être. Ils seront hébergés à plusieurs par cage pour leur socialisation. Un animal sera isolé de ses congénères en cas de lésions, d’agressivité, de respiration anormale ou de comportement anormal. Un fond sonore sera diffusé la journée pour leur permettre de s’habituer au bruit généré par les manipulations et limiter le stress des expérimentations. Du matériau leur permettant de nidifier et du matériau en bois à ronger seront disposés dans leurs cages d’hébergement. Pour les animaux exposés « corps entier », après la tonte préalable à l’exposition, des friandises seront déposées dans leurs cages d’hébergement. Pour les animaux exposés par voie oro-nasale, des tubes semblables à ceux utilisés pour l’exposition seront disposés dans leurs cages d’hébergement pour leur permettre de se familiariser avec le dispositif et se cacher. Préalablement à l’exposition, les animaux seront habitués au placement dans l’enceinte d’exposition, pour ceux exposés « corps entier », et à la contention imposée par le placement dans les tubes, pour ceux exposés par voie oro-nasale. Après chaque phase d’habituation, des friandises seront déposées dans leurs cages d’hébergement. L’eau de boisson sera supplémentée avec un complément de réhydratation et/ou des gels nutritifs seront mis à disposition dans les cages d’hébergement. En cas d’exposition « corps entier » dans l’enceinte > 1 m3, des biberons seront mis à disposition des animaux durant l’exposition. Les animaux seront observés attentivement au plan clinique dans les heures qui suivront l’exposition, et jusqu’à ce que leur bon état de santé soit avéré. Des critères de raffinement des gestes techniques qui seront pratiqués, des points limites relatifs à l’apparition de signes de douleur et des actions correctives visant à soulager les animaux ont été définis en adéquation avec les paramètres étudiés pour assurer leur bien-être. Des critères supplémentaires à ceux listés dans la présente demande pourront être définis au cas par cas suivant les informations toxicologiques disponibles sur la substance étudiée. Le cas échéant, ils seront indiqués dans le protocole d’essai associé.

Choix des espèces

Ces expérimentations seront réalisées chez le rongeur car sa physiologie est largement connue et car il constitue un modèle de prédiction des effets toxicologiques reconnu par la réglementation (cf. Document d'orientation de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques n°39). Ce projet suivra les recommandations des lignes directrices de l’Organisation de Coopération et de Développement Economiques pour l’étude de la toxicité aiguë par inhalation (n°403, 433 et 436), d’utilisation du rat et de souche couramment utilisée en laboratoire, d’animaux adultes (âgés au moment de l’exposition de 8 à 12 semaines), d’un poids de ± 20% du poids initial moyen des animaux exposés au préalable, et de femelles nullipares et non gravides le cas échéant.

84 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune testée deux fois par jour pendant quatre semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie d'une heure trente pose des électrodes intracérébrales, puis chaque animal vit seul en cage pour éviter que ses congénères n'arrachent l'implant. Les tests appliquent des stimulations aux pattes et aux paupières afin d'installer une mémoire de peur, puis de mesurer à quel point elle se généralise à des contextes ambigus. Les troubles anxieux touchent 15 à 20 % de la population selon le porteur, mais les stratégies thérapeutiques annoncées relèvent du long terme, quand l'isolement et les stimulations sont, eux, immédiats.

Objectifs

Le cerveau utilise un mécanisme pour déterminer si une situation ressemble à une expérience connue (complétion de motif) ou si elle est perçue comme nouvelle (séparation de motif). Ce processus a été principalement étudié dans une région du cerveau appelée l’hippocampe dorsal. En revanche, une autre région, l’hippocampe ventral impliquée dans la régulation de l’anxiété reste encore peu explorée dans ce contexte. Dans ce projet, nous émettons l’hypothèse que, dans des contextes flous, le cerveau tend à « combler les vides » en associant la situation à des souvenirs de peur. Ce mécanisme pourrait expliquer pourquoi certaines personnes généralisent leur peur à des situations qui ne présentent pourtant aucun danger réel. L’objectif de ce projet sera de développer une tâche comportementale chez la souris permettant d’évaluer comment la généralisation de la mémoire de la peur peut être modulée par l’information contextuelle présentée.

Bénéfices attendus

Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ces troubles touchent environ 15 à 20 pour cent de la population à un moment ou un autre de leur vie. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.

Procédures

Une chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie. L’intervention dure environ 1h30, et chaque animal bénéficie ensuite d’une période de récupération post-chirurgicale de 7 jours. À l’issue de cette période de récupération, les animaux commencent le protocole de comportement qui s’étend sur environ quatre semaines. Chaque souris vigile est testée deux fois par jour, dans des sessions de 30 minutes, séparées par une récupération de 3 heures.

Impact sur les animaux

Les nuisances induites par la procédure comprennent, en lien avec la chirurgie, une légère perte de poids, des difficultés de cicatrisation et une douleur post-opératoire durant environ 48 heures, ainsi que des risques anesthésiques tels que l’hypothermie, la détresse respiratoire ou un arrêt cardio-respiratoire. L’hébergement individuel est susceptible d’induire un stress social. Dans le cadre des tests comportementaux, les stimulations appliquées au niveau des pattes et des paupières peuvent engendrer un stress modéré accompagné d’une douleur transitoire.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue du projet afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses nécessaires post-mortem).

Remplacement

Un impératif majeur des études portant sur les récepteurs naturels du cerveau est de préserver l’intégrité des réseaux neuronaux, afin de maintenir leurs connexions synaptiques. À ce jour, il n’existe aucune méthode alternative à l’utilisation du modèle rongeur pour répondre à cette condition. Les techniques d’enregistrement chronique sont invasives et ne peuvent pas être réalisées chez l’humain ni chez le sujet sain. Elles sont réservées à des patients épileptiques, dont l’activité cérébrale est déjà altérée, et ne permettent pas de mener des études systématiques, car le placement des électrodes dépend des besoins médicaux. Par ailleurs, les connaissances actuelles et les capacités technologiques ne permettent pas encore de reproduire avec précision le fonctionnement de ces réseaux neuronaux à l’aide de modèles informatiques.

Réduction

Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Les statistiques utilisés sont des tests paramétriques et non paramétriques classiques ainsi que des tests en lien avec les analyses de réseaux neuronaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 3 ans, ce projet de recherche impliquera 84 animaux

Raffinement

Après leur réception, les animaux commerciaux sont habitués à l’animalerie pendant une semaine avant de débuter toute procédure. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Durant la chirurgie, la température corporelle des animaux est maintenue constante à l’aide d’un tapis chauffant, afin d’éviter toute hypothermie liée à l’anesthésie. Les administrations seront effectuées conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux sont stabulés dans les conditions d'hébergements standards (enrichissement de nidification) comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux implantés (suivi à l’aide d’une grille post-opératoire) seront maintenus en hébergement individuel : la présence d'une autre souris pourrait ralentir la cicatrisation et endommager les électrodes implantées chroniquement (grattage, rognage) entraînant l’euthanasie de l’animal. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire pour éviter que les souris ne s’arrachent mutuellement leurs implants, permet donc de maximiser la quantité de données récoltées sur chaque animal et ainsi de minimiser le nombre total d'animaux pour le projet. Cependant, pour diminuer le stress lié à l’hébergement individuel les animaux implantés sont maintenus dans de grandes cages contenant 2 compartiments séparés par une cloison transparente percée de trous permettant ainsi à l’animal isolé d’avoir des interactions avec l’animal isolé dans le second compartiment (contiguïté visuelle, olfactive, auditive). Lorsqu’un animal est implanté, pour éviter toutes blessures et d’endommager les électrodes, la nourriture ne sera plus placée dans la mangeoire au niveau de la grille de la cage, mais sera directement dispersée dans la sciure. Cette démarche aura pour avantage d’enrichir l’environnement de l’animal puisqu’il sera obligé de fouiller la sciure pour trouver les croquettes. Cet enrichissement sera également complété par le dépôt de morceaux de bois dans la cage de l’animal. Une surveillance sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé.En cas de signe de douleur (échelle de grimace), les animaux seront exclus du protocole.

Choix des espèces

La souris est un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central (SNC) développé. Il s’agit également d’un animal qui se prête aux modifications génomiques. Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. Il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de l’animal. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Sa robustesse et ses capacités d'apprentissage la qualifie comme un modèle idéal d'étude de la mémoire chez les mammifères. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.