Procédures sévères
Étude de la migration des cellules métastatiques du cancer du poumon à petites cellules dans le cerveau
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
1 455 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, dont 675 recevront une fenêtre de verre de trois millimètres implantée dans le crâne au cours d'une chirurgie d'une heure. Toutes reçoivent une injection de cellules tumorales directement dans le cerveau, puis sont tuées pour prélèvement et étude histologique du cerveau. Le développement de la tumeur peut entraîner une perte de poids et une hausse de la pression intracrânienne, l'enjeu déclaré étant de comprendre comment les cellules du cancer du poumon à petites cellules migrent vers le cerveau. Une perte de poids supérieure à 20 %, une prostration, une agressivité persistant plus de 48 heures ou les premiers tremblements déclenchent la mise à mort.
Objectifs
Ce projet se déroule dans 2 Etablissements utilisateurs EU1 et EU2. Chez l’Homme, le cancer du poumon, le plus malin et le plus fréquent à l'échelle mondiale, inclut un sous-type particulièrement agressive appelé cancer du poumon à petites cellules (CPPC), représentant 14 % des cas de cancer pulmonaire. Environ 20 % des patients atteints de CPPC présentent des métastases cérébrales au moment du diagnostic, constituant la principale cause de décès dans cette population. En raison de sa nature agressive et de son potentiel métastatique élevé, le CPPC est utilisé par notre équipe comme modèle cliniquement pertinent pour comprendre les mécanismes responsables de la migration des cellules métastatiques, en particulier les métastases cérébrales, qui demeurent mal compris malgré son impact clinique majeur. Ce projet est une collaboration avec des chercheurs Américains, spécialiste mondial de ce type de cancer, qui nous donne accès à des lignées cellulaires dérivées de modèles murins et de tumeurs humaines. Les cellules détectent la nature physique et biochimique de leur environnement pour contrôler des fonctions cellulaires (adhésion, migration, prolifération, apoptose, différenciation) impliquées dans le développement du cancer. Notre hypothèse de travail est que le potentiel métastatique des cellules est associé à l’acquisition de nouvelles structures adhésives et de nouvelles structures du cytosquelette de l'actine.
Bénéfices attendus
Le projet vise à approfondir notre compréhension des mécanismes de dissémination métastatique du cancer du poumon à petites cellules (CPPC) dans le cerveau. En étudiant les interactions entre les cellules de CPPC et leur microenvironnement cérébral, il cherche à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter le CPPC métastatique. En comparant ces mécanismes avec ceux d'autres types de cancer cérébral comme le glioblastome, le projet offre une perspective élargie sur les approches thérapeutiques possibles. En utilisant des modèles murins, il contribue à améliorer la fiabilité des tests précliniques de nouveaux traitements. De plus, en caractérisant le microenvironnement tumoral, il ouvre la voie à une meilleure compréhension de son rôle dans la progression de la maladie et à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques. En résumé, ce projet offre une opportunité précieuse d'avancer dans la lutte contre le cancer du poumon en fournissant des données pertinentes pour le développement de traitements plus efficaces et ciblés.
Procédures
675 souris auront la pose d'un dispositif d'imagerie. Pour avoir ce dispositif il faut procéder à une chirugie (dans l'EU1) sur animal endormi qui dure environ 1h avec utilisation de produits anti douleur. Un dispositif d'imagerie (fenetre en verre) de 3mm de diamètre sera implanté dans le crâne de la souris (dans l'EU1) . Toutes les souris auront une injection directe dans le cerveau pendant qu'elles seront endormies (dans l'EU1 et 2) . Les souris auront une préparation des tissus pour l'étude des propriétés cellulaires après une ou plusieurs injections (si la souris a un dispositif d'injection ou non)(dans l'EU1 et 2) . Cette préparation des tissus se fera sur animal endormi très profondement avec utilisation d'anti douleur. L'animal sera ensuite euthanasié et le cerveau sera récupéré(dans l'EU2) .
Impact sur les animaux
Les étapes de la chirurgie entrainent de la douleur chez les animaux et modifient leur comportement. Le développement tumoral intracérébral peut entraîner une perte de poids et/ou une augmentation de la pression intracranienne.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement du cerveau et etude histologique
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations transposables à l'homme. Ce protocole nécessite l'utilisation d'animaux. Il est nécessaire d’utiliser des approches in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux et leurs interactions avec les cellules tumorales sont modifiées dans ces préparations.
Réduction
Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe (i.e mâle et femelle). La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés
Raffinement
A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au coeur de nos préoccupations. Nos animaux naîtront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter leurs points limites post injection de cellule tumorale (week-ends, vacances et jours fériés inclus) : poids (pesés quotidienne), si plusieurs pertes de poids consécutives, avec une perte >20% par rapport à la pesée de référence à raison d’une pesée par jour, les animaux seront euthanasiés. Si l’animal présente un comportement stéréotypé ou à des comportements anormaux (agressivité, cachexie, stéréotypie, prostration) il sera dans un premier temps isolé et surveillé, l’animal est euthanasié si pas d’amélioration après 48h. Les animaux seront euthanasiés, dès les premiers signes neurologiques détectés (tremblements, problème de mobilité) Trasport entre les deux EU: Le transfert entre les 2 animaleries est effectué par les utilisateurs. Ils ramènent les cages sur un chariot du PIV-EXPE au quatiréme étage (EU B33063940) vers la salle d’hébergement du CHRONIC au deuxiéme étage (EU B33063943) en utilisant un montecharge adapté. Ils suivront une acclimatation de 4 jours minimum avant de commencer le protocole expérimental.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux à l'age adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.
Evaluation d’un nouveau substitut vasculaire construit par ingénierie tissulaire à partir du cordon ombilical humain EU1/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
Une ouverture du thorax, un pontage coronarien et l'occlusion volontaire d'une artère du cœur, puis un suivi de six semaines à un an avec une à trois anesthésies supplémentaires : 54 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Tous sont tués à la fin pour prélèvement de tissus. Il s'agit de valider un greffon vasculaire fabriqué à partir d'artères de cordon ombilical humain avant son implantation chez l'être humain, le projet se déroulant sur deux établissements avec transport des animaux entre les deux. Les minipigs sont retenus pour une anatomie cardiovasculaire comparable à celle de l'humain et un développement achevé à 60 ou 80 kilos, l'effectif de 54 intégrant une mortalité estimée à 20 %.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est la validation d'un greffon artériel construit par ingénierie vasculaire à partir d'artère de cordon ombilical humain pour un pontage cardiaque chez un modèle animal de cochon. Ce greffon totalement d’origine humaine ainsi validé permettra de proposer un produit « prêt à l’emploi » à usage clinique sans problème de rejet. Le projet sera réalisé dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour finalité de proposer un greffon naturel humain sans problème de rejet afin de répondre à un problème majeur de Santé publique : les pathologies cardio-vasculaires dont le principal traitement repose sur le pontage coronarien. Pour pratiquer cette intervention, il est nécessaire de disposer de greffons vasculaires. Or aujourd’hui, les sources possibles reposent sur les autogreffes de patients ou les greffons synthétiques. Ils présentent chacun de nombreux inconvénients tels que les complications liées à leurs prélèvements pour l’un et au fait qu’ils sont peu adaptés pour remplacer des greffons de petits diamètres pour l’autre. La validation du greffon chez l’animal le plus proche de l’homme en terme de physiologie nous permettra de disposer de données pré-cliniques pour évaluer ce greffon avant son implantation chez l’homme.
Procédures
Dans l'établissement utilisateur 1 (hébergeur), Les animaux auront tout d'abord une injection d'un calmant afin de réduire le stress dû à la manipulation. Après transport dans l'établissement utilisateur 2 (de chirurgie) , une perfusion intraveineuse sera posée afin de permettre une anesthésie générale. Une fois totalement endormi et sous traitement anti-douleur, ils subiront une intervention chirurgicale avec mini-ouverture du thorax afin de mettre en évidence le cœur et nous procéderons au pontage avec l'artère d'intérêt et occluerons une des artères du cœur afin de mettre le cœur dans les conditions physiologiques identique à la clinique. L'animal sera alors réveillé et suivi entre 6 semaines et 1 an. Durant cette phase, les animaux subiront entre 1 et 3 anesthésies supplémentaires selon le groupe afin de réaliser des tests indolores (échographies et imageries cardiaques) pour lesquels le produit de revelation sera injecté pour estimer la perméabilité du greffon.
Impact sur les animaux
La principale nuisance est la réalisation d’une chirurgie intra-thoracique chez le cochon et le maintien en vie de l’animal pendant une longue période post-opératoire. Cette longue période est nécessaire afin de s’assurer que le greffon reste perméable même à distance de l’opération.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés afin d'effectuer des prélèvements de tissus nécessaires aux analyses histologiques.
Remplacement
Ce travail a traversé différentes phases d'études notamment in vitro avant d'atteindre la phase préclinique sur les cochons en tant que modèle de gros animaux. Des évaluations mécaniques et cellulaires de ce greffon sont réalisés avant implantation, ce qui nous permet d'étudier et de nous assurer des propriétés du greffon, tout en remplaçant les animaux et réduisant le nombre d'animaux utilisés. Les résultats intéressants obtenus in vitro ont montré les réelles capacités de cette prothèse vasculaire. Ces résultats prometteurs nécessitent donc en vue d’essais cliniques, une validation via une vraie étude comparative sur les minipigs qui présentent des similitudes importantes d’un point de vue anatomique et physiologique avec l’homme.
Réduction
Des évaluations du vaisseau sont réalisées avant greffe afin de valider ses propriétés et de n'implanter que des vaisseaux de qualité. Ceci permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Les différences intergroupes sont évaluées par le test statistique adéquat. En tenant compte de la mortalité estimée pour ce modèle à environ 20%, 54 cochons sont nécessaires afin d’obtenir une étude statistiquement exploitable.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en box collectif afin de limiter l’angoisse, le stress des animaux en respectant le quota d’animaux par box. Les cochons seront intubés, sédatés et reçoivent un traitement antalgique continu pendant toute l'opération. La fréquence, le rythme cardiaque et respiratoire de l'animal seront suivis en continu. Toute modification de ces paramètres signale un réveil, une douleur ou un inconfort de l’animal et induirait alors un réajustement immédiatement des traitements permettant de limiter les souffrances au maximum. En suivi post-opératoire : Prise d’antibiotiques en prévention d'office pendant les 7 jours suivants l'opération avec des comprimés à croquer 2 fois par jour ainsi qu'un traitement antalgique par patch pendant 3 jours au minimum et plus si nécessaire. Un protocole empêchant la coagulation du sang est mis en place ainsi que des soins locaux antiseptiques aux abords des points chirurgicaux. Les animaux seront hébergés à l'animalerie dans un premier temps en box individuel mais permettant tout de même un contact olfactif, visuel et sonore avec des congénères présents dans les boxes en face. Ceci permettra de limiter l'angoisse et le stress des animaux. Le milieu reste enrichi avec des jouets adaptés (balles, cordes à mordre...). Les animaux seront remis en groupe selon leur état de récupération (estimé à 2 semaines).
Choix des espèces
Les minipigs ont été choisis comme modèle animal pour ce projet pour 2 raisons. Ce modèle possède une anatomie comparable à l’homme pour le système cardio-vasculaire qui permet d’implanter le greffon vasculaire dans des conditions chirurgicales similaires. De plus, le suivi des animaux s’effectuant sur une durée pouvant aller jusque un an, il faut un modèle animal avec un développement physique achevé et comparable à l'homme (adulte à 60-80kg).
Radiothérapie vectorisée pour le traitement des méningiomes : évaluation thérapeutique de nouveaux radiopharmaceutiques dans des modèles de xénogreffes orthotopiques murines
- Recherche appliquée
- Cancers
Tester si des particules alpha traitent mieux les méningiomes que les particules bêta déjà employées conduit à utiliser 509 souris, toutes tuées pour prélèvement d'organes. 240 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, 140 d'un niveau modéré, 120 d'un niveau léger et 9 sont opérées sans réveil. Les procédures comprennent une greffe de méningiome dans le crâne sous anesthésie pendant 45 minutes, des injections intraveineuses de radiopharmaceutiques sur animal vigile, des prélèvements de sang répétés et une imagerie TEP-IRM hebdomadaire, l'escalade de doses pouvant provoquer perte de poids, chute des cellules sanguines et apathie. L'imagerie sert aussi à fixer le jour de la mise à mort, en complément de l'observation du comportement.
Objectifs
Un méningiome est une tumeur bénigne qui se développe à partir des méninges, qui sont les enveloppes protégeant notre cerveau et notre moelle épinière. Ces tumeurs présentent souvent un grand nombre de récepteurs pour une hormone qui régule certaines sécrétions dans notre corps. Pour diagnostiquer et suivre ces tumeurs, les médecins utilisent une technique d'imagerie particulière, plus informative que l’IRM ou le scanner. Cette méthode consiste à injecter une substance par les veines (un analogue de l'hormone, c’est-à-dire, une molécule qui y ressemble beaucoup) marquée avec un élément radioactif, qui permet de visualiser les méningiomes. En effet, la particule radioactive va rejoindre la tumeur grâce à la molécule qui ressemble à l’hormone en se fixant sur son récepteur. En ce qui concerne le traitement des méningiomes, de nouvelles méthodes, comme la radiothérapie interne, ont été développées (cela revient à faire venir directement dans la lésion la particule radioactive contrairement à la radiothérapie classique, externe qui envoie la particule radioactive au travers de la peau et du cerveau avant d’atteindre la lésion). Cette approche utilise aussi un traceur radioactif, d’un autre type, cette fois-ci pour délivrer des particules radioactives qui vont permettre de traiter la lésion. Certaines particules radioactives (que l’on appelle alpha) pourraient être encore plus efficaces que celles qui sont actuellement utilisées (que l’on appelle Beta). Elles ont un trajet radioactif plus court et donc délivrent toute leur énergie de manière plus concentrée, ce qui pourrait détruire davantage de cellules tumorales tout en préservant les tissus sains autour. Des recherches préliminaires ont montré que cette méthode fonctionnait bien pour d'autres types de tumeurs. Le but de ce projet est donc de vérifier si ces alphas peuvent également améliorer le traitement des méningiomes, qui malheureusement, évolue dans certains cas, sans que les techniques chirurgicales, médicamenteuses (chimiothérapie) et de radiothérapie classique ne fonctionnent.
Bénéfices attendus
La radiothérapie interne est un traitement qui utilise principalement des particules radioactives de type bêta pour cibler et détruire les cellules tumorales. Cependant, une nouvelle méthode prometteuse consiste à utiliser des particules radioactives de type alpha. La différence entre ces deux types est que les alphas parcourent une distance plus courte dans le corps, mais avec une énergie beaucoup plus élevée. Cela signifie qu'ils peuvent libérer plus d'énergie directement dans la tumeur, ce qui peut endommager davantage les cellules cancéreuses tout en protégeant mieux les tissus sains autour qui ne sont pas traversés par la matière radioactive. Ce projet vise donc à développer de nouveaux médicaments radioactifs qui seront plus efficaces dans le traitement des tumeurs et qui entraîneront moins d'effets secondaires pour les patients.
Procédures
Procédure 1 (9 souris) : Validation du geste : Greffe de méningiome sur souris anesthésiées et analgésiées (45minutes/souris), procédure sans réveil . Procédure 2 (80 souris) : Mise en place des 4 modèles de méningiome: Greffe de méningiome sur souris anesthésiées et analgésiées (durée 45 minutes/ souris). Imagerie TEP/IRM 1fois par semaine sur souris anesthésiées (11minutes/souris). Le développement tumoral s'étale sur 4 à 10 semaines en fonction des modèles . Procédure 3 (60 souris) : Escalade de doses: Injection intraveineuse sur souris vigile (1 minute)_ Prélèvement de sang (1 minute) sur souris anesthésiées sous isofurane/air après application d'une goutte de tétracaïne à J-7, J 7, J14, J 21, J28 puis une fois par mois et en terminal sur 3 mois. Procédure 4 (120 souris): Biodistribution : Injection sous cutanée sur le flanc de cellules de méningiome (1 Minute),_ Injection intraveineuse du radiopharmaceutique sur souris vigiles (1 minute). Procédure 5 (240 souris) : Thérapie : Greffe de méningiome sur souris anesthésiées et analgésiées (durée 45 minutes/ souris)_Injection intraveineuse du radiopharmaceutique sur souris vigiles (1 minute)_ Prélèvement de sang (1 minute) sur souris anesthésiées sous isofurane/air après application d'une goutte de tétracaïne à J-7, J 7, J14, J 21, J28 puis une fois par mois et en terminal_ Imagerie TEP/IRM 1fois par semaine sur souris anesthésiées (11minutes/souris). Le développement tumoral s'étale sur 4 à 10 semaines en fonction des modèles pour les souris où le traitement n'aurait pas d'effet. Les souris ayant bénéficié d'un effet thérapeutique sont suivies jusqu'à 150 jours.
Impact sur les animaux
La procédure d'escalade de doses pour déterminer la dose maximum tolérée peut entrainer une exposition toxique pour les hautes doses. A savoir: perte de poids cytopénie, apathie. Nous limiterons au maximum cette exposition en se référant à la litterature et à nos précédents projets. Pour chaque procédure concernée, c'est l' étape de greffe orthotopique puis l'évolution tumorale qui peuvent induire des nuisances aux souris. A savoir : -1 Les greffes orthotopiques se font par chirurgie ce qui induit de la douleur. 2- L'évolution tumorale peut également engendrer de la douleur notamment dans les groupes contrôle.
Devenir
Pour toutes les procédures les animaux sont mis à mort pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Les pathologies chroniques comme le cancer sont des phénomènes complexes qui font intervenir de multiples étapes. Ces paramètres ne pouvant être étudiés in vitro de façon globale et intégrée, le recours aux animaux est indispensable. La spécificité des vecteurs est préalablement testée in vitro sur des cellules tumorales.
Réduction
Réduire : pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisés est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. L’apport de l’imagerie permet de réduire le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Les animaux seront hébergés selon la réglementation en vigueur avec un enrichissement du milieu. Les souris sont hébergées avec des frisottis pour pouvoir faire un nid , avec un libre accès à l'eau et la nourriture adaptée. Chaque cage contient un tunnel de préhension, pour pouvoir manipuler l'animal sans stress. Pour chaque procédure, les souris bénéficient d'une période d'acclimatation d'une semaine.L’état général et clinique des animaux sera surveillé de façon quotidienne ce qui permet de déterminer le palier de douleur. L’évaluation journalière permettra la mise en place et l’ajustement de traitements analgésiques lorsque ce sera nécessaire, en accord avec le palier de douleur observé. L’apport de l’imagerie permet d’une part de raffiner les modèles animaux existants et d’autre part de développer et proposer des modèles in vivo toujours plus proches des situations cliniques. Par ailleurs, l’imagerie permet de visualiser et quantifier le volume des tumeurs et donc de pouvoir, en parallèle de l’observation comportementale, d’adapter l’analgésie à mettre en place et de déterminer le jour auquel il faut procéder à la mise à mort. Dans la procédure de thérapie, l'étape d’injection du radiopharmaceutique en intraveineuse n’est pas douloureuse et les doses sont choisies pour être non toxiques. Après l’injection du traceur, l’animal est remis dans sa cage où il a libre accès à l’eau et à la nourriture pendant le temps nécessaire à la biodistribution du traceur (1h à 2h). Pendant l’acquisition d’imagerie, les souris sont anesthésiées durant les 11 minutes de l’examen. Elles sont placées dans une cellule d’imagerie chauffante et une goutte de gel est déposée sur leurs yeux pour prévenir le dessèchement oculaire. Elles sont replacées dans leur cage dès le réveil avec libre accès à la nourriture et à l’eau.
Choix des espèces
De nombreux modèles de tumeurs ont été développés chez la souris. Par ailleurs, l’existence de souches de souris immunodéprimées permet de développer des modèles de tumeurs à partir de cellules humaines. A partir de 7 semaines car les souris sont adultes. Les méningiomes touchent les adultes chez l'homme, les greffes sont faites entre 7 et 12 semaines, et le suivi se fait jusqu'à 150 jours après la greffe.
Etude du tropisme et des paramètres d’excrétion des virus influenza aviaires hautement pathogènes chez le canard domestique.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
Infectés par un virus influenza aviaire hautement pathogène, par aérosol ou par dépôt dans l'arrière-gorge, des canards subissent ensuite des prélèvements répétés de sang, de plumes en croissance, de gorge et de cloaque. 1 580 canards vont être utilisés, dont 1 280 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec des signes possibles de paralysie, de torticolis, de saignements ou de mort soudaine. Parmi les bénéfices annoncés figurent l'amélioration du "bien-être" des volailles d'élevage et la limitation des pertes économiques liées aux abattages. Tous les canards sont tués, 3, 5, 7 ou 14 jours après l'infection selon la procédure, pour prélever organes et plumes, et parce que leur infection interdit toute réutilisation.
Objectifs
Les virus influenza aviaires hautement pathogènes (VIAHP) ont eu un impact considérable dans les élevage de volailles et chez les oiseaux sauvages ces dernières années. Cela a conduit dans le monde entier à l'abattage à grande échelle d'animaux infectés, à la mort d'espèces en danger et à un risque de transmission plus élevé à d'autres animaux (notamment mammifères), y compris l'humain. Les canards et oies jouent un rôle crucial dans la transmission des VIAHP parce qu'ils peuvent produire une quantité importante de virus et le transmettre avant de montrer des signes de maladie. Le virus se propage dans l'environnement principalement par les excréments et l'air expiré par les animaux infectés. Des recherches récentes montrent que les plumes en croissance des canards peuvent aussi diffuser le virus. Les plumes infectées peuvent contenir le virus pendant très longtemps, jusqu'à 160 jours. Pour développer des mesures de contrôle efficaces et lutter contre ces virus, il est important de comprendre comment ils se multiplient et se propagent. Ce projet vise à comprendre comment ces virus pénètrent et diffusent dans les plumes, et à déterminer quels sont les facteurs influençant l'infection des plumes (par exemple : les différentes espèces de canards et les types de virus). Ces recherches aideront à mieux comprendre la dynamique de l'infection que l'on peut observer sur le terrain. Elles permettront également de comprendre comment les virus diffusent et survivent dans l'environnement, et au final à évaluer l'impact de la vaccination sur la propagation des virus contemporains et futurs.
Bénéfices attendus
Le projet vise à : 1) étudier la libération du virus par les plumes, en mesurant l'intensité, la durée et la quantité de virus libérés, pour comprendre le rôle des plumes dans la contamination de l'environnement. 2) Comprendre par quels mécanismes les virus arrivent à infecter les plumes et s'y développent pour déterminer l'impact des différents types de virus, des espèces animales et de la vaccination. Les plumes pourraient en effet être un site où le virus se développe facilement même chez des animaux vaccinés. Ces recherches pourront aussi étudier de nouveaux virus influenza aviaires qui pourraient apparaître pendant la réalisation du projet. Cela permettra d’évaluer le rôle des plumes dans leur diffusion dans l'environnement et de déterminer si les vaccins restent efficaces dans le contrôle de la maladie. Ces résultats aideront à décider s'il faut ajuster le vaccin et/ou les programmes vaccinaux, et s'il faut renforcer les mesures de biosécurité dans les élevages. Cela permettra potentiellement de limiter les pertes économiques dues à l'abattage de milliers de volailles en cas de foyers, tout en améliorant le bien-être de ces dernières, et d'estimer les risques de transmission des virus par les plumes à l'humain.
Procédures
Avant de commencer l'étude, une prise de sang sera effectuée pour vérifier si les animaux ont déjà été en contact avec le virus ou si eux ou leurs parents ont été vaccinés. En effet, si des animaux ont déjà rencontré le virus, les résultats de l'étude seront faussés. Pour étudier la multiplication du virus dans les plumes, les animaux seront infectés soit par inhalation d'un aérosol contenant le virus, soit en déposant une solution contenant le virus dans le passage reliant le nez et la gorge (voie intra-choanale). Ensuite, les animaux infectés seront euthanasiés à différents moments : 3 jours après l'infection afin d'étudier les premiers stades de l'infection, et 5 ou 7 jours après l'infection (selon le virus utilisé) pour étudier les stades plus avancés de la maladie. Les animaux seront anesthésiés par injection d'anesthésiques par voie intra-musculaire avant de procéder à l'euthanasie. Une deuxième procédure permettra quant à elle de suivre la diffusion du virus au cours du temps. Après avoir infecté les animaux par la même méthode que dans la première procédure, des prélèvements seront réalisés à plusieurs moments (0, 1, 2, 3, 5, 7, 10, 14 jours après l'infection) : prises de sang, plumes en croissance de la région de la poitrine, écouvillons de la gorge et du cloaque. A la fin de l'expérience, les animaux seront euthanasiés.
Impact sur les animaux
(1) Les virus influenza aviaires hautement pathogènes (VIAHP) peuvent provoquer des symptômes graves, parfois mortels. Les signes cliniques peuvent dépendre du type de virus et de l’espèce animale touchée. Les effets indésirables peuvent inclure : une fatigue générale (abattement), des problèmes nerveux (comme torticolis, tremblements, paralysie), des difficultés à respirer, des saignements, ou une mort soudaine. Ces signes, lorsqu’ils surviennent, peuvent apparaître dès 24 à 48 heures après infection et s’intensifier jusqu’à la mort des animaux. (2) Prélever des plumes en croissance peut entrainer un léger risque de saignement ou de douleur, surtout pour les grandes et grosses plumes comme celles de l'aile. Ces risques sont beaucoup plus faibles sur des plumes plus petites, comme celles de la poitrine.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Dans la première, certains animaux seront euthanasiés 3 jours après infection pour prélever différents organes et des plumes. Les analyses de ces prélèvements sont importantes pour étudier les premiers stades de l'infection et voir comment le virus envahit dans les différents tissus/organes, dont les plumes. Les autres animaux seront euthanasiés 5 ou 7 jours après infection (selon le virus étudié) et les mêmes prélèvements seront faits pour étudier les mêmes points à un stade plus avancé de la maladie, où la quantité de virus est très importante. Dans la deuxième procédure, les animaux seront tous euthanasiés 14 jours après l'infection, car c'est le dernier moment utile pour étudier la diffusion du virus dans l'environnement au cours du temps. Après euthanasie, les mêmes prélèvements que dans la première procédure seront réalisés (organes et plumes). Ils permettront notamment d'analyser par exemple : les lésions causées par le virus, sa localisation dans les cellules, sa quantité dans les différents tissu au fil du temps. L'euthanasie des animaux est donc indispensable pour répondre aux différentes questions scientifiques de l'étude. De plus, les animaux infectés par un virus influenza hautement pathogène ne peuvent donc malheureusement pas être réutilisés, replacés ou adoptés car ils représentent un risque de diffusion virale.
Remplacement
Pour remplacer les tests sur animaux, des plumes peuvent être prélevées et mises en culture en laboratoire (explants de plumes) afin d'étudier l'infection par le virus. Un seul canard peut permettre d'obtenir des dizaines d'explants, permettant de tester de nombreuses conditions d'infection. Cependant, ce modèle ne prend pas en compte le fonctionnement complet de l'organisme, où le virus circule dans le sang et se propage dans les organes. Néanmoins, le projet vise aussi à étudier les paramètres cliniques, la propagation du virus, les lésions, l'excrétion, la transmission et l'impact de la vaccination. Ces études nécessitent des expériences sur animaux, car aucun modèle alternatif ne peut reproduire entièrement la diffusion du virus dans un organisme vivant. En parallèle de la présente saisine, le développement d'un modèle d’infection sur œufs embryonnés de canards et de poulets (modèle d'infection in ovo) a été initié car il permettrait de réduire les infections sur des jeunes animaux. Il représente pour le moment un modèle alternatif complémentaire à l'expérimentation animale, car il a des limites : l'infection est plus courte et ne reflète pas complètement celle des animaux présents dans les élevages.
Réduction
Une approche statistique a permis de calculer le nombre minimal d'animaux infectés permettant d'atteindre les objectifs scientifiques du projet (détection d'une différence dans la quantité de virus entre les groupes). Le nombre d'animaux témoins non infectés sera réduit au minimum permettant de valider l'expérience.
Raffinement
Afin de réduire la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux, plusieurs mesures seront mises en place : 1. Une période d’acclimatation de 72h en isolateur. 2. Un enrichissement du milieu de vie avec des jouets suspendus, la possibilité pour les canards d’exprimer un comportement de toilettage à l’aide des dispositifs d’abreuvement, des miroirs avec clochette, et des friandises (comme de la salade ou des vers de farine). 3. Un suivi clinique rapproché, deux fois par jour, avec une grille de suivi et de notation clinique par le vétérinaire responsable de l’essai. Si un animal présente un signe grave ou atteint un point limite, il sera euthanasié pour éviter toute souffrance supplémentaire. Avant l'euthanasie, les animaux seront préalablement anesthésiés pour réduire leur douleur et leur stress.
Choix des espèces
Les canards sont une espèce soumise à la vaccination déployée depuis septembre 2023 et jouent un rôle fort dans l’écologie des VIAHP en produisant beaucoup de virus sans forcément être visiblement malades. Les canards Pekin (Anas Platyrhinchos), canards de barbarie (Cairina moschata), leurs hybrides (canards mulards) juvéniles (d’un âge maximum de 6 semaines), mâles et femelles, seront hébergés durant la période de croissance post-natale permettant d’exploiter le duvet, et les plumes adultes se développant par la suite jusqu’à 6 semaines d’âge. A ces âges les canards ne peuvent pas encore voler. Ils pèseront au maximum 3 kg à 6 semaines d’age.
Etude des fonctions des structures cérébrales des poissons téléostéens cichlidés
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Après trois mois d'entraînement à des tests comportementaux, chaque poisson subit une chirurgie d'environ une heure destinée à léser une structure de son cerveau, puis vit trente jours avec cette lésion. 900 cichlidés de trois espèces vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec parmi les effets attendus une récupération difficile après une longue anesthésie et des déficits moteurs. Le projet part du constat que ces poissons utilisent des outils, se reconnaissent dans un miroir, identifient leurs congénères et communiquent de façon complexe, capacités qui justifient précisément qu'on lèse leur cerveau pour en localiser le siège. Grégaires, ils sont isolés autour de l'opération avec un simple contact visuel entre aquariums voisins, avant d'être tués pour le prélèvement du cerveau.
Objectifs
Certains poissons téléostéens comme les Labres et les Cichlidés présentent des comportements comme l’utilisation des outils, l’utilisation du miroir (reconnaissance de soi), la reconnaissance individuelle, et une communication multimodale complexe. Notre projet consiste donc à étudier l'organisation du cerveau des cichlidés, en particulier les espèces Amatitlania nigrofasciata (A. nigrofasciata), Neolamprologus brichardi (N. brichardi), et Pseudotropheus zebra (P. zebra). Ces trois espèces ont des origines géographiques, une taille et des comportements différents. Les cerveaux des poissons téléostéens sont organisés de façon très différente par rapport aux cerveaux des mammifères, et leurs structures et leurs fonctions demeurent peu connus. En particulier, une structure de la partie ventrale du cerveau, le lobe inférieur, n'existe que chez les téléostéens, et n’est pas retrouvée chez les mammifères ou les oiseaux. Les fonctions de cette structure demeurent inconnues, et nos travaux précédents suggèrent qu’elle pourrait être impliquée dans les fonctions cognitives remarquables des cichlidés et des labres. Mieux connaître la fonction du lobe inférieur chez les poissons téléostéens permettra de mettre en lumière comment, au cours de l’évolution, des cerveaux aussi différents que ceux des téléostéens ont pu permettre l’émergence de comportements complexes. Cette étude permettra donc de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires.
Bénéfices attendus
Les cichlidés présentent des comportements assez complexes incluant certaines capacités cognitives dites de « haut niveau ». Cependant, les structures cérébrales impliquées demeurent méconnues. Afin d’expliquer comment les cerveaux des poissons produisent ces comportements, des études lésionnelles sont nécessaires. Nos études précédentes montrent que l'organisation globale du cerveau de poissons téléostéens est très différente de celle des tétrapodes, et que le lobe inférieur, une structure unique aux téléostéens, pourrait être impliquée dans ces comportements complexes. Cette étude lésionnelle permettra de mieux comprendre comment les cerveaux de tétrapodes et de téléostéens, dont les morphologies diffèrent considérablement, peuvent posséder des capacités cognitives similaires.
Procédures
Entrainement à des tests comportementaux pendant 3 mois maximum, puis procédures chirurgicales durant environ une heure. Les animaux seront euthanasiés pour le prélèvement du cerveau 30 jours après la chirurgie.
Impact sur les animaux
En plus de l'intervention chirurgicale, deux nuisances post opératoires potentielles sont attendues : une récupération potentiellement difficile dues à l'effet de la longue anesthésie ; et l’effet de la chirurgie elle-même : douleur potentielle, déficit moteurs liés à la lésion cérébrale. De plus, les cichlidés étant des animaux grégaires, l’isolement peut avoir un impact sur leur bien-être.
Devenir
L'euthanasie des individus est nécessaire au prélèvement de leur cerveau pour les études neuroanatomiques prévues dans notre projet, permettant de visualiser précisément le site de chaque lésion.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, les espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées. Notre étude nécessite un échantillonnage d'espèces qui ont un grand cerveau avec des capacités cognitives de haut niveau, et qui possèdent un lobe inférieur développé, ce qui est le cas des cichlidés. Les tests comportementaux prévus ne peuvent être réalisé que sur ces animaux. Les trois espèces que nous souhaitons utiliser, A. nigrofasciata, N. brichardi, P.zebra, ont des comportements très différents et des cerveaux organisés de façon différentes. De ce fait, il est pertinent et nécessaire d'utiliser ces trois espèces de cichlidés.
Réduction
Pour ces expérimentations, le nombre d’animaux utilisés sera limité aux besoins statistiques de nos analyses, et nous privilégierons des tests statistiques non-paramétriques qui permettront de limiter le nombre d’individus nécessaires. Des études précédemment publiées chez les téléostéens nous permettent de déterminer le nombre d’individus nécessaires.
Raffinement
Dès la réception des animaux, leur bien-être sera particulièrement observé par des zootechniciens compétents. La température de la pièce ainsi que son taux d’humidité seront surveillés. Lors de la chirurgie, après l'induction de l'anesthésie, une injection est pratiquée dans les muscles entourant la boite crânienne afin d'analgésier localement la zone avant la craniotomie. Après la chirurgie cérébrale, le bien-être des animaux est plus attentivement surveillé par des expérimentateurs compétents jusqu'à l’euthanasie des animaux. Pour surveiller la santé des animaux, des points limites seront utilisés, prenant en compte des comportements ou signes visibles. Dans le cas où des animaux montreraient des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Selon la gravité de ces signes, les animaux pourront être soignés via une analgésie dans l’eau de nage, ou si ce n'est pas possible de soigner, ils seront euthanasiés dans les délais les plus brefs. Des cachettes (tubes en PVC) seront ajoutées à l'hébergement avant l'opération chirurgicale pour fournir de l'enrichissement. Un contact visuel entre les poissons sera possible avant et après l’opération puisque les aquariums seront placés les uns à côté des autres.
Choix des espèces
Les poissons téléostéens ont été récemment cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses anatomiques étudiant les structures cérébrales qui sous-tendent les fonctions motrices et sensorielles, ainsi que des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces différents types de comportements ont déjà été observé chez A. nigrofasciata, Neolamprologus brichardi, et Pseudotropheus zebra, mais chaque espèce présente des comportements particuliers et qui lui sont propres. De plus, leurs cerveaux sont anatomiquement différents. Pour mettre en évidence quelles parties du cerveau de cichlidé sous-tendent ces remarquables capacités cognitives, une étude neuroanatomique de ces espèces est indispensable. De plus, la taille du cerveau des espèces de téléostéens traditionnellement utilisées (poisson zèbre, médaka), ne permet pas de réaliser les chirurgies nécessaires à ce projet. L’utilisation de cichlidés, et en particulier de ces trois espèces, dont la taille du cerveau permet la chirurgie, semble donc toute indiquée. Nous travaillerons sur des jeunes adultes (taille du corps à partir de 3 cm) car il nous est nécessaire d’étudier un cerveau pleinement développé.
Elevage et maintien de la lignée de souris DMSXL utilisée comme modèle de la dystrophie myotonique de type 1 à des fins de recherche scientifique et visée thérapeutique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Les souris homozygotes de cette lignée transgénique présentent dès leurs premières semaines un retard de croissance et une faiblesse musculaire, ce qui vaut à 1 250 d'entre elles un classement en niveau de souffrance sévère. 5 000 souris au total sont concernées par cet élevage destiné à fournir un modèle de la maladie de Steinert, avec pour seules interventions déclarées une biopsie de queue à sept jours, un microtatouage des phalanges au même âge et la coupe des incisives quand la mâchoire se déforme, ce qui survient dans 40 % des cas. Le porteur dimensionne la colonie sur l'historique des performances de reproduction, afin de "ne produire que le juste nécessaire d'animaux d'étude". Les souris au génotype recherché partent vers les laboratoires utilisateurs au sevrage, à trois ou quatre semaines, les surnuméraires sont tuées au même moment, et quelques porteurs sains sont gardés pour renouveler les reproducteurs.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de maintenir une colonie d'élevage de variant transgénique de la souris utilisé comme modèle de la maladie de Steinert afin de disposer de modèles d'étude pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la dystrophie myotonique de type 1 (DM1 ou maladie de Steinert) ainsi que développer et tester de nouvelles approches thérapeutiques. La DM1 chez l'Homme se manifeste notamment par une faiblesse musculaire, une myotonie, une cataracte précoce, des troubles cardiorespiratoires, un hyperinsulinimisme ainsi que par des anomalies cognitives et comportementales très handicapantes. La forme la plus sévère se manifeste dès la naissance par une hypotonie, des troubles respiratoires graves, des difficultés de succion et de déglutition ainsi que par un retard psychomoteur et une déficience intelectuelle.
Bénéfices attendus
Pour étudier la DM1 au cours du développement ainsi que dans divers types cellulaires et tissulaires affectés par la maladie, nous avons développé un modèle de souris transgénique porteuse du gène muté responsable de la maladie. Ces souris reproduisent plusieurs caractéristiques moléculaires, cellulaires et physiologiques de la maladie notamment dans les mucles et le système nerveux. Ce modèle sera utilisé pour étudier les mécanismes spécifiques liés à la mutation et leurs conséquences physiopathologiques ainsi que pour identifier des biomarqueurs permettant d'évaluer la progression de la maladie et les réponses thérapeutiques développées dans notre laboratoire et des équipes de collaborateur travaillant sur la même pathologie.
Procédures
Les seules interventions auxquelles les animaux d'élevage seront soumis sont une biopsie caudale à partir d'un prélèvement d'un petit bout de queue (moins de 0,5 mm) à des fins d'identification génétique des animaux à 7 jours postnatal, un microtatouage à l'encre à l'extrêmité distale des phalanges au même âge et le cas échéant, une taille des incisives lorsqu'un risque de mal-occlusion des mâchoires apparaît.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues pour les animaux sont pour partie liées au prélèvement pour typage et pour autre partie au phénotype des individus homozygotes. Concernant le génotypage des animaux, cette identification nécessite la biopsie d'un petit fragment de queue (inférier à 0,5 mm) à 7 jours postnatal s'accompagnant d'une légère douleur passagère. Concernant les nuisances liées au phénotype, les animaux homozygotes présentent un retard de croissance et une faiblesse musculaire dès leur plus jeune âge, assimilables à un phénotype prospectif sévère. Cependant, les symptômes phénoypiques caractéristiques de la maladie ne sont pas exprimés avant 3-4 semaines, âge à partir duquel les animaux sont expédiés vers le(s) Laboratoire(s) utilisateurs ce qui permet de faire correspondre l'effet délétaire (retard de croissance et myotonie) à un degré de gravité sévère.
Devenir
Les animaux modèles (homozygotes) et leur contrôle sont envoyés au Laboratoire utilisateur après sevrage au plus tard à 3-4 semaines d'âge. Les animaux surnuméraires ne présentant pas le génotype d'intérêt sont éliminés au sevrage. Quelques animaux porteurs (sains) du gène responsable de la maladie (hétérozygotes récessifs) sont conservés pour le renouvellement des reproducteurs placés en accouplement suivant un processus dit d'utilisation continue pour fourniture aux utilisateurs.
Remplacement
Dans une optique de remplacement, des études sur des modèles cellulaires de la maladie ont été largement menées avant toute utilisation de modèles animaux. Ces travaux ont permis d’approfondir nos connaissances et d’établir un rationnel solide pour ce projet. Cependant, les modèles in vitro de cellules (notamment des cellules musculaires et neuronales) présentent des limites importantes car ils ne reproduisent pas la complexité du contexte tissulaire (muscle et cerveau) ni les interactions intercellulaires hautement spécialisées. La compréhension des mécanismes à l’origine de la maladie de Steinert et le développement de solutions thérapeutiques pour les patients nécessitent donc l’utilisation de modèles animaux pertinents de cette pathologie, tels que nos modèles murins qui expriment la mutation associée à la maladie et reproduisent des anomalies moléculaires et physiologiques similaires avec la maladie humaine.
Réduction
Afin d'adapter la production aux besoins de l'expérimentation et ne produire que le juste nécessaire d'animaux d'étude, la colonie d'élevage est dimensionnée à l'issue d'un historique de plusieurs années permettant de rationaliser la production sur la base d'une stratégie d'accouplement en couple bigame et des performances parentales connues.
Raffinement
Les animaux sont examinés individuellement attentivement une fois par semaine et contrôlés une fois par jour pour le relevé des naissances et la détection d'un changement brutal du poids corporel ou la survenue d'anomalies du comportement. De plus, compte tenu que les individus homozygotes présentent dans 40 % des cas une anomalie au niveau des incisives se manifestant par une mal-occlusion dentaire due à un allongement des incisives, les incisives sont coupées à l'aide d'une paire de ciseaux fins spécialement prévus pour cet acte. Le cas échéant, le mileu d'élevage est alors supplémenté avec des pellets d'aliment humidifiés. Le programme d'élevage prévoit par ailleurs des points limites pré-établis étant entendu que les animaux destinés à rejoindre les projets applicatifs ne sont jamais conservés au delà de 3 à 4 semaines post-natales dans l'élevage.
Choix des espèces
La nécessaire modélisation vivo de la maladie de Steinert a porté le choix de notre Laboratoire vers l'espèce souris compte tenu des possibilités offertes par la transgénèse qui nous a permis d'insérer le gène humain porteur de la mutation responsable de la maladie dans son génome et de mimer certaines caractéristiques moléculaires et physiologiques de la maladie chez le patient. Le phénotype des animaux se manifeste dès la naissance mais les animaux seront utilisés à l'état adulte entre 1 et 4 mois.
Evaluation de l’effet d’un candidat médicament sur la température corporelle chez le lagomorphe
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1 620 lapins vont être utilisés, dont 1 500 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 1 560 tués et 60 réutilisés dans un autre projet après accord du vétérinaire. Après une nuit de jeûne, chacun reçoit le médicament à tester puis reste cinq à six heures dans une boîte de contention avec une sonde rectale, deux fois par semaine. D'autres subissent une chirurgie de vingt minutes sous morphine pour l'implantation d'un capteur abdominal, avec une reprise possible. Le test recherche une élévation de température de un à deux degrés sur environ 180 médicaments en deux ans, et le porteur situe lui-même ce test hors de la pharmacopée européenne depuis 2024 tout en indiquant qu'il reste exigé par de nombreux pays hors Union européenne.
Objectifs
Ce projet est principalement réalisé dans le cadre de la libération de lots de médicaments avant distribution aux centres de soins (approximativement 180 molécules à tester sur 2 ans). Il peut également s'inscrire, dans de plus rares cas, dans le processus de mise sur le marché de nouveaux médicaments. Ce projet a pour but d'évaluer l'impact de ces médicaments sur la température corporelle des lagomorphes. Pour cela, la température de chaque animal sera mesurée pendant plusieurs heures, avant et après l'administration du médicament. Cette mesure de température sera réalisée soit en rectal (insertion d'une sonde pendant quelques heures), soit en abdominal (après implantation d'une petit dispositif par chirurgie).
Bénéfices attendus
La stérilité d'un médicament n'implique pas qu'il soit forcément exempt de molécules pouvant provoquer une hyperthermie. Par conséquent, avant utilisation, il est très important de vérifier que l'administration d'un médicament ne provoque pas une élévation de température corporelle chez l'animal, pour éviter que des réactions fébriles ne se produisent ensuite chez les patients. Les bénéfices de ce projet sont donc la libération de lot de médicaments (qualité du produit) ou la mise sur le marché de nouveaux médicaments n'induisant pas de fièvre après leur administration (sécurité du patient).
Procédures
Les animaux de ce projet subiront une contrainte liée à la privation de nourriture avant l'administration du médicament (généralement 1 nuit de mise à jeun, maximum 2 fois par semaine, avec une récupération d'une semaine entre chaque expérience) et une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors de l'administration du médicament (injection généralement en moins de 5 min). Certains animaux subiront une contrainte liée au positionnement dans des boites et à la mesure de température en rectale pendant plusieurs heures (environ 5-6h, 2 fois par semaine). D’autres subiront une chirurgie afin d’implanter un dispositif permettant l’enregistrement automatique de la température (durée de la chirurgie : 20min). Cette chirurgie préalable sera réalisée sous anesthésie générale avec une analgésie morphinique (1 implantation dans leur vie et 1 reprise maximum) suivant les bonnes pratiques vétérinaires. Après la chirurgie, une semaine de récupération, au minimum, sera prévue avec un isolement des animaux pour optimiser la cicatrisation. Pour ces animaux implantés, la mesure de température (avant et après administration du médicament) se fera ensuite chez un animal libre de ses mouvements dans sa cage d'hébergement pendant plusieurs heures ou jours (technique de télémétrie). Dans de rares cas, des prélèvements sanguins pourront être effectués durant les phases expérimentales sur animal vigile ou anesthésié (durée de chaque prélèvement : moins de 3min).
Impact sur les animaux
Les animaux seront mis à jeun avant l'administration du médicament. Cette période de jeun durera généralement une nuit et maximum 24h. La mise à jeun engendre un stress physiologique et psychologique d'intensité modérée mais de courte durée. La contention des animaux dans les boites (pour les mesures de température rectale) pourra induire un stress qui sera réduit par une préalable habituation à cet environnement restreint. La chirurgie d'implantation du petit dispositif (pour mesure de température à distance) pourra induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Un effet attendu dans ce projet est l'élévation de la température corporelle de l'animal, de l'ordre de 1à 2 degrés, pendant 2-3 heures, si le médicament testé se révèle avoir un effet.
Devenir
Tous les animaux de la procédure 1 seront mis à mort (procédure de degré de gravité sévère). Seront aussi euthanasiés les animaux pour lesquels des prélèvements d’organes sont prévus en fin d'expérience. Certains animaux de la procédure 2 pourront être réutilisés dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée.
Remplacement
A ce jour le lagomorphe est l'espèce animale qui est la plus adaptée à ce type de modèle d'étude (vérifier l'absence d'effet d'un médicament sur la température corporelle). Ce projet ne peut pas toujours être remplacé par d'autres méthodes expérimentales telles que le test d'activation des monocytes (ou MAT pour Monocyte Activation Test). En effet certains médicaments, comme les protéines humaines extraites du sang, provoquent une coagulation du milieu réactionnel. Il est donc totalement impossible de prélever le surnageant pour réaliser les dosages de marqueurs inflammatoires in vitro. De plus, même si ce test a été retiré de la pharmacopée européenne en 2024, il est encore exigé par de nombreux pays hors Union Européenne pour autoriser l'importation de médicaments, vaccins ou dispositifs médicaux.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d'animaux par groupe (généralement 3 mais pouvant aller jusqu'à 12) est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Une réutilisation des animaux au sein d'une même procédure (pour tester plusieurs médicaments) est envisagée et permettra de réduire le nombre réel d’animaux utilisés.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives ou les moins contraignantes possibles (mesure de température par télémétrie= animaux libres de leurs mouvements pendant les enregistrements), • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux (si applicable), • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (avant le début de l'étude, habituation à plusieurs reprises, et sur de courtes durées, aux boites utilisées pour les mesures de température rectale afin de réduire au maximum le stress des animaux),• Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire.
Choix des espèces
Le lagomorphe est l'espère animale la plus pertinente et la plus couramment utilisée pour évaluer les effets d'un médicament sur la température corporelle, de par la grande sensibilité de son système immunitaire. Ce projet sera réalisé sur des animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Role de la co-transmission ACh/Glutamate dans la mise en place des mémoires émotionnelles chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Une chirurgie cérébrale de deux heures, puis jusqu'à quatorze jours d'injections quotidiennes et de séances de conditionnement à la peur : 184 souris génétiquement modifiées subissent ces procédures, dont 160 à un niveau de souffrance sévère. Le porteur indique que la mise en place de la mémoire de peur entraîne un stress et possiblement de l'anxiété, et signale un risque d'hypothermie et d'arrêt cardiorespiratoire sous anesthésie. Il conclut néanmoins que ses points limites lui permettent de garantir le bien-être des animaux non-humains dans l'entièreté du projet. Toutes les souris sont tuées pour prélever leur cerveau.
Objectifs
Les dysfonctionnements de la mémoire émotionnelle peuvent résulter en des pathologies de type stress post-traumatique. Les réseaux neuronaux sous-tendant ces mémoires émotionnelles sont bien identifiés. Ainsi la structure amygdalienne, région clé dans la gestion des mémoires avertives, reçoit des projections cholinergiques du cerveau antérieur moyen. Or ces projections sont en partie également glutamatergique. Le but de ce projet est de caractériser le rôle de ces projections dans la mise en place et le maintien des mémoires averties chez la souris. Afin de pouvoir disséquer ces mécanismes, nous allons utiliser différentes lignées de souris génétiquement modifiées couplées à une approche virale afin de moduler spécifiquement cette transmission population neuronale.
Bénéfices attendus
Dans la population humaine, 5 à 30 pour-cent des victimes de traumatismes développent des troubles de stress post-traumatique (TSPT), alors même que d’autres personnes ne présentent pas de conséquences à long-terme. Mieux comprendre le rôle l’activité cérébrale des régions impliquées dans la gestion des évènements traumatiques nous permettra d’identifier les dysfonctionnements menant aux TSPT et ainsi de pouvoir mieux appréhender les approches thérapeutiques. Dans ce contexte, notre projet tend à comprendre les mécanismes neuronaux sous jacents à la mise en place de la mémoire de peur chez la souris, en étudiant plus spécifiquement une voie neuronale mal connue. A l’heure actuelle très peu de données permettent de comprendre son rôle dans la mémoire de peur. Notre travail permettra une meilleure compréhension sur ce sujet, en approfondissant nos connaissances sur ces désordres cognitifs.
Procédures
Deux procédures expérimentales seront effectuées afin de comprendre les bases neurobiologiques des mémoires de peur. En utilisant des modèles murins nous évaluerons le rôle joué par différents neurotransmetteurs dans les mémoires de peur. Un premier aspect de notre travail sera de caractériser ces projections anatomiquesémanant du cerveau moyen antérieuret projetant sur l’amygdale chez un modèle murin. Dans un premier temps, une unique chirurgie cérébrale sera effectuée afin de pouvoir identifier par la suite les voies neuronales impliquées. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max sera effectuée sous anesthésie et analgésie. Notre étude comportementale subséquente consistera à s’intéresser à la mise en place de la mémoire de peur en étudiant les effets de l’activation ou de l’inhibition de ces projections chez les animaux. Pour cette procédureune chirurgie cérébrale sera effectuée afin d’administrer des vecteurs viraux permettant de contrôler l’activité de cette voie. Cette chirurgie d’une durée de 2 heures max sera effectuées sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront ensuite évalués quant à leur niveau d’anxiété dans le cadre de trois tests comportementaux (10 min d’exploration spontanée des dispositifs durant 3 jours consécutifs) avec un temps de repos entre chaque. La moitié des animaux sera testée quant à la mise en place de leur mémoire de peur et de son extinction (2 protocoles comportementaux successifs, sur une durée totale de 14 jours max à raison de 10-20min par jour) suite à la modulation de la co-transmission neuronale (grâce à l’administration du ligand 1 injection quotidienne durant 14 jours max). L’autre moitié des animaux sera testée quant à la mise en place de mémoires spécifiques de peur selon l'environnement (durée totale de 10 jours max à raison de 2 fois 5 min par jour) suite à la modulation de la co-transmission neuronale (grâce à l’administration du ligand (1 injection quotidienne durant 10 jours max). A la fin de ces procédures, les animaux seront anesthésiés puis euthanasiés pour effectuer des analyses de prélèvements biologiques.
Impact sur les animaux
La mise en place de la mémoire de peur entraine un stress et possiblement une anxiété chez les animaux. L’injection intrapéritonéale peut entraîner une douleur légère de courte durée au point de piqure et dans de rares cas, une infection. Les chirurgies au niveau du cerveau (injections de virus) peuvent entraîner un affaiblissement des animaux pendant les heures suivant celles-ci. Un risque d’inflammation peut aussi être considéré suite aux sutures. Un risque d’hypothermie est possible sous anesthésie tout comme un arrêt cardiorespiratoire.
Devenir
L'ensemble des souris sera euthanasié afin de prélever les cerveaux nécessaires à la réalisation des analyses immunohistochimiques.
Remplacement
Un organisme vivant est nécessaire pour étudier les acteurs impliqués dans la mise en place des mémoires que nous étudions. Ainsi l’utilisation de rongeurs est nécessaire dans la mise en oeuvre de ce projet. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires, moléculaires et neuronaux rentrant en jeu dans ces processus cognitifs. L’absence de méthodes alternatives quant à l’étude des mémoires aversives nous impose d’utiliser les modèles murins proposés.
Réduction
Le projet impliquera un total de 184 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-individuelles et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Pour ce projet nous avons réduit le nombre d'animaux utilisés au maximum en calculant le nombre nécessaire par groupe expérimental avec une analyse prédictive du nombre d’animaux en utilisant l’outil statistique. La taille des groupes expérimentaux pour le comportement doit se situer entre 10 et 15, et pour les analyses purement histologiques nous nous restreindrons à 3-6 animaux.
Raffinement
Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont essentielles pour comprendre les bases cérébrales de ces capacités cognitives et par conséquents pouvoir appréhender l’origine des désordres observés dans certaines pathologies de la mémoire de peur comme dans le cas des troubles du stress post-traumatique (TSPT). Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie et génomique). Les stratégies de raffinement mises en place lors de ce projet comprennent l’enrichissement environnemental proposé aux animaux dans leur cage d’élevage, le soin apporté aux animaux tout au long de ces procédures, du choix des procédures afin de garantir une anesthésie et une analgésie optimale quant celles-ci font parties de procédures et d’une surveillance régulière garantie par un personnel formé. La mise en place de points limites pour chaque procédure proposée nous permet de garantir le bien être animal dans l’entièreté de ce projet.
Choix des espèces
Nos travaux nécessitent l’utilisation de rongeurs pour l’étude de phénomènes complexes tels que la mémoire et ses troubles. L’étude d’un système intégré nécessite d’avoir recours à des animaux « entiers ». Cette nécessité est d’autant plus incontournable lorsqu’il s’agit de l’étude des comportements et capacités cognitives telles que la mémoire. Dans notre projet, l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés nous permet également d’aborder la physiopathologie humaine. Pour l’ensemble de ces raisons, seule l'utilisation d'animaux nous permet de répondre à ces questions. Dans nos études, nous utilisons des animaux adultes, de plus de 8 semaines au moment du début des procédures décrites. En effet, nos études visant à identifier les bases neurales de la mise en place de la mémoire se focalisent pour le moment chez l’adulte. Pour l’anatomie, nous utiliserons des animaux du même âge.
Nouvelles stratégies de réduction de l’inflammation intestinale chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Sans possibilité de retour à l'élevage ni d'adoption, 8 480 larves de poisson zèbre sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour analyses post-mortem. Une entérocolite leur est provoquée par des molécules pro-inflammatoires ajoutées à leur eau pendant trois jours, dès le troisième jour après la fécondation. Certaines sont gavées sous anesthésie, d'autres immobilisées deux minutes pour être observées au microscope. Le porteur reconnaît ne pas pouvoir exclure un état général dégradé, un comportement anormal ou la mort, et met en avant la transparence des larves, qui offre selon lui une clarté optique appréciable.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI), comme la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des pathologies multifactorielles caractérisées par une inflammation chronique de l’intestin associée à une réponse immunitaire excessive et un déséquilibre du microbiote. Cela peut entraîner des symptômes sévères comme des douleurs abdominales, des diarrhées, et une fatigue intense, affectant gravement la qualité de vie des patients. Ce projet s’incrit dans un projet plus global multiéchelle et pluridisciplinaire allant de la molécule jusqu’au patient. Les stratégies testées ici auront été au préalable validées par des expériences sur des modèles cellulaires. Ce projet, mettra à profit les avantages de la larve de poisson zèbre, chez qui il est possible d’induire une inflammation de l’intestin, afin de valider des molécules candidates ou des stratégies de délivrance afin de réduire l’inflammation. Avec le poisson zèbre nous pourrons évaluer plusieurs paramètres du tube digestif tels que l’anatomie, l’intégrité de la barrière intestinale, la réponse inflammatoire, le stress oxyydant,… Nous espérons ainsi valider de nouvelles perspectives thérapeutiques pertinentes pour le traitement des MICI.
Bénéfices attendus
En utilisant un modèle largement utilisé en routine dans des études pharmaco-toxicologiques, les larves de poisson zèbre, nous pourrons accélérer considérablement le processus de sélection des candidats médicamenteux prometteurs ou de modalité de délivrance de ces composés pour une amélioration nette et durable des symptomes des MICI. Les larves de poisson zèbre ne seront utilisées qu’après une première phase d’étude qui comportera des analyses chimiques des composés (pureté, activité) et des études in vitro sur cellules épithéliales intestinales et cellules immunitaires (cultures isolée, coculture ou utilisation de la technologie organ-on-chip). Ces larves offrent un système intégré, rapide, efficace et simple d’évaluation de la toxicité et de l’efficacité des composés préselectionnés lors de la première phase. De plus, de part la transparence du modèle au stade larvaire, celui-ci nous offre une très belle clartée optique fortement appréciable et permettant des observations in vivo non invasives grâce à des techniques d’imagerie de pointe.
Procédures
Les larves seront soumises aux interventions suivantes : Lors des sessions d’imagerie au microscope, les larves anesthésiées seront éclairées avec différents sources lumineuses. La durée totale de la procédure est courte puisqu’elle durera 2 min minutes par animal. La puissance de la source lumineuse sera choisie pour permettre l’observation sans endommager les tissus. Les larves vigiles seront exposées à des molécules ajoutées dans l’eau du bain : Ces larves seront exposées aux molécules durant 3 jours à partir du stade 3 jours post fécondation avec un changement des bains journalier de 4 à 6 jours. Certaines larves seront gavées avec une molécules fluorescente non toxique qui permet d’évaluer l’intégrité de la barrière intestinale. Le gavage, d'une durée de 2 secondes, sera réalisé sous anesthésie, un seul gavage sera réalisé par animal.
Impact sur les animaux
L’entérocolite chez la larve sera induite par différentes molécules pro-inflammatoires. Nous sélectionnerons la molécule, la dose et la fenêtre de traitement permettant d’induire une entérocolite sans toxicité sévère. Cependant, nous ne pouvons pas exclure que le traitement avec nos molécules ne cause pas des effets indésirables tels qu’un état général dégradé, un comportement anormal ou de la mortalité.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure. En effet, ces larves étant exposées à des molécules nous n’avons pas l’autorisation de les remettre dans l’élevage ou de les faire adopter. De plus, l’euthanasie des animaux est nécessaire car des prélèvements et analyses post-mortem seront réalisées sur l’ensemble des animaux.
Remplacement
Dans ce projet, nous ne pouvons pas nous passer d’un modèle animal et nous avons choisi le poisson zèbre. Une première partie du projet impliquera une étude in vitro, réduisant le nombre d’animaux de cette étude. Toutefois ces modèles cellulaires ne permettent pas de prendre en compte la complexité des interactions de l’épithélium avec d’autres acteurs (système immunitaire et environnement de la lumière du tube digestif). Le poisson zèbre nous fournira un modèle simple et intégré d’entérocolite chez un vertébré, où les réponses in vivo au niveau tissulaire, cellulaire et moléculaire seront facilement observables et quantifiables. Une tâche longue et ardue dans un modèle murin. Un modèle animal est essentiel pour la bonne évaluation des effets induits par les composés chimiques et permettra d’étudier les acteurs mis en jeu dans cette étude.
Réduction
Nous avons prévu 8460 larves de poisson zèbre pour réaliser les six procédures décrites dans ce projet qui a pour objectif de réduire l’inflammation dans un modèle d’inflammation induite du tube digestif. Nous avons déterminé ce chiffre en prenant en compte : -Les articles déjà publiés sur l’inflammation induite du tube digestif chez le poisson zèbre afin de limiter les conditions et les protocoles à mettre en place -Les expériences préliminaires réalisées sur les molécules anti-inflammatoire que nous souhaitons tester. Les effets bénéfiques de ces molécules ont été ou seront étudiés sur des cultures de cellules de vaisseaux sanguins ou des cellules immunitaires de sujets sains et de patients atteints de maladie inflammatoire du tube digestif (MICI). Ces expériences nous donneront des informations sur les doses à utiliser. -des tests permetant de déterminer le nombre minimal d’animaux nécessaire pour une interprétation fiable des résultats -les données obtenues à partir d’expériences précédentes seront réutilisées et intégrées dans les nouvelles études lorsque cela est possible, évitant ainsi des répétitions inutiles.
Raffinement
Deux personnes expérimentées suivent quotidiennement les animaux de l’animalerie et procèdent au nourrissage bi-quotidien. Un prestataire agrémenté assure les nourrissages et suivis pendant les week-end et jours fériés. Les procédures décrites dans ce projet seront réalisées par du personnel formé et dans des locaux ayant obtenu un agrément du ministère. Des inspections sont effectuées régulièrement. Afin d’améliorer le bien-être des larves au cours des expériences, différentes méthodes de raffinement seront appliquées. Les larves seront gardées dans une enceinte thermostatée dédiée au poisson zèbre dans des conditions de vie optimale afin de réduire leur stress avec une température de 28 degrés Celsius et un pH de 7.2. Les larves seront contrôlées quotidiennement lors des changements de leur eau. Une grille de suivi de l’état des animaux sera complétée rigoureusement lors de ces contrôles et des indicateurs d’une éventuelle souffrance et/ou détresse aussi appelés points limites ont été identifiés. Ces points de surveillance garantissent le bien-être des larves et respectent des standards éthiques. Nous privilégions des techniques non invasives. Lors des sessions d’imagerie au microscope, les larves seront anesthésiées pour éviter tout stress.
Choix des espèces
Le poisson zèbre présente de nombreux avantages. Ces larves offrent un système digestif complexe, intégré dans un organisme qui nous permettra d’évaluer facilement l’efficacité des composés préselectionnés lors de la phase préliminaire réalisée sur cellules en culture. Leurs systèmes digestif, cardiovasculaire, neurologique et immunitaire sont bien étudiés, présents chez la larve et comparables à ceux des mammifères, ce qui en fait un excellent modèle pour étudier les effets de médicaments sur ces systèmes. La larve de poisson zèbre est devenue un modèle reconnu d’étude de l’inflammation intestinal. Dans ce projet, nous étudierons le système digestif chez des larves de poisson zèbre jusqu’à 6 jours post-fécondation comme décrit dans les études d’inflammation du tube digestif induite. A ce stade, ce tube présente des caractéristiques physiologiques et anatomiques permettant de répondre à nos objectifs expérimentaux. Enfin, les larves sont transparentes ce qui permet une observation directe et non invasive des processus biologiques internes grâce à des techniques d’imagerie.
Tests réglementaires de toxicité spécifique pour la production de vaccins et d’immunosuppresseurs à usage humain
- Tests réglementaires
- Contrôles de qualité
Rats : 610
Cochons d'Inde : 6240
13 850 animaux non-humains vont être utilisés puis tués pour des tests réglementaires de contrôle qualité de vaccins et d'immunosuppresseurs : 7 000 souris, 610 rats et ratons, 6 240 cobayes. Pour les 705 d'entre eux placés en gravité sévère, la nuisance attendue est la mort par réaction d'hypersensibilité ou le développement de tumeurs. Les autres reçoivent une à cinq injections sous la peau, dans l'abdomen ou dans une veine, les ratons cinq injections dorsales ou ventrales. Des méthodes in vitro existent déjà et sont acceptées par plusieurs pays destinataires, et le porteur décrit un travail d'advocacy auprès de la dernière autorité réglementaire qui les refuse.
Objectifs
Ce projet a pour objectif l’évaluation de la toxicité spécifique des vaccins, des immunosuppresseurs et de leurs composants destinés à l’Homme, selon les normes d’innocuité et de sécurité règlementaires. Les tests de toxicité spécifique sont des tests de contrôle qualité interne définis par les dossiers d’Autorisation de Mise sur le Marché (AMM) et par les référentiels réglementaires internationaux : • OMS (TRS n°980 « Normes relatives au vaccin antidiphtérique, au vaccin antitétanique, au vaccin anticoquelucheux et aux vaccins associés » • OMS (TRS n°979 Annexe 4) • Pharmacopée Européenne monographie n°0452 et l’OMS (TRS n°980 « Normes relatives au vaccin antidiphtérique, au vaccin antitétanique, au vaccin anticoquelucheux et aux vaccins associés ») • Immunoglobuline animale anti-lymphocytes T pour usage humain - monographie 1928 (pharmacopée européenne) Ces tests incluent les évaluations de stabilité des vaccins requises par la réglementation. Ils peuvent être également réalisés pour documenter les dossiers de validation de procédés, de matériels et/ou de bâtiments afin de vérifier que les changements réalisés n’ont pas d’impact sur la qualité des vaccins et médicaments produits.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus pour ce projet sont la mise sur le marché (ou éventuellement l’utilisation en essai clinique) de lots de vaccins ou d’immunosuppresseurs conformes aux textes réglementaires, et ainsi l’amélioration de la qualité de vie des patients.
Procédures
1 seule injection par voie sous-cutanée est réalisée sur les cobayes. 2 injections par voie intrapéritonéale sont réalisées chez la souris pour une 1ère procédure. 2 injections par voie sous-cutanée et 1 injection intrapéritonéale sont réalisées sur les souris pour une 2ème procédure. 1 injection par voie intraveineuse, ainsi qu’une anesthésie par voie intramusculaire sont réalisées sur les rats. 5 injections par voie sous-cutanée dorsale ou ventrale, ainsi qu’une anesthésie par voie intrapéritonéale sont réalisées sur les ratons. Ces différents types d’injection durent moins de 10 secondes. Les injections intraveineuses peuvent être plus longues (1 à 2 minutes).
Impact sur les animaux
Les nuisances subies par les animaux de ce projet sont très variables : • Une injection de vaccin ou d’immunosuppresseur pour les procédures gradées légères • La mort de l’animal par réaction d’hypersensibilité ou le développement de tumeurs pour les procédures sévères.
Devenir
Les procédures 4, 5 et 6 sont des procédures terminales (autopsies ou prélèvements d’organes en fin de test). Les procédures 1 à 3 ne permettent pas non plus la réutilisation des animaux, qui ont tous subi des injections de vaccins ou composants vaccinaux, et ne peuvent donc pas être inclus dans un autre test sans risque d’apporter un biais. De plus, des critères de poids ou d’âge pour l’entrée en test rendent impossible la réutilisation d’animaux.
Remplacement
Des méthodes in vitro sont en cours de développement ou en cours de dépôt réglementaire pour remplacer certaines procédures de ce projet. Ces méthodes alternatives ont déjà été adoptées par certains pays destinataires de ces produits, et servent ainsi d’exemple aux autres pays destinataires. Un travail d’advocacy est réalisé auprès de la dernière autorité réglementaire qui a refusé jusqu’à maintenant le remplacement de la procédure n°3 par une technique in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est défini par la réglementation. Le prévisionnel du nombre de lots à tester sur les 5 années à venir et la mise en place des stratégies de remplacement ou d’arrêt de ces tests nous permettent de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet. L’arrêt de la procédure 3 pour l’ensemble des destinations (sauf une), a permis de réduire d’un facteur 8 le nombre de souris utilisées. Le dépôt réglementaire pour la destination restante, pour la suppression du groupe témoin positif de la procédure 3 (n=10 par série) est en cours, date cible : Q1 2026, ce qui permettra de réduire l’effectif d’une série à chaque test.
Raffinement
Souris : Elles sont hébergées en groupe dans des cages avec litière contenant plusieurs enrichissements : des plateformes surélevées, des dome-homes (abris en carton) pour créer des barrières visuelles, des nestlets (carrés de coton) utilisés pour la nidification. Le dépôt réglementaire pour la destination restante, pour la suppression du groupe témoin positif de la procédure 3 (n=10 par série) est en cours, date cible : Q1 2026, ce qui entrainera une forte diminution du nombre de souris gradées sévères. Cobayes : Ils sont hébergés en groupe dans des cages contenant plusieurs enrichissements : des buchettes en bois à ronger, des huttes pour créer des barrières visuelles, du foin de Crau pour compléter leur alimentation. Un projet est initié dans le but d’héberger les cobayes sur litière. Rats : Ils sont hébergés en groupe dans des cages avec litière contenant plusieurs enrichissements : des buchettes en bois à ronger, des tunnels. Seules les mères gestantes sont hébergées seules, avec du matériel supplémentaire nécessaire à la nidification (mouchoirs, nestlets). Pour chacune de ces espèces, il y a une surveillance quotidienne et des points limites sont définis. De plus, des récompenses alimentaires (graines et fruits secs) leur sont distribuées après un acte jugé stressant ou douloureux.
Choix des espèces
L’évaluation réglementaire de la toxicité spécifique des vaccins ou d’une réaction toxique liée à l’activité biologique d’un composant concerné par ce projet impose le recours aux animaux de laboratoire selon les exigences règlementaires : • OMS (TRS n°980 « Normes relatives au vaccin antidiphtérique, au vaccin antitétanique, au vaccin anticoquelucheux et aux vaccins associés » • OMS (TRS n°979 Annexe 4) • Pharmacopée Européenne monographie n°0452 et l’OMS (TRS n°980 « Normes relatives au vaccin antidiphtérique, au vaccin antitétanique, au vaccin anticoquelucheux et aux vaccins associés »)
Etude du rôle des cellules T résidentes mémoires du système immunitaire dans la tuberculose et développement de stratégies vaccinales et thérapeutiques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Tester sur des souris des vaccins et des molécules qui stimulent des cellules immunitaires dites mémoires doit d'abord produire des connaissances fondamentales sur la tuberculose, les applications humaines n'étant espérées qu'en retombées indirectes. 1 974 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser leurs poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Toutes sont infectées par la tuberculose au moyen d'un aérosol. Certaines reçoivent en outre un vaccin sous anesthésie, d'autres des molécules jusqu'à une fois par jour pendant deux à trois semaines, éveillées, et une partie des souris seulement infectées subit une chirurgie de la cage thoracique pouvant durer cinq heures, dont elles ne se réveillent pas. Le porteur affirme avoir "besoin de travailler sur des organismes vivants" et conclut que son projet "nécessite l'utilisation d'un organisme entier telles les souris vivantes".
Objectifs
La tuberculose est l'une des maladies les plus meurtrières au monde, causant près de 1,5 millions de décès chaque année. Elle reste difficile à diagnostiquer et à suivre chez les patients, et il est encore compliqué de la prévenir par la vaccination ou de la traiter efficacement avec des médicaments. Même si l'on sait que le système immunitaire joue un rôle clé dans cette maladie, notre compréhension actuelle est encore limitée, ce qui complique les efforts pour améliorer le dépistage, le suivi et le traitement. Ce projet de recherche s'appuie sur des découvertes récentes qui montrent des différences dans les cellules immunitaires présentes dans les poumons de souris infectées par la tuberculose, selon qu'elles y sont plutôt sensibles ou plutôt résistantes. L'objectif est de tester de nouvelles approches, soit par des traitements qui renforcent le système immunitaire, soit par des vaccins, pour stimuler une réponse protectrice des cellules T (un type de cellules immunitaires) chez la souris. Plus précisément, le projet cherche à renforcer certaines cellules immunitaires, les cellules T « mémoires », qui pourraient jouer un rôle crucial dans la protection contre la tuberculose.
Bénéfices attendus
Il est attendu du projet un gain de connaissances fondamentales concernant le rôle de cellules T mémoires du système immunitaire dans le contrôle de l'infection. A partir de ces travaux, nous espérons des retombées indirectes comme par exemple le fait de pouvoir exploiter ces connaissances en proposant de possibles nouvelles approches préventives ou thérapeutiques, et ce, à partir de l'identification de stratégies vaccinales et/ou de l'utilisation de molécules pharmacologiques favorisant la résolution de l’infection en favorisant l’action des cellules T mémoires du système immunitaire. Ces démarches s'inscrivent dans la perspective de l'Organisation Mondiale de la Santé de mettre fin à la tuberculose.
Procédures
Dans ce projet, les souris seront infectées par la bactérie responsable de la tuberculose ; ceci se produit sur des animaux vigiles par l’utilisation d’aérosol et se déroule en une fois en quelques minutes. Certaines souris recevront l’administration d’un vaccin prophylactique (une seule injection dans une étape qui dure quelques minutes et qui est réalisée chez l’animal endormi) et d’autres recevront l’administration répétée de molécules thérapeutiques, réalisée sur des animaux vigiles de façon répétée (au maximum une fois par jour) pendant 2 à 3 semaines. Certaines souris seulement infectées subiront une chirurgie au niveau de la cage thoracique (une seule fois sous anesthésie générale et pour une durée de 5 heures au maximum).
Impact sur les animaux
Les principales nuisances causées à l’ensemble des animaux résideront dans l'induction d'une pathologie pulmonaire, la tuberculose suite à une infection expérimentale. Les autres nuisances concerneront, pour une partie des animaux, celles liées à une procédure chirurgicale et, pour les autres animaux, les nuisances liées à l'administration de molécules pharmacologiques ou de vaccins.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des expériences car celles-ci sont réalisées dans un environnement infectieux et que le poumon doit être analysé comme point final.
Remplacement
Nous nous intéressons à l’impact des cellules T mémoires dans la tuberculose. Etant donné que les populations de lymphocytes d’intérêt sont assez rares, qu’elles sont pour certaines accessibles seulement dans les poumons et qu’il n'existe aucun modèle cellulaire ni de possibilité de culture ex vivo, nous devons utiliser un système intégré dans lequel la circulation sanguine, la présence de ganglions lymphatiques et les poumons sont nécessaires (ce qui exclut les modèles multicellulaires du type "organoïde"). Une partie de l’étude porte sur le comportement des lymphocytes notamment leur dynamique de déplacement, leur localisation pulmonaire et leurs interactions avec les cellules infectées dans l’environnement pulmonaire. L’autre partie vise à mobiliser ces cellules sur le site infectieux dans un cadre de thérapies ciblant l’hôte ou de vaccinations. L’ensemble de ces événements sont étroitement liés à certains paramètres physiologiques tels que la circulation sanguine, la présence de ganglions lymphatiques et le microenvironnement des poumons. Il n’existe aucun modèle cellulaire de culture ex vivo à ce jour qui recapitule cette complexité d’interactions. De ce fait, afin de répondre à nos questions biologiques, nous avons besoin de travailler sur des organismes vivants ayant une réponse immunitaire et un tissu pulmonaire suffisamment proche de l’homme. Ainsi notre projet nécessite l’utilisation d’un organisme entier telles les souris vivantes.
Réduction
Dans ce projet, un nombre maximum de 1974 animaux sera utilisé. Afin de s’inscrire dans la logique de réduction, nous avons intégré trois étapes dans notre raisonnement. Tout d’abord, certaines étapes de nos projets pourront en effet être suivies de décisions de poursuite ou d’arrêt de l’étude en fonction des promesses offertes par les résultats. Nous possédons une forte expertise dans le domaine de la microscopie intravitale des poumons ce qui nous a fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Pour les thérapies ciblant l’hôte et la vaccination, nous disposons là aussi d’une forte expertise qui nous a permis de développer des approches expérimentales permettant d’analyser sur un même lot d’animaux, des paramètres qui étaient avant mesurés sur des lots d’animaux séparés. Finalement, l’expérience des années précédentes nous a fourni des indications sur la taille minimale des lots d’animaux à respecter pour obtenir en première intention des résultats statistiquement significatifs. Des tests statistiques seront utilisés sur des lots de 6 animaux par test.
Raffinement
Dans ce projet, plusieurs étapes peuvent causer de la douleur, du stress ou de l’inconfort aux animaux, et nous les prenons en compte pour minimiser ces effets : • Vaccination : Elle se fait sous anesthésie pour éviter la douleur. • Administration de substances : Nous privilégions des méthodes non douloureuses, comme les aérosols ou la prise d’eau, ou faiblement douloureuses comme certaines injections. • Injections spéciales : Elles sont réalisées sous anesthésie et avec un analgésique pour éviter toute douleur. • Suivi des souris infectées : Les souris sont surveillées quotidiennement pour repérer tout signe de souffrance. Si leur état se dégrade, elles sont mises à mort pour éviter toute souffrance inutile. • Chirurgie pour l'observation au microscope : Les souris reçoivent des anesthésiques et des analgésiques pour éviter la douleur, et leur confort est surveillé pendant toute la procédure. Elles ne sont pas réveillées après l'intervention. Ainsi, chaque étape est encadrée pour assurer le bien-être des animaux autant que possible.
Choix des espèces
Il existe plusieurs modèles animaux pour étudier la tuberculose, comme les singes, les poissons ou les rongeurs. Nous avons choisi d’utiliser des souris, car elles réagissent de manière similaire aux humains en termes de réponse immunitaire et de développement de la maladie. En particulier, certaines souris développent des lésions pulmonaires ressemblant à celles observées chez l’homme, ce qui permet une étude plus représentative. Les souris offrent aussi l’avantage de pouvoir utiliser des outils précis pour suivre les cellules du système immunitaire. Dans ce projet, nous utiliserons des souris d’un groupe génétique commun, ce qui permet d’éviter des différences qui pourraient fausser les résultats. Pour ce projet, seules des souris adultes de 6 à 12 semaines seront utilisées, car leur système immunitaire est suffisamment développé à cet âge pour fournir des résultats pertinents.
Approche thérapeutique par anticorps contre une cible thérapeutique dans le cas d’une fibrose des voies biliaires dans un modèle de souris humanisées.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Quatre semaines d'un régime alimentaire qui provoque un rétrécissement des voies biliaires et une fibrose du foie : 252 souris génétiquement humanisées sont utilisées, dont 156 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever leurs tissus. Elles reçoivent six injections d'anticorps sur animal vigile et trois prélèvements sanguins sous anesthésie. L'objectif déclaré est d'élargir les indications d'un anticorps déjà en développement clinique contre d'autres fibroses et le cancer du foie. Le porteur ne décrit aucun effet néfaste attendu, se bornant à rappeler que le régime reproduit la maladie.
Objectifs
Dans la Cholangite sclérosante primitive (CSP), un mécanisme d’inflammation, de rétrécissement des voies biliaires (ou sténoses) et de développement d’une fibrose est établi. Au cours de l’évolution de la maladie, des sténoses biliaires avec fibrose altèrent la fonction des voies biliaires conduisant à une fibrose. A ce jour, la transplantation hépatique est la seule solution thérapeutique, présentant malgré tout un risque de récidive dans 25% des cas. Il est donc urgent de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour cette maladie. Un modèle à base d’un régime alimentaire spécial, permet de récapituler le développement de la maladie chez la souris permettant le développement de sténoses des voies biliaires avec fibrose. Ce modèle nous permettra de tester une approche thérapeutique grâce à un anticorps ciblant spécifiquement une protéine. Le but de ce projet est donc, de valider cette approche thérapeutique avec un anticorps actuellement en développement clinique pour d’autres indications (fibrose hépatique, rénale, pulmonaire, cancer du foie) afin d’élargir les indications médicales de cet anticorps dans les CSP.
Bénéfices attendus
En cas de succès, le projet apporterait d'énormes avantages, directement applicables aux patients atteints de fibrose bilaire. L'objectif de l'ensemble du projet est de rassembler des preuves scientifiques solides et robustes permettant la transposition du traitement par anticorps thérapeutique dans un contexte clinique sans autres options thérapeutiques et d’étendre les indications thérapeutiques de l’anticorps clinique.
Procédures
Les animaux seront soumis à un régime spécial pendant 4 semaines. A partir de la 2ème semaine de régime les souris recevrons 6 injections d’anticorps (2 fois par semaine) sur animal vigile. Chaque injection prend moins d’une minute à être réalisée. Les animaux subiront 3 prélèvements sanguins sur animal anesthésié. Cette procédure est réalisée en 1 minute environ.
Impact sur les animaux
Un modèle à base d’un régime alimentaire spécial, permettra de récapituler le développement de la maladie chez la souris permettant le développement de sténoses des voies biliaires avec fibrose.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues nécessaires qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à une précédente étude afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Des méthodes anesthésiques, analgésiques et de confort seront appliquées lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatations de 14 jours, les souris seront laissées 7 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi permet de récapituler au plus proche les caractéristiques histologiques des cholestases hépatiques humaines en 3 à 6 semaines. C’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour étudier le développement de la fibrose suite à une cholestase hépatique. De plus le modèle humanisé dont nous disposons permet d’étudier plus finement l’effet thérapeutique de notre anticorps clinique. Les animaux seront utilisés à partir de 8 semaines afin d’induire une fibrose biliaire du jeune adulte.