Procédures sévères

Soumises à une chirurgie de deux à quatre heures, dont une ouverture du thorax avec implant au cœur pour une partie d'entre elles, 618 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères, toutes tuées pour vérifier au microscope la position des électrodes implantées dans leur cerveau. Chaque animal passe ensuite jusqu'à sept séances d'enregistrement de trois heures en contention, et certains reçoivent jusqu'à sept administrations d'agents anxiogènes ou panicogènes utilisés en psychiatrie. L'objet déclaré est de manipuler le rythme cardiaque pour mesurer comment le cerveau se représente l'information venue du cœur, et son effet sur la prise de risque et l'apprentissage. Le porteur reconnaît un risque d'abîmer le cœur ou les poumons pendant la chirurgie et des douleurs post-opératoires plus sévères après ouverture du thorax, tout en rangeant les tests comportementaux parmi les simples "gênes".

Objectifs

La perception que nous avons de notre rythme cardiaque peut réguler nos états émotionnels. En conséquence, une dérégulation de cette perception peut prédisposer à des maladies psychiatriques (anxiété, panique). Cependant, le rythme cardiaque est lié à d’autres variables, comme l’activité physique, rendant difficile son analyse spécifique et limitant nos connaissances sur les mécanismes neuronaux de la perception cardiaque. Ce projet, réalisé chez la souris, a 4 objectifs (1) Développement de deux méthodes de manipulation du rythme cardiaque pour pouvoir étudier spécifiquement la perception du coeur. Nous choisirons la méthode permettant le contrôle le plus fin et minimisant les effets sur la physiologie et le comportement. (2) Mesurer comment le cerveau représente l’information cardiaque. Pendant les stimulations cardiaques, nous enregistrerons chez la souris de grandes populations de neurones. Ces mesures permettront de relier l’activité neuronale aux stimulations cardiaques. (3) Evaluer le rôle du cortex dans l’utilisation de l’information cardiaque. Nous effectuerons 3 tâches permettant de mesurer différents aspects de l’impact du cœur : la perception cardiaque, l’effet du cœur sur la prise de risque et sur l’apprentissage respectivement. (4) Evaluer l’impact de molécules utilises en psychiatrie dans l’utilisation de l’information cardiaque. Dans les trois même tâches que (3), nous évaluerons si 4 agents pharmacologiques impliqués dans l’anxiété ou la panique modifient l’impact du rythme cardiaque sur le comportement de l’animal. Ces objectifs contribueront, à plus long terme, à une meilleure compréhension des mesures de perception cardiaques effectuées chez l’humain et à l’impact de cette perception sur certaines maladies psychiatriques.

Bénéfices attendus

La perception que nous avons de l’état de notre corps, et en particulier les battements de notre cœur, repose sur un sens, appelé intéroception. Ce sens nous permet de répondre aux besoins de notre corps (repos, alimentation, régulation cardio-vasculaire…) mais participe aussi à nos prises de décision et à nos états émotionnels. Ainsi, certaines maladies psychiatriques affectives comme l’anxiété ou les crises de panique sont associées à des déficits de perception cardiaque comme l’hypersensibilité ou bien l’insensibilité à ces battements. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’intéroception sont mal connues. Le bénéfice principal de ce projet est d’établir un modèle animal de la perception intéroceptive cardiaque ce qui permettra d’adresser trois questions importantes sans réponse à l’heure actuelle : - Quelle est la précision de la perception intéroceptive cardiaque en comparaison avec les autres sens (audition) ? - Comment le cœur influence-t-il le comportement émotionnel et il y a-t-il un lien avec les maladies psychiatriques? - Quelles zones cérébrales sont fonctionnellement impliquées dans la perception cardiaque ? Certaines maladies psychiatriques et somatique semblent liées à une intéroception de précision réduite (autisme, trouble du déficit de l’attention) ou hypersensible (anxiété, syndrome de l’intestin irritable). Avoir un modèle animal de cette perception permettra donc d’une part d’identifier les bases neuronales pour mieux comprendre et contrôler la variabilité chez l’humain et de tester des hypothèses mécanistiques sur ce qui mène à ces dérégulations.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à une chirurgie. Les chirurgies durent entre 2 et 4h maximum. Les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement chez l’animal éveillé allant jusqu’à 3h pendant un maximum de 7 jours avec maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux feront également des tâches comportementales d’une à trois heures sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. Il y a au maximum une session par jour, chaque session étant espacée d’au moins 12h. Pendant les sessions d’enregistrement, certains animaux reçoivent l’administration d’un agent pharmacologique utilisé en psychiatrie (anxiogène, anxiolytique, panicolytique ou panicogène). Nous effectuons au plus une administration par jour chaque session étant espacée d’au moins 12h. Il y aura au maximum 7 administrations par animal.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée. Pour les animaux qui subissent la chirurgie avec implant cardiaque, il y a un risque pendant la chirurgie d’abîmer le cœur ou bien les poumons engendrant des insuffisances cardio-respiratoires. La thoracotomie peut induire des douleurs plus sévères en post-chirurgie. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques qui pourraient augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Pendant le projet, nous allons modifier le rythme cardiaque ce qui pourrait imposer une physiologie inhabituelle pour l’animal et donc un stress et réaliser des tests comportementaux qui peuvent induire une gêne aux animaux.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour pouvoir effectuer l’analyse histologique sur le cerveau afin de vérifier la position des électrodes implantées.

Remplacement

Ce projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible d’utiliser des neurones en culture ou tout autre modèle in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’activité cardiaque à l’état émotionnel et la prise de décision, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue des tâches de décision.

Réduction

Utilisation de méthodes à haut rendement : Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement de l’activité éléctrique du cerveau et de leurs variables corporelles qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaires pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Utilisation de statistiques adaptées : Dans cette étude, beaucoup de statistiques sont basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux ce qui permet d’acquérir une grande puissance statistique car les neurones sont enregistrés par centaines. Pour les tests qui nécessitent de comparer des groupes d’animaux, nous calculons la taille des cohortes basé sur ce qui est attendu d’après la littérature pour ne pas utiliser plus d’animaux que nécessaires. Dès que possible, les expériences sont conçues pour effectuer des tests appariés (chaque animal est son propre contrôle) ce qui diminue la variabilité dans nos groupes et diminue donc le nombre d’animaux. Nous utilisons de méthodes accélérant l’apprentissage des tâches que nous avons montré efficace et qui permettent de réduire le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des mesures comportementales.

Raffinement

Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. Une analgésie adaptée est admnistrée avant et pendant la chirurgie et les jours suivants. Hébérgement : Les animaux sont hébergés à plusieurs dans des cages enrichis (dôme, coton). Ils sont suivis quotidiennement par le personnel de l'animalerie et après chirurgie par l'expérimentateur grâce à la grille de suivis. Les animaux sont habitués progressivement à la manipulation. Points limites : Pour le suivi postchirurgical, une grille d’évaluation permet de donner un score de l’animal et donc d’implémenter des points limites gradués. Pendant les expériences comportementales l’observation du comportement de la physiologie de l’animal permettent d’implémenter des points limites gradués liés à l’inconfort de l’animal. Nous utilisons également les doses minimales d’agents pharmacologiques pour avoir l’effet escompté afin d’éviter des effets secondaires.

Choix des espèces

Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles. La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal. De plus, la stratégie expérimentale nécessite l’utilisation de lignées transgénique qui n’existent que chez la souris. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.

Opérés une heure sous anesthésie générale pour qu'on leur crée des fistules anales, puis isolés de leurs congénères pour protéger la zone chirurgicale, 36 cochons mâles de 30 à 50 kilos subissent des procédures impliquant des niveaux de souffrance modérés à sévères. Trois à quatre semaines plus tard, les fistules sont évaluées sous sédation d'une heure, puis contrôlées six fois par imagerie au rythme d'une séance par semaine, avant et après l'application du traitement testé, sous anesthésie générale à nouveau. Le porteur décrit une douleur et une difficulté à déféquer les premiers jours, puis un inconfort rectal, une perte de poids modérée, de l'agitation et des nuits perturbées. Tous sont tués à l'issue pour l'analyse histologique de leurs fistules, dans un dossier destiné à étayer une demande de mise sur le marché.

Objectifs

L’objectif est d’étayer la demande de mise sur le marché d’une nouvelle approche biologique (médecine régénérative) pour traiter les fistules anales récidivantes qui viennent alourdir le pronostic dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Il s’agit d’apporter des preuves de concept clinique de l’efficacité de vésicules extracellulaires (ou exosomes) pour la cicatrisation de fistules périanales complexes. L’application vise les patients souffrant de la maladie de Crohn, lorsque les fistules ont montré une réponse inadéquate à au moins une thérapie conventionnelle (chirurgie) ou biologique. Les fistules périanales (FPA) sont de petits tunnels anormaux qui relient la muqueuse rectale à la peau, dans les pourtours de l'anus. La persistance des PAF est le signe d'une progression sévère de la maladie de Crohn qui a un impact négatif sur la qualité de vie. Elles entrainent douleur, formation d'abcès, écoulements et complications fonctionnelles telles que la sténose anale, la destruction du sphincter et un risque accru de tumeur maligne. L'objectif principal du traitement des FPA est d'éliminer les orifices internes et externes ainsi que l'épithélium du tractus, tout en préservant la continence anorectale (muscles). La chirurgie (fistulotomie, fistulectomie) reste le traitement standard, un large éventail d'approches est disponible (incision, curetage, drainage, pose de sétons, protectomie…) témoignant de l’absence de traitement idéal pour les fistules complexes. La récidive et l'incontinence sont les complications les plus courantes et les plus redoutées. De nouvelles techniques non chirurgicales sont en cours de développement pour améliorer les traitements tout en réduisant les effets indésirables. La collecte de données fiables sur leur sécurité et efficacité est requise avant leur utilisation chez les patients (tests réglementaires de mise sur le marché). Ce projet vise à développer des modèles précliniques représentatifs de l’évolution des FPA pour la recherche translationnelle et l’évaluation des nouveaux traitements prometteurs.

Bénéfices attendus

Le traitement actuel des patients souffrant de fistules périnéalescomplexes est essentiellement chirurgical et associé à des récidives et complications comme l’infection et l'incontinence. Tout progrès dans ce domaine améliorera la qualité de vie des patients, en majorité jeunes (30-40 ans), dont l'espérance de vie est longue. La thérapie régénérative mise au point dans ce projet représente une alternative acellulaire qui favorise la cicatrisation des tissus. Il s’agit d’une solution à base de vésicules extracellulaires, ou exosomes, provenant de tissus adipeux, mélangées à une solution se gélifiant à la température du corps. Cette combinaison offre l'avantage d'atteindre les zones peu accessibles, de combler les défauts irréguliers, de favoriser un effet occlusif et de retenir les exosomes dans le site de la lésion pour le traitement des fistules périanales complexes

Procédures

Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous anesthésie générale de 1 heure pour la création de fistules anales. Les fistules seront évaluées après 3 à 4 semaines par des examens d'imagerie non douloureux (IRM, echographie, scanner) sous sédation pendant 1 heure. Ces contrôles par imagerie seront renouvelés 6 fois, pendant 1 mois à un rythme hebdomadaire pour le suivi post traitement de la résolution des fistules. Le traitement des fistules sera appliqué au niveau anal sous anesthésie générale (1 heure). Des prises de sang pour bilan sanguin pourront être réalisées à la faveur des anesthésies.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables pour les animaux sont liés à l’anesthésie (inflammation, douleur au point de l’injection intramusculaire, nausées, irritation trachéale), à la création de fistules anales et au stress de l’isolement post opératoire temporaire, nécessaire pour préserver la zone chirurgicale des agressions par les congénères. Dans les premiers jours, l’animal peut ressentir de la douleur et de la difficulté à déféquer liés à l’inflammation périanale, ensuite il s’agit plutôt d’inconfort et de sensibilité au niveau rectal. Une perte de poids modérée, de l’agitation et une modification des rythmes de sommeil peuvent survenir la première semaine.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure pour des analyses histologiques des fistules.

Remplacement

A l'heure actuelle, aucun modèle alternatif ne peut remplacer les essais sur animaux vivants pour les autorisations réglementaires de nouvelles thérapies pour les patients. En complément des tests ex vivo préalablement réalisés, les modèles in-vivo sont essentiels pour reproduire les processus biologiques complexes impliqués dans l’altération des tissus et la cicatrisation des plaies. Nous ne pouvons pas remplacer le modèle animal pour reproduire fidèlement les conditions de pathogénèse des fistules périanales, comprendre leurs évolutions cicatricielles et résolutions thérapeutiques Cette étude nécessite le développement d'un modèle chronique de FPA pour permettre un suivi détaillé de la réponse et de la guérison des tissus après un traitement. L’espèce porcine a été retenue comme modèle le plus adapté car les animaux de petite taille ne répondent pas à toutes les caractéristiques requises dans ce projet. La toxicité éventuelle du traitement sera testée chez le rongeur (dans un autre établissement), mais pour évaluer l’efficacité et la sécurité de la thérapie nous avons besoin d’une approche en taille réelle, à l'échelle 1 :1, pour respecter l'ergonomie et la manipulation clinique. Nous avons donc besoin d'animaux de grande taille. Parmi les grands mammifères disponibles en recherche, dont les chiens et les singes, le porc s’avère le plus pertinent du fait de ses similitudes anatomiques et physiologiques avec l'homme, notamment en ce qui concerne son système gastro-intestinal et péri-anal, ce qui accroît le potentiel de transposition des résultats. La littérature a démontré la capacité du porc à simuler des fistules chroniques complexes, difficiles à reproduire dans des modèles animaux plus petits, ce qui permet une représentation plus précise des états pathologiques humains. Le modèle porcin nous permettra donc de recueillir des données complémentaires aux études préalables ex vivo et in vivo rongeur, intégrant les performances des traitements en situation clinique : nous évaluerons la sécurité et l'efficacité des dispositifs/thérapies dans la fermeture et la cicatrisation des défauts de la muqueuse sans effets indésirables tels que les saignements. La taille des porcs est compatible avec les dispositifs thérapeutiques testés et les techniques d'imagerie avancées utilisées chez le patient (endoscopie, IRM, échographie…), ce qui permettra un suivi complet et non invasif pendant toute la durée de l'étude.

Réduction

A partir des données de la littérature et des analyses statistiques réalisées, nous limitons le nombre d’animaux au strict nécessaire. Les techniques d’imagerie médicale avancées comme l'IRM, la fistulographie et l'échographie haute fréquence nous permettent d’augmenter significativement la quantité de données cliniques sans augmenter le nombre d'individus.

Raffinement

A leur arrivée dans l’animalerie, les porcs sont acclimatés en groupe social dans un environnement contrôlé en température et hygrométrie. Ils reçoivent une alimentation adaptée à leurs besoins, de l’eau à volonté, des jouets et dispositifs favorisant leurs comportements naturels comme le fouissage et mâchouillement. Un temps de familiarisation avec distribution de récompenses permet l’habituation des animaux à l’homme et aux manipulations. Un chirurgien expert du modèle porcin supervise les gestes spécifiques liés à la création des fistules et aux approches thérapeutiques. L’utilisation de l'imagerie permettra de procéder à des investigations mini-invasives sous sédation pour un suivi chronique sans dommages pour les animaux. Pour les procédures, afin d’éviter toute douleur et/ou stress, les animaux seront anesthésiés par injection intramusculaire puis relai gazeux, avec ventilation assistée, thermorégulation et monitoring des constantes. Une couverture antibiotique et un traitement analgésique seront mis en place, adaptés au niveau de douleur et à l’évolution des fistules. Les animaux seront étroitement surveillés au réveil de chaque anesthésie et examinés quotidiennement tout au long de la période d’étude. Une grille d’évaluation de la douleur est établie avec la conduite à tenir en cas de complications. L’isolement des animaux présentant des extériorisations de sutures sera limité au mieux, en laissant les porcs rencontrer leurs congénères sous surveillance afin qu’ils ne se blessent pas sur les zones chirurgicales. Même isolés, le contact visuel, sonore et olfactif sera maintenu entre les individus, des jouets seront distribués, et les temps de contacts positifs avec le personnel seront privilégiés : douche tiède, promenade, caresses, récompenses. Une vidéosurveillance 24h/24 permet un suivi visuel des comportements en animalerie et une intervention rapide du vétérinaire en cas d’anomalie. Des points limites sont définis pour arrêter la procédure en cas de souffrance.

Choix des espèces

Des études ont montré que la musculature du canal anal et les structures glandulaires du porc ressemblent étroitement à celles de l'homme, ce qui facilite la simulation des conditions de la fistule humaine. La taille des organes et les similitudes anatomiques du système digestif des porcs avec l’homme en font des modèles particulièrement précieux pour l'étude d'états pathologiques complexes tels que la maladie de Crohn avec complications fistulisantes, ainsi que pour l'évaluation de nouvelles interventions thérapeutiques dans des conditions cliniques (utilisation des mêmes équipements chirurgicaux/ imagerie que chez les patients). Des porcs males de 30 à 50 kg seront utilisés, la maladie ayant une prédominance masculine.

170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une partie d'entre elles porte une mutation qui reproduit la maladie de Niemann-Pick de type C1, avec perte de poids, perte de coordination motrice et une durée de vie moyenne de 125 jours. Selon les procédures, les souris reçoivent à partir de 10 jours de vie trois injections sous la peau puis une injection dans l'abdomen chaque semaine pendant 6 ou 12 semaines, et subissent des prises de sang sous anesthésie ainsi que des tests de coordination motrice, de marche, d'activité locomotrice et d'anxiété, et d'inhibition de la préimpulsion. Le traitement espéré pour les patients passe encore par un développement thérapeutique puis une preuve clinique chez l'humain. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de "modèles non-animaux" capables de reproduire une neurodégénérescence fatale. La molécule testée a été choisie au préalable sur des cellules.

Objectifs

Notre projet a pour objectif de tester l’efficacité in vivo d’une molécule sur un modèle murin de maladie de Niemann-Pick de type C1 (NPC1), qui récapitule le tableau clinique de la pathologie humaine.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet nous permettra d’obtenir une preuve de concept in vivo que la nouvelle approche thérapeutique envisagée est efficace sur plusieurs signes cliniques prédictifs du cours de la pathologie humaine. À plus long terme, ce projet se poursuivra par un développement thérapeutique de cette molécule visant à obtenir la preuve clinique de son efficacité chez l’homme, avec pour objectif final de proposer un traitement efficace pour les patients atteints de NPC1.

Procédures

Injections sous-cutanées (3/animal, 1 x par semaine, 1 min par injection) puis injections intrapéritonéales (1 x par semaine pendant 12 semaines, 1 min par injection), prélèvements sanguins (intracardiaque, 5 min par prélèvement sous anesthésie générale ; 3 fois à la veine temporale sous anesthésie gazeuse, 3 minutes par prélèvement). Tests comportementaux : Observations cliniques et évaluation des fonctions sensori-motrices 15 minutes chaque semaine (7 à 16 semaines d'âge), mesure de l'activité locomotrice et anxiété 5 fois 30 min, mesure des troubles de la marche (5 sessions de 3 jours, 5 minutes par jour), test de coordination motrice 4 fois 20 minutes, mesure de l'inhibition de la préimpulsion 3 fois 45 min. Amendements : injections intrapéritonéales : 1 x par semaine pendant 6 semaines pour l'étude précose ou 12 semaines pour l'étude tardive, 1 min par injection.

Impact sur les animaux

Les souris mutés présentent un phénotype dommageable ; ce modèle animal présente une perte de poids, une diminution de la coordination motrice, une mortalité prématurée avec une durée de vie moyenne de 125 jours. Pour la première procédure, ces animaux seront mis à mort suite à une anesthésie (nuisance légère). Pour la procédure deuxième, les animaux subiront 3 injections sous-cutanées indusiant une légère nuisance (1 par semaine pendant 3 semaines). Pour la troisième, les animaux subiront 3 injections sous-cutanées (1 par semaine pendant 3 semaines) puis 1 injection intrapéritonéale par semaine pendant 12 semaines induisant une nuisance modérée. Les souris subiront 3 prélèvements sanguins d’environ 3 minutes induisant une nuisance modérée. Amendements : Pour l'étude précose, les animaux subiront 3 injections sous-cutanées induisant une légère nuisance (1 par semaine pendant 3 semaines) puis 1 injection intrapéritonéale par semaine pendant 6 semaines induisant une nuisance modérée.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des procédures afin de prélever les tissus en vue d'analyse post-mortem, excepté pour l'étude pilote ou seul le sang sera prélevé.

Remplacement

L'étude de l'effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que les maladies neurodégénératives ne peut se faire sans l'utilisation de modèles animaux. En effet, il n'existe pas actuellement de modèles non-animaux permettant de récapituler l'ensemble des mécanismes physiologiques complexes à l'œuvre dans la mise en place d'une neurodégénérescence fatale, comme dans la maladie de Niemann-Pick de type C1. Cependant, le choix de la molécule optimale testée dans cette étude a préalablement été réalisé sur un modèle cellulaire.

Réduction

Ce projet implique des souris homozygotes présentant la mutation induisant la maladie de NPC1 et des souris non mutés qui seront considérées comme des contrôles ne présentant pas la maladie de NPC1. Dans l’étude précoce, les groupes expérimentaux seront constitués comme suit : 5 souris homozygotes mutées traitées avec le véhicule et 5 souris contrôles traitées avec le véhicule, pour chaque sexe, seront nécessaires à la caractérisation préliminaire du modèle dans le laboratoire. Dix souris homozygotes mutées traitées avec le composé, 10 souris homozygotes mutées traitées avec le véhicule et 10 souris contrôles traitées avec le véhicule, pour chaque sexe, seront nécessaires à la vérification des caractéristiques décrites dans le papier princeps. Le nombre de souris défini dans l’étude précoce repose sur les conditions nécessaires optimales à l’analyse des biomarqueurs. Il intègre à la fois la taille des effets attendus (diminution de 80 % de la protéine NPC1 chez les souris mutés, effet du traitement 40-45 % espéré) et la variabilité technique connue (30 %). À chaque étape, la variabilité réelle obtenue sera calculée. Dans le cas où l’étude précoce mettrait en évidence une « surestimation » par rapport à la variabilité technique théorique, une réduction du nombre d’animaux lors de l’étude d’efficacité tardive sera envisagée. Pour l’étude d’efficacité tardive afin de réduire le nombre d’animaux, nous avons décidé de ne pas réaliser de groupe contrôle non muté. Le groupe muté non traité permet d’évaluer les caractéristiques liées à la pathologie. Les résultats du groupe muté traité seront préférentiellement rapportés aux souris du groupe muté (point de départ de la pathologie). En cas de « situation optimale », les souris mutés sous traitement auront des niveaux de protéine NPC1 équivalents aux souris WT. Le choix de 16 animaux par groupe a été défini en fonction de la haute variabilité des tests comportementaux.

Raffinement

Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une étude toxicologique préliminaire a été réalisée afin de déterminer la dose maximale non toxique de la molécule à administrer aux animaux. Nous suivrons l'état général des animaux, le toilettage, la posture, la présence de vocalisation. Tous ces items nous permettront de décider de l'atteinte de points limites, le cas échéant, pouvant entraîner l'euthanasie de l'animal pour éviter toute souffrance. En cas de rixe entre animaux, nous pourrons être amenés à isoler l'individu dominant pour éviter toute lésion. L’animal isolé sera sorti de la procédure temporairement (si on arrive à le soigner) ou définitivement et il sera alors mis à mort. Les animaux seront maintenus en groupes, dans des conditions d'animalerie optimales. Ils disposeront sans limitation de nourriture, de boisson et d'un milieu enrichi (nids en quantité suffisante, bâton et balles à ronger). Si un animal présente un trouble locomoteur, de la nourriture mouillée et un biberon à longue tétine seront ajoutés à la cage. Si une douleur est présente, un antalgique pourrait être administré selon les recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés toutes les semaines en plus du suivi quotidien habituel. Lors du prélèvement sanguin, nous effectuerons une compensation du volume injecté avec du sérum physiologique.

Choix des espèces

La souris est l’animal de choix pour la création et l’étude de modèles avec une perte de fonction d’un gène (mutation). De plus, la souris est un modèle animal adapté à l’étude de la locomotion, phénotype d’une dégénérescence neuronale. Enfin, il n’existe pas de modèles in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier un phénotype locomoteur et/ou la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. Le traitement avec la molécule médicament débutera à 10 jours post-natal et sera donné 1 fois par semaine. Dans la littérature, l'ensemble des études ayant testé l'efficacité de notre molécule dans différentes pathologies ont commencé le traitement avant le sevrage des animaux, c'est pourquoi nous allons suivre ce même schéma expérimental.

Immunodéficientes, immunocompétentes ou humanisées à l'aide de cellules souches issues de cordons ombilicaux, 30 128 souris vont être utilisées sur quatre ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent des greffes de fragments tumoraux ou des injections de cellules cancéreuses, subissent des chirurgies du fémur, du foie, du poumon ou une castration de cinq à trente minutes, des prises de sang quotidiennes pendant cinq jours au minimum et parfois plusieurs semaines, ainsi que des prélèvements vaginaux. Le chiffre de 30 128 est établi sur le nombre d'études des années antérieures et sur l'anticipation d'une croissance annuelle, "en accord avec le plan commercial". Toutes seront tuées, le porteur indiquant qu'elles "ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de pouvoir tester des candidats médicaments en oncologie. Pour ce faire, nous utiliserons des modèles de tumeurs humaines ou murines implantés sur des souris immunodéficientes (diminution de l’état d’immunité de l’organisme), immunocompétentes (≠immunodéficience, capacité normale de l’organisme à se défendre contre une infection) ou humanisées à l’aide de cellules souches issues de cordons ombilicaux humains ou de cellules sanguines provenant du sang périphérique (PBMC). Différentes stratégies d’implantations des tumeurs pourront être réalisées en fonction des besoins expérimentaux. Le modèle nous permettra non seulement d’évaluer l’effet du candidat médicament sur la croissance tumorale mais également d’analyser l’implication du système immunitaire dans la réponse. Des souris sans tumeurs pourront également être utilisées dans des études pilotes, des études de biodistribution et toxicité de candidats thérapeutiques en oncologie.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’établir la fonctionnalité d’un candidat médicament dans un modèle se rapprochant le plus possible des conditions des cancers humains. En utilisant des souris au système immunitaire humanisé, nous mettons à disposition des chercheurs un modèle permettant d'étudier les mécanismes immunitaires anticancérigènes et les potentiels effets thérapeutiques de candidats médicaments avec davantage de spécificité de l'espèce utilisatrice de ces futurs traitements : l'Homme.

Procédures

Injection par voie intraveineuse : 2 fois maximum. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Chirurgie avec implantation de fragments de tumeurs : moins de 5 minutes. Injection de cellules tumorales : moins de 5 minutes. Autres chirurgies (castration, fémur, foie, poumon, …) : entre 5 à 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie pulmonaire, tumorale, dermique, digestive ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Le suivi de la croissance tumorale pourra se faire par imagerie d’une durée comprise entre 10 et 45 minutes. Le suivi de l’état de santé des animaux se fera par score clinique (aspect des poils, mobilité, état corporel, …) ou bien par palpation (ou autre geste technique). Afin de suivre l'évolution de la pathologie et d'objectiver les effets des molécules à visées thérapeutiques, des prises de sang seront réalisées. Les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements dépendra du vétérinaire d’établissement et figurera dans le protocolé d’étude. Des prélèvements vaginaux pourront également être effectués. La fréquence des prélèvements est quotidienne, pendant au minimum 5 jours de suite, pouvant aller jusqu'à plusieurs semaines de suite si nécessaire pour bien caractériser le cycle en entier, surtout si les souris ne sont pas synchronisées. Le geste durera quelques secondes.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par les injections, les chirurgies, le développement de tumeurs et des éventuelles métastases, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques injectés et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer. Le prélèvement vaginal pourrait entraîner une légère irritation locale transitoire, une inflammation minime ou un stress temporaire.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés car ils auront été implantés avec des cellules tumorales ou des fragments de tumeurs dérivées de patients ou auront développé une tumeur. Ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire et de mimer ses interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d’une molécule en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de thérapies innovantes pour les patients.

Réduction

Un total de 30128 souris seront utilisées, couvrant une période de 4 ans et permettant de réaliser environ 600 études précliniques de 50 souris et 2 études précliniques de 64 souris chacune pour la castration. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques. La variabilité de la croissance tumorale dépend fortement du modèle tumoral. Le nombre de souris par groupe est fonction du type d’étude. Des études pilotes pourront être réalisées afin de déterminer le nombre d’animaux à utiliser afin d’obtenir un résultat interprétable.

Raffinement

En début d’étude, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Cette couche de litière pourra être supplémentée par un échantillon de litière provenant de cages mâles dans le but de synchroniser le cycle œstral de la souris. En plus de ces conditions minimums légales, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 5 jours et seront habituées régulièrement à la présence humaine. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire d’établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique, de la perte de poids, et le cas échéant du volume tumoral ou de l’apparition d’une ulcération tumorale.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et homme, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. Pour les souris non humanisées, les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 6 semaines, animaux matures au niveau de leur système immunitaire. Pour les souris humanisées les animaux seront inclus aux études à partir de l’âge minimum de 8 semaines, première apparition des cellules immunitaires humaines dans le sang.

Soumises à une stimulation électrique produisant un stress intense, puis ramenées quatre fois à ce même épisode pendant quatre minutes à chaque séance, 765 souris développent les symptômes recherchés d'un trouble de stress post-traumatique. Elles passent ensuite une série de tests comportementaux de cinq à quinze minutes et subissent plusieurs prélèvements sous contention, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. L'objet est de tester un dérivé de la mémantine contre ce trouble, puis de le comparer à la fluoxétine et à la sertraline, sans que les tests comportementaux employés soient nommés. Toutes sont tuées à la fin pour prélever tissus et fluides.

Objectifs

En 2024, 3,9 % de personnes sont atteintes de Trouble de Stress Post-Traumatique (TSPT) dans le monde selon l'Organisation Mondiale de la Santé dont 2 femmes pour 1 homme. Pour réduire les symptômes de ce trouble, de nombreux anti-dépresseurs sont utilisés. C'est le cas de la Kétamine qui a révélé des effets positifs chez des patients atteints de TSPT. Cependant elle a pu aussi mettre en avant chez le patient des effets secondaires important tels que des effets dissociatifs. D'autres molécules sont actuellement utilisées pour lutter contre la dépression telle que la Fluoxetine et la Sertraline. La recherche pharmacologique explore donc activement d'autres pistes, la première d'entre elles étant de mettre au point des molécules similaires mais avec un bénéfice pharmacologique plus actif et sans effets secondaires. Une des pistes de traitement s'articule autour d'un dérivé direct de la Mémantine qui a eu des effets positifs sur des modèles de TSPT. Une question essentielle pour envisager le développement clinique de ce composé est de bien comprendre les spécificités et les conséquences pharmacologiques de ce traitement dans le TSPT. Ce projet a pour objectif de valider un nouveau modèle de TSPT chronique basé dans le but d’étudier la robustesse de l’induction de symptômes de TSPT chez la souris. Des marqueurs biologiques spécifiques du TSPT seront également analysés afin de caractériser le modèle. Une fois le protocole validé, le but sera de traiter les animaux avec ce dérivé à différentes doses et de la comparer dans un deuxième temps à la Fluoxetine et la Sertraline. Les marqueurs spécifiques qui reflètent la présence du TSPT dans le cerveau des souris seront analysés afin de déterminer si le traitement par ce dérivé de la Mémantine est susceptible de les modifier.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de valider un nouveau modèle de TSPT chronique et de révéler un effet positif de ce dérivé de la Mémantine sur les symptômes chronique de TSPT comparé aux molécules actuelles, et ainsi de faire progresser le développement pré-clinique d'un traitement plus efficace que celui utilisé aujourd'hui. A ce jour il n’existe aucun traitement pour le TSPT. Seuls les symptômes associés comme la dépression sont pris en charge. Il est donc important de trouver un traitement efficace suite à l’échec de la Kétamine en clinique.

Procédures

Les animaux seront soumis à un test de comportement suivi de 4 rappels afin d’induire les symptômes de TSPT (durée moyenne : 4-5min par test). Puis une série de plusieurs tests de comportement pour évaluer les différents symptômes de TSPT développés sera réalisée (durée moyenne : 5-15min par test). Plusieurs prélèvements sous contention seront effectués (durée : moins de 5 min). Une anesthésie générale sera réalisée pour effectuer des prélèvements sur l'animal (durée : moins de 15 min) puis lors de la mise à mort un prélèvement sera effectué.

Impact sur les animaux

Afin d’induire les symptômes de TSPT, certains animaux seront soumis à une stimulation électrique produisant soit un stress intense ou léger. Puis des séances de rappels seront réalisées pour réactiver ces éléments, produisant un stress léger à modéré pendant 4 minutes/rappel. Durant ces expériences, des prélèvements de sang auront lieu et engendreront un stress léger et sans lésion à l'animal. A la suite du protocole d’induction de TPST, plusieurs tests de comportement auront lieu, tests qui engendreront un stress léger de 5 à 15 minutes. Après ces tests de comportement, une anesthésie générale sera effectuée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter les tissus et fluides pour analyse et ainsi déterminer l’impact du traitement sur les marqueurs de la pathologie de TSPT.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours «in vivo» pour mîmer les symptômes pathologiques du TSPT et rechercher des biomarqueurs associés. En effet pour mîmer le TSPT chez l'humain et mesurer les différents paramètres évoluant lors de ce stress, certains points tels que le stress encouru, les impacts sur la mémoire, l'anxiété, la sociabilité, la perception douloureuse mais aussi le contexte de l'évènement traumatique (odeur, lieu) et les rappels de cet évènement ne peuvent être effectué que sur des modèles "in vivo".

Réduction

Les analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux à 16 par groupe et par sexe pour obtenir une puissance statistique suffisante pour les analyses de variances. Tous les tests comportementaux sont effectués sur les mêmes lots de souris pour limiter le nombre d'animaux utilisés. Nous avons mis des options en fonction des résultats obtenues dans le but de réduire au maximum l’utilisation d’animaux pour notre étude.

Raffinement

Nous avons mis une option en fonction des résultats obtenues sur la perception douloureuse dans le but de réduire au maximum l’utilisation d’animaux pour notre étude mais surtout de s’assurer du bien-être de nos animaux. Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation de 5 minutes par souris avant le début des expériences. Les animaux ayant subi un stress intense développent un phénotype anxieux mais on s’attend à ce que celui-ci soit modéré. Il sera révélé lors des différents tests comportementaux mais ne se traduit pas par des symptômes spontanés dans la cage d'hébergement. Si une altération de l'état est observée, une grille de score est utilisée pour identifier les points limites et déterminer la conduite à tenir.

Choix des espèces

Afin de refléter les symptômes du TSPT, la souris reste à ce jour un des modèles se rapprochant au plus près de l'humain et dont les capacités de mémoire, de stress, d'anxiété, de sociabilité et de perception douloureuse peuvent être étudiées en laboratoire. Les expériences débuteront sur des animaux de 10 semaines, âge adulte des souris.

5 060 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, dont 3 360 en gravité sévère. Des femelles gestantes reçoivent une injection destinée à faire naître une descendance présentant des symptômes proches de l'autisme, puis sont tuées après le sevrage parce qu'elles ne développent pas elles-mêmes ces troubles. Leur descendance passe jusqu'à quinze tests comportementaux en cinq mois, avec jusqu'à vingt heures de jeûne, vingt-trois jours de cage individuelle, une exposition à une lumière et un bruit forts, et des stimuli aversifs douloureux. Seules 900 souris, celles qui n'ont reçu aucun traitement et ne sont approchées par les autres que lors des tests de sociabilité, seront réutilisées ailleurs, le porteur affirmant que la complexité des troubles autistiques impose le recours à des modèles in vivo.

Objectifs

Les Troubles du Spectre Autistique (TSA) sont considérés comme des maladies du développement du système nerveux qui se manifestent dès la petite enfance. Ces pathologies se traduisent par des troubles du comportement, de l’interaction sociale, par des problèmes de communication, qui ne sont pas systématiquement associés à des retards intellectuels. Afin de chercher des pistes thérapeutiques contre les TSA, il est nécessaire de passer par des modèles animaux. Cependant, aucun modèle animal ne récapitule l’ensemble des symptômes des TSA, c’est pourquoi nous utiliserons 4 modèles souris dans ce projet. Notre objectif sera donc de tester par des études comportementales (évaluation de l’anxiété, compulsivité, sociabilité, mémoire… des souris) et/ou neurochimiques (évaluation des contenus en différents neurotransmetteurs dans le cerveau des souris) de nouvelles molécules issues de notre centre de recherche sur ces modèles souris de TSA. Nous utiliserons deux modèles d’autisme induits pendant la gestation, et deux modèles génétiques, avec en particulier un modèle du syndrome de l’X Fragile qui portera la même mutation que chez l’humain, et qui entraîne un TSA chez 10 à 30% des patients.Ce projet nous permettra ainsi de mener 50 études (chaque étude permettant de tester l'efficacité de 3 candidats médicaments ou de 3 doses d'un même candidats) sur 5 ans dans nos 4 modèles d'autisme.

Bénéfices attendus

A court terme, les procédures mises en œuvre permettront de caractériser les différents modèles d’autisme chez la souris et d’évaluer la capacité de nouvelles entités pharmacologiques à moduler les symptômes autistiques observés. A long terme, ce projet permettra de générer des données scientifiques pré-cliniques indispensables au processus de développement de nouveaux candidats médicaments, notamment avant le passage en phase de tests cliniques.

Procédures

Des souris femelles gestantes vont recevoir une unique injection d’un produit pharmacologique afin d'obtenir une descendance présentant des symptômes proche des troubles du spectre autistique. La détermination des symptômes autistiques chez les souris se fera grâce à une série de tests comportementaux (activité locomotrice, sociabilité, anxiété, compulsivité, mémoire…). Ces tests seront d’une durée maximale de 30 minutes par animal et par jour, et dans la limite de 15 tests sur 5 mois. La majorité des tests se fera sur une seule journée, avec un seul test par semaine, et au maximum une même souris sera testée sur 5 jours consécutifs. Une administration de candidats médicaments sera effectuée avant chaque test, avec dans la majorité des tests une seule administration par semaine, pouvant aller jusqu’à 4 par semaine dans le cas d’un test. Les délais d’administration avant les phases de test seront de 0 à 4h. Pour chaque administration une courte contention de quelques secondes sera nécessaire. Pour un test impliquant une dérogation de la mise à jeun, les animaux seront mis à jeun pendant maximum 20h. Dans un autre test impliquant une dérogation à l’hébergement, les souris seront hébergées en cages individuelles pendant une période maximale de 23 jours (incluant une phase d’habituation aux conditions expérimentales d’au moins 7 jours).

Impact sur les animaux

Parmi les effets indésirables attendus sur les souris, on aura le stress de la courte contention le temps de l’administration de produits, qui pourra également causer une courte et légère douleur dans le cas d’une injection. Un test de comportement nécessitera que les souris soient hébergées en cages individuelles, ce qui est source de stress pour les souris qui sont des animaux sociaux. Cependant, l'enrichissement sera maintenu (appareil de nidification...) ainsi que le contact visuel, olfactif et auditif avec les congénères afin de limiter ce stress. D’autres tests comportementaux utilisés pour caractériser les symptômes autistiques de nos modèles souris pourront par ailleurs induire d’autres types de stress brefs de durées maximales inférieures à 30 minutes. De plus, dans le cadre d’un protocole spécifique, les souris pourront être soumises à une courte période de restriction alimentaire. Pour un autre protocole, la lumière et le bruit ambiant seront forts pour motiver la recherche d’un refuge dans un labyrinthe, et seront donc source de stress chez les animaux. De plus, un protocole comprend des stimuli aversifs qui sont susceptibles de causes une douleur passagère chez les rongeurs.

Devenir

Les femelles ayant reçu un traitement pharmacologique durant la gestation sont mises à mort après sevrage des petits. En effet, ces femelles ne peuvent pas être incluses dans les procédures car elles ne développent pas de troubles autistiques. A la fin de tous les tests comportementaux et neurochimiques toutes les souris appartenant à nos 4 modèles autistes sont mises à mort, puisqu’une analyse des contenus en neurotransmetteurs dans leur cerveau (nécessitant une mise à mort) pourra être réalisée dans le cadre d’une procédure de ce projet, et si ce n’est pas le cas elles ne pourront être réutilisées.. Seules les souris utilisées comme stimulus social (et n’ayant subi aucun traitement) dans un de nos tests comportementaux pourront être réutilisées dans d’autres projets au sein du centre de recherches.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de nouvelles entités pharmacologiques sur les troubles du spectre autistique dans le cadre du développement de nouveaux médicaments. La nature des troubles du spectre autistique mettant en jeu des processus complexe et intégré qui requière la mise en place de modèles in vivo afin de pouvoir apporter des données comportementales et une efficacité potentielle d’un candidat médicament.

Réduction

Un effectif minimum de 16 souris par groupe expérimental est prévu pour la robustesse des tests statistiques, au vu de la variabilité attendue du comportement des rongeurs dans nos tests comportementaux. Ces tests statistiques nous permettront en effet de déterminer pour chaque expérience s’il existe bien une différence entre notre groupe contrôle et notre/nos groupe(s) traités avec des composés pharmacologiques.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe dans des cages adaptées à l’espèce avec la présence d’enrichissement (tunnel, igloo, appareil de nidification…) et avec accès illimité à l’eau et à la nourriture. Seule un test comportemental nécessite un hébergement en cages individuelles des souris et toujours avec un enrichissement maintenu et un contact visuel et olfactif avec des congénères. Autant que possible, les animaux seront placés de manière transitoire dans des cages de transfert individuelles après l’administration des produits et/ou le test afin de réduire le stress induit par le replacement de l’animal au sein de ses congénères. Lors du change des cages hebdomadaire, les animaux font l’objet d’un suivi par l’expérimentateur avec entrée des observations (et des éventuelles action prises) dans une base de données. Les membres de la SBEA (Structure Bien-Etre Animal) effectuent une observation mensuelle de tous les animaux.. Le raffinement sera aussi obtenu grâce au recours à des procédures les moins invasives possibles ainsi qu’à une familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (période d’habituation aux pièces et aux dispositif, phase de familiarisation aux manipulations...). De plus, des points limites adaptés (impliquant l'arrêt des expériences sur l'animal concerné), suffisamment prédictifs et précoces, ont été définis afin de limiter la douleur des animaux à son minimum.

Choix des espèces

La souris est déjà grandement caractérisée d’un point de vue comportemental et neurochimique et possède un système nerveux suffisamment évolué pour envisager raisonnablement une extrapolation à l’homme de certains résultats. De nombreux parallèles existent en effet entre les caractéristiques comportementales étudiées chez la souris et les caractéristiques du comportement humain. Cette espèce est la plus couramment utilisée pour évaluer les troubles du spectre autistique. De plus, la souris est une espèce pour laquelle il est possible d’avoir des effectifs permettant d’avoir une robustesse des résultats statistiques, et pour laquelle les quantités nécessaires de lots de recherche synthétisés par la chimie sont minimes. Dans deux de nos modèles d’autisme induits pendant la gestation, les injections de produits se font entre le 9ème et le 15ème jour de gestation, d’après les données de recherche qui suggèrent qu’ils s’agit d’une fenêtre critique pour l’induction des symptômes autistiques dans la descendance. Les études comportementales et/ou neurochimiques menées sur la descendance dans ces deux modèles, mais également dans nos deux modèles génétiques de l’autisme, se feront sur des souris jeunes adultes à partir de 7 semaines (animaux sevrés depuis plus de 3 semaines et suffisamment âgés pour avoir un comportement social élaboré).

2 442 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune ouverte au niveau de l'abdomen pour recevoir une injection de cellules cancéreuses directement dans le pancréas. 244 d'entre elles relèvent d'un niveau de souffrance sévère, les 2 198 autres d'un niveau modéré. À la chirurgie s'ajoutent jusqu'à cinq séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie et seize gavages, tandis que la tumeur pancréatique provoque des douleurs abdominales et, chez quelques individus, des métastases au foie ou au côlon. Le porteur vise l'identification de cibles moléculaires susceptibles d'améliorer un jour la réponse à la chimiothérapie, dans un cancer dont il rappelle qu'il a le plus mauvais taux de survie à cinq ans.

Objectifs

Le cancer du pancréas a le plus mauvais taux de survie à 5 ans de tous les types de cancer et est souvent résistant à la chimiothérapie classique. Il est donc urgent de trouver des options thérapeutiques innovantes. Les tumeurs sont des systèmes complexes constitués d'une multitude de populations cellulaires immunitaires et non immunitaires différentes, qui forment ensemble le microenvironnement tumoral. Au cours de la dernière décennie, il est devenu évident que les cellules dendritiques jouent un rôle clé dans l'initiation des réponses immunitaires anti-tumorales en absorbant les antigènes tumoraux et en amorçant les cellules T cytotoxiques dans les ganglions lymphatiques. Cependant, les études les plus récentes montrent que les cellules dendritiques sont généralement sous-représentées dans le microenvironnement tumoral de différents cancers et qu'elles sont peu performantes. Chez l'homme, les patients présentant un nombre élevé de cellules dendritiques dans le microenvironnement tumoral ont une meilleure survie et une meilleure réactivité au traitement, quel que soit le type de cancer en question. Cependant, le mécanisme qui cause la rareté et le dysfonctionnement des cellules dendritiques dans le microenvironnement tumoral est inconnu. L'objectif du projet est donc de comprendre l'hétérogénéité et la composition du microenvironnement de la tumeur pancréatique et la manière dont cela affecte la fonction des cellules dendritiques en ce qui concerne le développement et la progression de la tumeur. Sur le plan technique, une technologie de pointe permettra de caractériser la composition et le positionnement des cellules immunitaires dans le microenvironnement de la tumeur pancréatique au cours des différentes étapes de l'apparition et du développement du cancer dans un modèle de souris couramment utilisé pour le cancer du pancréas. L'objectif final est d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles permettant d'améliorer l'efficacité anti-tumorale des thérapies actuellement disponibles et de nouvelles options thérapeutiques centrées sur les cellules dendritiques.

Bénéfices attendus

Dans ce projet, nous visons à caractériser les cellules immunitaires et en particulier les cellules dendritiques dans le microenvironnement tumoral de l'adénocarcinome pancréatique à différents stades de l'apparition et du développement du cancer. Les cellules dendritiques sont souvent sous-représentées dans le microenvironnement tumoral et ne parviennent pas à exercer leur fonction normale, à savoir la présentation d'antigènes dérivés de la tumeur aux cellules immunitaires T dans les ganglions lymphatiques et l'induction de réponses immunitaires antitumorales. Notre objectif est d'identifier les interactions entre les cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral qui sont à l'origine de la rareté et du dysfonctionnement des cellules dendritiques dans l'adénocarcinome pancréatique. Ensuite, nous utiliserons les connaissances acquises pour sélectionner des cibles moléculaires potentielles qui pourraient aider à améliorer la réactivité à la chimiothérapie et à la thérapie par 'checkpoint' immunitaire.

Procédures

Les animaux auront une injection chirurgicale de cellules dans le pancréas. Durée 15 min par animal, sous anesthésie générale et analgésie adaptée.. Les animaux auront des injections d'analgésiques en sous-cutanée (3 en tout) Avant les injections sous-cutanées, un anesthésique local sera utilisé pour anesthésier la peau. Imagerie in vivo : une fois par semaine, durée 15 min par animal, (n=5 au maximum) sous anesthésie générale, avec injection d'agent pour la luminisecence (1 fois par séance, sous anesthésie générale). Gavage oral pour certaines souris : deux fois pendant des jours consécutifs, 8 sessions, soit 16 gavages, 1 min par animal. Prises de sang : un animal par groupe sera prélevé sous anesthésie générale, 1 fois, durée 3 minutes.

Impact sur les animaux

La chirurgie d'injection de cellules dans le pancréas induira par elle même des nuisances légères dues à la préhension puis à la cicatrisation de la plaie (inconfort, douleur légère). La croissance des tumeurs dans le pancréas induira pour la majorité des individus des nuisances modérées (potentiellement : douleurs abdominales) du fait du suivi clinique et en imagerie (arrêt de la procédure à une taille limitée). Pour certains individus (rares), il pourra y avoir des métastases hors du pancréas (foie, colon). Dans, ce cas, les conséquences pourraient être éventuellement sévères (douleurs, anorexie potentielle). Le nuisances liées aux gavages, injections et prises de sang seront légères et temporaires (inconfort, stress temporaires).

Devenir

Tous les animaux participant à cette étude subiront une chirurgie abdominale pour introduire l'adénocarcinome pancréatique. Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever la tumeur et différents organes (sang, ganglions lymphatiques) pour différents types d'analyses immunologiques. La réutilisation des animaux n'est pas possible.

Remplacement

Ce projet nécessite l'établissement de l'adénocarcinome pancréatique dans toute sa complexité au niveau systémique. À l'heure actuelle, les approches organoïdes (= 3 D structure composée de cellules et ressemblant à un organe) existantes pour l'adénocarcinome pancréatique ne parviennent pas à reproduire la diversité des cellules immunitaires infiltrant et existant dans le microenvironnement tumoral. En outre, le projet nécessite la présence de une formation de cellules sanguines dans la moelle osseuse, d'une circulation sanguine et de ganglions lymphatiques. Dans notre cas, cela est important car les cellules dendritiques proviennent de la moelle osseuse et atteignent le pancréas via la circulation sanguine. Après avoir absorbé les antigènes tumoraux, les cellules dendritiques migrent de la tumeur vers les ganglions lymphatiques pour induire des réponses immunitaires antitumorales. Nous rechercherons régulièrement des stratégies de remplacement dans la littérature. De futures questions scientifiques, par exemple l'essai de médicaments qui ciblent les cellules ou les molécules identifiées dans ce projet, pourraient permettre de passer à une approche in vitro d'organoïde 3D à l'avenir.

Réduction

Nous avons pris en compte de multiples facteurs qui nous permettent de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour répondre aux questions scientifiques sous-jacentes. Tout au long du projet, nous adhérons à des normes largement acceptées dans la littérature internationale et continuons à réviser nos approches. Le nombre d'animaux analysés dans les groupes expérimentaux est maintenu aussi bas que possible afin de pouvoir tirer des conclusions valables et significatives des expériences proposées. En outre, pour répondre à nos questions scientifiques, nous utiliserons des méthodes à haut débit impartiales qui maximisent les connaissances acquises à partir d'une petite cohorte d'animaux. En outre, nous planifierons et exécuterons les expériences de manière réfléchie afin de combiner le plus grand nombre possible de tissus d'intérêt et de groupes de contrôle. Grâce à ces stratégies, nous visons à réduire le nombre d'animaux au minimum, tout en garantissant des résultats scientifiquement pertinents.

Raffinement

Des contrôles seront effectués quotidiennement. En outre, les chercheurs évalueront fréquemment (deux fois par semaine) les souris sur le plan clinique selon les critères définis précis. Les critères scientifiques de suivi sont atteints avant que la souffrance ne dépasse les points limites définis par l’éthique. En détail, les critères scientifiques de suivi sont sélectionnés pour couvrir chaque étape du développement de la tumeur. Les points temporels précoces et intermédiaires sont sélectionnés pour étudier le remodelage des tissus et l'établissement de la tumeur. Les points temporels longs (> 28 jours) sont sélectionnés pour assurer la croissance de la tumeur. Quand le point limite est atteint, les souris sont immédiatement retirées de l'étude . En ce qui concerne la manipulation des souris, celles-ci disposeront de suffisamment de temps pour s'acclimater à leur nouvel environnement, y compris pour entrer en contact avec les chercheurs avant le début des expériences. Nous appliquerons des méthodes visant à réduire le stress induit par la manipulation des souris, par exemple en évitant de les attraper par la queue et en optant plutôt de les recuperer aux creux des de nos mains ou tunnels. Les procédures seront effectuées dans un environnement stérile et des mesures appropriées seront prises pour éviter les infections post-procédure. L'anesthésie et l'analgésie seront pratiquées chaque fois que nécessaire pour réduire le stress et la douleur. Dès que les souris montrent de l'inconfort, la fréquence de surveillance sera augmentée et des mesures seront prises pour soulager le stress/la douleur. Les cages contiendront des enrichissements sous la forme de sizzlenest et de maisons ou tunnels en carton. Après le début de l'expérience (= injection de cellules tumorales), les souris resteront dans leur habitat habituel et seront continuellement hébergées en groupes sociaux.

Choix des espèces

- grande similitude avec l'homme en ce qui concerne la génétique et la complexité du système immunitaire - disponibilité d'une large gamme de modèles de souris génétiquement modifiées - disponibilité d'un modèle de tumeur murine bien établi - large éventail de techniques de laboratoire établies pour les souris Souris sexuellement matures, 8 et 12 semaines. Il est nécessaire d'utiliser des souris sexuellement matures entre 8 et 12 semaines pour s'assurer que a) la taille et le poids des souris sont suffisamment élevés pour supporter la croissance de la tumeur, b) la taille du pancréas est suffisamment grande pour l'injection de cellules tumorales et la croissance de la tumeur, c) le système immunitaire est mature.