Procédures sévères

Injectées sous échographie dans le cœur, le rein ou le foie pour y faire naître une insuffisance cardiaque ou une tumeur, 1 147 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Il s'agit d'une prestation de service : la plateforme facture aux laboratoires la fabrication de modèles murins de maladies humaines. Le porteur présente la technique comme réduisant le traumatisme et la durée de l'intervention, et ne décrit les suites du développement tumoral ou cardiaque qu'en termes de faiblesse, de perte de poids ou de douleur. Aucune mise à mort n'est annoncée au terme de la session : les souris sont soit suivies par imagerie d'une semaine à 18 mois, soit renvoyées chez le demandeur pour la poursuite de son projet.

Objectifs

L'objectif de ce projet générique de service est de fournir aux scientifiques des prestations d'injections guidées par imagerie ultrasonore en temps réel pour la création de modèles murins mimant les pathologies humaines. Les principales applications incluent : 1) la modélisation de pathologies cardiaques, telles que l'insuffisance cardiaque ; 2) le suivi, par imagerie ultrasonore, de l'injection de cellules cancéreuses ainsi que des traitements spécifiques à ces maladies.

Bénéfices attendus

Les avantages de l'approche de l'injection guidée par imagerie ultrasonore sont les suivants : 1- Une diminution du traumatisme pour l'animal. 2- Une réduction significative du temps d'intervention. 3- Une vérification en temps réel de l'efficacité de la procédure. 3- Ces techniques, principalement utilisées pour l'étude et la découverte de nouveaux traitements de pathologies humaines, optimisent non seulement le temps, mais aussi la qualité des résultats scientifiques, renforçant ainsi la pertinence et la précision des études menées.

Procédures

Les animaux seront soumis à une session d'injection guidée par imagerie, réalisée sous anesthésie et analgésie préventive, afin de permettre un ciblage précis des organes (cœur, rein, foie, etc.). Cette session vise à créer des modèles de pathologies cardiovasculaires ou cancéreuses, dans le but d’améliorer la compréhension de ces maladies et de tester in vivo des traitements innovants. La durée de la session sera comprise entre 5 et 20 minutes maximum.

Impact sur les animaux

La session d'injection guidée par imagerie entraînera le développement de pathologies cardiaques ou cancéreuses. L’apparition d’éventuels effets indésirables, tels que la faiblesse, la perte de poids ou la douleur, sera attentivement surveillée après les injections.

Devenir

À la fin du protocole expérimental, nous organiserons soit le suivie par imagerie non invasive sur une période d'une semaine à 18 mois soit le retour de l'animal sur le site du demandeur pour la poursuite du projet dans le cadre d'une utilisation continue.

Remplacement

Le développement de nouveaux modèles murins présentant des pathologies cardiovasculaires et des cancers joue un rôle essentiel dans la compréhension des grandes fonctions en recherche préclinique, en particulier dans des domaines où les méthodes substitutives ne peuvent pas fournir des informations équivalentes. Le suivi des processus physiologiques tels que le métabolisme, la perfusion tissulaire, les communications inter-organes, la fonction des organes complexes ou l'effet des médicaments dans l'organisme offre des informations précieuses sur les grandes fonctions biologiques. Les modèles cellulaires ne peuvent pas reproduire fidèlement ces fonctions complexes, dynamiques et spatiales présentes dans les systèmes biologiques.

Réduction

Les procédures de d’injection suivi par imagerie permettent d'optimiser les expérimentations tout en réduisant le nombre d'animaux nécessaires. Grâce au suivi longitudinal, chaque animal sert de témoin pour lui-même, ce qui permet de suivre l'évolution des pathologies dans le temps dès les premiers signes de dysfonctionnement. Cette approche réduit significativement le nombre d'animaux requis, tout en garantissant des données fiables et précises.

Raffinement

Toutes les procédures sont effectuées de manière à limiter le stress et la souffrance des animaux, notamment par l'utilisation d'anesthésie et d'antalgiques en cas de douleur. Les souris seront surveillées quotidiennement par notre personnel qualifié afin de détecter le moindre signe de souffrance chez l’animal. Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué régulièrement en concertation avec l'équipe de zootechnie. Les animaux seront placés dans leur cage avec une litière propice à un aménagement approprié, utilisant des matériaux favorisant une nidification rapide tels que des matériaux prédécoupés. De plus, nous mettons en place des structures de repos adaptées dans les cages, telles que des rouleaux en carton ou cage en plastique.

Choix des espèces

L'utilisation de rongeurs tels que la souris permet de reproduire les pathologies humaines telles que les maladies cardiovasculaires, le cancer, etc. L'utilisation de souris transgéniques (KO, KI, inductible) permet ainsi de caractériser fonctionnellement un gène ou une protéine. Les souris sont des modèles de choix dans la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. Le panel d'âges sera variable car il dépendra du projet scientifique auquel nous serons confrontés. Techniquement, nous pouvons faire des injéctions guidées par imagerie sur des animaux allant de P15 (15 jours après la naissance) à 24 mois d'âge.

32 souris subissent une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie générale pour recevoir une injection dans la moelle épinière cervicale, et sont toutes tuées ensuite pour l'étude histologique. Le porteur annonce des saignements, une douleur après l'opération, un risque d'infection de la suture, une réduction de la mobilité, un déséquilibre et une perte de poids, dans des procédures classées en souffrance sévère. L'objet est de cartographier les neurones inhibiteurs qui utilisent la glycine pour réguler la posture et l'équilibre, un travail d'anatomie dont le RNT n'annonce aucune application clinique. Des essais pilotes chez le xénope ont servi à caler les protocoles avant le passage à la souris, que le porteur juge "indispensable" faute de modèle in vitro reproduisant ces conditions.

Objectifs

Ce projet de recherche cherche à mieux comprendre comment le cerveau et la moelle épinière travaillent ensemble pour contrôler nos mouvements, comme se tenir debout ou marcher de façon stable. Même si on connaît bien certaines parties du système nerveux qui envoient des signaux pour activer les muscles, les interactions avec les parties qui inhibent ou freinent ces signaux sont moins bien comprises. Pour étudier ces mécanismes, nous allons utiliser des souris spécialement modifiées pour rendre visibles des neurones particuliers qui jouent un rôle d'inhibition, utilisant une substance appelée glycine. Grâce à ces souris, nous pourrons cartographier et analyser ces réseaux de neurones, pour mieux comprendre leur rôle dans la coordination des mouvements et de la posture, et voir comment ils interagissent avec les autres circuits nerveux. .

Bénéfices attendus

Notre projet permettra une meilleure compréhension du système postural impliqué dans le maintien corporel d’un être vivant. L’étude anatomique de ce système d’adaptation apportera des connaissances utiles pour la compréhension de son fonctionnement en situation physiologique et pathologique.

Procédures

32 animaux seront soumis à 1 chirurgie d’injection dans la moelle épinière, d’une durée de 30 à 45 min sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Il s’agit de risques généraux suite à la chirurgie tel que le saignement, la douleur post-chirurgicale, l'infection au niveau de la suture, la réduction de la mobilité à court terme, le déséquilibre, la perte de poids.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation pour l'étude histologique.

Remplacement

En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent aux questions scientifiques posées par notre étude. Le recours donc au modèle animal « souris » est indispensable pour la réalisation de cette étude qui nécessite une évaluation comportementale et un ciblage de neurones spécifiques. Aucun modèle in vitro ne peut reproduire de telles conditions. Cependant, nous avons réalisé des études pilotes chez le xénope pour mettre au point les protocoles et s’assurer de leur fonctionnement avant de les adapter à la souris.

Réduction

Avant la mise en place de ce projet, nous avons réalisé des expériences pilotes pour la mise au point des injections spinales cervicales afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux du projet. La réduction du nombre d’animaux a été prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique. Le nombre maximal, en prenant en compte les variations expérimentales, 8 animaux par groupe pour cette étude anatomique. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles, ce qui permet d’inclure tous les animaux des portées

Raffinement

Tous les protocoles sont réalisés par des experts dans le domaine et sont ainsi optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. Les animaux sont hébergés tout au lond de l'expérimentation en cage collective avec enrichissement du milieu (tunnel, maisonnette, cellulose pour le nid). L’utilisation d’anesthésique et d’analgésiques est prévue pour soulager les douleurs post-chirurgicales. De plus, de la nourriture enrichie est fournie pendant au moins 3 jours suivant la chirurgie et si besoin plus. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement, des traitements vétérinaires si besoin. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter la souffrance des animaux, pour cela, les animaux seront suivis régulièrement pour détecter d’éventuels signes cliniques (perte de poids, apparence physique, comportements provoqués/non provoqués). En plus des points limites spécifiques (score>4) sont déterminés suite à la chirurgie (poids, mobilité, respiration) et ce pendant 3 jours après la chirurgie. Les sutures seront particulièrement surveillées pendant la première semaine et seront reprises en cas d’ouverture.

Choix des espèces

La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. C’est l’espèce qui présente le plus de modèles génétiquement modifiés permettant de répondre à notre problématique. Il n’existe en effet pas de modèles autres de la modification génétique qui nous interesse dans ce projet. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de minimum 8 semaines lorsque les réseaux neuronaux sont mis en place et le système nerveux est mature.

Pour tester une molécule nommée GC7 sur l'insuffisance cardiaque qui suit un infarctus, 112 souris rendues pré-diabétiques par un régime riche en gras et en sucre vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal suit ce régime pendant dix à vingt-six semaines, subit cinq jeûnes de six heures suivis d'injections de glucose ou d'insuline et de prises de sang, cinq échocardiographies sous anesthésie générale, puis une chirurgie qui bloque une artère du cœur pendant quatre-vingt-dix minutes avant le réveil. Le porteur décrit une prise de poids importante, un retentissement progressif sur la fonction cardiaque, une douleur modérée de quelques heures après l'opération, et un risque de mortalité péri-opératoire "non nul" intégré au calcul des effectifs. Toutes sont tuées huit, douze ou seize semaines après l'infarctus, pour prélever le cœur, le foie, les reins et le tissu adipeux.

Objectifs

L’insuffisance cardiaque touche près d’un million de personne en France et on lui attribue 70 000 décès par an. Elle se traduit par un remodelage du muscle cardiaque délétère associé à des altérations fonctionnelles qui conduisent le plus souvent à la mort. Elle survient, très souvent suite à un infarctus du myocarde aigu dont la survenue est plus fréquente chez les patients avec un syndrome métabolique. L’objectif du projet est d’utiliser un modèle murin ayant développé un pré-diabète. Nous induirons sur ce modèle un infarctus du myocarde dans le but d’étudier le developpement d’une insuffisance cardiaque. Nous testerons les effets d’une drogue nommée GC7 ayant pour cible un facteur d’initiation de la traduction (protéine se liant au ribosome pour permettre la traduction de l’ARNm en proteines) EiF5A, en aigue, sur la taille d’infarctus, et à long terme sur le developpement d’une insuffisance cardiaque en verfiant si la poursuite d’une diète riche en gras et en sucre altère ou non les effets du traitement. Des études antérieures ont pu montrer que cette drogue permet de moduler l’énergétique mitochondriale. La limitation de l'infarctus et l'amélioration de la récupération fonctionnelle à long terme sont des objectifs majeurs pour améliorer la morbi-mortalité et le bien-être des patients. C’est pourquoi, le suivi dans le temps de ce modèle nous permettra de mieux comprendre l’évolution de cette pathologie cardiaque et de pouvoir évaluer l’efficacité́ de ce nouveau traitement donné à la phase aigüe de l’infarctus dans un contexte métabolique altéré. Nous nous attacherons donc a évaluer l’efficacité de notre traitement à distance de l’infarctus, sur les altérations de la fonction cardiaque ainsi que sur le developpement d’une insuffisance cardiaque, à différents temps (8, 12 et 16 semaines post-ischémie). Nous déterminerons également, en aigu (24h après l’infarctus), la taille d’infarctus. En fin de chaque protocole, des tissus (cœur, sang, reins, tissu adipeu, foie) seront prélevés afin d’évaluer l’inflammation systémique et tissulaire, la fibrose tissulaire au niveau cardiaque et rénale et les atteintes métaboliques du tissu adipeu et du foie. La maladie métabolique peut avoir un retentissement sur la maladie cardiaque et inversement. Il est donc important de comprendre quels sont les effets cardiaques et métaboliques de notre intervention pharmacologique.

Bénéfices attendus

Notre objectif principal est l’évaluation du succès de la transposition de l'effet protecteur ischémique d’un nouveau composé pharmacologique le GC7 dans un modèle in vivo d’insufisance cardiaque post-infarctus chez la souris lorsqu'il est utilisé à une dose unique au moment de la reperfusion. De plus ce travail nous permettra de définir si le GC7 peut être un agent cardioprotecteur lorsqu'il est administré en juste après l’infarctus dans un modèle de souris nourries avec un régime riche en graisses et en sucres. Notre objectif final serait de montrer que le GC7 est un traitement efficace dans la prévention du développement de l'insuffisance cardiaque dans un contexte de pré-diabète quand il est administré à la phase aigue de l’infarctus.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Un régime riche en gras et en sucre pendant 10 ou 26 semaines selon les groupes - 5 tests consistant en l’administration de glucose ou d’insuline (durée < 1 minute) puis prélèvements de sang (durée < 30 secondes). Ces tests sont espacés de minimum 7 jours les uns des autres et sont précédés d’un jeûne court de 6h. - 5 examens échocardiographiques sous anesthesie générale (durée : 15-30 minutes), espacés également de minimum 9 jours les uns des autres. - Une chirurgie mimant l’infarctus du myocarde sous anesthésie générale profonde et couverture analgésique adaptée. Les souris seront soumises à 90 minutes d’infarctus sous anesthésie puis reveillées suite à la recanalisation de l’artère occluse. - Mise à mort pour prélèvement final du sang et des organes d’intérêt.

Impact sur les animaux

Le régime riche en sucre et en gras pendant 26 semaines maximum est associé à une prise de poids corporelle importante et rapide, ainsi qu’à un retentissement progressif sur la fonction cardiaque. Ceci peut induire, après plusieurs semaines de ce régime, un inconfort d’intensité légère à modérée de longue durée pour l’animal. L’induction de l’anesthésie (pour la chirurgie), ainsi que le réveil peuvent s’accompagner d’un léger inconfort et stress de courte durée. La chirurgie cardiaque induit une douleur modérée de durée moyenne (quelques heures). Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs). La chirurgie, c’est-à-dire 90 minutes d’infarctus chez des individus pré-diabétique est susceptible d’être accompagnée d’un risque de mortalité peri-opératoire non nul qui a été pris en compte dans la calcul des effectifs.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des 2 protocoles afin de prélever des tissus (cœur, foie, tissu adipeu et reins) en vue d’analyses ultérieures.

Remplacement

Il s’agit ici de l’utilisation d’un modèle chirurgical animal d’étude de l’insuffisance cardiaque post ischémique, nécessitant par essence le recours à l’animal. En effet, l’insuffisance cardiaque post-infarctus est une pathologie complexe que les méthodes alternatives actuelles ne permettent pas de simuler dans son ensemble. Aussi, réaliser un suivi de la fonction cardiaque, sur plusieurs semaines d’évolution de la pathologie nécessite le recours à un organisme entier. De plus, le contexte métabolique altéré (pré-diabète) impliquera des altérations fonctionnelles des tissus adipeux et hépatique qui pourraient retentir sur le remodelage cardiaque. Néanmoins, afin de mieux comprendre certains des mécanismes intracellulaires mis en jeu par l’utilisation du traitement, un des nos collaborateurs effectuera certaines experiences sur des cellules humaines en culture afin de limiter le nombre d’animaux necessaires à cette étude. Ces études sur modèle cellulaire ne pourront pas nous apporter de réponse quand à l’effet à long terme.

Réduction

Les effectifs ont été estimés au minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats exploitables : Le nombre d’animaux par groupe a été calculé à l’aide de tests de puissance sur la base des résultats des études précédentes. Le nombre d’animaux de cette étude a été déterminé par une analyse statistique sur un logiciel spécifique. Afin d’analyser nos résultats, nous effectuerons des tests statistiques adaptés afin de comparer nos groupes experimentaux.

Raffinement

Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisées sous prémédication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sous anesthesie générale avec prémedication par injection sous cutané d’un antidouleur. La mise à jeun courte de 6h avant les tests métaboliques est réalisée au matin, ce qui correspond au début de période diurne pour les animaux (c’est à dire à leur période de plus faible activité et en situation post-prandiale). Les prélèvements d’autres tissus (reins, tissu adipeux, foie et sang) en parallèle du cœur sont réalisés sur les mêmes souris afin de compléter l’analyse du profil d’insuffisance cardiaque qui est souvent associé en clinique humaine à une défaillance multi-organes. Des points limites adaptés aux procédure envisagées ont été mis en place.

Choix des espèces

La souris est un modèle largement utilisé dans la littérature dans le cadre d’études mécanistiques ou précliniques portant sur les maladies cardiovasculaires. La différence physiologique majeure au niveau cardiaque entre la souris et l’homme est la fréquence cardiaque. Néanmoins, ce modèle animale semble être adapté au vu des réponses physiologiques et physiopathologiques dans le cadre de l’étude de l’infarctus du myocarde et du developpement de l’insufisance cardiaque. Les animaux participant à ce projet devront être de jeunes adultes (5 à 10 semaines au début de la procédure) pour faciliter les examens échographiques : plus les os sont denses, plus ils gênent le passage des ondes ultrasonores, créant des « cônes d’ombre » sur les images échographiques, dont l’analyse peut alors s’avérer plus complexe. De plus, des experiences préliminaires menées au laboratoire ont permis de mettre en évidence que la diète riche en gras et en sucre devait commencer tôt afin d’avoir des effets cardiovasculaires marqués.

1 140 souris sans poils vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont exposées aux ultraviolets B trois fois par semaine pendant trente semaines, jusqu'à développer des tumeurs de la peau, et reçoivent jusqu'à 210 injections quotidiennes dans l'abdomen ou 90 injections d'anticorps. Le porteur décrit des rougeurs, des irritations, de rares ulcérations et des tumeurs "généralement bien tolérées", tout en admettant que des masses de taille importante peuvent gêner les déplacements. Il indique avoir choisi une souche dépourvue de poils pour éviter le rasage et garantir une exposition uniforme, et affirme que les modèles in vitro déjà utilisés ne reproduisent pas la complexité des tissus vivants.

Objectifs

Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines molécules de l'immunité innée, un système de défense naturel du corps, peuvent contribuer à l'aggravation des cancers de la peau. Nous nous concentrons sur des traitements potentiels pour ralentir ou stopper la progression tumorale. Les recherches portent sur des cancers de la peau causés par des expositions prolongées aux Ultraviolets B, qui sont un facteur clé du développement de ce type de cancer chez l’être humain. En laboratoire, nous avons observé que certaines molécules de l'immunité innée favorisent le développement des tumeurs. Nous voulons maintenant confirmer ces résultats en utilisant un modèle chez la souris, ou les souris sont exposées aux Ultraviolets B trois fois par semaine pendant 30 semaines (à raison de 2 minutes par exposition) afin de tester différentes drogues capables d'inhiber ces molécules. L’objectif final est de vérifier si ces traitements peuvent réduire efficacement la progression des cancers de la peau, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles options thérapeutiques pour les patients.

Bénéfices attendus

Si ce projet aboutit, il pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour traiter les cancers de la peau et, plus largement, améliorer la compréhension des mécanismes qui favorisent le développement des tumeurs dans d’autres maladies. Les résultats pourraient permettre de développer des traitements ciblant des molécules spécifiques de l’immunité innée, offrant ainsi des options innovantes pour ralentir ou stopper la progression des cancers. De plus, ce projet contribuera à enrichir les connaissances scientifiques sur le rôle de ces molécules dans la formation des tumeurs, ce qui pourrait bénéficier à la recherche sur d’autres types de cancers.

Procédures

- Injections intrapéritonéale : 20 secondes x nombre d’injection (quotidien pour les inhibiteurs soit 210 injections, 3 fois par semaine pour les anticorps, soit 90 injections) par animal. Une rotation des sites d’injections sera effectuée à chaque injection. - Manipulation pour prise de poids : 15 secondes par animal, ce qui est le temps nécessaire pour prendre la souris, la poser sur la balance, reporter son poids et la reposer dans sa cage.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de cette étude, certaines interventions peuvent entraîner des effets indésirables sur les animaux. L’exposition répétée aux UVB peut provoquer des rougeurs ou des irritations cutanées, et des ulcérations superficielles peuvent apparaître dans de rares cas. Les tumeurs cutanées développées dans ce modèle sont généralement bien tolérées. Cependant, elles peuvent, dans certains cas, entraîner un inconfort, pouvant se manifester par une modification de la posture ou une réduction de l’activité. Des tumeurs de taille importante pourraient également affecter les déplacements des animaux. Les injections intrapéritonéales prévues dans le protocole peuvent provoquer des réactions locales comme des rougeurs temporaires. Par ailleurs, en réponse à l’exposition aux UVB et à l’évolution tumorale, certains animaux pourraient présenter une perte d’appétit ou une réduction de leur activité.

Devenir

À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tumeurs et l’analyse post mortem des échantillons. Les tumeurs primaires, ainsi que les tissus environnants, seront prélevées pour des analyses histologiques et biochimiques afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Les critères d’analyse incluront : 1. La taille et le nombre des tumeurs pour évaluer la progression tumorale. 2. La présence de cellules immunitaires dans les lésions tumorales, afin de confirmer leur implication dans le développement des cancers. 3. La fibrose tumorale, qui correspond à l'épaississement et au durcissement des tissus autour de la tumeur, pour comprendre comment ces transformations du tissu peuvent favoriser la croissance et la progression de la tumeur. Ces analyses permettront de valider ou d’infirmer les hypothèses du projet, notamment en ce qui concerne l’efficacité des inhibiteurs et anticorps testés pour ralentir ou stopper la progression des tumeurs. En résumé, la mise à mort des animaux est essentielle pour atteindre les objectifs expérimentaux, tout en garantissant que les animaux ne subissent aucune souffrance inutile à l’issue de la procédure.

Remplacement

Pour comprendre le développement des cancers de la peau, nous avons d'abord utilisé des modèles en laboratoire sans recours aux animaux (modèles in vitro). Ces travaux ont montré que certaines cellules du système immunitaire, appelées neutrophiles, jouent un rôle dans la progression des tumeurs. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions qui existent dans les tissus vivants, comme celles entre les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires et les modifications des tissus environnants. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux est nécessaire pour ce projet.

Réduction

Nous avons soigneusement calculé le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats fiables. Les tests statistiques préalables et les données obtenues en laboratoire nous ont permis d’optimiser le design expérimental afin de limiter l’utilisation des animaux tout en garantissant la validité scientifique. De plus, des résultats déjà publiés sur des modèles similaires nous aident à prévoir la progression de la maladie, réduisant ainsi le nombre de souris nécessaires. Ainsi un nombre de 10 souris par groupes sera nécessaire pour tester nos hypothèses. Un total de 1140 souris sera ainsi utilisé pour tester toutes nos hypothèses scientifiques.

Raffinement

Des mesures spécifiques seront mises en place pour garantir le bien-être des animaux tout au long de l’expérience. Les souris utilisées seront hébergées dans des conditions optimales, dans des cages ventilées et enrichies, afin de minimiser leur stress. Les manipulations, comme les injections, seront effectuées avec soin, souvent sous anesthésie pour réduire la douleur. Une surveillance régulière (trois fois par semaine) permettra de détecter rapidement tout signe de mal-être, et une fiche d’évaluation sera utilisée pour assurer un suivi rigoureux. Si un point limite est atteint, l’animal sera immédiatement retiré de l’étude de manière éthique.

Choix des espèces

Nous cherchons à comprendre le rôle système immunitaire, dans le développement de certains cancers de la peau. L’utilisation de souris comme modèle d’étude est pertinente car elles partagent de nombreuses similitudes avec l’être humain, notamment dans leur réponse immunitaire et leur réaction au stress causé par les ultraviolets. Nous avons choisi une souche de souris sans poils, particulièrement adaptée aux études d’exposition chronique aux ultraviolets. Leur absence de poils permet une exposition uniforme à la lumière, évitant ainsi le stress lié à des manipulations supplémentaires comme le rasage. Ces souris sont également connues pour leur sensibilité à développer des cancers sous l’effet des ultraviolets, ce qui garantit des résultats fiables et reproductibles. L’exposition aux ultraviolets sera réalisée sur des souris âgées de 7 à 9 semaines, une période correspondant à leur maturité physique initiale. Cela permet de reproduire des conditions similaires à celles observées chez l’adulte humain, où les mécanismes de développement des cancers de la peau sont comparables. Nous nous concentrons uniquement sur l’étude de ces cancers chez l’adulte, car les réactions tumorales et immunitaires diffèrent chez les jeunes ou les animaux âgés. Les prélèvements des tumeurs auront lieu au plus tard 30 semaines après le début des expositions (a raison de 3 expositions de 2 minutes par semaine) ou dès que des critères définis dans le protocole seront atteints. Les souris seront euthanasiées avant tout prélèvement, conformément aux normes éthiques en vigueur. Ce modèle garantit une étude rigoureuse des mécanismes liés aux cancers de la peau, tout en permettant des résultats applicables à la physiopathologie humaine.

Tués à 8 ou 21 jours de vie pour prélèvement d'organes, 1 010 souriceaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. À sept jours de vie, chacun subit un traumatisme crânien sous anesthésie de moins de deux minutes, puis reçoit chaque jour l'une des deux molécules testées, par injection dans l'estomac ou par gavage. Le porteur chiffre la mortalité du modèle à moins de 4 %, attribuée à l'anesthésie ou au traumatisme lui-même, et ajoute 1 % de mortalité liée au gavage. Il affirme qu'aucune solution alternative n'est possible et que les conséquences cérébrales d'un traumatisme ne peuvent s'évaluer ni sur cellules en culture ni par modélisation informatique, l'amélioration annoncée du devenir des enfants blessés restant au conditionnel.

Objectifs

Le traumatisme crânien (TC) correspond aux lésions cérébrales traumatiques et aux altérations des fonctions cérébrales qui en résultent : lésions primaires (consécutives à l’impact), secondaires (suite aux conséquences des lésions primaires) et tertiaires (survenant de façon chronique). Les traumatismes crâniens chez l’enfant sont fréquents et sous-diagnostiqués, c’est pourtant un enjeu de santé publique majeur. En effet, ils sont potentiellement responsables de troubles de l’acquisition des connaissances et comportementaux chez l’adulte. Dans le cerveau, les cellules importantes pour la réponse inflammatoire sont les cellules microgliales et les astrocytes. Elles analysent en permanence leur environnement et participent au bon fonctionnement du cerveau. La réponse inflammatoire initiale dans le cerveau ou neuroinflammation suite à un traumatisme crânien est surtout due à une mort cellulaire abondante suite à la lésion. Une inflammation anormale peut persister pendant des semaines voire des années après le traumatisme. Des molécules spécifiques, les interférons de type I, sont libérés par la microglie et les astrocytes pour stimuler la neuroinflammation. L'activité anormale d’une protéine qui va augmenter la production de ces interférons est de plus en plus reconnue comme néfaste dans différentes contextes d’inflammation comme le traumatisme crânien. Des travaux ont montré que la suppression de l’activité de cette protéine était neuroprotectrice et permettait de limiter les lésions dues à un traumatisme crânien dans un modèle de souris adultes au moment du traumatisme. Le but de l’étude est de voir l’effet de molécules qui vont empêcher la production d’interférons juste après un traumatisme crânien pédiatrique. Pour cela, nous utiliserons un modèle de traumatisme crânien modéré chez le souriceau de 7 jours sous anesthésie générale. Les animaux recevront une des 2 molécules 30 minutes après le traumatisme puis quotidiennement, par voie orale. Ce modèle est maitrisé au sein de l’équipe pour analyser les phénomènes inflammatoires. Nous étudierons : 1) l’épaisseur d’une partie du cerveau (le corps calleux) 14 jours après le traumatisme ; 2) la mort cellulaire (apoptose) 24 heures après le traumatisme ; 3) l’activation de la microglie par étude de l’expression de gènes sur cellules microgliales triées 24 heures après le traumatisme. Ces différents paramètres permettront de savoir si une des molécules est efficace pour atténuer l’effet du traumatisme crânien.

Bénéfices attendus

Nous nous attendons à voir une diminution des effets du traumatisme crânien due à la réduction de l’inflammation grâce à la molécule administrée. Le fait de pouvoir administrer une molécule de façon précoce suite à un traumatisme crânien pourrait ouvrir la voie pour diminuer la morbidité liée au traumatisme crânien et ainsi permettre un meilleur pronostic pour les patients. Enfin nous pourrons également voir s’il y a un effet de dose de la molécule administrée. Le but est de pouvoir améliorer le devenir des enfants avec un traumatisme crânien.

Procédures

Cinq groupes de souriceaux subiront un traumatisme crânien à 7 jours de vie sous anesthésie générale, moins de 2 minutes d’anesthésie ; puis des injections intragastriques, moins d’une minute, puis des administrations orales, moins d’une minute, de la molécule que nous souhaitons tester : 1 groupe sans traitement et 4 groupes avec 2 doses différentes de 2 molécules distinctes. Un groupe contrôle sera réalisé, avec anesthésie générale de moins de 3 minutes mais sans traumatisme avec molécule : 1 groupe sans traitement et 4 groupes avec 2 doses différentes de 2 molécules distinctes.

Impact sur les animaux

Grâce à notre expérience du modèle, nous savons que la mortalité est de moins de 4% (principalement due l’anesthésie générale ou au traumatisme crânien lui-même). Très rarement, il pourrait y avoir un hématome suite à l’injection intragastrique ou une irritation de la gorge suite aux gavages. Les effets de la molécule ne sont pas encore connus mais la mortalité estimée due à l’injection intragastrique ou au gavage est estimée à 1 %. Le fait de manipuler les souriceaux quotidiennement n’entraîne pas de rejet par la mère lors de la remise au nid car les souris utilisées ne sont pas perturbées par cela.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à 8 jours de vie ou 21 jours de vie pour prélèvement d’organes pour analyse.

Remplacement

L’étude de l’effet d’une molécule sur l’impact du traumatisme crânien ne peut être envisagée que dans des conditions « in vivo », c’est-à-dire dans un organisme vivant. Aucune solution alternative n’est possible pour conduire ce projet de recherche. Il est impossible d’évaluer les conséquences sur le fonctionnement cérébral d’un traumatisme crânien sur un modèle de cellules en culture ou sur des modélisations informatiques.

Réduction

Le nombre d’animaux estimé et les tests statistiques utilisés sont basés sur notre expérience pour ce type d’étude. En effet, des études antérieures sur ce modèle permettent d’évaluer la mortalité et ainsi d’avoir le nombre d’animaux nécessaire pour avoir des résultats statistiquement corrects. Ce nombre minimum nous permettra d’être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet.

Raffinement

La procédure chirurgicale de traumatisme crânien sera réalisée sous anesthésie générale inhalatoire. Les animaux seront remis dans leur nid et on vérifiera que l’adoption par la mère se fait bien. Des arbres décisionnels seront proposés en fonction de l’âge des animaux, déterminant ainsi des points limites prédictifs : à la phase aiguë, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités et le tonus ; à distance du traumatisme crânien, on réalisera une surveillance régulière de la prise de poids, de l’absence de troubles du comportement (isolement, agressivité). Les animaux seront hébergés en groupe en milieu enrichi pour minimiser leur stress. Avant sevrage, les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. Les animaux recevront la molécule quotidiennement et on en profitera pour faire une surveillance étroite de leur état de santé. Le personnel technique de l’animalerie réalise aussi une surveillance quotidienne des animaux et de leurs conditions d’hébergement (nourriture, eau, température de la pièce, taux d’humidité) et nous alerte en cas de problème.

Choix des espèces

La problématique de l’inflammation du cerveau est une thématique très étudiée dans notre laboratoire. Les études chez l’animal permettent d’étudier les conséquences d’un traumatisme crânien modéré localisé sur l’ensemble du cerveau et de mimer au mieux la pathologie humaine. Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles de lésions du cerveau et notamment le traumatisme crânien. De plus, ce modèle de souris présente l’avantage de ne pas rejeter les petits après une séparation de courte durée. Les souris seront utilisées de 7 jours de vie à 21 jours de vie. Le traumatisme crânien sera fait à 7 jours de vie, pour mimer la survenue d’un traumatisme crânien chez le jeune enfant humain. L’injection du médicament sera réalisée 30 minutes après le traumatisme pour mimer une intervention rapide. Les effets seront analysés 24h et 2 semaines après le trauma pour voir les effets aux phases aiguë et tardive, car l’inflammation pendant le développement cérébral est un processus complexe qui doit être étudié dans le temps.