Procédures sévères

Les souris de ce projet portent deux modifications génétiques combinées, dont celle qui reproduit chez elles la sclérose latérale amyotrophique. 3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 724 d'entre elles et sévère pour 1 056. 1 056 animaux nagent jusqu'à trois fois trente secondes dans un couloir d'eau tous les quinze jours et subissent deux fois par semaine un test de force d'agrippement, à mesure que leurs membres postérieurs s'affaiblissent. Le porteur écarte les modèles invertébrés au motif qu'ils n'ont pas de moelle épinière organisée, et prévoit des tétines de biberon allongées pour les animaux qui n'atteignent plus leur eau.

Objectifs

La sclérose latérale amyotrophique (SLA), également connue sous le nom de maladie de Charcot, est une maladie qui entraîne une dégradation progressive des neurones moteurs – les cellules chargées de transmettre la commande motrice produite par le cerveau vers les muscles –. En général, cette maladie est fatale dans les 3 à 5 ans suivant le diagnostic. Malgré la création de plusieurs modèles animaux, aucune cause précise de cette perte des neurones n’a encore été trouvée. Des recherches récentes ont permis d’identifier un type unique de neurones situés autour du canal central de la moelle épinière, appelés neurones de contact avec le liquide cérébrospinal. Ces neurones ont une structure particulière, avec une extension qui atteint directement le liquide. Leur rôle reste encore largement inconnu, mais on sait que dans le cas de la maladie de Charcot, la composition du liquide cérébrospinal devient toxique. Il semblerait que les neurones autour du canal central soient capables de détecter les changements de composition du liquide cérébrospinal grâce à une protéine spécifique. Notre projet vise à étudier l’implication de cette protéine dans la maladie de Charcot en utilisant entre autres des souris dont le gène codant pour cette protéine a été invalidé.

Bénéfices attendus

Ces travaux permettront d’étudier le rôle des neurones présents autour du canal central de la moelle épinière et l’implication des facteurs qu’ils libèrent dans le développement de la maladie de Charcot. Ce projet pourrait déboucher sur l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques afin d'améliorer la vie des patients.

Procédures

1056 animaux seront soumis à des mesures de vitesse de nage dans un couloir de nage (maximum 30 secondes dans l’eau trois fois avec un temps de pause de 2 min entre chaque test) tous les 15 jours à compter de leur 2 mois. 1056 animaux seront soumis à des tests de force d’agrippement (maximum 3 minutes 30), deux fois par semaine à partir de deux mois postnataux. Afin de déterminer le génotype des animaux, une biopsie de 1mm, pouvant entrainer une douleur légère, sera réalisée en quelques secondes durant les 15 premiers jours postnataux au niveau de la queue des animaux.

Impact sur les animaux

La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices des membres antérieurs mais surtout postérieurs. Les animaux seront aussi soumis à un stress modéré lié aux tests de comportements.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour réaliser des prélèvements.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas de méthode alternative suffisamment prédictive qui permettrait de se passer de l’utilisation d’animaux pour étudier la maladie de Charcot. La SLA est une maladie neurodégérative multifactorielle d’étiologie complexe avec des formes génétiques et sporadiques. L’absence de moelle épinière organisée chez les invertébrés ne permet pas d’utiliser ces modèles animaux lorsqu’on s’intéresse aux processus de dégénérescence des neurones spinaux .

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux au maximum, nous ferons des études comportementales et des analyses post-mortem sur les mêmes animaux. Le nombre d’animaux par lot a été déterminé par l’expérience que nous avons acquise au laboratoire qui travaille depuis de nombreuses années sur ce modèle animal dans lequel il y a une variabilité interindividuelle importante quant à l’évolution des processus neurodégénératifs.

Raffinement

Les animaux seront hébergés au sein d'un établissement utilisateur agréé dans des conditions d’hébergement favorisant leur bien-être (enrichissement, suivi quotidien par du personnel qualifié). Des dispositifs adaptés aux besoins des animaux commençant à présenter des faiblesses motrices seront mis en place comme des tétines de biberon plus longues et de la nourriture dans la cage pour un accès à l'alimentation et à l'eau facilité. Les mâles étant agressifs entre eux, leur nombre est limité à 4 dans une cage de taille moyenne et à 6 dans une grande cage. De l’enrichissement sera aussi ajouté pour permettre un maximum de cachettes (maison en carton, tunnel, sizzlenest). Les intervenants sont formés aux points limites de la maladie et interviennent dès que cela est nécessaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix de la sclérose latérale amyotrophique aujourd’hui dans la communauté scientifique. Il existe des modèles d’invertébrés de la sclérose latérale amyotrophique mais l’absence de moelle épinière organisée ne permet pas du tout les mêmes études surtout lorsqu’on s’intéresse, comme ici, à des neurones hyperspécialisés et à leur rôle chez le mammifère qui est vraisemblablement extrêmement différent de celui qu’ils ont chez les invertébrés. Les tests comportementaux commenceront 60 jours après la naissance, bien avant l’apparition des premiers symptômes moteurs afin d’avoir une période contrôle avant la dégradation progressive des différents paramètres moteurs analysés

Pour tester chez le primate une thérapie génique contre la maladie de Parkinson déjà évaluée chez la souris, 8 macaques à longue queue vont être utilisés, tous tués à l'issue pour analyses histologiques. Quatre subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, quatre d'un niveau sévère. La moitié subit d'abord une chirurgie de six heures sous IRM pour induire la maladie, puis tous reçoivent une ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons de trois heures trente, quatre ponctions lombaires, trois IRM, six PET-scans et cinq transports routiers d'une heure entre deux établissements. Le porteur reconnaît un risque d'arrêt cardiaque lors de l'ouverture de la barrière et des fuites de liquide céphalorachidien après les ponctions, et indique que cette étape sur une seconde espèce est exigée par l'Agence nationale de sécurité du médicament avant tout essai chez l'humain.

Objectifs

La maladie de Parkinson est une maladie neurodégénérative conduisant à une atteinte majeure de la qualité de vie chez les patients, consécutive à une perte des neurones spécifiques d’une partie du cerveau. De nos jours, les patients parkinsoniens sont majoritairement sous traitements médicamenteux de L-Dopa, efficaces pour une durée dépendante de chaque patient, mais qui ne permet qu’un effet transitoire et évoluant ensuite vers une paralysie progressive et une perte importante de qualité de vie. L’enjeu majeur est donc de trouver un traitement pour ces patients permettant de ralentir voire de corriger les symptômes de la pathologie. Nous évaluerons une thérapie génique pour tenter de corriger la perte neuronale responsable des symptômes parkinsoniens. Nous avons démontré l’efficacité de notre approche thérapeutique dans 3 modèles murins de la maladie de parkinson. Cette thérapie sera injectée par voie veineuse et pourra pénétrer jusqu’au cerveau grâce à l’ouverture de la barrière hémato-encéphalique, réalisée de manière non invasive (dispositif disposé sur la tête de l’animal et envoyant des ultrasons de manière focalisée). Les objectifs du projet sont d’évaluer la faisabilité, l’efficacité et la tolérance d’une administration par voie intraveineuse de cette thérapie génique chez le primate non humain (PNH) pour permettre ensuite de réaliser ce traitement chez l’Homme. Le suivi de la pathologie nécessitera de travailler dans 2 établissements pour l’utilisation d’un appareil d’imagerie spécifique.

Bénéfices attendus

Il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement qui permette de guérir les patients atteints de maladie de Parkinson. Le bénéfice de ce projet pourrait être de prouver l’efficacité d’une nouvelle thérapie génique et à plus long terme cela pourrait amener à proposer un essai clinique pour un nouveau traitement de thérapie génique (nouveau médicament-vecteur d’intérêt) pour des patients atteints de maladie de Parkinson.

Procédures

Tous les gestes techniques sont réalisés sous anesthésie générale, et une même anesthésie générale permet la réalisation de plusieurs gestes (prise de sang + prélèvements de Liquide céphalo rachidien et/ou imagerie par résonance magnétique (IRM) et PET-scan. Au sein de l'établissement 1 (EU1), la moitié des animaux aura une procédure d’ouverture de barrière Hématoencéphalique couplée à une administration intraveineuse de thérapie génique et une imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 3h30). Ils auront également 4 prélèvements sanguins et 4 prélèvements de Liquide céphalo rachidien (LCR) espacés de 4 semaines minimum entre chaque prélèvement (1 anesthésie générale pour un prélèvement de sang et LCR, maximum 30-45min, répété 4 fois au total). Et enfin 3 Imagerie par résonance magnétique (IRM) (environ 1h30). L’autre moitié des animaux aura une procédure chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie adaptée, sous IRM, pour induire le modèle pathologique associée à une prise de sang (durée environ 6h, EU1) puis 1 mois après une procédure d’ouverture de barrière Hématoencéphalique couplée à une administration intraveineuse de thérapie génique sous anesthésie générale et analgésie adaptée sous IRM également (environ 3h30maximum, EU1). Dans l’EU1, les animaux auront 3 examens de suivi par Imagerie par résonance magnétique à 1 mois d’intervalle minimum et associées à chaque fois à une prise de sang et une ponction lombaire au cours de la même anesthésie (durée totale 2h maximum). Pour le suivi, dans l’EU2, les animaux auront également 6 imageries PET-scan (1 semaine minimum entre chaque) qui nécessiteront une injection de substance faiblement radioactive (durée totale 2h maximum). 3 de ces imageries PET-scan seront associées à une prise de sang pour mesurer la concentration de la substance radioactive dans le sang (prélèvements multiples au cours des 2h). Les animaux seront transportés d’un établissement à l’autre par un transporteur agréé 5 fois au total (1h de trajet environ).

Impact sur les animaux

Les animaux auront une chirurgie sous anesthésie générale. La chirurgie engendrera un inconfort et une douleur en post-opératoire. L’anesthésie générale nécessaire pour cette chirurgie et pour les examens d’imagerie sera associée à une hypothermie et un risque de dépression cardiorespiratoire. La procédure permettant d’ouvrir la barrière hématoencéphalique sera associée à un risque d’arrêt cardiaque. Les 5 transports de l’animal entre les établissements 1 et 2 pourront engendrer un stress. Plusieurs prélèvements de sang dont certains avec pose d’un cathéter fémoral pourront générer des hématomes et des indurations de la zone de prélèvement. Les ponctions lombaires présenteront un risque de fuite de liquide céphalorachidien (maux de tête, vomissements, signes neurologiques) et la formation possible d’hématomes. Les animaux ressentiront un stress lié à leur capture en cage lors de l'induction de l'anesthésie.

Devenir

A la fin du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié pour permettre les études histologiques et de biodistribution afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique et la tolérance de l’approche.

Remplacement

Toutes les études in vitro (en dehors de l’animal) possibles pour valider la cible thérapeutique ont été effectuées avant ce projet afin de valider l’utilisation de ce médicament-vecteur comme nouvelle cible thérapeutique dans la maladie de Parkinson. Ensuite la stratégie thérapeutique et la fonctionnalité de notre thérapie ont été réalisées chez la souris en amont de ce projet. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de cette approche thérapeutique chez l’Homme nécessite une étude de son efficacité et de sa toxicité, sur un modèle animal de plus grosse taille, le plus pertinent pour reproduire le modèle de la maladie de Parkinson est le primate non humain. Ces étapes sont réglementaires et requises par l’Agence nationale de la sécurité des médicaments (ANSM) pour toute demande d’autorisation d’étude clinique (chez l’Homme).

Réduction

Il y a 8 animaux au total sur ce projet, ce qui correspondant au minimum requis pour la validation de l’efficacité de l’approche thérapeutique. L'étude statistique concernera principalement l’étude histologique et sera réalisée par un anatomopathologiste certifié.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupe. Un programme d’enrichissement est mis en place pour complexifier l’environnement et permettre l’expression de comportement propres à l’espèces (ex : fourragement). Les animaux auront un suivi quotidien par les techniciens du projet, un suivi de poids à chaque anesthésie, l'utilisation d’un analgésique pour les ponctions lombaires et la chirurgie d’injection virale, pour éviter tout inconfort. Une observation journalière sera faite tout au long du projet de manière à suivre les points limites mis en place dans le projet. A la moindre anomalie détectée, un avis vétérinaire sera demandé et un traitement mis en place si nécessaire. L’ensemble des gestes techniques seront faits sous anesthésie et analgésie adaptées. Lors de ces anesthésies nous contrôlerons et maintiendrons les paramètres physiologiques de l’animal. Nous nous assurons ensuite du réveil et de la bonne récupération des animaux. Le nombre d'anesthésies est minimisé en regroupant les procédures, par exemple prise de sang, ponction lombaire et imagerie IRM sont faites au sein de la même anesthésie générale. Les animaux auront un temps de récupération de minimum 1 semaine entre chaque session de prélèvement ou d’imagerie, et nous respecterons les volumes de prélèvement maximaux recommandés pour l’espèce (volume adapté à la taille des animaux et conforme aux recommandations en termes de Bien-être animal). Ce projet se déroulera dans deux établissements, afin de minimiser le stress induit par les changements d’établissements les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation à leur arrivée pour chacun des sites. Le transport entre les 2 établissements sera assuré par un transporteur agréé et avec un animal vigile. L’euthanasie des animaux sera réalisée sous anesthésie générale et analgésie.

Choix des espèces

Dans les maladies que nous ciblons, il existe un modèle murin de la maladie, utilisé dans une première étape, déjà réalisée et ayant permis de confirmer la preuve de concept de la thérapie. Cependant pour une étude de toxicologie règlementaire, une deuxième espèce animale de grande taille est requise. Les organes du PNH en particulier le cerveau, se rapprochent le plus du cerveau Humain en terme de structure anatomique et connectivité fonctionnelle. L’administration du vecteur dans un cerveau proche du cerveau humain permet de définir au mieux les paramètres du protocole clinique (chez l’homme). L'injection de vecteurs adeno associés chez le primate est le seul moyen d'évaluer au mieux la faisabilité, l'efficacité et la tolérance d'une telle approche thérapeutique réalisée préalablement chez les rongeurs. Les animaux utilisés sont des macaques adultes (1-15 ans) (2 à 10 Kg) ayant un cerveau complètement développé́ compte tenu des patients ciblés par notre approche

Greffées de cellules tumorales, injectées jusqu'à trois fois d'un virus puis traitées cinq jours par semaine pendant trois semaines par une substance antitumorale, 7 008 souris vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 2 848 d'entre elles et sévère pour 4 160. Le porteur décrit des ulcérations ou nécroses des tumeurs sur le flanc, des métastases pulmonaires entraînant des difficultés respiratoires et de l'ascite liée aux nodules abdominaux. Il s'agit d'évaluer des virus oncolytiques, seuls ou combinés à d'autres traitements, dans des modèles de greffe tumorale. Il affirme pourtant que seuls les virus ne risquant pas d'induire une souffrance seront testés, et prévoit de réutiliser jusqu'à 200 souris pour la formation de ses techniciens, les autres étant tuées.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer sur différents modèles de xénogreffes et de greffes syngéniques chez la souris l’activité antitumorale de nos virus candidats-médicaments seuls ou en combinaison avec des therapies antitumorales. Nos virus oncolytiques sont produits en supprimant plusieurs gènes viraux afin de diminuer la réplication du virus dans les tissus sains, tout en gardant la capacité de réplication dans les tumeurs et ainsi de limiter sa toxicité. Avant d’être testés en modèles murins, les virus candidats ont été évalués sur des modèles alternatifs, notamment par culture cellulaire sur de nombreuses cellules tumorales établies et caractérisées, ainsi que dans des cellules primaires (non tumorales). Ne seront évalués chez l’animal que les virus ayant une activité antitumorale et ne présentant pas de cytotoxicité sur les modèles alternatifs. Concernant les combinaisons avec les thérapies antitumorales, ne seront évaluées chez l’animal, que les combinaisons efficaces. En conclusion, nous testerons chez l’animal uniquement les virus candidats-médicament et les combinaisons préalablement sélectionnée avec un rapport bénéfice/risque significatif.

Bénéfices attendus

Les progrès scientifiques de ces dernières années sur la compréhension de la croissance tumorale ont permis d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques dans la lutte contre le cancer. La mise au point de ces nouveaux médicaments n’est possible qu’en passant par des modèles animaux adaptés. Les bénéfices portent sur la mise au point des traitements plus efficaces contre les cancers chez l’homme. Les virus oncolytiques du fait de leur réplication spécifique dans la tumeur induisent moins d’effets secondaires que les traitements standards (chimiothérapies, …) utilisés aujourd’hui. A court terme, ces bénéfices porteront sur l’amélioration de la prise en charge des patients atteints de cancer et à long terme sur l’allongement de la survie des patients.

Procédures

Dans ce projet, les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Implantation des cellules tumorales par injection sur animal vigile ou sous anesthésie légère puis 3 injections maximum (espacées de 30h minimum) de virus sur animal vigile puis administration d’une substance antitumorale sur animal vigile (maximum 5 fois par semaine pendant 3 semaines), un minimum de 3h est respecté entre chaque substance, - Imagerie sous une anesthésie légère, -Prélèvement de sang (espacés d'une semaine minimum et jusqu'à 120 jours après l'administration du virus). Chaque geste ne dure que quelques secondes, sauf l’anesthésie pour l’imagerie qui dure environ 15 minutes.

Impact sur les animaux

Malgré toute l’attention portée aux évaluations précédentes des études chez l’animal, nous ne pouvons pas exclure la survenue d’effets secondaires des médicaments. Ils peuvent se manifester sous la forme d’une perte de poids, des troubles gastro-intestinaux ou de troubles du comportement. Les injections répétées peuvent être une source de stress, de douleur pour l’animal et peuvent parfois engendrer une induration ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection. Une ulcération ou nécrose des tumeurs sur le flanc peut être observée. Une gêne dans la mobilité de la souris peut également être observée en fonction de l’implantation sur le flanc. Le développement de métastases pulmonaires peut entrainer une difficulté respiratoire. La présence de nodules dans l’abdomen peut provoquer de l’ascite. Tous ces symptômes sont décrits dans une grille de score.

Devenir

Les animaux supplémentaires pourront être utilisés dans le cadre de la formation continue et/ou initiale de nos techniciens en s’appuyant sur un projet dédié et en accord avec le responsable de la SBEA (structure en charge du bien-être animal). Nous prévoyons la réutilisation de maximum 200 animaux sur 5 ans pour la formation. Dans le cas où aucune formation n’est nécessaire, ces animaux seront mis à mort. Toutes les souris inclues dans l’évaluation des virus seront mises à mort soit après atteinte d’un point limite, soit à la fin de l’étude pour le prélèvement de tissus. En raison des modèles et de l’utilisation de virus oncolytiques, ces animaux ne peuvent être réutilisés, replacés ou adoptés.

Remplacement

Avant d’être testés chez l’animal, les virus candidats et leur combinaison avec les thérapies antitumorales ont été évalués et sélectionnés pour leur rapport bénéfice/risque significatif dans les modèles alternatifs disponibles. Ces modèles étant incomplets, il reste indispensable de tester les candidats sélectionnés chez l’animal. L’étude de l’activité antitumorale d’un candidat médicament nécessite un modèle intégré faisant intervenir un ensemble complexe de phénomènes biologiques, impossible à modéliser, conduisant au développement de la tumeur, à la distribution, à la toxicité et à l’élimination des médicaments.

Réduction

La réalisation de ces procédures par un technicien rompu à ces manipulations, et la standardisation du protocole garantissent une bonne reproductibilité et permettent de réduire le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux par groupe est choisi selon des contraintes statistiques. Du fait de la variabilité des prises de greffes tumorales, des animaux supplémentaires sont intégrés dans chaque expérience. Ces animaux ne recevront qu’une injection de cellules tumorales pour assurer l’obtention d’un nombre suffisant de souris présentant la croissance tumorale attendue dans le modèle sous-cutané, ou pour vérifier la bonne prise tumorale dans les modèles d’implantation en intra-péritonéale ou intra-veineux. Des tests statistiques seront utilisés sur les données obtenues (volumes tumoraux).

Raffinement

Seuls les virus oncolytiques et leur combinaison avec les thérapies antitumorales présentant le meilleur rapport efficacité/non toxicité dans nos modèles alternatifs seront étudiés chez l’animal. De précédents dossiers déposés et apptouvés nous ont permis et nous permettent de tester la toxicité des nouvelles souches de virus. Seuls les virus ne risquant d'induire une souffrance chez l'animal seront testés dans ce projet. Durant l’étude in vivo, nous portons une attention particulière au bien-être de l’animal. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux afin de réduire le stress et un enrichissement du milieu est prévu (coton et tunnel de change) dans chaque cage avec eau et nourriture ad libitum. Les animaux sont toujours manipulés en douceur. Une période d’acclimatation et d’habituation aux gestes sont respectées avant de démarrer un protocole pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et ainsi, diminuer le stress lié au transport et à la manipulation. Des points limites ont été établis pour permettre de soustraire l’animal à la souffrance. Les injections se feront sur animal vigile ou sous anesthésie et l'imagerie sur animal anesthésié. Afin d’éviter une hypothermie due à l’anesthésie, l’animal est placé sur un tapis chauffant de son endormissement à son réveil. Pour le prélèvement de sang terminal une anesthésie et une analgésie sont prévues. Nous veillons à limiter l’angoisse et la souffrance des animaux, en surveillant l’apparition d'éventuels effets secondaires occasionnés par les traitements et en appliquant le cas échéant des critères d’interruption de l’expérimentation en fonction de l’aspect clinique des animaux.

Choix des espèces

Tous les traitements standards que nous souhaitons tester en combinaison avec nos virus oncolytiques sont décrits dans la littérature dans de nombreux modèles de cancers de souris. Par conséquent, la souris est un modèle de référence en oncologie, avec de multiples modèles expérimentaux disponibles. De nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires sont disponibles dans cette espèce. Des souris immuno compétentes et immuno déficientes seront utilisées dans ce projet afin d’évaluer nos virus oncolytiques dans différents modèles de tumeurs solides de type carcinome. Animaux âgés entre 6 et 8 semaines lors de l’injection des cellules tumorales (avec un âge plus avancé il y a un risque non négligeable de prise tumorale moins homogène et par conséquent la nécessité d’augmenter le nombre d’animaux).

2 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Environ la moitié est hébergée seule dès le sevrage, à trois semaines, et pour le reste de sa vie, soit une quinzaine de semaines, avec un régime obésogène pendant douze à seize semaines, jusqu'à trois prélèvements de sang à la veine faciale et pour certaines une chirurgie du crâne d'une heure. Elles passent cinq tests, anxiété, reconnaissance d'objets, reconnaissance sociale, et transmission sociale de la préférence alimentaire précédée de seize heures sans nourriture. Le porteur qualifie ces tests de peu stressants au motif qu'ils font appel à des comportements naturels, et affirme qu'il est "primordial" de comprendre pourquoi la mise à l'écart aggrave les troubles de mémoire des adolescents en surpoids.

Objectifs

L'objectif du présent projet est d’approfondir notre compréhension des effets de l’hébergement en cage individuelle et de la consommation d'une nourriture obésogène pendant l'adolescence sur les fonctions hippocampiques et la mémoire chez la souris. Nous étudierons plus précisément différents types de mémoire dont la mémoire sociale chez la souris et les effets de l’activité physique volontaire dans ces contextes. Nous étudierons en particulier les mécanismes neurobiologiques sous-tendant ces fonctions cognitives (notamment l'implication de l'ocytocine et des endocannabinoides) et nous ciblerons une structure cérébrale connue pour son rôle dans différents types de mémoire, l'hippocampe. Il est aujourd’hui nécessaire d’évaluer l’influence de ces différents facteurs aussi bien chez les mâles que chez les souris femelles car nous ne savons pas si les individus des deux sexes se comportent de la même manière en impliquant les mêmes structures cérébrales.

Bénéfices attendus

Etant donné la forte hausse de l’obésité juvénile dans les sociétés industrialisées, il s'avère primordial de mieux comprendre pourquoi la consommation d’une alimentation obésogène à l’adolescence entraîne des perturbations de mémoire à l’âge adulte et si l'ostracisation (mise à l'écart, l'isolement social) dont sont victimes les enfants/adolescents en surpoids est un facteur aggravant. En effet, avoir une vue d’ensemble des modifications physiologiques et neurologiques que cette alimentation et que l'isolement social entraînent permettra à terme de mieux encadrer les jeunes sujets en surpoids ou obèses afin de limiter les conséquences délétères sur les fonctions cognitives. Le cerveau étant vulnérable au cours de l’adolescence, tout changement environnemental comme une consommation obésogène excessive ou l’hébergement en cage individuelle est particulièrement susceptible d’altérer la maturation et par conséquent, le bon fonctionnement cognitif. Cette étude permettra en outre de souligner l’enfance et l’adolescence comme périodes clés et critiques du développement cérébral, et de fournir des données pour les campagnes de prévention de l’obésité juvénile. Notre étude permettra aussi de mieux comprendre l'importance de l'exercice dans le comportement social, notamment chez la souris et son lien avec l'alimentation, équilibrée ou non et d'approfondir nos connaissances par des approches pharmacologiques sur l'activité d'une sous-région de l'hippocampe. Par ailleurs, les relations sociales faisant intervenir différents systèmes neurobiologiques, il est important d’évaluer l’influence potentiellement différentielle du type d'hébergement, de l’alimentation obésogène et de l’activité physique chez les deux sexes.

Procédures

Chaque animal sera soumis à maximum trois prélèvements sanguins à la veine faciale et certains animaux seront également soumis à une chirurgie stéréotaxique d'une heure max sous anesthésie générale. La composition corporelle des animaux sera analysée par résonance magnétique nucléaire (2 minutes) au cours de l’étude (3 fois à environ 6 semaines d’intervalle). Les injections péritonéales (3 injections maximum de 15 secondes) ou focales (3 injections maximum de 2 minutes) se feront au cours de 5 tests comportementaux qui évaluent leur niveau d'anxiété (5 minutes) et différents types de mémoire (trois sessions de 10 minutes pour la reconnaissance sociale et la reconnaissance d'objets) et la qualité de leurs interactions sociales (transmission sociale de la préférence alimentaire: 16h max de privation alimentaire suivie de 30 minutes d'interaction sociale suivies de 2h de suivi de consommation alimentaire). Le test de reconnaissance sociale ou d'objets pourra être répété une fois avec un délai différent si nécessaire. De plus, environ la moitié des animaux sera hébergée en cage individuelle pour modéliser un isolement physique des congénères de leur arrivée à 3 semaines d'âge jusqu'à la fin de leur vie (environ 15 semaines d'expérimentation) .

Impact sur les animaux

Le régime obésogène donné pendant 12 à 16 semaines entraîne un surpoids qui reste non délétère chez des animaux jeunes, comme c’est le cas dans nos études précédentes. L'hébergement en cage individuelle peut certes engendrer des effets néfastes sur les comportements mais c’est justement pour mettre en évidence l’accentuation éventuelle des dérèglements neurobiologiques et comportementaux engendrés par cette situation particulière que nous voulons travailler exceptionnellement dans ces conditions. Les chirurgies stéréotaxiques présentent un degré de sévérité modéré durant la période péri-chirurgicale; même si les souris présentent un comportement normal à leur réveil, elles bénéficieront d'au moins 5 jours de "repos" avant les tests comportementaux. Ces derniers génèrent très peu de stress car ils font appel à des situations adaptées à leur comportement naturel et la restriction alimentaire utilisée dans un des tests (transmission sociale de la préférence alimentaire) est limitée à 16h maximum. Les injections (péritonéale ou intracérébrale) peuvent induire un stress qui sera limité par une maitrise des manipulations par les expérimentateurs. Les prélèvements sanguins seront aussi effectués par des expérimentateurs expérimentés afin de limiter le stress de cette manipulation.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés car leur cerveau ou certaines structures cérébrales doivent être récupérés pour analyses histologiques et biochimiques.

Remplacement

L’étude intégrée des effets de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral est permise grâce à l’utilisation du modèle de rongeur soumis à de la nourriture obésogène, à un hébergement en cage individuelle et à l’activité physique. Il n’est donc pas possible de remplacer ce modèle souris par des modèles in vitro ou in silico.

Réduction

Tous les efforts seront faits pour réduire le nombre d'animaux en effectuant plusieurs tests comportementaux chez les mêmes individus plutôt que des groupes différents. Cependant, si certains tests peuvent influencer le comportement ultérieur des animaux, des groupes différents seront utilisés. Le nombre d'animaux nécessaires a été estimé pour obtenir des résultats concluants et permettre des comparaisons statistiques fiables (tests paramétriques), 2260 souris seront nécessaires afin de mener à bien le projet. Cela correspond à une durée de 5 ans.

Raffinement

Les recherches seront réalisées en accord avec les recommandations institutionnelles pour le bon traitement des animaux de laboratoire. Les souris seront hébergées tout au long de leur vie en cage collective (sauf les souris hébergées en cage individuelle pour modéliser l’isolement social) avec un environnement ayant un enrichissement minimal (igloo ou roue d’activité) dans une animalerie agréée comportant une régulation de la température, de l’hygrométrie et du cycle jour/nuit. Elles recevront de l’eau et de la nourriture à volonté, elles seront changées régulièrement et elles seront observées tous les jours de la semaine par un personnel qualifié. Au cours de ces observations, si un animal présente des blessures, il sera immédiatement soigné et surveillé deux fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être, il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l’animal ne montre pas d’amélioration significative, il sera euthanasié dans les 48h. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale avec administration d’antalgiques en pré- et post- opératoire pour limiter la douleur.

Choix des espèces

Le modèle de rongeur soumis à des régimes obésogènes permet l’étude intégrée de la nutrition sur des aspects comportementaux et de fonctionnement cérébral qu’il n’est pas possible de remplacer par des approches cellulaires. Les tests comportementaux utilisés font appel à des comportements innés chez les rongeurs. Nous avons particulièrement choisi la souris car les effets de notre régime sont bien caractérisés dans cette espèce. De plus, notre approche pharmacologique pourra éventuellement être complétée/ ultérieurement en utilisant des souris transgéniques existantes. Nous utiliserons un premier lot de souris maintenues en cage collective (2 à 6 par cage) dès le sevrage ainsi qu’un second lot de souris maintenues en cage individuelle. Les souris seront exposées au régime obésogène ou contrôle, avec ou non accès à une roue d'activité, dès le sevrage (3 semaines) et ce pendant 12 à 16 semaines. Cette exposition commence dès le sevrage (jusqu’à l'âge adulte) afin de couvrir la période de l'adolescence. Après 12 semaines de régime obésogène, les souris seront intégrées dans les différentes procédures expérimentales. Les animaux soumis à un aliment contrôle seront également testés à l'âge adulte afin de garantir la comparatibilité des résultats.

Porteurs d'une mutation qui prive leurs cellules cardiaques de frataxine, 68 rats Long Evans développent une atteinte du cœur censée reproduire l'ataxie de Friedreich. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, tous tués à l'issue pour que leurs cœurs soient analysés au microscope. Chaque animal passe une échocardiographie sous anesthésie gazeuse de 45 minutes une fois par mois pendant un an, une électromyographie sous anesthésie injectable et des prises de sang, la cadence passant à une mesure par semaine dès qu'une anomalie cardiaque apparaît. Le porteur justifie le passage de la souris au rat par une similitude physiologique plus grande avec les humains, système cardiovasculaire, système nerveux et enzymes du foie, tout en rappelant que le même modèle murin se dégrade vite dès l'âge de neuf semaines.

Objectifs

L'ataxie de Friedreich est une maladie évolutive, due à l’atteinte de certaines cellules du système nerveux (maladie neuro-dégénérative). Elle se traduit avant tout par des troubles de l’équilibre et de la coordination des mouvements volontaires (ataxie). Une atteinte cardiaque, des troubles ostéo-articulaires (scoliose, pieds creux) et un diabète sont parfois associés. Dans cette étude nous allons utiliser un modèle de rat déficient pour une petite protéine, induisant le developpement d'une ataxie de Friedreich. Ce modèle est bien défini chez la souris, notamment dans le décours de la pathologie, qui dès l’âge de 9 semaines présente une réduction rapide de l'état, du fait d'une pathologie cardiaque de ces souris. Si les mêmes symptômes se présentent chez le rat, ils seront euthanasiés dès l'apparition des premiers symptômes ou seront surveillés de manière rapprochée et à l'aide des points limites décrits dans la section appropriée. Pour ce projet, nous effectuerons une caractérisation détaillée de la fonction cardiaque de rats mâle et femelle par échocardiographie, de la fonction musculaire par une électromyographie (EMG), ainsi qu'une analyse histologique du cœur de ces animaux. Globalement, ce projet nous permettra d'évaluer dans quelle mesure ce modèle de rat correspond au spectre clinique de l'ataxie de Friedreich.

Bénéfices attendus

À court terme, ce projet nous permettra de valider un nouveau modèle de rat de l'ataxie de Friedreich, qui recapitule le tableau clinique de la pathologie humaine. Ce modèle nous servira dans un deuxième temps à obtenir des preuves de concept in vivo que de nouvelles approches thérapeutiques sont efficaces sur plusieurs signes cliniques prédictifs de la pathologie humaine, avec pour but, poursuivre par un développement thérapeutique clinique. L'objectif final étant de proposer un traitement efficace pour les patients atteints d'ataxie de Friedreich.

Procédures

Nous allons réaliser une mesure de la fonction cardiaque sous anesthésie gazeuse (45 minutes) et une mesure de la fonction musculaire (10 minutes) sous anesthésie (une injection d'anesthésique et une autre de son réversant). Il y aura également un e suivi du poids des animaux (1X/semaine) et un prélèvement sanguin (30 secondes). Amendement: La mesure de la fonction cardiaque sera réalisée 1 fois par mois pendant 1 an maximum, dès lors qu'une anomalie sera détectée la mesure sera réalisée 1 fois par semaine pendant 1mois. Amendement 1 : plusieurs mesures de la fonction cardiaque sous anesthésie gazeuse (45 minutes) seront réalisées afin de suivre le phénotype cardiaque des animaux.

Impact sur les animaux

La mutation induit un phenotype dommageable induisant une dysfonction cardiaque. Les animaux subiront une anesthésie gazeuse pouvant induire de légères difficultés respiratoires. Les animaux subiront une anesthesie gazeuse et une injection d'anesthesique chimique et de son réversant pour étudier les fonctions cardiaques et musculaires qui peuvent générer une douleur de courte durée au point d'injection et de légères difficultés respiratoires. Une prise de sang sera effectuée sous anesthésie sur l'ensemble des animaux pouvant induire de légères difficultés respiratoire et une hypovolémie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de la réalisation de l'ensemble des expériences afin de prélever les organes et réaliser des analyses complémentaires post-mortem (analyses histologiques).

Remplacement

L'objectif de cette étude est de caractériser des modèles de rats portant une mutation dans le gène de la frataxine dans les cardiomyocytes, représentatif de la clinique humaine. Il s'agit en particulier de caractériser de façon détaillée la fonction cardiaque de ces animaux. Des modèles in vitro vont permettre de mieux comprendre les mécanismes d'action, mais seul un modèle animal nous permettra de caractériser les symptomes de la pathologie de l'ataxie de Friedreich. Des modèles cellulaires ou le gène de la frataxine est inhibé ont été étudiés et ont permis de cibler différentes molécules étant capables de diminuer les effets cellulaires indésirable de l'inhibition de ce gène. Cependant cette étape in vivo, qui nous permettra de comprendre la physiologie cardiaque d'un animal où la frataxine est inhibée, est indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez l’homme. Nous avons dans cette étude choisi un modèle de rat. Un avantage majeur des modèles de rats par rapport aux souris est leur grande similitude physiologique avec les humains. Leur système cardiovasculaire et leur système nerveux sont plus proches de ceux des humains que ceux des souris, tout comme le nombre et le type d'enzymes hépatiques. Il semblerait qu’un modèle de rat pour l'ataxie de Friedreich reflété mieux la plupart des aspects de la maladie humaine.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous préconisons habituellement 9 animaux par groupe et par sexe. Cependant dans cette étude nous travaillerons sur des groupes de 12 animaux pour la partie phénotypage car il s’agit de rats Long Evans, issus de croisements non consanguins et présentent donc une plus grande variabilité. Pour la partie analyse moléculaire 3 animaux par groupe sera suffisant pour obtenir des résultats comparables. De plus, les données de modèles similaires chez la souris montrent des différences dans l'évolution de la maladie cardiaque entre les mâles et les femelles. Pour cette raison, nous devons les garder séparés.

Raffinement

Afin d’améliorer leurs conditions de vie, les rats seront ainsi stabulés dans des conditions optimales pour l’espèce : en petit groupe, avec des paramètres environnementaux maitrisés, un milieu enrichi à l’aide de nids, de bâtons à ronger, de balles à ronger et de croquettes d'alimentation dans le fond de la cage pour favoriser l'enfouissement. Pour les cages de mâles, à chaque change, nous leur remettons un peu de litière sale de leur précédente cage afin de limiter l'agressivité pour la prise de territoire / hiérarchie. Nous enrichissons fortement le milieu de vie des animaux, surtout des mâles afin d'éviter au maximum l'agressivité. Tous les animaux seront observés de manière quotidienne et suivis selon un tableau de scoring pour l'évaluation de la douleur et pour l'établissement de points limites, prenant en compte le poids, l'apparence physique, les signes cliniques et le comportement de l'animal. Tout au long des procédures, si l’état de santé de l’animal est dégradé, le personnel formé et compétent décide de ne pas réaliser le test et d'euthanasier l’animal le cas échéant. A réception, les animaux vont passer une période d'habituation de 15 jours qui vise à les habituer à la manipulation et donc réduire le stress ressenti lors du transport. Lors de l'anesthésie de l'EMG, du gel oculaire est placé sur la cornée afin de prévenir tout déssèchement de l'oeil, et les animaux sont placés sur un tapis chauffant à 37°C durant toute la durée de l'anesthésie pour prévenir la déperdition de chaleur. Amendement 1 : Nous allons réaliser des echocardiographies pour suivre le phénotype dommageable de ces animaux.

Choix des espèces

Le modèle rat portant une mutation inductible sur le gène de la frataxine dans les cellules musculaires permet de reproduire tout ou une partie des symptômes de l'ataxie de Friedreich observés en clinique humaine (données préliminaires). Nous utiliserons des animaux adultes jeunes, mâle et femelle. Nous avons besoin que les animaux soient matures physiologiquement, cérébralement et physiquement pour effectuer cette batterie de tests. Le planning de phénotypage démarrera à l'âge de 9 semaines.

22 970 animaux vont être utilisés, 7 480 rats, 7 080 souris, 3 700 lapins, 2 530 cobayes et 2 180 hamsters dorés et de Chine, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Ils reçoivent des substances à tester en administration unique ou quotidienne, subissent des études de carcinogénèse et de reprotoxicité, des tests d'irritation oculaire, cutanée et mucosale, et pour certains une chirurgie d'une heure trente. Le porteur indique que les tumeurs induites peuvent provoquer douleur, agressivité et automutilation, et que la toxicité aiguë peut tuer les individus testés. L'installation travaille pour des clients de l'industrie pharmaceutique et agro-alimentaire, et annonce des points limites propres à chaque procédure sans en décrire aucun.

Objectifs

L’objectif de ce pojet est d’évaluer la toxicité de substances, de dispositifs médicaux ou agro-alimentaires pour l’industrie pharmaceutique chez les rongeurs, de type rat, souris, hamster et cobaye et chez les lagomorphes de type lapin.

Bénéfices attendus

Ce projet permet d’évaluer la toxicité de substances et dispositifs pharmaceutiques ou agro-alimentaires sur des modèles animaux. Le bénéfice attendu est donc de pouvoir développer et tester ces substances ou dispositifs sur l’Homme afin de proposer des traitements ou des produits agro-alimentaires. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.

Procédures

Pour l’évaluation de la tumorigénicité, l’injection de la substance à tester est réalisée sur animal anesthésié. Il s’agit d’une administration unique ou d'une chirurgie. Un protocole d’analgésie sera appliqué pour la chirurgie. La chirurgie ne peut exéceder 1h30 et l’administration dure 10 minutes maximum. Pour l’évaluation de la toxicité aigue, il s'agit d'une administration unique de la substance test. L'administration dure 10 minutes maximum. Pour l'évaluation de la toxicité chronique et sub-chronique, de la toxicocinétique, de la carcinogénèse, de la reprotoxicité et de la génotoxicité, l’administration de la substance test peut être réalisée quotidiennement (le schéma de traitement dépend de ce qui est réalisé chez l'Homme). Ces administrations durent 10 minutes maximum. Pour l’évaluation de la présence de contaminants viraux, la substance test est administrée deux fois. Les administrations durent 10 minutes maximum. Pour l’évaluation de l’irritabilité cutanée, l’irritabilité occulaire, l’irritabilité mucosale et la sensibilisation de la peau, il s'agit d'une administration unique de la substance test. L'administration dure 10 minutes maximum. Des prélèvements sanguins peuvent être réalisés pour toutes les procédures décrites. Le nombre de prélèvement sanguin dépend de la durée de l'étude, il peut y avoir entre 2 prélèvements sanguins jusqu'à 20 prélèvements sanguins par étude pour les études les plus longues. La durée d'un prélèvement sanguin est de 10 minutes maximum. Pour certaines procédures les animaux sont mis à jeun en cage métabolique, les durées de mise à jeun étant comprises entre 16 heures et 24 heures maximum pour le rat, le hamster, le cobaye et le lapin. Pour la souris, la mise à jeun est de 6h minimum et n'excèdera pas 10h.

Impact sur les animaux

Les études de tumorigénicité et de carcinogénèse peuvent provoquer l’apparition de tumeurs chez les animaux, ce qui peut engendrer une douleur. Les effets liés à l’apparition d’une masse tumorale peuvent aboutir à une baisse d’activité ainsi qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, atteinte de l’état général (poils hérissés, le dos voûté…)). L’étude de toxicité aigüe peut engendrer une irritation au niveau du site d’injection dû à l’administration de la substance test. Une douleur peut accompagner cette irritation de même qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, fièvre, atteinte de l’état général (poil hérissés, dos voûtés…)). In fine, la toxicité de la substance testée peut provoquer la mort des individus. Les études de toxicité sub-chronique et chronique, de toxicocinétique, de génotoxicité et de reprotoxicité peuvent engendrer une irritation au niveau du site d’injection dû à l’administration ou aux administrations répétées de la substance test. Une douleur peut accompagner cette irritation de même qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, fièvre, atteinte de l’état général (poil hérissés, dos voûtés…)) selon le schéma et le mode d’administration. Les études d’irritation oculaire, cutanée, mucosale et de sensibilisation de la peau peuvent engendrer des irritations, des plaies, des nécroses au niveau du site d’application de la substance test. Ceci peut être accompagné d’une douleur d’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, atteinte de l’état général (poil hérissés, dos voûtés…)). Les études d’évaluation de la présence éventuelle de contaminants viraux peuvent engendrer une douleur. Les effets peuvent aboutir à une baisse d’activité ainsi qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, fièvre, atteinte de l’état général (poil hérissés, dos voûtés…)). Ces effets ne sont pas limités dans le temps et peuvent durer tout le long du projet. En l’absence de traitement, ces nuisances sont irréversibles.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses vitro et ex-vivo.

Remplacement

Le développement de produits pharmaceutiques, de dispositifs médicaux ou agro-alimentaires nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable par nos clients ou par notre installation. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe. Dans le cas de la tumorogénicité et de la carcinogénèse, il peut s’agir de l’apparition d’une tumeur associée à une possible douleur. Dans le cas des études de toxicité sub-chronique et chronique, de toxicocinétique, de génotoxicité et de reprotoxicité, il peut s’agir de l’irritation au niveau du site d’injection et des organes reproducteurs. Dans le cas des études de toxicité aigüe, il peut s’agir de signes cliniques de toxicité et in fine la mort des individus si la dose testée est toxique. Dans le cas d’irritation oculaire, cutanée, mucosale et de sensibilisation de la peau, il peut s’agir d’irritation, de plaies et de nécrose au niveau du site d’application. Ces signes pathologiques et leurs résorptions ne peuvent être observés qu’avec l’utilisation d’animaux.

Réduction

Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Par exemple, un nombre minimum d’animaux est requis pour les essais réglementaires, chaque groupe est composé de 10 animaux minimum (5 mâles et 5 femelles minimum) et peut aller jusqu'à 50 animaux par groupe pour les procédures de carcinogénèse et de reprotoxicité. Les analyses statistiques seront effectuées comme décrit dans les procédures internes. Afin de réduire le nombre d’animaux, différents prélèvements d'organes et/ou de sang seront réalisés.

Raffinement

De l’enrichissement comme des bâtonnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. En fonction du mode d’administration, il est possible de mettre en place une analgésie adaptée. En fonction du projet, le poids corporel des animaux sera enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée plus régulière peut être réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) peut être mis en place. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème) après chaque traitement peut être réalisée. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Il s’agit de modèles expérimentaux choisis de préférence, en raison de leur durée de vie relativement courte, de leur utilisation fréquente dans les études pharmacologiques et toxicologiques, de leur sensibilité à l'induction de tumeurs et de la disponibilité de souches suffisamment caractérisées. Ces caractéristiques permettent d'obtenir une grande quantité d'informations sur la physiologie et la pathologie de ces animaux. Leur génotype est donc connu et ils sont faciles à héberger. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire les différents modèles. De même, les lapins présent un organisme et des mécanismes de fonctionnemnt internes similaires à l’homme. Leur génotype est également connu et leur utilisation est largement décrite dans la bibliographie. Ces espèces (rat, souris, cobaye, hamster, lapin) sont choisies en fonction du produit à tester, de la dose, du volume et de la procédure expérimentale suivie. Cobayes, rats, hamsters, lapins : adultes ou jeunes adultes car ils nécessitent d’avoir le système immunitaire et autres organes vitaux fonctionnels et totalement développés, dont l’appareil reproducteur. Souris : adultes ou jeunes adultes sauf pour les études de contaminants viraux pour lesquelles des nouveaux-nés sont requis dans le cadre d’études réglementaires obéissant aux lignes diretrices de la Pharmacopée Européenne ou de la FDA.

Les souris qui perdent plus de 20 % de leur poids, ou entre 10 et 20 % avec des signes de souffrance, sont mises à mort. 1 512 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever organes et sang. Elles subissent seize semaines de régime riche en graisses, des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec sept prélèvements en deux heures, des injections quotidiennes pendant sept jours, et un séjour de six heures ou dix jours à 5 °C, seules en cage pour les empêcher de se réchauffer les unes contre les autres. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'aucun système cellulaire ne reproduit cette complexité, qu'il lui est donc "nécessaire" d'étudier la protéine au sein d'un "organisme entier" et qu'"aucune méthode alternative n'existe".

Objectifs

Il existe dans notre organisme deux grands types de cellules graisseuses appelées adipocytes : les adipocytes blancs qui stockent les graisses que nous mangeons et les adipocytes bruns et beiges qui brulent ces graisses. L'&ctivation de ces adipocytes bruleurs de graisse contribue au maintien de la température corporelle lors d'une exposition au froid et permet de dissiper l'excédent calorique après un repas. Ainsi favoriser la fonction de ces adipocytes bruleurs de graisse diminuerait la prise de poids. Nous avons récemment découvert que ces adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse expriment en grande quantité une protéine donc l’activation est contrôlée par des forces mécaniques. Cette protéine, appelée Piezo1, est dite mécano-sensible. L'objectif de ce projet est de déterminer si cette protéine mécano-sensible contrôle la capacité des adipocytes bruns et beiges à bruler des graisses lors de l'exposition au froid et après la prise d'un repas et si elle joue un rôle dans ces adipocytes pour moduler le développement de l’obésité induite par un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

L'ensemble des expériences décrites dans ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de cette protéine mécano-sensible dans les mécanismes d'activation des adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse et ainsi pourrait permettre de proposer cette protéine comme une future cible pour des médicaments visant à augmenter la fonction et/ou le nombre de ces adipocytes bruleurs de graisse. Cela permettra de favoriser la dépense énergétique et de réduire la masse grasse et ainsi lutter contre l’obésité et ses complications métaboliques comme le diabète de type 2 ou les maladies cardiovasculaires.

Procédures

Les souris seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines. La masse maigre et la masse grasse sera mesurée sur des souris vigiles par un appareil à raisonnance magnetique nucléaire (RMN) qui est une procédure non invasive un peu comme un scanner, la mesure dure 1 min/souris. Les souris vigiles seront soumises à des prélèvements d’une goutte sang lors des tests de tolérance au glucose (GTT) ou à l'insuline (ITT) (0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes). Cette goutte de sang est appliquée sur une bandelette qui est insérée dans un glucomètre pour mesurer la glycémie. Le GTT sera réalisé aprés 8 et 13 semaines de régimes. Le GTT et l’ITT seront espacés de 2 semaines. Pour les experiences à thermoneutralité, les souris seront hébergées à 30 °C pendant 4 semaines maximimum. Pour les expériences d'adaptation au froid par mesure de la température corporelle, les souris seront hébérgées à 5°C pendant 6h ou 10 jours et seront pour ces durées seules dans la cage afin d’éviter le comportement de thermorégulation sociale qui consiste au regroupement d’animaux les uns contre les autres afin de se réchauffer, comportement qui pourrait fausser les résultats de la mesure de la variation de température corporelle.

Impact sur les animaux

Une grille d'observation avec conduite à tenir a été mise en place pour détecter rapidement tous signes de souffrance et prendre les mesures appropriées. Les critères d’appréciation de la douleur sont ceux publiés par l’Office Vétérinaire Fédéral Suisse : « Classification rétrospective des expériences sur animaux selon leur degré de gravité (catégories de contrainte) » (800.116- 1.05), mis à jour en 2004. Les souris seront mises à mort si blessure grave, signes de souffrance et de stress (repli en boule, pelage négligé, maigreur), perte de poids > 20 % par rapport à la pesée précédente ou perte entre 10 et 20 % avec signe de souffrance. Lors des injections en intra-péritonéale répétées, les souris seront plus particulièrement surveillées pour repérer des irritations ou des zones d'infection aux zones d'injection. Pour les injections IP quotidiennes pendant 7 jours, nous alternerons les sites d'injection droite/gauche afin d'éviter de créer une zone inflammatoire au point d'injection. Lors de l'exposition au froid, les souris comme tous les homeothermes sont capables de mettre en jeux différents processus pour maintenir leur température corporelle. Nous surveillerons cependant ces souris plus particulièrment pour détecter tous signes d'hypothermie sévère comme une perte du réflexe de redressement, une prostration ou une léthargie. La température rectale sera mesurée et si inférieure à 32°C la souris sera mise à mort.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour récuperer des organes et du sang.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement nous avons fait des études in vitro sur des cellules d'adipocytaires brunes et nous avons ainsi montré que Piezo1 est fortement exprimé dans ces adipocytes et nos expériences in vitro suggèrent que Piezo1 contrôle le développement/fonction des adipocytes thermogéniques, adipocytes qui participent au contrôle de la prise de poids. Les mécanismes du developpement de l’obésité et de ses complications métaboliques sont complexes faisant intervenir un dialogue inter-organe, le système immunitaire, et le microbiote intestinal. Il n’est pas possible pour l’instant d’utiliser des systèmes cellulaires reproduisant cette complexité biologique. Il nous est donc nécessaire maintenant d’étudier le rôle de cette proteine mécano-sensible Piezo1 dans les adipocytes brusn et beiges au sein d’un organisme entier car aucune méthode alternative n’existe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer des animaux en excès. Les protocoles utilisés sont bien maitrisés par les participants au projet. Cette expertise permet de définir pour chaque procédure un nombre d’animaux minimum pour obtenir des résultats reproductibles et permettant des études statistiques pertinentes. Ce nombre a été obtenu en utilisant un logiciel dédié qui tient compte de la variabilité de l'effet étudié. En pratique le nombre d'animaux est de 8-12 par groupe pour la plupart des expériences. Différents test statistiques seront utilisés pour déterminer si les différences observées entre les groupes experimentaux sont significatives. Nous choisissons de faire des groupes de 8-12 souris et les procédures seront répétées 3 fois. Cependant, si une différence statistiquement significative est observée après 2 répétitions, nous ne ferons pas la troisième répétition. Ceci nous permettra de réduire le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Nous avons généré des souris avec une invalidation de la protéine étudiée restreinte au adipocytes bruns et beiges pour limiter le risque d'apparition d'un phenotype dommageable. L'hébergement sera réalisé dans des locaux appropriés avec un maximum de 4-5 souris/cage sur des portoirs ventilés. L’isolement de souris sera évité hormis pour un temps limité pour les études en cage métabolique et pour l'exposition au froid. Les personnes réalisant les procédures sont autorisées à l'expérimentation animale et respecteront les règles d'éthique. L'environnement est amélioré pour minimiser le stress (igloo, tige de coton, batonnets de bois). Le suivi sanitaire est quotidien et réalisé les jours ouvrables et fériés par les zootechniciens et par des personnes formées pour cela le WE. Cela permettra d'identifier rapidement des souris souffrantes dans les élevages et de prendre les mesures correctives nécessaires (isolement de l'animale pour soins si blessure pas trop grave, mise à mort si blessure importante et/ou signes de souffrance). Si des signes de souffrance apparaissent au cours d'une expérimentations, l'experimentation sera immédiatement arrétée. Une grille d'observation avec conduite à tenir a été mise en place pour détecter rapidement tout signes de souffrance et prendre les mesures appropriées. Les animaux seront anesthésiés par un mélange Kétamine (100mg/kg) / Xylasine (10mg/kg) pour éviter toute souffrance lors de prélévement important de sang par ponction cardiaque entrainant la mort de l'animale.

Choix des espèces

L'utilisation de souris se justifie par le fait que cette espèce a beaucoup d'adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse qui contribuent à la dépense énergétique et à la capacité d'adaptation au froid. Les souris sont donc un modèle de choix pour identifier de nouvelles protéines régulant la fonction de ces adipocytes et la dépense énergétique. Cette espèce est aussi très utilisée dans les études sur le développement de l'obésité et de ses complications métaboliques car lorsque les souris sont nourries avec un régime riche en lipide, elles deviennent obèse en 16-20 semaines. Ce temps relativement court par rapport à d'autres espèces permet d'étudier facilement l'impact de modifications génétiques ou de composés pharmacologiques sur l'obésité. L'obésité des souris est assez proche de celle de l'homme permettant de tirer des informations pertinentes pour l'obésité humaine. Enfin, la souris est l'espèce de mammifère de choix pour réaliser des modifications génétiques (surexpression ou invalidation d'une protéine, globale ou ciblée dans un tissu). Pour l'ensemble des procédures, nous utiliserons des souris males adultes dont l'age sera de 15-24 semaines selons les procedures.

Pour mettre au point une imagerie IRM de diagnostic de l'AVC, 9 singes écureuils vont être utilisés, tous tués 24 heures ou 7 jours après l'opération. Trois subissent une craniotomie de moins de 3 mm pour recevoir une injection de LPS ou de thrombine dans le cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Six subissent une chirurgie d'une heure pour provoquer un AVC ischémique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, avec une perte de sensibilité d'un côté du corps et des déficits moteurs et cognitifs mesurés par un neuroscore. Le porteur justifie le recours au primate par sa "forte proximité phylogénique" avec l'humain et précise qu'il utilisera les animaux "les plus âgés possibles", l'âge étant un facteur de risque d'AVC.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) est une pathologie neurologique survenant après l’occlusion d’une artère irriguant le cerveau. Cette pathologie est la 3ème cause de mortalité et la première cause de handicap acquis chez l’adulte dans le monde. En France, cent trente mille nouveaux cas sont répertoriés par an. L’AVC pose donc un problème majeur tant dans le domaine de la santé publique que sur le plan humain. Actuellement, la prise en charge des patients à la phase aigüe de l’infarctus cérébral est réalisée par l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) associée ou non à la thrombectomie pour lesquels seul 20% des patients seront éligibles. De ce fait, il existe de nombreux travaux de recherche qui ambitionnent de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques et/ou diagnostiques permettant de traiter un maximum de patient. Pour cela, il est nécessaire de tester ces nouvelles stratégies sur des modèles animaux avant de pouvoir les évaluer chez l’Homme. Le but de ce projet est de développer une nouvelle méthode d’imagerie diagnostique par IRM et de démontrer son possible transfert pour une utilisation chez l’homme. Cette technique est privilégiée car elle est non invasive, disponible dans tous les centres hospitaliers de proximité et utilisée en routine pour la plupart des protocoles de recherche clinique en imagerie. Pour cela, il est prévu de réaliser un modèle d’accident vasculaire chez le primate non humain (PNH) et ainsi valider cette nouvelle approche diagnostique sur une espèce animale présentant une forte proximité phylogénique. En plus des aspects anatomiques, physiologiques et comportementaux, l’évaluation IRM sera possible sur des machines utilisées en clinique. En effet, la phase de développement nécessitera la mise au point des programmes d’acquisition qui pourront alors directement être transposable à l’imagerie chez l’homme.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objet de mettre au point un nouvel agent d’imagerie IRM permettant de réaliser un diagnostic de l’AVC et plus généralement de l’inflammation cérébrale associée aux AVC. La proximité phylogénétique du PNH est un atout majeur de transposabilité des résultats précliniques chez l’homme du fait de l’anatomie et la physiologie cérébrale et permet l’utilisation d’IRM humain.

Procédures

Less animaux subiront soit une chirurgie pour induire une inflammation cérébrale(durée 30 min) soit pour induire un AVC ischémique (durée 1h). Ces chirurgies seront suivi par des examens d'imagerie médicale pour évaluer l'inflammation et les lésions cérébrales (durée 1h par examen) à +24h et +7j. Les animaux seront mis à mort soit à 24h soit à 7 jours post-chirurgie.

Impact sur les animaux

La première partie du projet se fera avec une procédure de courte durée (24h). Les animaux sont habitués à la préhension mais un léger stress peut exister au moment de la sédation initiale. La deuxième partie du projet inclut après réveil une série de scoring à 24h et 7jours. Suite à la chirurgie, il est attendu une désorientation et un stress des animaux. La craniotomie nécessaire pour les injections de LPS ou de thrombine sera très réduite (diamètre

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour permettre la réalisation d'études histologiques complémentaire de l'IRM.

Remplacement

Les études de développement de stratégies thérapeutiques et /ou diagnostiques nécessitent leur validation sur un modèle animal proche de l’homme avant un potentiel essai clinique. Cette étude ayant pour but de développer une technologie d’imagerie diagnostique basée sur l’injection de particules biodégradables, il est impossible de remplacer l’utilisation d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au maximum afin de valider les techniques d’imagerie de l’inflammation dans 2 conditions différentes. La validation de telles techniques ne nécessite pas le recours à de grands groupes expérimentaux. La première phase de validation à l’aide du modèle LPS, très reproductible, et déjà validée chez le rongeur utilisera 3 animaux afin de vérifier les doses nécessaires d’agent de contraste. Le modèle d’AVC, générant plus de variabilité, nécessitera 6 animaux pour la validation de l’outil d’imagerie dans une pathologie mimant la clinique humaine. Il n’est pas prévu de faire une évaluation statistique des effets de l’AVC, mais une validation de l’outil d’imagerie.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe sociaux tout au long du projet. Hébergement, enrichissement et alimentation seront adaptés pour limiter les comportements anormaux (stéréotypies, prostration…) avec un suivi journalier des comportements individuels et alimentaires ainsi que des interactions sociales. Pour l’IRM et la chirurgie, les animaux seront anesthésiés et sous couverture analgésique. Les paramètres physiologiques (température, hydratation) seront contrôlés.

Choix des espèces

Le niveau de complexité anatomique et fonctionnel de ces structures, ainsi que la volonté d’obtenir un modèle suffisamment proche de l’Homme pour tester ensuite de nouvelles stratégies thérapeutiques font du PNH un modèle particulièrement approprié pour notre étude. De plus, les capacités d’apprentissage des singes permettent la réalisation de tâches comportementales similaires à celles réalisées chez l’homme. La complexité des niveaux cérébraux d’intégration (anatomie, connectivité, cognition) rend difficile/impossible à l’heure actuelle, la modélisation des processus post-lésionnels in vitro et nécessite des systèmes intégrés. Les animaux seront adultes (age supérieur à 3 ans). Étant donné que l’âge est un facteur de risque pour les accidents vasculaires cérébraux, des animaux les plus âgés possibles seront utilisés.