Procédures sévères
Etude de la diversité moléculaire et fonctionnelle des interneurones cholinergiques du striatum et conséquence sur la micro-circuiterie striatale chez la souris saine et pathologique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une chirurgie stéréotaxique de trente à soixante minutes pour injecter des composés directement dans le cerveau, puis pour une partie des animaux cinq heures d'enregistrement électrique sous anesthésie, procédure dont ils ne sortent pas vivants : 1 783 souris vont être utilisées, dont 194 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Chez les souris rendues parkinsoniennes par destruction unilatérale des neurones dopaminergiques, le porteur attend chez environ 20 % d'entre elles une altération du comportement alimentaire et de la prise de boisson, avec perte de poids sévère. Le projet vise à montrer que ces interneurones du striatum forment des sous-populations distinctes, hypothèse qualifiée de "très innovante". Les tests censés évaluer les déficits moteurs tiennent en quinze minutes au maximum et ne sont jamais nommés.
Objectifs
Les dysfonctionnements des interneurones cholinergiques du striatum (CINs) sont impliqués dans un large éventail de troubles neurologiques et neuropsychiatriques qui représentent un fardeau social et économique élevé pour la population mondiale. Ces interneurones font partie d'un réseau impliqué dans les apprentissages sensorimoteurs. L'hypothèse principale de ce projet est que les CINs présentent une diversité moléculaire qui peut être liée à leur hétérogénéité fonctionnelle. Il s'agit d'un projet très innovant car les CINs ont jusqu'à présent été considérés comme une population homogène, excluant toute possibilité de diversité fonctionnelle. Plus précisément, nous voulons analyser les gènes exprimés par les CINs et, surtout, établir le lien entre ces gènes et les propriétés fonctionnelles évaluées à l’aide d’approches anatomiques, électrophysiologiques et d’imagerie chez la souris. Décrypter la diversité moléculaire des CINs nous permettra de mieux comprendre leur rôle dans les nombreuses pathologies impliquant ces interneurones, notamment dans la maladie de Parkinson.
Bénéfices attendus
Si l'on considère que le processus pathologique de la maladie de Parkinson affecte différemment des sous-populations spécifiques d’interneurones cholinergiques, les résultats de notre étude devraient permettre d'améliorer les stratégies thérapeutiques en ciblant sélectivement la/les sous-population(s) appropriée(s). Considérant que les interneurones sont impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques dont le coût sociétal dans la population européenne est considérable, nous espérons que mieux comprendre les mécanismes sous-tendant ces troubles neurologiques contribueront à en améliorer le traitement.
Procédures
- Une contention pour procéder à des injections intra-péritonéales et sous-cutanées. - La plupart des souris subiront une chirurgie stéréotaxique permettant l’injection intracérébrale de composés sous anesthésie générale et avec une analgésie appropriée. La chirurgie proprement dite dure entre 30 et 60 minutes et les souris ne sont opérées qu’une seule fois. - Des tests comportementaux seront réalisés pour évaluer les déficits moteurs. Durée maximale: 15 min. - Certains animaux subiront une perfusion intracardiaque pour prélévement (procédure terminale, durée : 3 min). - Des enregistrements électrophysiologiques sur animaux anesthésiés (procédure terminale, durée: 5h). Un même animal peut subir plusieurs interventions mais chaque intervention n'est faite qu'une seule fois.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues concernent d'une part les injections intrapéritonéale et sous-cutanées et d'autre part, les chirurgies stéréotaxiques. Les nuisances liées à la chirurgie stéréotaxique sont bien tolérées et n'ont que peu d'impact sur les animaux grâce aux soins post-opératoires. En revanche, elles peuvent être plus sévères chez les animaux rendus parkinsoniens. Ce modèle de la maladie de Parkinson entraine en effet la destruction unilatérale des neurones dopaminergiques. Cette destruction peut affecter les comportements alimentaire et dipsique chez environ 20% des animaux et entrainer une perte depoids sévère. De tels effets ne sont pas observés chez les animaux injectés contrôles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Les méthodes in vitro ne peuvent pas reproduire le fonctionnement d’un organe aussi complexe que le cerveau en raison de l’isolement des cellules du contexte physiologique.
Réduction
En maintenant notre animalerie dans le respect des bonnes pratiques, nous nous efforçons de minimiser la variabilité induite par le stress ou par la présence de pathogènes. Afin de limiter le nombre d’animaux au strict nécessaire, nous utilisons le calcul de Puissance lors de la planification des expériences : ce calcul permet de fixer un effectif tel que l’on ait 80% chances de vérifier notre hypothèse pour un seuil de significativité inférieur à 5%. Cependant ce calcul nécessite de connaître au préalable la taille de l’effet et la variabilité des mesures, ce qui n’est pas toujours possible. Par expérience nous avons déterminé pour les expériences de physiologie que des effectifs comprenant 10 à 15 cellules issues de 7 à 8 animaux (mâles et femelles) nous permettent de mettre en évidence des différences significatives entre les groupes expérimentaux. Pour les analyses moléculaires et cellulaires, 6 animaux/groupe sont nécessaires. Ceci prend en compte les problèmes susceptibles de survenir aux différentes étapes de l’expérimentation et qui peuvent amener à écarter des animaux. Les analyses statistiques appropriées seront réalisées. D’autre part, afin de réduire le nombre de souris et de s’assurer de la reproductibilité des résultats, les paramètres d’injection (coordonnées stéréotaxiques, quantités de vecteurs infusés et délai d'expression des transgènes) et les conditions expérimentales pour les expériences in vitro (ex : utilisation de nouveaux anticorps) sont toujours testés lors d’expériences pilotes. Enfin, pour limiter le nombre d'animaux produits, nous utilisons à la fois des animaux mâles et femelles.
Raffinement
Les souris sont maintenues en groupe (de 2 à 5 animaux par cage) pour éviter l’isolement social, avec enrichissement de l’environnement qui est régulièrement renouvelé afin de diversifier au maximum l'environnement et permettre un maximum de comportements proches des comportements naturels. Lors de la chirurgie, nous utiliserons un anesthésique volatil qui par rapport à un anesthésique injectable permet une induction et un réveil rapides ainsi qu'une meilleure stabilité du niveau d’anesthésie. Ceci améliore la récupération post-opératoire et limite la létalité. Cet anesthésique n’ayant pas d’effet antalgique, une injection d'antalgique est réalisée 30 minutes avant la chirurgie. La température corporelle des souris est maintenue constante par une couverture chauffante thermostatée. Du gel ophtalmique maintient les yeux humides. Avant l’incision du scalp, une analgésie locale est effectuée. Les instruments chirurgicaux sont stérilisés et la zone opérée est désinfectée. La fréquence des visites augmente pour s’assurer d’une bonne récupération des animaux et intervenir rapidement si problème. Nous vérifions particulièrement les signes de douleurs selon une grille qui tient compte de l’aspect général de l’animal, de son poids, de son comportement naturel et induit. Si un animal présente des signes de douleurs (pelage terne, poil hérissé, dos voussé, yeux mi-clos, apathie), il reçoit un traitement antalgique toutes les 24h et est observé deux fois par jour. Si au bout de 48h, il n’y a pas d’amélioration la souris reçoit à nouveau une injection d'antalgique. L’absence d’amélioration le lendemain entraine l’euthanasie. D’expérience, les chirurgies stéréotaxiques consistant à délivrer des vecteurs viraux sont bien tolérées. Les modèles de la maladie de Parkinson peuvent nécessiter un traitement antalgique pour environ 20% des animaux. 10% à 20% de ceux-ci ne sont pas améliorés par le traitement antalgique et sont euthanasiés.
Choix des espèces
Compte tenu du degré de similarité anatomique et cellulaire important entre le cerveau de souris et le cerveau humain, la souris est un modèle de choix pour étudier le rôle des CINs en condition normale et pathologique. D’autre part la souris nous permet d’utiliser tous les avantages des techniques de transgénèse et d’induction de protéines d’intérêt par injection d’AAVs. Nous utilisons des souris sauvages C57/BL6J et des souris transgéniques sans phénotype dommageable sur le même fond génétique. Les animaux utilisés dans ce projet sont adultes (P>30, 20 à 35g) car nous travaillons sur la maladie de Parkinson, une maladie neurodégénérative touchant le sujet adulte.
Rythmes cérébraux hippocampiques et codage neuronal chez les souris modèle des troubles du spectre autistique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour étudier comment l'hippocampe rejoue les expériences vécues, 356 souris porteuses de mutations liées à l'autisme vont être utilisées : 196 opérées et enregistrées sous anesthésie profonde sans jamais se réveiller, 160 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Ces dernières reçoivent des électrodes intracrâniennes au cours d'une chirurgie stéréotaxique de deux heures, puis sont enregistrées une heure par jour pendant deux semaines, pendant qu'elles explorent une arène ou dorment, hébergées seules jusqu'à cinq semaines. Le porteur signale que certains souriceaux porteurs de la mutation meurent à la naissance d'une hypotonie générale, et que d'autres animaux perdent leur implant par choc accidentel. La surveillance repose sur des points limites de bien-être général qui déclenchent des soins ou la mise à mort, dont les seuils ne sont pas donnés.
Objectifs
La sensibilité extrême aux informations sensorielles des personnes autistes sous-entend un traitement cérébral de l’information bien particulier. Ce projet a donc pour objectif d’étudier les propriétés du traitement cérébral de l’information chez des souris reproduisant des traits observables dans les troubles du spectre de l’autisme. Plus précisément, nous étudierons l’activité de groupes de neurones présents dans une région du cerveau appelée hippocampe, structure impliquée dans la mémoire épisodique (mémoire des évènements autobiographiques -vécus à la première personne) et sociale. Il a été montré, chez le rongeur puis chez l’Homme, que lorsque nous vivons une expérience certains neurones de cette structure s’activent dans un ordre temporel précis qui récapitule, dans une fenêtre temporelle réduite (quelques millisecondes) cette même expérience. Lorsque l’individu est hors contexte, ces mêmes neurones reproduisent à nouveau cette même activité séquentielle, rejouant sans la vivre directement l’expérience passée. Or, cette propriété de réactivation séquentielle, rendue possible par l’architecture des circuits neuronaux de l’hippocampe, joue un rôle primordial dans la mémoire et l’apprentissage. Puisque l’architecture neuronale de l’hippocampe est altérée chez la personne autiste et dans les modèles de l’autisme, nous émettons hypothèse qu’une des traits comportementaux propre à la personne autiste est due à une anomalie de ce traitement séquentiel. Nous tenterons de caractériser ces altérations ainsi que les mécanismes responsables de ces déficits chez des souris reproduisant des traits observables dans les troubles du spectre de l’autisme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes physiologiques responsables des déficits cognitifs propres aux troubles du spectre autistique. A long terme, ceci pourrait permettre l'élaboration de traitements prévenant ou rémidiant à ces déficits.
Procédures
Un groupe d’animaux subira des enregistrements électrophysiologiques intracrâniens sous anesthésie profonde suivie de chirurgie terminale sous anesthésie. Le deuxième groupe se verra implanter des électrodes intracrâniennes sous chirurgie stéréotaxique (2h). Ceci se fera sous anesthésie gazeuse, anesthésie locale et analgesie. Une semaine plus tard l'activité cérébrale sera enregistrée alors que l’animal explore une arène circulaire et lors de phases de sommeil, pour un total d'une heure par session, une session par jour pour un maximum de deux semaines. A la fin des enregistrements, les animaux seront soumis à une chirurgie terminale sous anesthésie profonde et analgesie. Une fois implantés les animaux seront hébergés en individuel pour 5 semaines maximum (3 semaines en moyenne), le temps des enregistrements.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables suivants sont attendus : l'anesthésie peut engendrer une détresse respiratoire; il peut survenir une douleur post-opératoire; un stress associé à l'isolement d'une partie des animaux ; un stress associé à la manipulation par l'experimentateur; la perte des implants par choc accidentel; la mort à la naissance de certaines souris portant le gène d'autisme (hypotonie générale). Les souris Nudes ont un phénotype dommageable et sont hébergées dans une animalerie adaptée (SOPF). Pour l'expérimentation, elles sont transférées dans une animalerie conventionnelle sous armoire ventilée pour une utilisation immédiate et sans réveil.
Devenir
Les animaux seront mis a mort et les cerveaux prélevés post-mortem caractériser leur état histologique et révéler la localisation des électrodes après les enregistrements.
Remplacement
L’étude de l’intégrité des oscillations hippocampique et de leurs fonctions nécessite l’observation de systèmes neuronaux intacts. Par conséquent, cette étude ne peut se faire que sur l’animal soit vigile en comportement, soit anesthésié. Ceci rend donc impossible l’utilisation de modèle in silico ou d'organoides. A ce jour, très peu d'enregistrements électrophysiologiques de l’activité hippocampique ont été réalisés chez les souris porteuses des gènes impliqués dans l'autisme que nous étudions. Nous avons opté pour l’utilisation de souris plutôt que de rat étant donné que les modèles d’autismes qui nous intéressent nécessitent la réalisation de mutation de gènes. La souris présente davantage de bénéfices étant donné l’accessibilité expérimentale (la réalisation de mutation génétique est plus simple que sur d’autres modèles).
Réduction
Afin de réduire au maximum les éventuelles souffrances induites par les chirurgies ainsi que le nombre d’animaux, la procédure d’enregistrements sous anesthésie (Procédure 1) a été mise en place pour déterminer en premier lieu, les phénotypes électrophysiologiques propres à nos modèles. Ainsi, elle permet de préciser à l’avance les paramètres et patrons à examiner lors des enregistrements chez l’animal en comportement. Par exemple si nos enregistrements anesthésiés révèlent une anomalie spécifique à un certain rythme cérébral dans une structure et non une autre, nous n’étudierons que la structure impliquée et le comportement auquel elle est associée. Ceci nous permettra donc de limiter le nombre d’implantation à des fins d’enregistrements en comportement. L’avancée technologique concernant la miniaturisation des systèmes électroniques et d’électrodes permet maintenant d’enregistrer un grand nombre de canaux, sur de multiples sites simultanément. Un grand nombre de nos analyses reposant sur le nombre de cellules enregistrées , ces progrès nous permettent de diminuer fortement le nombre de souris utilisées. Pour les souris des portées de modèles autistiques, les animaux présentant le génotype requis par l’étude constitueront la population cible ; les animaux ne présentant pas le génotype requis seront aussi étudiés en tant que contrôles de la population cible, réduisant le nombre de portées à produire dans le cadre de cette procédure. De même, les mâles et femelles seront étudiés dans le cadre des procédures TSA, aboutissant à une utilisation de l’ensemble des animaux de chaque portées. Enfin, les données obtenues au cours du projet seront mises à disposition de la communauté scientifique pour analyses complémentaires et utilisation dans des modèles computationnels. Les animaux sont préparés par petites séries de 4 ou 5 et les résultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procédure s'arrêtant dès que le nombre de 10 expériences réussies par groupe est atteint.
Raffinement
Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). La souffrance animale est minimisée par les conditions d'élevage (cages collectives, les animaux sont mis en présence de matériel d’enrichissement : un dôme en carton permettant la nidification (sauf protocole 2) , une tige de papier pouvant être rongée et faisant aussi office de matériel de nidification, ainsi qu’une briquette en bois pour le rongeage), le suivi des règles de l'art pour les interventions chirurgicales (aseptie, anesthésie et antalgie, regulation thermique), le suivi régulier des animaux par le chercheur responsable et par le personnel animalier (définition de points limites de bien être général qui déclenchent soins particuliers, voire euthanasie, selon leur gravité). Les animaux sont conservés le minimum de temps nécessaire au projet, dès lors qu’ils ont atteint l’âge adulte. Les souris sont habitués progressivement à la manipulation afin de minimiser le stress. Bien que les animaux soient sujets à une mutation génétique, ces derniers ne présentent aucun phénotype dommageable s’ils ont survécu à la naissance. Enfin les animaux ont un accès illimité à l'eau et la nourriture.
Choix des espèces
Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. C'est également l'espèce de choix pour modéliser la pathologie cérébrale concernée par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique, facilité d'élevage, pertinance par rapport aux pathologies chez l'humain) et les dommages éventuels (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives, notamment des aspectis sociaux et de mémoire spatiale, a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus au sein de l’équipe et avec la communauté scientifique ainsi qu’une minimisation du nombre d'animaux utilisés. Les animaux seront de jeunes adultes (7-8 semaines) puisque nous nous intéressons à un système nerveux mature. Nous voulons aussi minimiser autant que possible la durée d'élevage en conditions d'animalerie de laboratoire.
Etude des effets de candidats médicaments dans un modèle d’embolie pulmonaire (EP) chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Un cathéter implanté par chirurgie dans la veine jugulaire, puis l'injection de caillots fabriqués à partir de leur propre sang pour boucher leurs artères pulmonaires : 1 615 rats vont être utilisés ainsi, dont 1 445 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. L'obstruction provoque une douleur et une détresse respiratoire plus ou moins marquée selon la zone touchée, suivie d'une baisse de mobilité, d'une perte d'appétit et d'une perte de poids. Il s'agit de mettre au point le modèle, puis d'y tester des candidats médicaments censés dissoudre les caillots. Tous les rats sont tués en fin de protocole, après une chirurgie qui expose le cœur et une mesure de pression dans le ventricule droit que le porteur juge "trop invasives pour envisager un réveil des animaux".
Objectifs
L'embolie pulmonaire est une pathologie cardiovasculaire résultant de l'obstruction d'une artère pulmonaire par un caillot de sang s'étant formé dans un vaisseau sanguin (appelé thrombose) éloigné, provenant généralement des veines des membres inférieurs. L'embolie pulmonaire est le 3ème syndrome cardiovasculaire aigu le plus fréquent dans le monde. Les facteurs de risques sont nombreux et incluent entre autres l’âge, les pilules contraceptives, l’insuffisance cardiaque, l’immobilisation, l’obésité, le tabagisme… La mortalité à la suite de l’embolie pulmonaire varie entre 2,5 et 30% selon les études. La plupart des décès par embolie pulmonaire surviennent quelques heures après l’événement, avant-même que le diagnostic ne soit réalisé dans 59% des cas. La prise en charge de la phase aigüe de l’embolie pulmonaire consiste à administrer des traitements qui vont venir dissoudre le caillot et rétablir la circulation dans l’artère pulmonaire obstruée tels que des anticoagulants, ou encore à effectuer le retrait du caillot par chirurgie. Cependant, cette dernière est réservée pour les cas les plus graves d'embolie pulmonaire et est une technique invasive alors que l'administration d'agent anticoagulant présentent des limites d'efficacité entre les individus et des effets secondaires tels que des risques d'hémorragie. L’objectif de ce projet est donc d'établir un modèle d’embolie pulmonaire chez le rat et de tester l’efficacité de nouveaux traitements pouvant dissoudre le caillot pour cette indication thérapeutique.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’apporter une preuve de concept de l’efficacité de nouveaux traitements sur le modèle rongeur d’embolie pulmonaire en agissant sur les paramètres des flux sanguins au niveau cardiaque (e.g., pression artérielle dans les cavités cardiaques ou vaisseaux sanguin pulmonaires) et anatomique/tissulaire. Ces nouvelles stratégies thérapeutiques pourront être testées en clinique afin de les proposer ensuite comme traitement aux patients souffrant d’embolie pulmonaire.
Procédures
Les animaux vigiles sont d'abord soumis à un prélèvement de sang au niveau de la veine caudale de la queue (durée 5min) entre 2 et 24h avant l'injection des caillots. Ensuite, les animaux sont anesthésiés quelques heures plus tard puis une chirurgie est réalisée pour implanter un cathéter dans la veine jugulaire, localisée au niveau du cou afin d'injecter des mini caillots dans la circulation sanguine en direction des petites artères pulmonaires et ainsi induire une embolie pulmonaire (durée de l'intervention environ 30min). Un composé de référence ou un candidat médicament peut être administré sur animal éveillé par voie intraveineuse au niveau de la queue. Les animaux sont ensuite remis dans leur cage soit directement avec leur congénère soit de manière individualisée (au maximum 10h) lorsqu'ils devront être traités avec un candidat médicament afin d'éviter qu'ils ne s'arrachent le cathéter veineux (permettant l'administation du composé) entre eux. Quelques heures plus tard, les animaux sont à nouveau anesthésiés (une à plusieurs fois) avant d'être soumis aux imageries cardiaques (environ 20 min pour chaque passage) pour contrôler les répercussions et l'évolution de l'embolie pulmonaire ou pour évaluer l'efficacité du traitement. A la fin de la procédure, une chirurgie est effecutée sous anesthésie et analgésie afin de réaliser des mesures de pression dans le ventricule droit et dans l'artère pulmonaire puis pourront être soumis à un prélèvement sanguin par ponction directe dans le coeur avant d'être mis à mort par surdose d'euthanasiant (durée 15min). En parallèle, ces animaux pourront subir un prélèvement sanguin par ponction directe de la veine jugulaire réalisée sous anesthésie gazeuse.
Impact sur les animaux
Le prélèvement de sang sur rat vigile, permettant de créer les caillots sanguins, nécessite une contention de l’animal pouvant être source de stress, ainsi qu’une ponction avec une aiguille de la veine de la queue pouvant générer une douleur. L’induction de l'obstruction des vaisseaux sanguins pulmonaires par l’administration de caillots (provenant du sang prélevé sur le même animal), se réalise sous anesthésie gazeuse, après l’ouverture chirurgicale de la peau au niveau du cou et peut donc provoquer des douleurs au réveil. L’obstruction des vaisseaux pulmonaires en elle-même engendre une douleur et provoque une détresse respiratoire plus ou moins sévère en fonction de la localisation et de de la taille de la zone obstruée. Dans les heures qui suivent l’obstruction des vaisseaux pulmonaires, une baisse de la mobilité peut être observée ainsi qu’une perte d’appétit et une baisse de l’hydratation entrainant une perte de poids. L’administration des composés dans le système veineux nécessite l'insertion d'un petit tube dans la veine de la queue pouvant être à l’origine de douleur et d’inconfort. Par ailleurs, ce tube peut être arraché par l’animal et entrainer un saignement plus ou moins abondant. Une nouvelle anesthésie générale sera nécessaire à chaque fois qu'une échographie cardiaque (pour suivre l'évolution de la pathologie) devra être réalisée (4 au maximum sur 24h toutes les 2h, avant et après l'occlusion des vaisseaux) ou pour réaliser des prélèvements sanguins à la veine jugulaire. De même, en fin de protocole, des mesures de la pression sanguine dans le coeur et le poumon seront effectuées sur animal anesthésié après exposition du coeur par chirurgie et pouvant être suivi par un prélèvement de sang. Les prélèvements de sang (sans excéder les 20% du volume total sanguin) entrainent une diminution du volume sanguin ainsi qu'une déshydratation accompagnée d'une sensation d'inconfort et de stress plus ou moins marquées en fonction du volume de sang prélevé. Un des effets indésirables potentiel est lié à l'administration du médicament à tester : un problème lors du geste technique ou un effet secondaire du composé testé peut être observé surtout pour les nouvelles molécules innovantes avec peu de recul.
Devenir
A la fin de la procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer des organes pour des analyses de tissus (coeurs, poumons, artères pulmonaires) et/ou des analyses de morphologie des organes (pesée des deux ventricules du coeur). Les mesures de pressions dans le ventricule droit sont également trop invasives pour envisager un réveil des animaux.
Remplacement
L’objectif du projet est d’obtenir une preuve de concept d’efficacité de nouveaux composé in vivo. Afin d’évaluer l’effet des composés sur l’évolution des paramètres de flux sanguin cardiaques et anatomique/tissulaire après l’embolie pulmonaire, le recours à un modèle animal est nécessaire, ce que ne peut pas reproduire le modèle in vitro.
Réduction
Ce projet débute par une étude pilote pour mettre au point le modèle d’embolie pulmonaire. L’induction de l’embolie pulmonaire sera évaluée par un suivi sur plusieurs heures de la réponse des flux sanguins au niveau cardiaque par échographie, ce qui permet de limiter le nombre d’animaux utilisés. Une fois la technique d’induction maîtrisée, un groupe d’animaux induits sera comparé à un groupe contrôle afin de valider statistiquement l’induction du modèle et les variabilités observées. Dans un second temps, 2 composés de références seront testés à 3 temps différents, afin de définir la fenêtre thérapeutique à laquelle l’administration de traitement permettant de dissoudre les caillots est efficace pour avoir des effets bénéfiques. Ces 6 groupes expérimentaux seront comparés à un groupe contrôle sain et à un groupe induit avec l'embolie pulmonaire et non traité afin de sélectionner le temps d’administration des composés le plus efficace et de limiter le nombre de groupes expérimentaux nécessaires pour tester ensuite l’efficacité de candidats médicaments. Les animaux seront répartis de manière aléatoire après l’induction de l’embolie pulmonaire à partir des mesures de flux sanguins par échographie cardiaque, permettant ainsi d’homogénéiser les différents groupes et de diminuer la variabilité entre ces derniers.
Raffinement
A l’arrivée des animaux, une période d'acclimatation d’au moins 6 jour est respectée. Les expérimentations sont effectuées par un personnel compétent et entraîné, habitué à de la microchirurgie vasculaire. Une importance particulière est portée au suivi des animaux pour prévenir et remédier à l’apparition de douleur ou de mal-être. Les points limites sont fixés avant le début des expérimentations. Les animaux seront hébergés par 2 par cage. Des enrichissements multiples leur sont proposés (batônnets en bois, carrés de cellulose, rouleaux en carton), en alternance, pour limiter l’habituation et l’ennui. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous anesthésie et/ou analgésie. Les animaux seront également habitués à la manipulation et à la contention pour diminuer le stress lié à ces procédures. Les prélèvements sanguins ainsi que les doses et volumes d’injection d’anesthésiques chimiques, d’analgésiques ou de sérum physiologique seront réalisés selon les recommandations éthiques (doses et volume adaptées en fonction des voies d’administration comme la voie intrapéritonéale, voie sous-cutanée ou voie intraveineuse). Après chaque prélèvement, une injection de sérum physiologique sera réalisée (volume équivalent injecté directement dans la voie veineuse ou 3 fois le volume prélevé injecté en sous cutané) afin de compenser la perte de volémie. La chirurgie pour induire l’embolie pulmonaire consistant à administrer des caillots de sang au niveau de la veine jugulaire sera réalisée sous anesthésie et analgésie et les animaux bénéficieront d’une surveillance accrue en phase post-opératoire jusqu’à la fin du protocole (24h maximum). De la nourriture et/ou des gels enrichis seront déposés dans la cage afin de limiter la perte de poids des animaux après la chirurgie. Les échographies cardiaques seront également réalisées sous anesthésie (i.e., gazeuse). Pour chaque anesthésie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant retro-contrôlé et maintenus et du gel ophtalmique est déposé sur leurs yeux.
Choix des espèces
Le rat, classiquement utilisé en laboratoire, présente des similitudes importantes avec l’humain d’un point de vue de l’anatomie et de la physiologie pulmonaire, vasculaire et cardiaque. La réponse pathophysiologique du rat dans les modèles d’embolie pulmonaire est comparable à celle des humains notamment en termes de modifications des flux sanguins et de réponse inflammatoire. Des rats de 5 semaines au moment où ils arrivent en acclimatation dans nos locaux sont utilisés pour ce modèle. Ce modèle est sensible à l’âge et des animaux plus âgés ne présentent pas le même développement de la pathologie.
Etude de la neuro-inflammation et du rôle de l’axe intestin cerveau dans un modèle murin d’anorexie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Une perte de poids de 25 % imposée sur quarante-quatre jours, chaque animal isolé en cage individuelle pendant toute la durée du protocole : 432 souris sont soumises à cette dénutrition chronique, dans des procédures classées au niveau de souffrance le plus élevé. Elles passent un test clair-obscur de quinze minutes et un test de construction de nid, 144 d'entre elles reçoivent en plus une injection intrapéritonéale par jour pendant cinq jours, et 36 boivent un cocktail d'antibiotiques pendant quarante-sept jours. Le porteur décrit pourtant ce modèle comme entraînant des "altérations du bien-être animal plus faibles" et un "taux de mortalité nul", par comparaison avec la version aiguë du même protocole. Toutes sont tuées à la fin pour l'étude de leurs tissus, une partie des prélèvements pouvant être échangée avec d'autres projets travaillant sur le même modèle d'anorexie.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont, premièrement, de rechercher la présence d'une inflammation au niveau cérébral (neuroinflammation) dans un modèle d'anorexie chronique chez la souris : le modèle Activity-Based Anorexia. Le second objectif de ce projet est d'évaluer le rôle potentiel du microbiote intestinal dans ce phénomène inflammatoire, via l'axe microbiote-intestin-cerveau. Deux zones d'intérêt seront particulièrement étudiées, au niveau du cerveau : l'hypothalamus, de par son rôle majeur dans le contrôle du métabolisme énergétique et de la prise alimentaire, mais aussi le circuit de la récompense, impliqué dans la composante du plaisir de la régulation du comportement alimentaire. En effet, les patients souffrant d'anorexie mentale présentent des atteintes cérébrales telles qu'une diminution des facultés cognitives, une baisse du volume cérébral et des anomalies de sécrétions d'hormones du métabolisme énergétique, ce qui justifie l'étude du cerveau dans le modèle murin d'anorexie. Ce projet permettrait d’apporter de nouvelles connaissances sur le fonctionnement du cerveau de ces patients et le rôle du microbiote intestinal dans le contexte de l'anorexie, afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques innovantes pour dépasser ces freins à la renutrition.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra de mettre en évidence l'existence ou l'absence de processus inflammatoires au niveau cérébral dans un contexte d'anorexie. Si de tels phénomènes sont montrés, nous pourront alors caractériser le rôle du microbiote intestinal, et notamment d'une molécule reliant le microbiote intestinal et la structure de l’intestin, dans la neuroinflammation associée à l'anorexie. Cette molécule étant connue pour son implication dans la régulation du comportement alimentaire. Il n'est pas possible de montrer de tels phénomènes chez l'Homme, l'accès au tissu cérébral étant nécessaire. L'utilisation d'un modèle animal est donc indispensable à la réalisation de ce projet. D'un point de vue fondamental, ces recherches permettront également de décrire l'activité et le phénotype des cellules gliales, les cellules non neuronales du cerveau, en condition de restriction sévère, ainsi que leurs interactions avec les centres cérébraux de régulation de la prise alimentaire. Il est également à noter que ce projet permettra de mieux caractériser le modèle ctivity-based anorexia sous sa forme chronique (44 jours), modèle moins bien décrit dans la littérature que le modèle aigu (17 jours), bien qu'il soit plus pertinent quant à sa comparaison avec la pathologie chez l'Homme, et moins sévère pour les souris (score de mortalité nul). De plus, il est habituellement observé chez les souris activity-based anorexia femelles une augmentation de la prise alimentaire et du poids corporel en fin de protocole, les souris s'éloignant ainsi de la pathologie anorexique souhaitée. Ce phénomène est évité dans le modèle chronique, puisque la prise alimentaire est contrôlée par l'expérimentateur. Le poids corporel cible des souris est ainsi maintenu stable tout le long du protocole. Sur le long terme, ce projet permettra une meilleure compréhension de l’interconnexion des acteurs de l'axe microbiote-intestin-cerveau dans un contexte de dénutrition chronique, et plus particulièrement le rôle du microbiote intestinal dans la neuroinflammation et le comportement alimentaire, ce qui permettra de proposer des solutions thérapeutiques innovantes pour aider à la renutrition des patients anorexiques, par exemple avec des probiotiques ou par la modulation directe de facteurs de l'inflammation.
Procédures
100% des animaux, soit 432, seront manipulés tous les jours pour la pesée et le relevé des critères de bien-être animal. Les 432 animaux seront en état de dénutrition chronique (perte de poids cible de 25% sur 44 jours). 100% des animaux, soit 432, subiront une injection d'anesthésique/analgésique de 3 secondes, ainsi qu'une contention de 2 min pour la mesure de la composition corporelle deux fois, au début et en fin de protocole, sur animal vigile. Les 432 animaux suivront des tests comportementaux afin d'évaluer leur état d'anxiété et de dépression, à savoir un test clair-obscur de 15 minutes (animaux placés dans un dispositif infra-rouge enregistrant leurs déplacements) qui peut générer un stress dû au nouvel environnement, et un test de formation de nid (nouveau coton placé dans la cage, évaluation par observation au bout de 24h, le coton est laissé aux souris jusqu’à la fin du protocole en tant qu’enrichissement) qui n'engendre ni stress ni douleur. 144 animaux recevront une injection intrapéritonéale de 3 secondes une fois par jour pendant 5 jours consécutifs, afin d’évaluer le rôle d’une molécule clé dans le dialogue bactérie-cellules intestinales. 36 souris auront un cocktail d'antibiotiques dans leur eau de boisson sur l'ensemble du protocole de restriction et 3 jours en amont, soit 47 jours.
Impact sur les animaux
L’ensemble des animaux seront isolés le temps du protocole, avec un faible impact sur le score de bien-être animal pour les animaux contrôles, comme observé dans nos protocoles précédents. Les animaux dénutris, quant à eux, peuvent présenter une diminution de la prise hydrique, et une hyperactivité anticipatoire (avant l'accès à l'alimentation), particulièrement les premiers jours de restriction. Cependant, ce modèle chronique reposant sur une restriction quantitative adaptée au poids corporel de chaque animal, les altérations du bien-être animal sont plus faibles et associées à un taux de mortalité nul, par rapport au modèle activity-based anorexia aigu habituellement employé qui repose sur une restriction temporelle identique pour chaque animal. Les animaux dénutris ont tout de même une perte de poids importante au cours du protocole, en accord avec ce qui est observé en clinique, cet aspect fait l’objet d’un suivi quotidien. Le suivi du bien-être animal est en effet effectué quotidiennement, les points suivants sont évalués : état du pelage, niveau de prostration, état de fatigue, perte de poids, prise hydrique et activité physique, baisse de la température corporelle. Lors des mesures de composition corporelle, la contention de 2 minutes engendre également un stress aigu. La réalisation des tests comportementaux peut également engendrer un stress, de par le changement de pièce d'expérimentation, et la découverte du dispositif. Les animaux dont le microbiote intestinal a été supprimé par antibiothérapie peuvent présenter des signes de douleurs intestinales, de la même manière que précédemment, ces animaux sont surveillés quotidiennement sur la base de critères de bien-être animal. Concernant les animaux génétiquement modifiés, aucune nuisance n'est donc observée sur ces animaux.
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort pour l’étude de leurs tissus à la fin du protocole et des procédures. Une utilisation conjointe sur plusieurs projets peut être envisagée, soit la récupération de tissus non utilisés lors de ce projet ou inversement sur d’autres projets activity-based anorexia ne récupérant pas le cerveau.
Remplacement
Ce travail est un projet de recherche intégré, la dénutrition étant la conséquence de relations métaboliques inter-organes complexes. Il permettra d’analyser les différents signaux mettant en jeu des relations importantes entre le microbiote intestinal, l’intestin et le cerveau. Le recours à des modèles animaux est donc nécessaire pour prendre en compte cet aspect multi-organes. De plus, l'anorexie mentale étant une pathologie psychiatrique, l'étude du comportement (prise alimentaire, activité physique, tests d'anxiété) est nécessaire à l'interprétation des résultats. Ces paramètres comportementaux nécessitent l'emploi de modèles de rongueurs. Cependant pour des études plus mécanistiques telle que l’étude des relations microbiote-cellules intestinales, nous avons recours à des techniques de culture cellulaire in vitro.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux, en prenant en compte les résultats de la littérature et de notre équipe sur le modèle activity-based anorexia aigu, nous avons fait le choix de ne pas réaliser certains groupes contrôles et notamment les animaux ayant un accès libre à l’alimentation et à une roue d’activité. En phase terminale du protocole, le maximum de tissus est prélevé et certains peuvent être partagés pour d'autres projets. Les analyses ont été préalablement optimisées et nous permettent de limiter le nombre d’animaux par groupe à 12. Le modèle activity-based anorexia chronique reposant sur une restriction quantitative adaptée au poids corporel de chaque animal, les altérations du bien-être animal sont plus faibles et associées à un taux de mortalité nul, par rapport au modèle activity-based anorexia aigu habituellement employé qui repose sur une restriction temporelle identique pour chaque animal. Il n'est donc pas nécessaire de prévoir plus d'animaux pour compenser une éventuelle perte au cours du protocole. Plus précisément, nous nous sommes basés sur de premiers résultats antérieurs du laboratoire dans le modèle activity-based anorexia aigu et avons calculé à l’aide de formules statistiques qu’il faudrait 12 animaux par groupes pour obtenir un pouvoir statistique suffisant pour la comparaison des groupes entre eux.
Raffinement
Après la période d'acclimatation à l'animalerie d'une semaine, les animaux sont transférés individuellement dans leur cage d'expérimentation. Ce transfert peut s'avérer stressant pour les animaux, c'est pourquoi une nouvelle période d'une semaine d'acclimatation à ces nouvelles conditions est appliquée. Concernant l'enrichissement, du papier kraft est ajouté dans toutes les cages, ainsi qu’un carré de coton ce qui permet la construction de nids pour compenser l'isolement des souris. Le modèle activity-based anorexia chronique reposant sur une restriction quantitative adaptée au poids corporel de chaque animal, les altérations du bien-être animal sont plus faibles et associées à un taux de mortalité nul, par rapport au modèle activity-based anorexia aigu habituellement employé qui repose sur une restriction temporelle identique pour chaque animal. Le suivi du bien-être animal est tout de même effectué quotidiennement, les points suivants sont évalués : état du pelage, niveau de prostration, état de fatigue, perte de poids, prise hydrique, activité physique et baisse de la température corporelle. Ces critères permettent de décider de l'atteinte ou non des points limites. De plus, comme indiqué dans les dernières recommandations, les souris sont manipulées quotidiennement en les faisant monter dans le creux de la main de l'expérimentateur de manière volontaire, et non pas en les attrapant par la queue. En effet, il a été montré que cela réduit significativement le stress et l'anxiété des souris. Un seul et même expérimentateur réalise les manipulations des animaux au quotidien, ce qui permet une meilleure habituation des animaux aux gestes pratiqués et à la présence d'un individu, réduisant le stress. L’antibiothérapie, pour les animaux concernés, est réalisée dans l’eau de boisson et non par administration orale comme fréquemment retrouvé dans la littérature, ce qui limite le stress des animaux et les risques liés à l’administration orale.
Choix des espèces
La souche de souris utilisée dans ce projet est communément utilisée dans les modèles soumis à des interventions nutritionnelles. De plus, il s’agit d’une souche ayant un bon taux de réponse dans le modèle activity-based anorexia. C’est un modèle validé au sein du laboratoire et à l’échelle internationale. Les modèles génétiques utilisés dans ce projet sont d’ailleurs construits sur ces mêmes souris. L'anorexie mentale touche majoritairement les adolescents et jeunes adultes avec 75% des patients déclenchant leur pathologie avant l'âge de 22 ans. Pour mimer au mieux les conditions d'apparition de la maladie nous utiliserons donc des souris de 6 semaines à leur arrivée au laboratoire. En tenant compte des deux semaines d'acclimatation, à l'animalerie puis aux conditions expérimentales, le protocole de restriction débutera sur des souris âgées de 8 semaines, ce qui correspond bien à un stade adolescent. La réussite du protocole activity-based anorexia chronique sur des souris de cet âge a d'ailleurs été montrée dans un article. De la même manière, les animaux arriveront à l'âge de 5 semaines pour les protocoles avec antibiothérapie et pour les animaux génétiquement altérés, afin de tenir compte de ces traitements avant de débuter le protocole de restriction à l'âge de 8 semaines.
Effets des ingrédients alimentaires olfactifs sur la physiologie intestinale et le microbiote
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Pour tester un ingrédient alimentaire odorant, 874 souris vont être utilisées, dont 677 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. On leur implante sous la peau une pastille qui libère en continu l'hormone du stress, on les force sept jours durant à éviter l'eau une heure par jour, on leur supprime l'odorat par un traitement, on les prive de nourriture dix-huit heures et on les héberge seules quatre jours. Trois distensions colorectales par souris mesurent la douleur viscérale, avec un risque de perforation du côlon repéré à la présence de sang. Le porteur annonce comme bénéfice de "mettre en évidence les effets bénéfiques des odeurs" sur la physiologie intestinale.
Objectifs
Ce projet visera à tester différents ingrédients olfactifs sur la physiologie intestinale (motricité intestinale, perméabilité intestinale, la distension colorectale et le microbiote) en condition contrôle et pathologique (modèle de stress chronique). Nous allons tester un ingrédient olfactif. Nous avons déjà obtenu des effets bénéfiques au niveau émotionnels de l’ingrédient olfactif. Nous souhaitons par la suite mettre en évidence un dialogue cerveau-intestin par le biais de cette modalité sensorielle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette étude préclinique sont de mettre en évidence les effets bénéfiques des odeurs via l’olfaction sur la physiologie intestinale.
Procédures
Les animaux seront soumis à l’implantation d’un pellet (=pastille qui libère en continu l'hormone du stress) (chirurgie 5minutes, 1 intervention). Ils subiront un stress aigu (stress dû à l’évitement de l’eau; 7 jours pendant 1heure). Ils vont recevoir un traitement (2 administrations), cela va entrainer une perte de l’olfaction. Ils subiront 1 prélèvement sanguin (1 fois sous anesthésie gazeuse). Ils subiront la distension colorectale 3 fois par souris étalé sur 1 semaine afin de regarder la douleur. Les animaux seront aussi soumis à 5 tests comportementaux afin d’étudier l’olfaction, l’anxiété, la résignation. Les souris recevront un seul gavage (10 secondes). Les souris vont subir une mise à jeun de 18heures une fois. Les souris seront en hébergement individuel pendant 4 jours."
Impact sur les animaux
Les effets indésirables peuvent être dus aux chirurgies et / ou au traitement avec la corticostérone et/ou aux tests comportementaux. Ils peuvent se traduire par une altération de l’état général de l’animal : hyperactivité puis isolement et indifférence par rapport au milieu extérieur, diminution du comportement exploratoire, perte de poids. Le modèle de stress n'induit pas de douleur spontanée mais une hypersensibilité viscérale lors de la distension colorectale. La distension colorectale ne cause pas de dommages tissulaires et donc peut être reproduite sur les animaux au cours du temps. Cependant, un effet indésirable suite à la distension peut être une perforation du colon mis en évidence par la présence de sang sur le ballonnet et/ou au niveau anal. Si une présence de sang est décelée en fin de distension, les animaux sont surveillés dans les heures qui suivent ainsi que le lendemain pour vérifier une éventuelle perforation du colon.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de faire dex expériences post-morterm.
Remplacement
L’objectif de cette étude préclinique est de mettre en évidence les effets bénéfiques des odeurs via l’olfaction sur la physiologie intestinale et d’émettre des hypothèses sur le lien cerveau intestin. Il est donc indispensable de travailler sur un modèle animal. Des expériences préliminaires ont été réalisées. Nous avons validé le modèle de stress chronique.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe est réduit au minimum nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante pour les comparaisons intergroupes : 24 animaux seront utilisés pour à la fois faire des études comportementales et pour les études post-mortem. À la suite de l’expérience de motricité, des tissus vont être récupérés afin de compléter les analyses (colons, fèces, liquide de rinçage, structures cérébrales). La technique de mesure de la douleur utilisée ici peut être couplée à l’utilisation d’autres méthodes de suivi clinique non-invasives (suivi de poids, consistance des selles …) ce qui permet d’observer et de suivre au cours du temps un seul animal permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux.
Raffinement
En ce qui concerne la douleur, la souffrance ou l’angoisse, nous avons identifié cinq risques principaux. Les chirurgies liées à l’implantation d’un pellet au niveau sous-cutané afin d’induire un modèle de stress chronique, l’introduction d’un ballonnet afin d’étudier les effets sur la distension colorectale, le prélèvement sanguin, le traitement chronique par l’hormone de stress. Afin de suivre la directive européenne 2010/63/UE, un enrichissement sera rajouté aux animaux. A savoir, des tunnels et des carrés de coton pur ou du papier absorbant permettant aux animaux de faire une nidation. Une étude rétrospective sera effectuée à la fin de chaque expérience pour déterminer les possibilités de diminution du nombre d'animaux et/ou d'amélioration des procédures pour diminuer la souffrance animale. Par exemple nous avons mis en place une période d’habituation des animaux pendant 1h avant chaque manipulation afin de réduire le stress. Durant toute la période d’expérimentation, l’état général des animaux sera observé au minimum une fois par semaine en plus de la surveillance quotidienne réalisée par les zootechniciens. Pour chaque procédure des points limites ont été définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal et l'animal sera euthanasié s’il présente un de ces points limites d’arrêt de la procédure. Les actions de soin prévues par cette grille seront appliquées en accord avec le vétérinaire. Par exemple, pour la douleur, un anti-inflammatoire non stéroidien pourra être administré en intrapéritonéal. De plus, s’il y a une plaie à la suite de bagarres ou aux chirurgies, une pommade cicatrisante pourra y être appliquée. 30 minutes avant la chirurgie, un analgésique sera administré. Enfin en cas de perte de poids, de la nourriture sera déposés dans la cage afin que la nourriture soit plus accessible.
Choix des espèces
Le modèle de corticostérone (CORT, hormone de stress) chronique est bien validé chez la souris. Il permet de reproduire un certain nombre des symptômes dépressif observés chez l'homme et répond aux antidépresseurs utilisés en clinique. Il s’agit d’un modèle de stress chez l’adulte. Les expériences débuteront sur des animaux de 10 semaines.
Evaluation d’un candidat médicament sur la physiopathologie de la drépanocytose dans le modèle murin Townes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Génétiquement modifiées pour porter l'hémoglobine drépanocytaire, 1 608 souris Townes vivent avec une anémie, des globules rouges de très courte durée de vie et une nécrose du foie. Elles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger pour 492 d'entre elles et sévère pour 1 116. Le protocole prévoit un gavage quotidien pendant plusieurs dizaines de jours ou plusieurs mois, des injections intrapéritonéales quotidiennes alternées, une injection dans le sinus de l'œil et des prélèvements sanguins répétés, le porteur indiquant que le stress de ces manipulations peut déclencher des crises vaso-occlusives et la mort de certains animaux. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever le sérum, les érythrocytes et les organes, dans une étude demandée par un partenaire industriel.
Objectifs
La drépanocytose ou anémie falciforme est une maladie autosomique récessive. L'espérance de vie des patients atteints de cette maladie génétique est fortement réduite. Cette maladie génétique la plus fréquente en france est due à une substitution d'une glutamine par une valine à la sixième position du gène codant pour la béta-globine. L'expression de ce gène chez les individus homozygotes donne une hémoglobine anormale (HbS) qui dans certaines conditions (température, stress, hypoxie, deshydratation) favorise la formation de globules rouges de forme allongées en faucille induisant des phénomènes vaso-occlusifs, une anémie et des prédispositions aux infections bactériennes. A la demande d'un partenaire industriel, l'objectif de ce projet est de compléter une étude partielle réalisée dans d'autres laboratoires sur la pharmacocinétique et la pharmacodynamique d'un candidat médicament de la drépanocytose très prometteur en utilisant un modèle murin in vivo spécifique de la drépanocytose (souris Townes homozygote pour HbS). Ces animaux présentent une anémie, une demi-vie des érythrocytes très courte et expriment un phénotype commun à la maladie humaine (augmentation des leucocytes, nécrose hépatique avec des infiltrats de neutrophiles et de macrophages, augmentation de l'érythropoïèse, splénomégalie, légère glomérulopathie). Ce projet est composé de 10 procédures qui complètent des travaux réalisés dans différents laboratoires relatifs à l'activité d'un candidat médicament sur la physiopathologie de la drépanocytose dans le modèle murin Townes. Ce projet comparera également l'effet de notre composé avec des molécules déjà commercialisées.
Bénéfices attendus
Nous attendons une amélioration de l'espérance de vie des animaux et une caractérisation de la cinétique et de la dynamique de la molécule utilisée. Celle- ci devrait pouvoir être proposée à des patients qui expriment des formes sévères de la maladie.
Procédures
Des animaux pourront être soumis à des prélèvements de sang qui respecteront la volémie grâce au volume et à la fréquence. Des animaux pourront êtres soumis à un gavage quotidien pendant plusieurs dizaines de jours ou plusieurs mois selon la procédure. Des animaux pourront subir une injection intra-péritonéale quotidienne alternativement gauche et droite pendant plusieurs dizaines de jours. Des animaux subiront une injection intra-veineuse d'un marqueur spécifique des glogules rouges (sinus retro-orbital, volume 50µl). Chacune de ces interventions dure au maximum 2 minutes ( contention de l'animal et exécution du geste technique). Un stress pourra être induit pendant la réalisation de ces gestes techniques et au cours de la pesée des animaux toutes les 2 semaines (durée 1 minute).
Impact sur les animaux
Concernant la molécule utilisée dans ce projet, les études toxicologiques n'ont pas démontré une activité toxique à la dose utilisée. Toutefois nous attendons l'expression de symptômes de la drépanocytose (anémie, inflammation, phénomènes vaso-occlusifs) sous l'effet d'un stress au cours de la manipulation des animaux qui expriment un génotype drépanocytaire. Des crises peuvent conduire au décès d'animaux. Toutefois nous attendons une amélioration chez les individus traités.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélever et étudier le sérum, les érythrocytes et les organes.
Remplacement
Cette maladie a des conséquences sur tous les organes vitaux (foie, coeur, rein, poumons, rate, cerveau) et comme il n'existe pas de modèle capable de mimer les relations complexes entre ces organes, un organisme entier vivant est incontournable.
Réduction
Les effectifs ont été calculés au plus juste en utilisant des animaux des deux sexes puisque cette maladie est autosomique. En tenant compte d'une possible mortalité d'animaux et de la puissance de 0,8 de nos tests statistiques, nous avons déterminé des groupes de 4 à 8 individus de chaque sexe.
Raffinement
Les conditions d'hébergement et de manipulation des animaux ne doivent pas exacerber les symptômes de la drépanocytose. Les animaux seront manipulés le plus souvent par cup handling ou par tubing. L'enrichissement par des buchettes à grignoter et du matériel de nidification sera présent. Les animaux seront observés pour la détermination du score sans les manipuler. Des points limites ont été établis et l'administration d'analgésique sera envisagée si le score est atteint. L'anesthésie gazeuse (vetflurane) sera utilisée au cours des prélèvements de sang.
Choix des espèces
L'espèce murine a été choisie puisque plus de 90% des gènes humains ont un orthologue direct chez la souris. Cette espèce animale est facilement et rapidement reproductible. Le modèle murin est modifiable génétiquement pour lui donner des caractéristiques humaines. De nombreux réactifs ainsi que des techniques variées sont disponibles pour réaliser les études biologiques. Les animaux choisis sont des animaux génétiquement modifiés (gènes de la globine alpha et beta) qui démontrent une grande homologie de symptômes avec ceux observés chez l'homme atteint de drépanocytose. Nous utiliserons des animaux âgés de 3-4 semaines et des animaux âgés de 6-8 semaines pour nous permettre d'étudier les stades précoces (adolescence) et tardifs de la maladie (adulte).
Etude des symptômes de douleur dans des maladies neurodégénératives
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes les souris passent d'abord des tests comportementaux, un tous les deux jours pendant quinze jours, de cinq à trente minutes, pour mesurer leurs seuils de douleur. Une partie est ensuite opérée du cerveau, trente minutes pour installer le modèle parkinsonien, quarante pour enregistrer l'activité des neurones, trente pour colorer les circuits. 2 205 souris sont concernées, dans des procédures allant du léger au sévère et dont 446 relèvent du niveau sévère, avec une perte de poids attendue chez les parkinsoniennes et des défauts de mémoire à partir de huit mois chez les souris Alzheimer. Toutes sont tuées à la fin pour analyse des tissus.
Objectifs
Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, le vieillissement de la population s’accélère partout à travers le monde. Combiné à l'allongement de l'espérance de vie, il en découle une augmentation des problèmes de santé liées au vieillissement, notamment les douleurs chroniques. En effet, la prévalence de la douleur chronique augmente avec l’âge. Elle passe de 6 pourcents chez l’enfant à 19 pourcents au sein de la population adulte, et dépasse les 30 pourcents après 65 ans pouvant aller jusqu’à 75 pourcents dans la maladie d’Alzheimer et de 86 pourcents dans la maladie de Parkinson. Ces symptômes de douleurs sont donc fortement accentués lors du vieillissement pathologique. Ils aggravent les symptômes de ces pathologies et de ce fait, impactent négativement la qualité de vie des patients, représentant un problème sociétal majeur. L’objectif de ce projet est d’étudier les réseaux cérébraux de la douleur dans des modèles animaux de la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson afin de mieux de comprendre les mécanismes du développement des douleurs chroniques favorisant l’identification de stratégies thérapeutiques efficaces.
Bénéfices attendus
La maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer se caractérisent par de nombreux symptômes incluant des douleurs chroniques qui ont un fort impact sur la qualité de vie des patients, entre autre, en aggravant les autres symptômes connus dans ces pathologies. Nous cherchons à comprendre certains mécanismes dans le cerveau qui induisent le développement de ces douleurs chroniques car ce n’est pas connu à l’heure actuelle. Comprendre les mécanismes de développement de ces symptômes est une première étape essentielle pour pouvoir ensuite développer des stratégies thérapeutiques ciblées et efficaces. Ces travaux auront également pour bénéfice de mettre en lumière l’existence de ces symptômes, encore peu reconnus lors de la prise en charge clinique de ces pathologies, en particulier chez les patients Alzheimer.
Procédures
1) L’ensemble des souris participeront à des tests comportementaux, pour évaluer leurs capacités sensorielles pouvant être impactées par les modèles pathologiques (un test tous les deux jours pendant 15 jours, durée 5 à 30 minutes). 2) La mise en place du modèle de souris parkinsoniennes se fait par chirurgie du cerveau (1 chirurgie de 30 minutes incluant l'anesthésie). 3) Sur une partie des souris, l'activité des neurones du cerveau sera évaluée nécessitant une chirurgie du cerveau (1 chirurgie de 40 minutes incluant l'anesthésie). 4) Sur une partie des souris, l'étude permettant de colorer les neurones pour mieux connaitre leur organisation nécessite une chirurgie du cerveau (1 chirurgie de 30 minutes incluant l'anesthésie).
Impact sur les animaux
- L’ensemble des souris participera à des tests comportementaux qui peuvent induire un stress léger lors du déplacement des animaux vers les salles expérimentales et induire une douleur légère lors de l’évaluation des seuils de douleur des souris. - La mise en place du modèle de souris parkinsoniennes se fait par chirurgie du cerveau pouvant induire un stress modéré lors du déplacement des souris vers la salle chirurgicale, lors de l’anesthésie et du réveil post-chirurgical. - Le modèle de souris parkinsoniennes implique la mise en place d’un état pathologique chez le rongeur induisant une perte de poids. - Le modèle de souris Alzheimer présente des défauts de mémorisation à partir de l’âge de 8 mois. - Les deux évaluations mesurant l'activité des neurones du cerveau peuvent induire un stress léger lors du déplacement des animaux vers les salles expérimentales.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour analyse des tissues.
Remplacement
Il n'existe aucune alternative expérimentale nous permettant d'éviter l'utilisation d'animaux vivants pour évaluer les transmissions de signaux naturels dans le cerveau tels que dans ce projet. Les études comportementales prévues ne peuvent se faire que sur des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe de manière à le réduire au maximum tout en garantissant la validité statistique des résultats, et sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre a été estimé par des expériences antérieures ayant permis d’obtenir un nombre de données sur chaque animal suffisant pour réaliser les analyses statistiques prévues. Les souris seront testées individuellement (une souris par jour) et les résultats analysés rapidement suite au test. Si les résultats obtenus permettent de conclure nos hypothèses, l’ensemble des animaux prévu ne sera pas utilisé.
Raffinement
1) Les souris auront une semaine d'habituation à la salle où elles sont hébergées avant de commencer les expériences. 2) Les souris seront habituées à la nouvelle pièce expérimentale une heure avant la réalisation des tests évaluant le comportement des souris et ceux permettant l'étude de l'activité des neurones afin de réduire le stress léger lié aux changement d’environnement. 3) Les tests comportementaux mesurant les seuils de douleur des animaux seront arrêtés dès les premiers signes de gênes de la souris. 4) les chirurgies sur le cerveau seront effectuées sous anesthésie générale avec une double couverture anti-douleur (générale et locale). 5) Un soin spécial (hydratation et nourriture enrichie) est mis en place pour limiter l'impact du modèle parkinsonien sur la perte de poids des souris. 6) les souris Alzheimer présentent des problèmes de mémoires à partir de l'âge de 8 mois et un vieillissement précoce à partir de l'âge de 12 mois. Les souris utilisées dans ce projet ne seront pas testées après l'âge de 8 mois pour minimiser l'impact de la pathologie sur leur bien être. 7) une échelle de cotation basée sur des signes indicatifs de gêne ou de douleur sera utilisée afin d'évaluer l'état général de chaque animal et de définir le point limite, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l'animal.
Choix des espèces
Le modèle souris permet d’avoir accès à des modèles génétiquements modifiés mimant certaines pathologies humaines. Dans le cas des souris Alzheimer, le modèle génétiquement modifié de ce projet exprime des mutations génétiques connues chez l'humain impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie. De plus, les parties du cerveau impliquées dans la mémoire sont les mêmes chez la souris et chez l'homme. Le modèle de souris parkinsoniennes est également justifié par des similarités des parties du cerveau impactées dans la maladie de Parkinson. Nous utiliserons des souris adultes de 3, 6 et 8 mois pour évaluer l’impact du développement de la pathologie sur la sensibilité à la douleur et le fonctionnement des parties du cerveau impliquées dans la réduction de la sensation de la douleur chez les souris Alzheimer et parkinsoniennes.
Implication des macrophages perivasculaires dans la neuroinflammation
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Paralysées des membres postérieurs par l'induction d'un modèle de sclérose en plaques, 400 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour analyse au microscope. L'induction dure deux minutes, l'injection de liposomes dans le liquide céphalorachidien trente minutes, l'imagerie cérébrale une heure, chaque intervention étant faite une fois par animal. Le porteur signale des signes de douleur dans les heures qui suivent la chirurgie et une douleur modérée à la pose du cathéter dans la veine de la queue. La paralysie, seule atteinte sévère décrite, ne s'accompagne d'aucune indication de durée, de degré ni de seuil de mise à mort, le résumé renvoyant à des points limites fixés au préalable et à une grille de grimaces.
Objectifs
La souris est l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l'inflammation cérébrale. La communauté scientifique dispose pour ces études d’un modèle animal utilisé sur la souris et reproduisant les carractéristiques de la l'inflammation cérébrale. Au cours de cette étude, nous étudierons l'implication d'un sous type de céllules immunitaires résident du cerveau et de la moelle épinière dans l'apparition et l'évolution de l'inflammation, et particulièrement dans l'inflammation des vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
La neuroinflamamtion est présente dans de nombreuse pathologies cérébrales, comme la sclérose en plaques, les accidents vasculaires cérébraux et la maladie d'Alzheimer. Une meilleure comprehension de l'implication des macrophages perivasculaires dans la neuroinflammation permettrait une meilleure prise en charge des patients atteints de ces différentes maladies.
Procédures
Les animaux seront soumis à trois types d'interventions: (1) Induction d'un modèle de sclérose en plaques. Durée : 2 minutes par animal. (2) Injection de liposomes dans le liquide cérébral. Durée : 30 minutes par animal. (3) Imagerie de l'inflammation cérébrale. Durée : 1 heure par animal. Chaque intervention est réalisée une fois par animal.
Impact sur les animaux
Le modèle de sclérose en plaques utilisé provoque une paralysie des membres postérieurs des animaux. Ces derniers peuvent également présenter des signes de douleur dans les heures suivant la chirurgie nécessaire à l'injection dans la citerne cérébrale. De plus, l'injection intraveineuse de traceur IRM requiert la pose d'un cathéter sur la veine caudale, ce qui peut occasionner une douleur considérée comme modérée.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort afin de réaliser des analyses de microscopie.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. En effet, la souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans la neuroinflammation, grâce à différents modèles bien caractérisés comme l’EAE utilisée dans ce projet. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables de la neuroinflammation rencontrée chez les patients. Enfin, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’homme.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. L’utilisation d’outils d’imagerie non invasive (comme l'IRM et l'IPM) permettent de réduire significativement le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles. Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera à volonté. Une importance particulière sera apportée au bienêtre des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les souris seront pesées et acclimatées pendant une heure dans la pièce expérimentale. Un suivi strict et rapproché des animaux, une évaluation de la douleur basée sur le grimace scale, une couverture analgésique suffisante en période pré et post induction et un accès facilité à la nourriture seront mis en place. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences vasculaires. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires desvaisseaux cérébraux sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier l'implication des macrophages perivasculaires dans les modèles de neuroinflamamtion. Le stade de développement des animaux est de 2 à 3 mois. Il est classiquement décrit que le modèle d’EAE est plus efficace dans cette fenêtre de temps, qui correspond à la pathologie humaine qui touche de jeunes adultes.
Intérêt thérapeutique du ciblage du récepteur au glutamate mGlu4 dans le syndrome dépressif chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées pour prélever leurs tissus, 2 068 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, 1 244 relevant du niveau sévère. Le porteur décrit un modèle de défaite sociale qui les isole puis les soumet dix jours durant à des agressions physiques répétées, avec une douleur physique brève, une détresse psychique et un stress qui persiste trois à quatre semaines. Six tests comportementaux de dix minutes suivent, dont une suspension par la queue, et une partie des souris reçoit quatorze jours d'injections intrapéritonéales. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ne convient, l'étude reposant sur l'observation d'un animal "exprimant toute la variété de son répertoire comportemental".
Objectifs
Les troubles dépressifs sont une cause majeure d'invalidité dans le monde. Cependant, les médicaments antidépresseurs ne fonctionnent pas bien pour un grand nombre de patients, environ 65 %. Il est donc très important de trouver de nouvelles cibles pour créer des médicaments qui puissent mieux aider les personnes souffrant de dépression. Parmi ces nouvelles cibles, nous avons identifié une cible qui semble prometteuse. Elle a la capacité de calmer l'activité de certains neurones qui sont trop actifs dans la dépression. Les objectifs de notre projet sont simples : comprendre comment ce récepteur est lié à la dépression causée par des expériences sociales difficiles, et étudier comment fonctionne la balance chimique dans le cerveau lorsqu'une personne est déprimée.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints de troubles dépressifs demande la création de stratégies thérapeutiques novatrices. Le projet que nous proposons aura pour but : (1) d'améliorer notre compréhension des mécanismes neurologiques des troubles dépressifs à travers un modèle préclinique de la maladie, (2) d'étudier le rôle d’un récepteur du cerveau dans le développement des troubles dépressifs, et (3) de proposer de nouvelles solutions thérapeutiques pour soulager ces troubles.
Procédures
Des animaux seront isolés et exposés au stress de la défaite sociale pendant 10 jours. Les réponses comportementales des animaux seront évaluées dans six tests, chaque test d'une durée de 10 minutes. Des animaux seront soumis à un traitement pharmacologique par injection intrapéritonéale pendant 14 jours. L'injection nécessite une contention légère de la souris et ne dure que quelques secondes.
Impact sur les animaux
Le modèle de défaite sociale, qui repose sur des agressions physiques répétées, provoquera une douleur physique de très courte durée, sauf en cas de blessure, qui sera gérée par les expérimentateurs. Il engendrera également une détresse psychique et un état de stress aigu pendant la procédure, devenant persistant après les répétitions (l'impact comportemental observé dans la littérature persiste jusqu'à 3-4 semaines). Ce contexte entraîne des phénotypes anxio-dépressifs chez les souris exposées au modèle. Certains animaux des procédures expérimentales seront soumis à des injections chroniques (pendant 14 jours) de composés par voie intrapéritonéale. Lors des tests de la suspension codale, certains animaux pourraient ressentir une légère douleur due au poids de la souris sur la queue. De plus, certains animaux seront hébergés de manière isolée.
Devenir
Les animaux seront mis a mort dans le but de prélever des tissus pour des expériences ex-vivo
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est actuellement disponible pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, en tant que modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.
Réduction
Nous utilisons des outils statistiques adéquats pour calculer précisément le nombre d'animaux nécessaire pour réaliser les expériences.
Raffinement
Nous prendrons en charge l’ensemble des contraintes que subissent les animaux au cours des expériences. Concernant l’hébergement, nous mettrons à disposition des animaux le matériel nécessaire pour faire un nid (ouate et cabane en carton) et en manipulant quotidiennement les animaux par le même expérimentateur. Comme la dépression est une pathologie qui touche aussi bien les hommes que les femmes, nous utiliserons des animaux des deux sexes. Pendant les expériences, nous suivrons quotidiennement le bien-être de nos animaux, en particulier leur poids, leur posture et leur point d’injection. Nous mettrons en place des points limites adaptés afin d’éviter de faire souffrir inutilement les animaux. Nous testerons chaque animal dans différentes tâches comportementales et nous utiliserons les tests statistiques adéquats pour analyser nos résultats.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux modèle, pour étudier la dépression. Par ailleurs, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie dépressive. Les déficits comportementaux détectés chez les souris sont suffisamment importants et robustes pour tester la validité de l'aspect du modèle et, le cas échéant, permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les déficits comportementaux sont fixés
Etude de la discrimination des perceptions dans un modèle de Schizophrénie chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2 312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant passer jusqu'à trois mois en restriction hydrique cinq jours par semaine et deux heures par jour en contention. Les procédures vont du niveau léger au niveau sévère, que subissent 440 d'entre elles. S'y ajoutent une biopsie de la queue, une chirurgie stéréotaxique de trois heures pour injecter et implanter dans le cerveau, six à vingt-et-une injections intrapéritonéales, jusqu'à neuf anesthésies gazeuses et trois tests nommés, exploration, anxiété et attention, ce dernier de 45 minutes. Le porteur annonce l'identification de "cibles thérapeutiques nouvelles et précises" pour les troubles neuropsychiatriques, quand la soif et la perte de poids provoquées par la restriction en eau sont, elles, décrites au présent.
Objectifs
Percevoir avec précision la réalité extérieure est essentiel à notre survie. En particulier, les modifications de la perception sont une des caractéristiques majeures de la plupart des troubles neuropsychiatriques et neurodéveloppementaux, eux-mêmes source de souffrance et d’exclusion sociale. Bien qu'elles soient fondamentales, les bases biologiques d'une perception précise ou altérée sont très peu comprises. Dans cette étude, nous allons étudier le rôle du cerveau dans la perception. Nous évaluerons les mécanismes qui conduisent au fonctionnement et au dysfonctionnement des neurones, grâce à l'utilisation d'un modèle de souris à haut risque de troubles neuropsychiatriques. Cette recherche fera progresser nos connaissances limitées sur la façon dont les troubles neurodéveloppementaux modifient les circuits neuronaux sensoriels et affectent ainsi la perception. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de cmprendre l’implication du cerveau dans la mémoire sensorielle chez la souris, modèle bien adapté pour mimer la physiologie et certains aspects de la pathologie humaine. L’utilisation de modèles murins transgéniques appropriés apportera des données au niveau cellulaire, anatomique et fonctionnel en identifiant les structures cérébrales mises en jeu. Mieux comprendre ces structures permettra d’appréhender les processus de mémorisation et de perception, mais aussi une meilleure compréhension des maladies psychiatriques dans lesquelles ils sont altérés. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.
Procédures
Biopsie de queue: 1 fois de moins d'une seconde. Injection sous-cutanée : 3 fois pour la chirurgie stéréotaxique, durée 5 secondes. Chirurgie pour injection stéréotaxique intracérébrale et implantation, 1 fois d'environ 3 heures. Etudes du comportement, 1 fois chacun: d’exploration (10 minutes), d’anxiété (10 minutes) et d’attention (45 minutes), répartis sur 2 à 3 jours. Regime hydrique: 5 jours/semaine, de 2 semaines à 3 mois. Contention pendent comportement de perception: 1 fois/jour d'environ 2 h, pour 5 jours pendent 2 semaines à 3 mois. Injection intra-péritonéale: 6-21 injections, durée 5 secondes, 1 fois/jour. Anesthesie gaseouse légér avec reveil: 5-9 fois de 15-45 minutes, 1 foi/jour.
Impact sur les animaux
La biopsie de queue peut entraîner une douleur légère de courte durée. L’anesthésie peut entraîner un stress léger de courte durée. Les injections intrapéritonéales d’anesthésiques et d’analgésiques peuvent entraîner un stress léger de courte durée. Une douleur modérée peut être associée à l’acte chirurgical. Les taches comportementales peuvent entraîner un stress modéré. Le régime de restriction hydrique entraine de la soif et une perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort: 1) pour prélever le cerveau en vue d'études physio-histologiques sur les souris expérimentales; 2) à la fin de la période de reproduction chez les souris utilisées pour les croisements.
Remplacement
Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales complexes (cognition) sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.
Réduction
Des analyses a priori de puissance statistique permettent de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire. D'autres tests statistiques a posteriori choisis en fonction des distributions des populations nous permetent de comparer les moyennes et identifier des différences deux à deux entre groupes expérimentaux et génotypes. Les tests statistiques permettent également de trouver des corrélations entre les variables étudiées.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux de plusieurs animaux afin d'éviter tout stress produit par un isolement social, dans un environnement avec matériel pour faire un nid. L’état de sante des animaux et leur accès à l’eau et nourriture sont surveillés quotidiennement. La chirurgie et le post-opératoire se déroulent dans des conditions qui protègent la santé de l'animal, en lui protégeant de l’hypothermie grâce à un tapis chauffant et de la déshydratation avec une du serum physiologique. Des analgésiques sont utilisés avant et après la chirurgie, et sur les jours suivants. A la fin de la chirurgie, après le réveil complet, l'animal est replacé dans sa cage collective avec de la nourriture et de l'eau ad libitum. Les animaux sont habitués à leur manipulation afin de réduire leur stress.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour l'exploration du comportement car les régulations cellulaires mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. De plus, les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris et nous permettent de réaliser des études phénotypiques comparatives pour caractériser les voies cellulaires ou mimer certains aspects de pathologies humaines. Pour les expériences, nous utiliserons des souris adolescentes et adultes entre 5 semaines et 8 mois car c'est au cours du jeune âge adulte que la plupart des altérations de la perception sensorielle apparaissent dans les troubles neurodéveloppementaux.
Etude de la thérapie combinée incluant l’immunothérapie et un traitement ciblant une protéine des jonctions serrées dans un modèle basé sur l’expression de différents oncogènes pour le traitement des cancers du foie.
- Recherche appliquée
- Cancers
760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection hydrodynamique qui déclenche des tumeurs du foie, puis un traitement par anticorps trois fois par semaine pendant au moins quatre semaines, une échographie hebdomadaire sous anesthésie et un prélèvement de sang terminal. L'objet déclaré est de vérifier qu'un anticorps mis au point par l'équipe améliore l'effet des immunothérapies contre le cancer du foie. Cet anticorps a déjà passé les tests de toxicité et est entré en essai clinique chez l'être humain pour d'autres maladies du foie, ce qui n'empêche pas 760 souris de développer des tumeurs hépatiques en souffrance sévère pour en tester la combinaison.
Objectifs
Le cancer du foie qui est le 3ème cancer le plus meurtrier dans le monde. Le traitement de référence des formes graves fait appel à des anticorps ciblant le système immunitaire, mais seul un faible pourcentage de patients répond à ces traitements. Il y a donc urgence à améliorer les thérapies actuelles. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie dans un modèle de souris ne présentant pas de système immunitaire. Nous avons également montré que le traitement de cellules issues de patients par notre anticorps permet d’activer les cellules immunitaires. Ceci suggère que notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité des thérapies existantes ciblant le système immunitaire pour le traitement du cancer du foie. L’objectif de notre projet est tout d’abord de valider nos résultats précédents en confirmant la capacité de notre anticorps à inhiber la progression tumorale dans des souris présentant un système immunitaire fonctionnel, mais également d’évaluer l’efficacité de notre anticorps en combinaison avec des anticorps ciblant le système immunitaire.
Bénéfices attendus
Le cancer du foie est un cancer pour lequel le nombre de cas est en augmentation constante partout dans le monde, et les traitements actuels ne permettent de soigner qu’un faible pourcentage de malades. Notre projet est une étape vers la mise en place de nouveaux traitements. Nous pensons que notre anticorps peut améliorer l’efficacité des thérapies actuelles qui ciblent le système immunitaire et ainsi la prise en charge des malades dans le futur. Cet anticorps a d’ailleurs déjà passé les tests de toxicité avec succès et est récemment entré en essai clinique pour le traitement d’autres pathologie du foie.
Procédures
Dans le cadre des traitements, tous les animaux de ce projet recevront un traitement par anticorps trois fois par semaine au moins pendant 4 semaines, d'une durée inférieure à une minute. Par la suite, une fois par semaine, les animaux seront anesthésiés pour réaliser une mesure par échographie, qui prendra moins de 5 minutes par animal. Enfin, un prélèvement de sang terminal sera réalisé sur des animaux anesthésiés, cette procédure durant environ 1 minute.
Impact sur les animaux
La procédure « injection hydrodynamique » peut entrainer du stress et peut-être de la douleur à court terme mais l’animal récupère en général rapidement (5 à 10 minutes) et complètement au bout d’une heure. Notre modèle induit des tumeurs dans le foie, qui peuvent entrainer une gêne et des douleurs au cas où la tumeur dépasse une certaine taille. De même, les injections répétées peuvent parfois engendrer de l’inflammation, une douleur ou très rarement une ulcération au niveau des sites d’injection.
Devenir
Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (tumeurs, foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain.
Réduction
Afin de réduire la quantité de groupes d’étude, nous prévoyons d’adopter une démarche pas-à-pas, en améliorant au fur et à mesure les conditions d’étude de notre anticorps. Les tailles d’effectifs ont été déterminées à priori grâce à un logiciel dédié afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont. L’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger. Les animaux seront maintenus en groupe. Des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Les procédures invasives ou stressantes sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimation de 7 jours, les souris seront laissées 2-3 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections répétées
Choix des espèces
Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme notamment du point de vue immunologique. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques ciblant le système immunitaire actuellement prescrites chez l’homme. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 6 à 8 semaines afin qu’ils présentent un système immunitaire mature
Impact de la neuroinflammation et des lymphocytes T résidents mémoires dans les perturbations cognitives associées au vieillissement
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Une injection de 200 tachyzoïtes de Toxoplasma gondii dans l'abdomen, une incision de la veine de la queue au scalpel, puis jusqu'à quarante administrations orales ou dix injections intrapéritonéales étalées sur un mois. 1 392 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 528 d'entre elles et sévère pour 864. Entre le septième et le quinzième jour, elles peuvent perdre jusqu'à 20 % de leur poids et présenter une forte prostration, et certaines passent jusqu'à trois semaines isolées en cage individuelle pour le labyrinthe de Barnes, sans qu'aucun analgésique soit prévu, au motif qu'il interférerait avec l'inflammation étudiée. Les retombées annoncées se limitent à de possibles pistes pour la prise en charge des troubles cognitifs liés au parasite, formulées au conditionnel.
Objectifs
L’inflammation du cerveau, ou ‘neuroinflammation’, peut perturber le fonctionnement des neurones. La neuroinflammation peut apparaître au cours du vieillissement naturel ou lors de pathologies associées au vieillissement telles que la maladie d’Alzheimer (MA). Cette neuroinflammation peut aussi être causée par des infections du cerveau, telles que celle causée par le parasite Toxoplasma gondii (T. gondii). Parmi les cellules immunitaires s'accumulant dans le cerveau au cours de la neuroinflammation, on trouve une catégorie de lymphocytes T appelés résidents mémoire. Les lymphocytes T résidents mémoire du cerveau participent à la surveillance immunitaire contre les agents infectieux (e.g. T. gondii), mais ils pourraient aussi jouer un rôle néfaste. En effet, ces cellules sont impliquées dans des maladies inflammatoires et / ou dégénératives du cerveau, telles que la sclérose en plaques et la MA. A l’aide d’un modèle murin de MA, nous avons observé que l’infection chronique par T. gondii précipite le déclin cognitif et s’accompagne d’une accumulation de lymphocytes T résidents mémoire dans l’hippocampe, une zone cérébrale impliquée dans la mémorisation. Même au cours du vieillissement naturel, les lymphocytes T résidents mémoire peuvent s’accumuler dans le cerveau, suggérant une possible contribution de ces cellules dans le déclin mnésique naturel lié à l’âge. Les mécanismes effecteurs par lesquels les lymphocytes T résidents mémoire altèrent les fonctions cognitives restent non élucidés. Notre projet vise à étudier la contribution de ces sous-populations de lymphocytes et de leurs mécanismes d'action, dans le déclin cognitif naturel associé au vieillissement naturel et au vieillissement accéléré (MA) par l’infection par T. gondii.
Bénéfices attendus
T. gondii est un parasite intracellulaire très répandu, auquel environ 1/3 des humains ont été exposés. Des réponses immunitaires se développent suite à l’infection mais elles ne permettent pas d’éliminer le parasite, qui persiste ensuite de manière latente dans les muscles, la rétine et le cerveau, sous forme de kystes intra-neuronaux contenant des bradyzoïtes. Parmi les 2 milliards d’êtres humains exposés à T. gondii, il est estimé que ~2/3 sont porteurs de kystes parasitaires cérébraux. A ce jour, ces kystes ne peuvent pas être éliminés pharmacologiquement. Ainsi, un grand nombre d’individus immunodéprimés (e.g. porteurs du VIH ou subissant un traitement immunosuppresseur) sont à risque de développer une encéphalite, et les individus immunocompétents infectés sont à risque de développer des troubles cognitifs et/ou de subir une accélération du cours de la MA. Les résultats de ce projet pourraient suggérer de nouvelles pistes pour améliorer la prise en charge des troubles neurocognitifs associés à l’infection par T. gondii.
Procédures
Animaux âgés traités avec des des inhibiteurs de perforine ou granzyme B (traitement anti-cytotoxicité) : - 10 injections intra-péritonéales (pendant 5 sec) tous les 3 jours pendant 1 mois. - ou bien 3 injections intra-veineuses dans la veine caudale à 2 semaines d’intervalle (pendant 10 sec) // Animaux infectés traités avec des inhibiteurs de perforine ou granzyme B (traitement anti-cytotoxicité) dans les modèles de MA : - 1 injection intra-péritonéale de 200 tachyzoïtes (5 sec) puis prélèvement de sang, obtenu via une légère incision à la veine caudale réalisée avec une lame de scalpel, une fois (après application de crème anesthésiante), puis - soit 10 injections intra-péritonéales à raison d’une injection de 5 sec tous les 3 jours pendant 1 mois ; - soit 3 injections intra-veineuses de 10 sec dans la veine caudale à 2 semaines d’intervalle // Animaux infectés traités avec des inhibiteurs du complexe PRC (traitement anti-kystes) dans les modèles de MA : - 1 injection intra-péritonéale de 200 tachyzoïtes (5 sec) puis prélèvement de sang, obtenu via une légère incision à la veine caudale réalisée avec une lame de scalpel une fois (après application de crème anesthésiante) puis - soit 40 injections per os (en 10 sec), à raison de 2 aministrations par jour, 5 jours par semaine pendant 4 semaines ; - soit 8 injections intra-péritonéales de 5 sec, à raison de 2 fois par semaine pendant 4 semaines. // Tests comportementaux effectués 1 x selon le chronogramme suivant : J1 : Labyrinthe en croix surélevé sur 10 min, J2 : Test de localisation d’objet sur 10 min, J3 : Test de reconnaissance de nouvel objet sur 10 min, J4 : Placement en cage individuelle, J9-J14 : essais d’apprentissage au labyrinthe de Barnes (3 ou 4 essais / jour pendant 5 jours), J15 et J17 : tests de rappel de mémoire à 24h et 72h post-apprentissage, J17 : remise des souris en groupe, J20 : euthanasie pour analyses ex vivo
Impact sur les animaux
La phase aigue de l'infection par T. gondii est symptomatique entre J7 et J15 (phase aigue) chez la souris. Pendant cette phase, les animaux peuvent perdre jusqu’à 20% de leur poids initial et présenter une forte prostration. Ensuite, les souris récupèrent et entrent en phase chronique qui, dans les modèles d’infection latente que nous utilisons, est cliniquement asymptomatique (à l’exception de déficits mnésiques). Les symptomes d’ataxie/syndrome vestibulaire (i.e. tête ‘désaxée’, mouvements circulaires récurrents) ne sont observés que dans des modèles d’encéphalite toxoplasmique, pas dans notre modèle d’infection latente. Les traitements inhibiteurs de la cytotoxicité pouvant altérer la surveillance immunitaire du parasite dans le cerveau, il est possible que nous observions une dégradation de l’état général des souris, causée par une réactivation du parasite, suite à l’administration de ces inhibiteurs. Dans ce cas, nous prendrons les décisions sur la base du tableau de scoring, tel que définies dans la procédure. Les souris subiront des injections intrapéritonéales (ip) ou intra-veineuses (iv). Ces manipulations sont susceptibles d’induire un stress, une angoisse, un inconfort et/ou une douleur de faible intensité et transitoire (secondes). L’isolement dans une cage individuelle (uniquement pendant la période de mesures sur le labyrinthe du Barnes) pourrait entraîner des changements, imputables au stress, dans la physiologie et le comportement des animaux. Cette période d'isolement sera limitée à 3 semaines maximum, et l'enrichissement des cages sera renforcé pour limiter le stress lié à la privation des aspects sociaux.
Devenir
Tous les animaux dans chaque procédure expérimentale seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses ex vivo.
Remplacement
Au lieu d'être propagé in vivo dans des souris comme c'était le cas auparavant, nous cultivons désormais les tachyzoïtes de Toxoplasma gondii sur des fibroblastes humains in vitro, ce qui contribue à l’objectif de remplacement. En revanche, des infections expérimentales in vivo restent indispensables pour appréhender les interactions entre systèmes nerveux (ex. neurones infectés) et immunitaire (ex. lymphocytes T), les mécanismes par lesquels le parasite T. gondii modifie ces interactions, ainsi que la pertinence des traitements envisagés. La complexité des systèmes immunitaire et nerveux, et du tissu cérébral, autant dans sa composition cellulaire que son architecture, font qu’il est à ce jour impossible de simuler (sous forme de modélisation informatique ou d’expériences in vitro) la ‘connectique’ de toutes les populations cellulaires mises en jeu. Par conséquent, il est actuellement impossible de répondre aux objectifs proposés dans ce projet par des méthodes excluant totalement l’utilisation du modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé a priori en respectant les critères pour une analyse statistique appropriée. Les rongeurs utilisés sont consanguins, de mêmes âge et sexe, réduisant la variabilité entre les animaux et donc le nombre nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Basé sur nos précédentes études portant sur des modèles animaux similaires et sur la variabilité inter-individuelle, des lots de 8 animaux (groupes-tests vs. contrôles) sont nécessaires pour assurer la fiabilité de nos résultats, chaque expérience devant être répétée 3 fois. Le nombre d’animaux prévus correspond au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Ceci garantira la valeur statistique de l'étude en intégrant les variations inter-expérimentales et les variations inter-individus.
Raffinement
Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale. Nous prendrons ceci en compte grâce au suivi rapproché et quotidien des animaux par le personnel de la zootechnie qui évaluera leur état général (toilettage, mouvements), s’assurera de l’enrichissement de leur environnement et du respect de l’aspect social du groupe (isolement limité à 3 semaines au maximum). Lors des phases potentiellement plus sévères, l'expérimentateur.rice vérifiera le poids et apportera quotidiennement une aide à l’alimentation (ajout dans la cage d'aliment et d'eau sous forme de gelée). Il/elle évaluera aussi l'état de santé global des animaux (comportement, prostration, plaies). L’expérimentation sera arrêtée en cas de dégradation trop importante de la santé d’un animal, atteignant un point-limite. Le projet ne prévoit pas l’utilisation d’analgésiques ou anti-inflammatoires stéroïdiens ou non stéroïdiens, car ces molécules sont connues pour interférer avec les cellules et les processus inflammatoires. Même les antalgiques de type morphinique ont des propriétés immunomodulatrices. Ces molécules seraient donc susceptibles de modifier fortement les résultats de notre expérimentation, qui cherche justement à estimer le rôle de la neuroinflammation et des lymphocytes T dans le déclin des fonctions cognitives.
Choix des espèces
Compte tenu des connaissances accumulées sur le fonctionnement des systèmes nerveux et immunitaire de la souris, et des nombreux outils qui existent dans cette espèce de rongeur, cette espèce est totalement pertinente pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires des interactions entre l’immunité adaptative (par ex. lymphocytes T résidents) et le système nerveux (fonctions cognitives), y compris dans le contexte d’infection parasitaire par Toxoplasma gondii. En effet, alors que Toxoplasma gondii peut infecter tout animal homéotherme, les hotes définitifs du parasite sont les félins, ce qui fait des rongeurs (proies classiques des félins) des hôtes pertinents dans le cycle de vie naturel du parasite. En outre, la physiopathologie de la toxoplasmose chronique chez la souris reproduit les caractéristiques retrouvées chez l’être humain, à savoir : rôle protecteur de l’immunité cellulaire médiée par les lymphocytes T, kystes persistant dans le cerveau, phénomène d’encéphalite en cas d’immunosuppression, modifications comportementales. Des souris adultes agées de 8 à 80 semaines seront utilisées afin d’étudier le rôle des lymphocytes T résidents intra-cérébraux et des mécanismes cytotoxiques, dans le déclin cognitif associé au vieillissement naturel. Pour les infections expérimentales avec T. gondii combinées avec le développement de la maladie d'Alzheimer, nous utiliserons des souris adultes agées de 8 à 11 semaines.