Carnivores

50 chiens porteurs de tumeurs naturelles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie tuée à l'issue pour autopsie, dix réutilisés dans d'autres procédures et dix proposés à l'adoption. Ils reçoivent pendant environ six semaines des traitements hebdomadaires, jusqu'à sept prises de sang par jour, des biopsies répétées et une résection chirurgicale de la tumeur en fin d'étude. Le porteur reconnaît un risque de syndrome de libération de cytokines, avec fièvre, déshydratation et perte d'appétit. Il indique que ces chiens, issus d'éleveurs et fournisseurs agréés, sont transférés vers l'établissement pour être traités, et présente l'espèce cible comme "requise" pour démontrer l'efficacité d'un médicament vétérinaire.

Objectifs

Le cancer est un problème de santé mondial important qui possède un taux d’incidence et de mortalité en constante augmentation, aussi bien chez l’Homme que chez les animaux. Le nombre de traitements vétérinaires indiqués contre le cancer canin est très limité. Actuellement la première approche qui peut permettre de réduire la masse tumorale est la chirurgie. Mais elle peut se révéler inutilisable en fonction de la localisation de la tumeur, voire insuffisante en cas de présence de métastases. La chimiothérapie et la radiothérapie sont aussi des solutions utilisées en deuxième intention pour traiter le cancer. Mais ces solutions possèdent, elles aussi, leurs limites. En effet, ces méthodes sont, elles aussi, parfois inefficaces car certaines tumeurs sont dites chimiorésistantes ou radiorésistantes. De plus, ces types de traitements ont des effets secondaires importants. Ils nécessitent également un matériel adapté ainsi qu’une gestion spécifique des effluents et déchets radioactifs et chimiques générés (risque de pollution pour l’environnement). Il est donc important de développer une nouvelle option thérapeutique qui pourra traiter un plus grand nombre de tumeurs avec un mode d’administration et une logistique des déchets plus simple.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’évaluation précoce de l’efficacité et de l’innocuité de nouveaux traitements médicaux à visée anti-tumoral chez le chien. En fonction des résultats obtenus, ce projet pourrait conduire au développement d’un traitement antitumoral chez le chien. Cette nouvelle thérapie permettra à la fois de lutter contre le développement des tumeurs et de réduire les risques de développement de métastases. En raison de l’activité immunomodulatrice de ces traitements, un panel de tumeurs canines sont ciblées : ostéosarcome, sarcome des tissus mous, glioblastome, tumeurs mammaires…

Procédures

Les animaux seront traités régulièrement (environ une fois par semaine) avec un traitement par voie orale, par intraveineuse (IV), intratumorale ou sous-cutanée pendant environ 6 semaines. Les prélèvements prévus dans la procédure sont les suivants : - Prises de sang : jusqu’à 7 fois par jour, 10 fois par semaine pendant 6 semaines consécutives. Le volume prélevé ne pourra en aucun cas dépasser 7.5% du volume total circulant d’un animal sur 24h ou 15% sur 28 jours. Si le volume total prélevé sur 24 heures atteint 7.5%, la prochaine prise de sang ne pourra pas être réalisée dans les 7 jours suivants (pour laisser un temps de récupération). - Prélèvements d’urine par cystocentèse, ou sondage urinaire, jusqu’à une fois toutes les deux semaines. - Biopsies (punch : 2 à 4 mm de diamètre) de la tumeur, jusqu’à 3 fois sur la durée de l’étude. Pendant le temps des prélèvements, les animaux pourront recevoir des analgésiques ou pourront être anesthésiés ou tranquillisés pour une courte durée, afin de réduire la douleur, l’angoisse ou la souffrance de l’animal. La décision de l’analgésie, de l’anesthésie ou de la sédation dépendra de plusieurs facteurs comme : les prélèvements à réaliser, du comportement des chiens, de la facilité de manipulation. - La résection chirurgicale de la/les tumeur(s) mammaire(s) en fin d’étude sera réalisée sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Les produits candidats ont pour objectif d’activer le système immunitaire des animaux. Le principal risque associé, pourrait être une suractivation du système immunitaire, qui entrainerait un syndrome de libération de cytokines. Ce syndrome peut entraîner des symptômes d’intensité faible à sévère comme : de la fièvre, une déshydratation, de l’apathie, une perte d’appétit. Afin de pouvoir objectiver les effets secondaires à l’administration du traitement et adapter le suivi clinique de chaque chien, les chiens seront hébergés individuellement pendant 8 heures (avec contact visuel et olfactif) après l’administration du traitement. Afin d’évaluer l’efficacité et l’innocuité de ces nouveaux traitements, des prélèvements devront être réalisés (sang, urine, biopsies de la tumeur…) ainsi qu’une résection chirurgicale de la/des tumeur(s) en fin d’étude. Ils peuvent générer un stress et de l’inconfort : au moment du geste pour ceux réalisés vigile, ou en post-opératoire pour ceux réalisés sous anesthésie générale. Les contentions liées à ces gestes peuvent générer du stress chez les animaux. La réalisation de biopsies et/ou la résection chirurgicale de la/des tumeur(s) pourraient induire des saignements, des gonflements, une infection, des ulcérations, une altération voire une destruction des tissus traversés. L’anesthésie pourrait générer : un stress au moment de l’induction, de l’inconfort, de la nausée et du stress au moment du réveil. Dans le cas où l’efficacité du candidat ne serait pas suffisante, il est possible que la tumeur continue de se développer (augmentation de la taille et développement de métastases).

Devenir

Les animaux pourront être mis à mort en fin de procédure pour autopsie, prélèvements d’organes ou de tissus pour évaluer l’innocuité et/ou l’efficacité des produits testés. Si au cours de la procédure ou à la fin de la procédure, l’animal présente un état de santé dégradé et qu’il atteint des points limites sévères l’animal sera euthanasié. À la fin de la procédure si l’animal recouvre un bon état physique/clinique, il pourra être (sur décision du vétérinaire désigné) mis à l’adoption ou être inclus dans une autre procédure.

Remplacement

Des études précliniques avec des candidats ont déjà été réalisées in vitro et in vivo sur rongeurs, chiens sains, chats, et sur l’Homme. Ces tests ont montré des résultats favorables. Après cette première étape, le recours aux animaux ayant développé une tumeur est requis, afin de pouvoir évaluer l’efficacité et l’innocuité du candidat médicament chez la population cible. En effet, l’efficacité d’un produit vétérinaire anti-tumoral doit être démontrée sur l’espèce cible. Car les études d’efficacité nécessitent de travailler sur un organisme entier, mettant en jeu des interactions entre différents tissus/organes impliqués dans le métabolisme et le/les effets physiologiques et thérapeutiques du futur candidat médicament.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, seul le ou les composé(s) ayant les meilleurs profils pharmacocinétiques et pharmacodynamiques et la meilleure innocuité, seront testés sur les animaux présentant une tumeur. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum lors des premières études exploratoires (jusqu’à 10 animaux par composé à tester soit 5 composés maximum). Ces études permettront de caractériser plus précisément les variabilités existantes inter-individus ainsi que les variabilités existantes entre les différents types de tumeurs incluses. Grace à ces informations, le nombre minimum d’individus le plus pertinent pourra être inclus dans les études suivantes. Pas d'étude biostatistique pour ce projet. Chaque chien sera son propre contrôle, c'est à dire que l'on comparera la tumeur avant/après ainsi que l'état clinique avant/après. Ceci permettra de réduire le nombre de chien inclus dans la procédure.

Raffinement

Des chiens présentant naturellement des tumeurs issues d’établissement éleveurs ou fournisseurs agréés seront inclus dans les études. Les animaux présentant des tumeurs (tumeurs mammaires dans un premier temps) seront alors transférés au sein de l’établissement utilisateur pour être traités. Afin de permettre un traitement le plus précocement possible, un chien seul peut être inclus dans la procédure. Dans ce cas, il sera mis en hébergement avec au moins un autre compagnon compatible durant cette période. Ce ou ces compagnons seront des chiens déjà présents au sein de l’établissement utilisateur et qui seront en période de repos entre deux études. Ils bénéficieront de zones de jeu avec interaction avec l’Homme. Les jouets présents dans les zones d’hébergement et dans les zones de jeu sont régulièrement changés pour favoriser la curiosité. Une période d’acclimatation systématique est mise en place. Si la durée n’est pas suffisante elle sera rallongée jusqu’à ce que les animaux soient aptes à entrer dans la procédure. Le personnel intervenant dans l’étude sera formé aux examens et prélèvements afin de travailler avec le plus d’expertise possible. Les animaux sont observés quotidiennement, ou plus si jugé nécessaire, ce qui permet de détecter tout signe comportemental anormal et/ou toute anomalie clinique non attendue. En cas de déviation de l'état normal d'un animal, le responsable de l’étude, le vétérinaire désigné ou le vétérinaire d'astreinte, décidera d'augmenter les fréquences d'observations, d'isoler l'animal et/ou d'envisager un traitement pour soulager l'animal. En cas de syndrome de libération de cytokines, un traitement avec des corticoïdes, une réhydratation et/ou un traitement symptomatique digestif seront prescrits pour diminuer les effets dus à ce syndrome. Un suivi clinique rapproché de l’animal sera également mis en place. Des points limites seront définis pour apporter des soins adaptés ou une exclusion de l’étude avec d’autres soins ou une euthanasie si nécessaire. Afin de limiter le stress lié aux actes (contention, traitements, prélèvements, …), ces actes seront travaillés sur les chiens en renforcement positif avec friandises et caresses lors de trainings pendant l’acclimatation puis pendant toute la durée de l’étude. La Structure du Bien Être Animal (SBEA) garantit l’amélioration des techniques de soins et des conditions de vie pour les animaux.

Choix des espèces

Espèce cible de la pathologie investiguée. Les animaux utilisés seront des animaux ayant naturellement développés une tumeur. Une tumeur chez le chien peut se développer quel que soit l’âge de l’animal, bien que les animaux les plus âgés sont les plus souvent atteints (en particulier pour les tumeurs mammaires).

20 furets vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié tuée à l'issue et l'autre moitié confiée pour adoption. Tous reçoivent un implant crânien lors d'une chirurgie de quatre à six heures, puis une cinquantaine de séances d'enregistrement cérébral sous contention, motivées par une privation d'eau. Dix furets sont tués pour analyse histologique du cerveau, les dix autres explantés lors d'une seconde chirurgie puis remis à des organismes d'adoption. Le porteur justifie l'usage du furet par son cortex plissé et une gamme auditive proche de celle de l'humain, et retient les femelles 'en raison de leur petite taille'.

Objectifs

Écouter dans des situations réalistes est un processus actif qui engage nos capacités de perception et de réflexion. Cela donne du sens à la parole, permet à la musique de nous émouvoir et aux sons de notre environnement d'avoir de l'importance. Grâce à notre écoute, nous, les humains et les autres animaux, sommes capables de naviguer à travers des paysages sonores complexes, de distinguer des sources sonores mélangées, de comprendre des messages et d'évaluer leur signification pour nos comportements. Ces compétences sont vraiment remarquables et nous dépassent souvent. Même les systèmes d'ingénierie audio les plus sophistiqués n'arrivent pas encore à égaler ces performances étonnantes. Le projet de recherche a pour objectif d'étudier une nouvelle approche de l'audition qui considère l'écoute comme un processus interactif entre nos facultés sensorielles et notre réflexion. Nous voulons intégrer la cognition (c'est-à-dire notre façon de penser et de prendre des décisions) comme une partie essentielle du traitement de l'information sonore, ce qui peut être étudié au niveau de notre activité cérébrale. En d'autres termes, nous cherchons à comprendre comment notre cerveau s'adapte rapidement lors de l'écoute, tant au niveau des neurones individuels que des groupes de neurones travaillant ensemble. Ce processus d'adaptation rapide est appelé "plasticité rapide". Il se manifeste à différents niveaux de notre système auditif, depuis l'oreille interne (cochlée) jusqu'au cortex auditif et préfrontal de notre cerveau. En résumé, ce projet de recherche explore comment notre cerveau traite les sons de manière active et flexible, en utilisant à la fois nos facultés sensorielles et cognitives. En comprenant mieux ces mécanismes, nous pourrons élargir nos connaissances sur l'écoute et développer de nouvelles avancées dans le domaine de l'audition.

Bénéfices attendus

Le projet s'appuie sur les travaux des chercheurs en charge du protocole réalisés lors de la dernière décennie sur la physiologie et la modélisation informatique de ces phénomènes. Ces efforts ont abouti à la découverte de plasticité rapide dans le cortex auditif, au niveau du neurone unique et de populations de neurones. Ils ont aussi conduit à l'élaboration d'un modèle neuromimétique de traitement auditif qui ont mené à des percées technologiques et à des applications concrètes. Ils ont enfin permis d’utiliser une technologie de neuroimagerie large-champ chez le furet. Ce projet étendra ces recherches et intégrera de nouveaux paradigmes psychophysiques puissants pour sonder l'écoute active chez l'homme. S'appuyant sur ces domaines très complémentaires et plusieurs innovations techniques (reconstruction de stimulus à partir d'enregistrements de neurones à grande échelle chez les animaux réalisant une tâche de comportement, nous espérons promouvoir une vision nouvelle de la perception auditive et de la cognition. Cela contribuera également de manière significative à des avancées significatives dans le domaine du traitement du signal pour les prothèses auditives cliniques, étant donné que de nombreuses limitations actuelles ne sont pas technologiques, mais plutôt conceptuelles.

Procédures

Tous les animaux (n=20) sont équipés d'un implant crânien lors d'une première chirurgie qui se fait sous anesthésie et analgésie (durée 4-6h). Cet implant permet ensuite de réaliser des enregistrements neuraux en électrophysiologie ou en neuroimagerie fonctionnelle par ultrasons (procédures répétées autour d'une cinquantaine de fois en moyenne par animal, entre 3 et 5 fois par semaine, durée moyenne d'enregistrement 3h). Une partie de la cohorte sera euthanasié (sous sédation et anesthésie ; n=10). L'implant crânien est retiré des animaux qui ne sont pas euthanasiés (n=10 - voir 5.8 + 5.9), lors d'une seconde chirurgie sous anesthésie et analgésie (durée 3h).

Impact sur les animaux

La procédure chirurgicale se faisant sous anesthésie, un risque anesthésique est présent. Au long-terme, il existe aussi un risque infectieux. Par ailleurs, les enregistrements neuraux se font chez l'animal en situation de contention. La contention des animaux est nécessaire dans le cadre des enregistrements et pourra être génératrice de stress et d’inconfort pour l’animal. De plus, le comportement sera motivé par une privation hydrique qui pourra entraîner une sensation de soif de courte durée chez l’animal.

Devenir

L'euthanasie est nécessaire pour réaliser une analyse post-mortem des tissus cérébraux. Cette méthode n'est utilisée que pour les animaux dont la localisation des injections ou des enregistrements électrophysiologiques aigus par histologie post-mortem est nécessaire (n=10). Pour l'ensemble des autres animaux (n=10), nous retirons l'implant crânien à la fin de l'expérimentation quand cela est possible, afin de les confier à des organismes chargés de trouver des particuliers qui souhaitent adopter nos animaux.

Remplacement

Afin de pouvoir comprendre le traitement de l'information sensoriel dans les cortex auditifs, visuels et frontaux, il est nécessaire d'avoir recours à des animaux vivants pour pouvoir enregistrer l'activité neurale, que ce soit de neurones uniques en électrophysiologie ou les flux hémodynamiques en imagerie large-champ. Ce type d'enregistrement n'est pas réalisable chez des êtres humains. Par ailleurs, le furet constitue un animal modèle nécessaire à la compréhension de la perception auditive dans un contexte de prise de décision. En effet, il est capable d'apprendre des tâches complexes et de percevoir des sons dans une gamme auditive similaire à celle de l'être humain. Son cerveau à cortex plissé permet aussi d'étudier le rôle fonctionnel des plis corticaux, ce qui n'est pas possible chez le rongeur ou primate à cortex licencéphale.

Réduction

Le type d'expérimentation que nous réalisons permet de réaliser de nombreux enregistrements dans un nombre réduit d'animaux (20 maximum). La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance par exemple et qu’il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages enrichies en jouets et tunnels divers et régulièrement mis tous ensemble dans une aire de jeu. Durant les week-ends, les animaux ne doivent pas effectuer de tâche comportementale. Leur état de santé est suivi en permanence, en collaboration avec un vétérinaire. Deux réunions du comité de suivi du bien-être animal sont faîtes chaque année, avec un suivi des recommandations du comité dans la durée (durée d'expérimentation, protocole de chirurgie, méthodes d'enregistrement…). Le comportement est motivé par une privation hydrique, raison pour laquelle nous suivons au plus près le poids des animaux ainsi que les marqueurs de bien-être suivants : + Poids – avant et après le week-end ; plus souvent si nécessaire. + État général de l'animal (activité, état global : fourrure, yeux...) – tous les jours. + Observation de l'état général des animaux – hebdomadaire – grâce à une méthode de scoring durant un examen clinique. L'évaluation de l'état général de chaque animal s'appuie sur la grille d'évaluation suivante : - le furet se cache ou de tente de mordre les expérimentateurs (comportement) - le furet cesse de s'alimenter (perte de poids) - le furet cesse de se nettoyer ou gratte de manière excessive un endroit de son corps (aspect du pelage) - état d'hydratation de l'animal (test du pli cutané) - état de l'implant crânien. Le protocole de chirurgie inclut l’administration d’anti-inflammatoire et d’anti-douleur en pré- et post-opératoire et les opérations sont réalisées sous analgésie et anesthésie. Sur le plan expérimental, un effort constant nous pousse vers le raffinement des différentes étapes de nos procédures. Tout d’abord nous portons un grand soin à l’habituation préalable à la contention chez les animaux implantés. Nous développons la pose de systèmes d'enregistrements chroniques chez les animaux pour obtenir des sessions d'enregistrements plus courtes. Enfin nous explantons un grand nombre d'animaux, quand cela est possible, à la fin de l'expérimentation, afin de les replacer.

Choix des espèces

Les furets apprennent rapidement une tâche ; ils ont par ailleurs une large gamme auditive, similaire à celle de l'homme. Leur cerveau est assez grand pour utiliser des électrodes avec 200 contacts. De plus leur cortex est convolué ; ces plis corticaux ne sont pas présents chez le rongeur à l’inverse de nombreux primates. Le furet permet d’étudier un putatif rôle fonctionnel de ces plis. Les individus femelles sont préférés en raison de leur petite taille. Les animaux ont entre 6 mois et 1 an quand ils arrivent au laboratoire, âge auquel ils sont adultes ; ce stade est choisi car le développement du cerveau est alors terminé.

20 chiens vont être utilisé·es, gardés en vie pour une réutilisation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit des administrations intraveineuses d'un produit vétérinaire à jeun, subit huit prélèvements de nœuds lymphatiques aux membres postérieurs et vingt-cinq prélèvements sanguins répartis sur cinquante jours. Le projet évalue la pharmacocinétique et la tolérance de quatre produits testés, avec des vomissements et des modifications cardiaques déjà observés lors d'un projet antérieur. Le porteur affirme qu'aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité et la sécurité d'un produit chez le chien et conclut au recours "indispensable" à l'animal entier.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'évaluer les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamique de quatre éléments d'essai testés ( efficacité et sécurité de chaque produit test).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir démontrer l'efficacité des produits tests et d'identifier si des signes cliniques apparaissent, d'évaluer le composé le mieux toléré par les animaux sans présenter de signe clinique et sans modifications des paramètres sanguins mais également de démontrer l'efficacité du produit administré grace aux prélèvements des cellules sanguines et des noeuds lymphatiques.

Procédures

Dans ce projet les nuisances sont: 1) l'administration des éléments tests par voie intraveineuse pendant 30 minutes avec mise à jeun au moins 10h avant. Aministration répétée 14 jours aprés la première administration 2) huit prélèvements au niveau des noeuds lymphatiques des membres posterieurs. Durée d'un prélèvement de l'ordre de la minute 3) Vingt-cinq prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigiles répartis sur 50 jours au total. Durée de l'ordre de la minute. 4) la manipulation et la pose d'appareillages non invasif pour la mesure de l'oxygène, de la tension et du rythme cardique.

Impact sur les animaux

L'effet indésirable susceptible d'être observé suite aux traitements est un vomissement et ou une modification des paramètres cardio-circulatoires, qui a été observé en dans un projet antérieur. Dans ce projet les nuisances sont: 1) l'administration des éléments tests par voie intraveineuse avec mise à jeun au moins 10h avant. Cela necessite une contention legère des animaux. Effets indésirables susceptibles, vomissement . 2) Prélèvements aux niveaux des noeuds lymphatiques des membres posterieurs. Cela necessite une contention legère des animaux. Effets indésirables irritation et inflammation post ponction au niveau du site de prélèvement. 3) Les prélèvement sanguins seront réalisés. Stress liée à la contention, manipulation des animaux. On ne s'attend pas à d'autre effet indésirable en particulier.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie à la fin de cette procédure. Les animaux auront un examen clinique général réalisé par le veterinaire désigné. Les actes réalisés dans cette procédure ne justifie pas d'un sort particulièrement prévu aux animaux.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permettant actuellement de reproduire la diffusion d’un produit dans le sang des animaux au niveau de l'organisme entier, il est indispensable de recourir à l’animal entier. Aucune méthode alternative ne permet d'évaluer l'efficacité et la sécurité d'un produit test chez le chien.

Réduction

Dans ce projet , 20 animaux seront inclus. En tenant compte de la variabilité intra et inter individuelle, c'est le nombre d'animaux minimal pour avoir des résultats représentatifs et interprétables. Pas de test statistique réalisé au préalable.

Raffinement

Pendant la période d'acclimatation, les animaux seront hébergés par groupe de 2 ou 3. Puis ils seront hébergés en condition individuelle à partir de l'administration jusqu'à 24h aprés. Cet hebergement en individuel est necessaire pour faciliter l'observation des animaux. Un suivi quotidien (voir plusieurs fois par jour) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et la détection précoce de signe clinique pour une prise en charge rapide d'éventuels effets secondaires. De l'enrichissement (exemple: balle, corde) sera présent autant que possible dans les boxes.

Choix des espèces

Espèce cible pour ce produit vétérinaire Adultes. Animaux adultes necessaire pour ce type de projet. Animaux qui ont fini leur croissance.

10 chiens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs de la même mutation que les enfants atteints de la maladie de Sanfilippo B, ils reçoivent une injection intracérébrale et intraveineuse de thérapie génique sous anesthésie de quatre heures, puis des prélèvements sanguins, des ponctions de liquide céphalorachidien et des IRM répétés sur trois à douze mois, avant leur mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable des injections et présente cette étape comme "indispensable" avant un essai clinique chez l'enfant. Il justifie le chien par sa prédisposition naturelle à cette mutation et sa proximité neurologique avec l'humain.

Objectifs

La mucopolysaccharidose de type IIIB (MPSIIIB), ou maladie de Sanfilippo B, est une maladie rare dite de surcharge lysosomale, et qui affecte 0.7 à 1.8 nouveau-nés pour 100000 naissances en Europe. La maladie survient lorsque des enzymes nécessaires à la dégradation et au stockage de molécules de sucres complexes font défaut à l’organisme : ainsi le déficit d’une enzyme nommée l’α-N acétylglucosaminidase (NaGlu), requise dans la voie de dégradation du sucre, l’héparane sulfate, engendre une accumulation toxique de ce dernier dans de nombreux organes dont le foie, la rate et surtout le cerveau. La maladie de Sanfilippo B est caractérisée par une atteinte sévère du Système Nerveux Central (SNC). La maladie débute le plus souvent entre 2 et 6 ans avec un retard du développement psychomoteur, des troubles du comportement, un défaut d'attention, une hyperactivité et une agressivité. La régression des acquisitions intellectuelles est rapide et sévère et dans la phase finale, ils deviennent grabataires, perdent tout contact avec leur entourage et développent une encéphalopathie profonde. Le décès survient généralement au décours d'une surinfection respiratoire. L’espérance de vie des enfants atteints de cette pathologie est de l’ordre de 15 à 20 ans. Actuellement, aucun traitement approuvé ne peut aboutir à la guérison. Les seuls soins apportés visent à traiter les complications liées à la maladie et améliorer la qualité de vie des malades et de leur entourage. Le produit de thérapie génique que nous souhaitons tester vise à corriger le déficit de l’enzyme NaGlu à l’origine de la maladie. L’objectif principal de ce projet est de réaliser une étude de biodistribution, d’efficacité et d’évaluation de la tolérance chez le modèle animal du chien MPSIIIB après administration combinant une injection intracérébrale et une injection intraveineuse (IV) du produit de thérapie génique, sur un suivi de 3 mois et de 12 mois post-injection.

Bénéfices attendus

Le syndrome de Sanfilippo est la conséquence d’une accumulation de molécules d’un sucre, l’héparane sulfate, partiellement dégradées, dans les tissus de l’organisme. Ceci est le fait d’une mutation génétique qui affecte l’activité d’une enzyme, l’α-N acétylglucosaminidase (NaGlu), nécessaire pour la dégradation de l’héparane sulfate. Ces molécules mal dégradées, qui ne peuvent pas être éliminées, entravent le développement normal du cerveau puis détruisent les cellules du cerveau. Les premiers symptômes de la maladie associent un retard du développement cognitif associé à une hyperactivité, un comportement autistique et des troubles du sommeil. Ils apparaissent habituellement avant l’âge de 3 ans. Par la suite, l’atteinte neurologique entraîne une déficience intellectuelle et une réduction des capacités motrices qui aboutissent à la perte d’autonomie vers l’âge de 10 ans et un décès survenant le plus souvent entre 10 et 20 ans. Actuellement, cette pathologie est incurable, le traitement n'est que symptomatique. L'évaluation d'approches thérapeutiques reste donc essentielle pour évoluer vers la mise en place d'un réel traitement curatif pour ces patients. La thérapie génique est une des approches prometteuses qui permettrait de traiter la cause moléculaire de la maladie. Pour évaluer de telles approches thérapeutiques, avoir un modèle animal pertinent est nécessaire pour pouvoir réaliser des études précliniques nécessaires (preuves de concept de l’efficacité des produits thérapeutiques, études de dose…). Le présent projet vise à évaluer l’efficacité d’un traitement de thérapie génique sur des chiens atteints de la maladie. C’est une étape essentielle dans le développement préclinique qui permettra à terme de proposer un traitement curatif aux patients atteints. Elle permettra ainsi de générer toutes les données précliniques telles que les données de biodistribution du produit de thérapie génique dans le cerveau et les organes périphériques des animaux injectés, l'étude histologique, mais aussi la tolérance globale de cette approche avec le suivi IRM (Imagerie par Résonance Magnétique), les données des bilans biologiques sanguins et de dosage de biomarqueur spécifique. Le but global de l'étude étant de soutenir la demande d'un essai clinique de phase I/II chez les patients souffrant de la maladie de Sanfilippo.

Procédures

Chaque animal inclus dans cette étude sera soumis aux interventions suivantes : - Une procédure d’injection intra-cérébrale et intraveineuse concomitante, effectuées par des spécialistes sous anesthésie générale et analgésie. Durée intervention : environ 4h - Des prélèvements sanguins effectués soit vigiles sous légère contention (animaux sociabilisés et habitués aux manipulations) soit sous anesthésie (anesthésie destinés aux autres gestes décrits). Pour un total de 7 prélèvements sanguins pour les animaux suivis 3 mois, et 10 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l’acte : environ 5 min - Des prélèvements du liquide céphalo rachidien (LCR) seront effectués par ponction, soit au niveau lombaire, soit au niveau atlanto-occipital. Ils seront réalisés par des vétérinaires spécialistes sous anesthésie générale et analgésie. Pour un total de 6 prélèvements pour les animaux suivis 3 mois, et 9 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l’acte : environ 10-15 minutes - Des imageries par résonnance magnétique (IRM) qui seront faites sous anesthésie générale et analgésie. Pour un total de 4 examens pour les animaux suivis 3 mois, et 5 pour les animaux suivis 12 mois. Durée de l’acte : environ 1h30 - Un traitement immunosuppresseur tout au long de l’étude par administration orale de corticostéroïdes et d’un immunosuppresseur

Impact sur les animaux

- L’injection du vecteur thérapeutique par voie intraveineuse et les prélèvements sanguins sont des gestes peu invasifs pour lesquels aucun effet indésirable est attendu. Ces 2 actes seront réalisés lors des anesthésies prévues pour les autres gestes. - L’injection du vecteur thérapeutique par voie intracérébrale (IC) sera réalisée par des neurochirurgiens experts et maitrisant cette technique. Elle se fera sous anesthésie générale et analgésie. Avec ce protocole et par les expériences passées, il n’est pas attendu de réaction douloureuse. - Les IRMs, examens non invasifs, seront réalisées sur les animaux anesthésiés - La ponction de LCR sera réalisée par des vétérinaires spécialistes maitrisant ce geste technique sous anesthésie et analgésie adaptées. Il n’est pas attendu d’effet indésirable. - Afin de limiter toute réaction inflammatoire au moment des injections d’AAV, un protocole d’immunosuppression sera mis en place, à base de corticoïdes de façon temporaire (D-1 à D+8) et d’un immunosuppresseur tout au long de l’étude . Il n’est pas attendu d’effet secondaire à ce traitement. -Le phénotype ne devient dommageable qu’après 15 mois. L’évolution de la maladie est très lente. Si le phénotype se déclarait, il restera léger au vu de la période de suivi des animaux.

Devenir

Les 10 animaux concernés par la procédure décrite dans ce projet seront suivis 3 mois ou 12 mois puis mis à mort pour prélèvements de tissus post-mortem. La mise à mort de tous les animaux est nécessaire pour obtenir les prélèvements de tissus afin de réaliser les analyses moléculaires et histologiques nécessaires au projet. Ces analyses ne peuvent se faire du vivant de l’animal.

Remplacement

Toutes les études in vitro possibles ont été́ effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité́ du vecteur Adeno-Associated Virus (AAV), produit de thérapie génique. Nous arrivons ici aux dernières étapes précliniques nécessaires pour une demande d’essai clinique de phase I/II pour lesquelles l’utilisation d’un modèle gros animal, permettant la mise en place d’approche chirurgicale similaire à celle effectuée sur les patients dans l’essai clinique est indispensable et nécessite donc l’utilisation de cette lignée de chiens MPSIIIB. Il n’existe pas aujourd’hui de méthode alternative pour tester l’effet d’un traitement de thérapie génique in vivo. Nous savons que l’efficacité du transfert de gène dans une lignée cellulaire in vitro n’est pas comparable à ce qui peut se passer in vivo dans un organisme entier. L’animal est le seul organisme vivant permettant d’étudier l’impact d’un transfert de gène dans différents types cellulaires (différents organes) et sur son phénotype, en lien avec le mode d’administration utilisé et la dose administrée. L'utilisation d’un modèle animal est donc essentielle pour l'évaluation préclinique de produits thérapeutiques pour le traitement de la Mucopolysaccharidose de type III B

Réduction

10 animaux au total maximum comprenant : 2 animaux injectés avec du véhicule (l’un sacrifié 3 mois post injection et l’autre sacrifié 12 mois post injection), 6 animaux recevant la double administration (IC + IV) dont 3 nécropsiés à 3 mois post injection et 3 nécropsiés à 12 mois post injection, et 2 animaux non injectés (un suivi 3 mois et un suivi 12 mois).Le nombre d'animaux par groupe (3 injectés vecteur AAV par temps de suivi – 3 et 12 mois, ; 1 injecté véhicule par temps de suivi ; 1 non injecté par temps de suivi ) a été évalué pour être un nombre minimal, sans qu'il soit excessif, permettant d'assurer la robustesse des résultats. Il est basé sur notre expérience de précédents projets et des données sur les autres modèles, lors desquels des résultats cohérents et reproductibles ont pu être obtenus dans des groupes de cette taille. Une analyse statistique (Test t et ANOVA) sera réalisée pour les mesures où le nombre d’échantillons permettra d’avoir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les procédures utilisées sont adaptées pour éviter tout inconfort de l'animal, et sont réalisées par du personnel formé et expérimenté. Le bien-être animal passera notamment par : 1) de bonnes conditions d'hébergement selon la réglementation en vigueur. Pour leur bien-être les animaux seront hébergés en groupe et recevront un enrichissement adapté (jeux divers disponibles dans les box, sociabilisation avec présence humaine, éducation, toilettage). Cet enrichissement serait renforcé si un animal se retrouvait en hébergement seul. 2) un suivi régulier des animaux (observations biquotidiennes, pesées régulières, analyse du comportement) .3) Afin de suivre efficacement l'état de santé des animaux et mettre rapidement en place une action, une liste de points limites a été établie. Elle permet de définir une conduite à tenir afin d’arrêter, minimiser ou diminuer toute souffrance à l’aide de mesures comme un traitement adapté ou une euthanasie anticipée. 4) la mise en place de mesures adaptées en fonction des interventions éventuelles (anesthésie et analgésie si nécessaire, antibiothérapie). De plus, le nombre d'anesthésie sera minimisé en regroupant les procédures (prise de sang - volume adapté à la taille des animaux et validé par le vétérinaire, ponction lombaire) au sein d'une même anesthésie.

Choix des espèces

La race de chien choisie (mix beagle et fox hound) est naturellement prédisposée à la même mutation génétique que chez l’homme lors de la Mucopolysaccharidose de type III B. Elle conduit comme chez l’homme au développement anormal du cerveau et à des troubles moteurs. Le choix de l’espèce est également basé sur son homologie avec l’homme, au niveau des plans anatomiques et fonctionnels du système nerveux central (SNC) et du point de vue immunitaire (tolérance semblable). Dans l’étude clinique, les enfants seront traités entre 4 et 12 mois. Les animaux seront injectés à l'âge de 3 mois. C'est un âge auquel les animaux sont considérés comme "juvéniles", et mimant donc le stade auquel des patients atteints du syndrome de Sanfilippo pourraient être injectés lors d'un futur essai clinique (enfants de moins de 5 ans). Les animaux injectés seront ensuite suivis sur une durée de soit 3 mois, soit 12 mois après injection pour documenter l’efficacité du traitement à 2 temps différents. Ce planning nous permettra d’effectuer l’intégralité du protocole chez tous les animaux inclus, sans atteindre un âge critique où la dégradation de l'état de santé due à la maladie pourrait devenir sévère. En effet, cette maladie de surcharge est associée à une dégradation progressive de l’état général de l’animal. Cette dégradation peut devenir visible (troubles locomoteurs, troubles cognitifs) pour les animaux au delà de 15 mois.