Carnivores

131 chiens vont être utilisés, dont 81 chiots qui subissent chacun, sur environ 33 semaines, trois ouvertures de l'abdomen par une large incision sous anesthésie générale pour des biopsies intestinales, douze biopsies de peau et huit prises de sang. Dès six semaines d'âge, ces chiots reçoivent de la cacahuète deux fois par semaine pendant sept semaines, par la bouche ou sur une peau dont la couche la plus superficielle est rompue par des calques cutanés, puis une prise orale censée déclencher l'allergie, avec la possibilité, écrit le porteur, d'une éruption, d'un gonflement sous la peau, "voire d'une réaction allergique importante". Environ six mois plus tard vient une sensibilisation par la peau "jusqu'à obtention d'un eczéma", et les 50 chiens adultes subissent la même application d'allergène sur peau fragilisée, dans des procédures que le porteur classe à un niveau de souffrance modéré. Tous restent en vie et sont déclarés réutilisés, certains pouvant aussi "entrer dans un programme d'adoption" selon le porteur, qui cite parmi les bénéfices la possibilité "de diminuer les frais pour les propriétaires car ces croquettes sont très onéreuses".

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont multiples : 1) Déterminer le rôle et les mécanismes de sensibilisation à travers la peau d’allergènes alimentaires chez le chien. 2) Evaluer la possibilité de rétablissement de la tolérance aux allergènes alimentaires chez les chiens allergiques. 3) Explorer les risques de rupture de la tolérance, induite par contact précoce digestif, par pénétration des allergènes par voie cutanée chez les chiens tolérants. 4) Déterminer si des modifications des micro-organismes présents au niveau digestif ou cutané, sont associées à la sensibilisation à des allergènes alimentaires et à l’allergie alimentaire. 5) Evaluer si la composition des micro-organismes présents au niveau digestif ou cutané est modifiée par la sensibilisation à des allergènes alimentaires ou l’allergie alimentaire, et déterminer si ces modifications sont réversibles. 6) Identifier des biomarqueurs de la sensibilisation à des allergènes, présents dans la couche cornée. 7) Comparer ces résultats avec les mêmes paramètres évalués à partir des modèles expérimentaux de dermatite atopique canine.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet seront, en plus de la connaissance scientifique sur les mécanimes pathogéniques de ces allergies (dermatite atopique et allergie alimentaire), d’en améliorer la prise en charge. En effet, aujourd’hui, l’éviction alimentaire (croquettes hypo / anallergéniques strictes) semble la seule méthode de diagnostic fiable d’allergie alimentaire, qu’elle soit associée à une dermatite atopique ou pas. Nous souhaitons mettre en évidence des biomarqueurs diagnostiques dans le sang et dans la peau (désensibilisation par immunothérapie) qui évitera la lourdeur d’un régime d’éviction alimentaire et de nombreux dosages d’IgE sériques inutiles car non validés et permettront : 1) d’accélerer la démarche diagnostique et donc la prise en charge de cette dermatose, 2) de diminuer les frais pour les propriétaires car ces croquettes sont très onéreuses. Ces biomarqueurs pourront églement servir lors du suivi thérapeutique. De plus, le modèle actuel d’allergie alimentaire étudié est un modèle murin, très éloigné de l’Homme. Il serait intéressant de montrer une similarité avec notre modèle d’allergie alimentaire canin car le chien est un modèle plus pertinent, de part la proximité qu’il partage avec l’Homme : environnement, alimentation, pression allergénique.

Procédures

Chez chiots (actes étalés sur une période d’environ 33 semaines) : écouvillons cutanés et prélèvements de selles (à 5 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), prises de sang (à 8 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), biopsies cutanées (à 4 reprises, avec 3 biopsies à chaque fois, sous anesthésie locale, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 20 minutes à chaque fois), biopsies intestinales (à 3 reprises, avec 2 biopsies à chaque fois, sous anesthésie générale par ouverture de l’abdomen par une incision large, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 1 heure à chaque fois entre l’induction de l’anesthésie, l’acte chirurgical et le réveil des animaux). Un test cutané explorant la sensibilisation à divers allergènes sera également réalisé (sur animal vigile, sur tous les chiots, la durée de l’acte est de 15 minutes). Application cutanée de cacahuète ou administration par voie orale en fonction des groupes, à la fréquence de 2 fois par semaine pendant 7 semaines, avec rupture de la peau la plus superficielle via des calques cutanés pour certains groupes (sur animal vigile, la durée de l’acte est d’environ 15 minutes par animal à chaque fois). Chez chiens (actes étalés sur une période d’environ 7 semaines) : prises de sang (à 2 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiens, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), prélèvements partie superficielle de la peau (à 2 reprises, sur animal vigile, sur tous les chiens, la durée de l’acte est de 1 minute à chaque fois), biopsies cutanées (à 2 reprises, avec 3 biopsies à chaque fois, sous anesthésie locale, sur tous les chiens, la durée de l’acte est de 20 minutes à chaque fois). Application cutanée de l’allergène après rupture de la peau la plus superficielle via des calques cutanés, à la fréquence de 2 fois par semaine pendant 7 semaines (sur animal vigile, la durée de l’acte est d’environ 15 minutes par animal à chaque fois).

Impact sur les animaux

Prises de sang au début de la sensibilisation, puis en fin de sensibilisation 42 jours plus tard, puis environ 15 jours plus tard lors du déclenchement de l’allergie, puis le lendemain, puis environ 3 mois plus tard, puis le lendemain, puis environ 3 mois plus tard, puis le lendemain. Application cutanée de cacahuète ou administration par voie orale en fonction des groupes, à la fréquence de 2 fois par semaine pendant 7 semaines (avec rupture de la peau la plus superficielle via des calques cutanés pour certains groupes). Puis, environ 6 mois plus tard, sensibilisation à travers la peau 2 fois par semaine jusqu’à obtention d’un eczéma lors de la phase de rupture de la tolérance. Biopsies cutanées réalisées par voie sous-cutanée en début de sensibilisation, puis 42 jours plus tard en fin de sensibilisation, puis environ 15 jours plus tard lors du déclenchement de l’allergie, puis environ 3 mois plus tard lors du rétablissement de la tolérance, puis environ 3 mois plus tard lors de la rupture de la tolérance. Biopsies intestinales réalisées lors du déclenchement de l’allergie, puis environ 3 mois plus tard lors du rétablissement de la tolérance, puis environ 3 mois plus tard lors de la rupture de la tolérance. Ces biopsies impliqueront donc une ouverture de l’abdomen par une incision large sous anesthésie générale. La possibilité d’une éruption se manifestant par des plaques rouges au niveau des lèvres, d’un gonflement de zones de tissu sous la peau, voire d’une réaction allergique importante est attendue lors de la phase de déclenchement (administration par voie orale de la cacahuète) et cette réaction sera la preuve de l’allergie alimentaire induite par sensibilisation transcutanée.

Devenir

Après chaque procédure, les animaux seront gardés en vie, car les procédures ne devraient pas impacter l'état de santé des animaux sur le long terme. Le vétérinaire et le directeur d'étude valideront systématiquement le devenir des animaux, en tenant compte de leur utilisation, des leur état de santé, et des possibilités éventuelles de réutilisation. Certains animaux pourront entrer dans un programme d'adoption, en tenant compte de leur utilisation, des leur état de santé, des possibilités éventuelles de réutilisation, et de leur comportement. Il n'est pour le moment pas possible d'anticiper le nombre d'animaux qui seront adoptés.

Remplacement

Une première étude in vitro sur peau reconstruite permet de caractériser l’inflammation induite par le contact avec la cacahuète, mais il n’est pas possible de réaliser la phase de déclenchement (qui consiste à administer l’allergène par voie digestive), d’où la nécessité d’utiliser des animaux vivants. Ce projet repose sur l’étude de la voie d’administration de l’allergène et de la comparaison entre l’induction de tolérance digestive versus la sensibilisation par voie transcutanée, qui n’est possible que sur animaux vivants. Enfin, le projet utilise des animaux vivants car il fait intervenir des réactions locales, régionales et générales, pour lesquelles aucune méthode alternative n’est disponible. Pour atteindre les objectifs du projet, les résultats seront analysés statistiquement.

Réduction

L’étude repose sur la formation de 9 groupes de chiots. Le nombre de chiots nécessaires pour une puissance statistique satisfaisante est de 81. La comparaison avec des modèles expérimentaux de dermatite atopique se fera sur 50 chiens pour avoir un nombre assez proche de chiots et des résultats interprétables.

Raffinement

Période d’acclimatation systématique de 2 à 3 semaines avant le premier acte technique. Animaux hébergés en groupe et avec des jouets. Des points limites adaptés permettront de sortir un animal de l’étude afin de limiter la douleur à son minimum. Actes techniques réalisés par du personnel formé et habitué à travailler avec les chiens, toujours accompagnés de renforcement positif (calins, croquettes). Présence de vétérinaires et surveillance accrue des animaux lors du déclenchement de l’allergie alimentaire. Pour les chiots, des lampes chauffantes seront installées. Paramètres d’ambiance des salles surveillés avec possibilité de modifier la température, afin d’optimiser le bien-être des chiots. Les chiots seront en présence de leur mère jusqu’au sevrage complet. Biopsies cutanées réalisées sous anesthésie locale et biopsies intestinales réalisées sous anesthésie générale, avec observation quotidienne des sites après interventions et prise en charge de la douleur.

Choix des espèces

Chez le chien, l’allergie alimentaire est souvent évoquée, exceptionnellement confirmée, car surtout mal comprise, en particulier chez les chiens souffrant de dermatite atopique. C’est la seule espèce qui présente une dermatite atopique comparable (sur plans cliniques et pathogéniques) à celle de l’Homme. Ce modèle permettra de vérifier les données obtenues uniquement dans le modèle murin expérimental et permettra d’approfondir les connaissances de la dermatite atopique du chien et d’explorer le rôle des allergènes alimentaires, en particulier la voie de pénétration de l’allergène. Utilisation d’animaux vivants car intervention de réactions locales, régionales et générales, pour lesquelles aucune méthode alternative n’est disponible. Le chien est l’espèce cible mais le projet peut, par la suite, servir à l’étude de l’allergie alimentaire chez l’Homme. Le chien est l’espèce idéale pour réaliser un modèle d’allergie alimentaire et de dermatite atopique (de plus, c’est la seule espèce pouvant développer une dermatite atopique de manière spontanée). L’étude s’interesse à une sensibilisation de chiots dès l’âge de 6 semaines pour la comparaison avec l’Homme (les bébés se sensibilisant par voie transcutanée dès la naissance et ayant une diversification alimentaire le plus tôt possible pour induire une tolérance, c’est-à-dire dès 2 mois). Il est donc choisi de commencer à sensibiliser les chiots dès qu’ils commencent une diversification alimentaire et ne se nourrissent plus exclusivement de lait maternel. Ce phénomène se produit à l’âge de 6 semaines chez le chien. Ils seront suivis pendant 2 ans pour la sensibilisation, l’induction de tolérance, la rupture de la tolérance acquise et l’immunothérapie (ce qui renforce le besoin d’animal jeune). Les chiens permettant l’établissement d’un modèle de dermatite atopique seront des jeunes adultes qui seront ainsi comparés aux chiots ayant grandi et pour lesquels l’étape de déclenchement aura eu lieu. Ils présentent, à cet âge, un juste équilibre entre réponse physiologique et acclimatation en étude.

24 chiens vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dix-huit tués à l'issue et six réutilisés pour d'autres projets. Chaque animal inclus subit une chirurgie d'ablation de la prostate au laser sous IRM d'une durée maximale de quatre heures, porte une sonde urinaire et reste isolé trois jours avant d'être tué pour prélever la prostate. Le porteur indique que le dispositif vise le cancer et l'hyperplasie de la prostate chez l'homme, et que cinq points de données sont exigés par la FDA. Il affirme qu'un organisme complet et vivant est "indispensable" pour valider le dispositif.

Objectifs

Le dispositif médical en développement est utilisé pour nécroser ou coaguler, de manière locale précise, les tissus mous par thérapie thermique interstitielle sous guidage par imagerie à résonance magnétique (IRM). Ce système de thérapie se compose d'une unité laser mobile et d'applicateurs laser. La lumière laser générée est appliquée localement au moyen d'applicateurs laser à usage unique. Le logiciel de thermométrie par résonnance magnétique est la troisième partie du dispositif médical et est conçu pour aider l'utilisateur à déterminer et à visualiser les changements relatifs de la température des tissus pendant la thérapie. Lorsqu'il est utilisé pour surveiller l'ablation thermique, le logiciel peut également calculer les dommages thermiques induits par les dispositifs d'ablation. Ce projet vise donc à évaluer l'utilisation de l’ensemble du dispositif à différents niveaux : 1) Démontrer la sécurité d'utilisation du système lors d’ablations de tissus mous prostatiques et fournir des données sur la précision et la prévisibilité de l'estimation de la dose thermique du système. 2) Démontrer que le logiciel permet de prédire avec précision l'étendue des lésions trois jours après le traitement, par rapport aux résultats histopathologiques. 3) Mesurer le taux de mise à jour et le décalage par rapport au temps réel avec des séquences de thermométrie par résonnance magnétique.

Bénéfices attendus

Ce dispositif permettra d’aider le clinicien utilisateur à déterminer et à visualiser les changements relatifs de température des tissus pendant le traitement. Lorsqu'il est utilisé pour surveiller l'ablation thermique, le logiciel peut également calculer les dommages thermiques induits par le dispositif d'ablation. L'évaluation précise des dommages thermiques immédiatement après le traitement n'est pas triviale en raison d'une variété de réponses cellulaires, vasculaires et inflammatoires qui se produisent au sein du tissu. Des lésions tissulaires au cours d'une intervention thermique peuvent provoquer une apoptose ultérieurement, d'où la nécessité de les évaluer avec précision afin de prédire et anticiper les dommages ultérieurs et adapter les soins post-opératoires nécessaires. L’utilisation de ce dispositif est particulièrement indiquée pour le traitement du cancer de la prostate ou l’hyperplasie benigne de la prostate. Ce dispositif médical pourra être appliqué à l’Homme, après avoir démontré sa sécurité chez l’animal, ainsi que sa capacité à prédire avec précision les dommages auxquels nous pouvons nous attendre.

Procédures

Sur animal vigile, des prélèvements sanguins pour analyses hémato-biochimiques pourront être réalisés avant l’intervention, puis pendant le suivi post-opératoire et en fin d’étude. Les volumes sanguins prélevés seront faibles (moins de 20mL) et représenteront moins de 3% du volume sanguin total de l’animal. Cependant, nous prendrons en compte le temps de repos nécessaire entre deux prélèvements, selon les recommandations en vigueur chez cette espèce. La procédure chirurgicale (unique) sera réalisée sous anesthésie générale et durera au maximum 4h. Ce test sera réalisé sous IRM.

Impact sur les animaux

Après réception des animaux, un prélèvement sanguin (environ 4mL) sera réalisé sur animal vigile via la veine jugulaire, dans le but de réaliser un bilan hémato-biochimique d’inclusion et donc s’assurer qu’il n’existe pas d’anomalie au niveau de ces paramètres sanguins. L’intervention sera réalisée sous anesthésie générale et ce temps d’anesthésie sera d’environ 4h (prise en compte de toute la partie préparation de l’animal, installation dans l’IRM et intervention avec le dispositif). Cette durée aura donc un impact sur le réveil des animaux. Nous pouvons nous attendre à une douleur après intervention (douleur qui sera prise en charge) et une inflammation des tissus environnants la prostate, provoquant une difficulté à uriner pour les chiens. Ainsi, en fin d’intervention, une sonde urinaire avec valve anti-reflux sera installée chez les chiens qu’ils garderont jusqu’à leur euthanasie 3 jours plus tard. Cela impliquera donc un hébergement en individuel après l’intervention pendant 3 jours. Des prélèvements sanguins pour analyses hémato-biochimiques pourront être réalisés avant l’intervention, puis pendant le suivi post-opératoire et en fin d’étude avant mise à mort des animaux. Les volumes sanguins prélevés seront faibles (moins de 20mL) et représenteront moins de 3% du volume sanguin total de l’animal. Cependant, nous prendrons en compte le temps de repos nécessaire entre deux prélèvements, selon les recommandations en vigueur chez cette espèce.

Devenir

Les animaux inclus dans les procédures expérimentales seront mis à mort, car des prélèvements d'organes, notamment de la prostate, devront être effectués pour analyses histopathologiques. En revanche, les animaux de réserve non inclus dans les procédures principales, seront gardés en vie et réutilisés pour d'autres projets. Le vétérinaire validera systématiquement le devenir des animaux, en tenant compte de leur utilisation, des leur état de santé, et des possibilités éventuelles de réutilisation.

Remplacement

Des premiers tests in vitro ont été réalisés en amont, afin de tester le dispositif avec le laser. En revanche, l’évaluation précise des dommages thermiques immédiatement après le traitement n'est pas triviale en raison d'une variété de réponses cellulaires, vasculaires et inflammatoires qui se produisent au sein du tissu, limitant ainsi notre capacité à le simuler in vitro. Le dispositif étant à visée clinique, il est nécessaire d’obtenir des données dans ces conditions réelles d’utilisation, ainsi l'utilisation d'un organisme complet et vivant est indispensable notamment pour le suivi post-opératoire.

Réduction

Une étude pilote sur 3 animaux sera réalisée en amont des études principales afin que la courbe d'apprentissage des opérateurs n'affecte pas les résultats finaux. Elle permettra d’être plus reproductible sur le traitement thermique et la prise de mesures, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires pour les études principales. À la demande de la FDA, au moins 5 points de données sont requis, afin d'obtenir une variation biologique suffisante et statistiquement significative. Par conséquent, nous prévoyons pour chacune des études principales, l’utilisation de 5 animaux + 2 animaux de réserve. Si les deux animaux de réserve ne sont pas utilisés, ils pourront intégrer une autre étude ou intégrer le troupeau permanant.

Raffinement

Les animaux auront une période d’acclimatation dans l’animalerie d'au minimum 14 jours avant le début des procédures expérimentales. Pendant cette durée, les chiens seront hébergés collectivement. Les animaux feront l'objet d'un conditionnement positif, basé sur des intéractions amicales avec les personnels en charge des soins, et l'administration de récompenses lors de différents exercices (monter sur la balance, s'immobiliser, se coucher, etc.), ceci afin de permettre des manipulations sans stress et avec un minimum de contraintes. Tous les animaux recevront un enrichissement du milieu adapté à leur espèce, régulièrement renouvelé (rotation des jouets par exemple). Des moments de récréation et de jeux avec les soigneurs seront mis en place. Utilisation de l’imagerie par IRM, qui est une modalité d’imagerie non-invasive et non-ionisante, contrairement à d’autres techniques. Tout au long de l’intervention sous anesthésie générale, les chiens seront monitorés par du personnel formé et habitué à travailler chez cette espèce animale. Une personne sera également présente en salle de réveil (salle chauffée), jusqu’au réveil complet des animaux. Après intervention et jusqu’à la fin de l’étude (pendant donc 3 jours), des traitements post-opératoires seront mis en place : analgésique, anti-inflammatoire, antibiotique et antispasmodique. L’intervention induira une inflammation des tissus environnants la prostate, avec possiblement une influence sur la capacité des chiens à uriner. Ainsi une sonde urinaire avec valve anti-reflux sera mise en place, impliquant donc un hébergement en individuel. Des techniciens et vétérinaires formés seront ainsi mobilisés pour gérer ces sondes et poches urinaires plusieurs fois par jour. De plus, un contact plus régulier avec le personnel sera mis en place pour les chiens hébergés en individuel. Un contact visuel et olfactif entre les chiens sera conservé en post-intervention. Toute observation sur la clinique des animaux sera remontée au vétérinaire désigné qui prendra les décisions adéquates. Des points limites suffisamment prédictifs sont mis en place, afin d’éviter toute forme de souffrance inutile.

Choix des espèces

Le modèle canin est l'un des rares modèles animaux qui offre une prostate de taille suffisante pour une thérapie thermique au laser, comparable en termes de taille à la prostate humaine. Adultes, pour garantir que la taille de la prostate est suffisante pour réaliser le traitement et être représentative d'un traitement chez l'Homme.

74 animaux non-humains, 64 cochons et 10 chiens, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures de niveau modéré. Ils subissent sous anesthésie l'implantation d'un dispositif dans l'estomac puis jusqu'à cinq prises de sang sur trois mois, avant d'être tués pour prélever leurs organes, afin de mettre au point une alternative à la chirurgie de l'obésité développée par une entreprise. Le porteur indique que la chirurgie provoque douleur et perte d'appétit et que le dispositif peut entraîner une inflammation digestive ou une obstruction. Il affirme que la complexité du système digestif rend l'usage d'un "organisme complet et vivant" "indispensable" pour valider le produit avant sa pose chez l'humain.

Objectifs

L’objectif du projet est de développer une solution innovante afin de traiter l’obésité de manière aussi efficace que la chirurgie de réduction de volume de l'estomac, tout en évitant les complications associées. Notre dispositif est aussi une alternative aux ballons intra-gastriques qui sont actuellement utilisés. Plusieurs essais sur des cadavres humains et animaux ont déjà été menés pour mettre au point le dispositif ainsi que son déploiement et son ancrage dans le tube digestif. Désormais, nous devons passer à une phase animale pour démontrer l'inocuité sur le moyen terme de notre dispositif, et pour prouver qu'il reste en place, malgré les conditions chimiques et le péristaltisme digestif. Nos études sont menées en parrallèle entre le laboratoire in vivo et les ateliers de mise au point et d'ingenierie médicale. Suite à chaque essai in vivo, les améliorations sont apportées au prototype. Dès que le prototype sera considéré satisfaisant, il sera mis en place chez l'humain pour des essais cliniques.

Bénéfices attendus

L’obésité est définie comme une présence anormale ou excessive de graisse représentant un risque pour la santé. Ce problème est devenu épidémique avec près de 4 millions de personnes dans le monde, décédant de comorbidités liées au surpoids et à l’obésité chaque année. D’après la World Health Organization, près de 39% des adultes dans le monde, représentant près de 1.9 milliards de personnes, étaient en surpoids en 2016. On estime aujourd’hui que plus de 700 millions de personnes souffrent d’obésité. Bien que l’efficacité de la chirurgie bariatrique, qui réduit le volume de l'estomac, ne soit plus à démontrer, seul 1% des patients éligibles décident de se faire opérer à cause du risque de complications sévères et des modifications anatomiques irréversibles. Et pour les solutions moins invasives, comme les ballons gastriques, elles sont aujourd’hui associées à une perte de poids limitée et temporaire. Ce projet est nécessaire pour le développement d’une solution qui sera posée, chez l'humain, par voie endoscopique afin de traiter l’obésité de manière aussi efficace que la chirurgie tout en minimisant les complications associées. En effet, il permettra de vérifier la sécurité et potentiellement l'éfficacité des dispositifs développés par l’entreprise.

Procédures

Les animaux subiront, principalement, une chirurgie, sous anesthésie générale, pour la mise en place du dispositif directement dans l'estomac. Puis, après leur réveil, ils recevront les soins post-opératoires pour une reprise d'alimentation normale. Des prises de sang sont prévues avant la chirurgie, pour évaluer les paramètres basaux des animaux, puis après la chirurgie, pour suivre l'évolution de ces paramètres et vérifier si le dispositif engendre des dérèglements. Un maximum de 5 prises de sang de 10 ml est prévu pendant les 3 mois du protocole. Elles ont lieu sous anesthésie pour les porcs et sur animal vigile pour les chiens. D'autre part, dans la période post-opératoire, les porcs et chiens devront être hébergés seuls pour une durée de 3 jours, mais dans des boxes confortables, et permettant à chaque porc et chien de voir, sentir et toucher ses confrères voisins quand ils le souhaitent.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables les plus prévisibles sont ceux que la chirurgie va provoquer : douleur, perte d'appétit, inconfort, suite à la chirurgie abdominale. D'autres effets indésirables pourraient intervenir si le dispositif n'est pas bien toléré. Il peut s'agir d'inflammations du tube digestif, ou d'autres phénomènes vasculaires localisés au niveau du site d'implantation. Si le dispositif ne reste pas en place, il peut aussi provoquer une obstruction digestive. Nous attendons très peu d'effets indésirables des prélèvements sanguins, dont le volume est réduit au regard du poids des porcs et des chiens.

Devenir

A l'issue des procédures les animaux seront euthanasiés pour le prélèvement d'organes pour des analyses macroscopiques et histologiques.

Remplacement

Ce projet vise à confirmer l’adéquation du dispositif en cours de développement avec le système digestif. Avant d’initier ce projet, des essais sur sujets anatomiques humains et animaux ont été effectués afin de confirmer les dimensions des prototypes en cours de développement. De plus, des essais in vitro ont été réalisés en laboratoire afin de simuler le déploiement du dispositif ainsi que son comportement lors de contraintes mécaniques simulant le péristaltisme. Néanmoins, la complexité et l’adaptabilité du système digestif limitent notre capacité à simuler l’environnement exact. Le dispositif étant à visée clinique, il est nécessaire d’obtenir des données dans ses conditions réelles d’utilisation, ainsi l'utilisation d'un organisme complet et vivant est indispensable notamment pour le suivi post implantation. Notre stratégie prévoit d’utiliser un maximum de 64 porcs et 10 chiens pour la totalité du projet comprenant une étude pilote, une preuve de concept et enfin une étude de validation de l’innocuité du dispositif. Nous fonctionnons pas à pas, et le projet sera arrêté si chaque phase ne permet pas d’obtenir les résultats escomptés.

Réduction

Avant d’effectuer les études de preuve de concept, une première phase avec une étude pilote sera effectuée en utilisant un nombre réduit d’animal afin de valider que le dispositif s'ancre et se déploie correctement. Pour tester le dispositif candidat. Le nombre d'animaux utilisés a été réduit au minimum et a été calculé pour obtenir une puissance statistique suffisante. Mais surtout, notre approche est progressive : nous réalisons des études successives, en améliorant le dispositif à chaque fois. Dès que nous estimons qu'il est au point, l'étude de preuve de concept s'arrête et nous réalisons une seule étude de tolérance. Le nombre d'animaux présenté ici est donc un nombre maximum d'animaux, qui peut être réduit si nous développons un dispositif satisfaisant rapidement.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect de leurs besoins éthologiques avec enrichissements propres à l’espèce. : ils disposent de vastes boxes, d'une taille supérieure à celle requise par la législation. Le suivi quotidien des animaux et les pesées hebdomadaires sont assurés par le personnel technique et animalier formés aux soins et à la manipulation de ces espèces. Les animaux suivront également un programme de socialisation afin de réduire le stress engendré par les actes quotidiens. Tout acte douloureux ou fortement stressant sera réalisé sous sédation ou sous anesthésie (locale ou générale selon les besoins). Si nécessaire, la douleur sera prise en charge par l'administration de traitements analgésiques adaptés. En cas de perte de poids importante se rapprochant des 20%, les rations pourront être enrichies avec une solution de nutrition entérale hyperénergétique.

Choix des espèces

Nous prévoyons d’utiliser les modèles porcin et canin car tous deux possèdent une anatomie et une physiologie du système gastro-intestinal très proches de celle de l’homme. Les deux modèles seront utilisés de manière complémentaire, le modèle chien principalement pour des dispositifs transpyloriques grâce à l’absence de torus pylorique et le modèle porc principalement pour des dispositifs avec « chaussette » de 60cm car nettement moins sujet aux intussucepions. Ainsi en fonction du dispositif testé, le modèle animal qui sera choisi sera celui qui, par son anatomie et sa physiologie, sera le plus approprié pour obtenir les données les plus robustes. Pour les porcs le critère de sélection principal sera le poids (environ 50-100kg) afin d’avoir des correspondances anatomiques similaires à celles observées en clinique. Cela correspondra à des animaux adolescents/adultes. Pour les chiens, nous prendront des chiens adultes qui ont auront terminé leur croissance.

Une chienne Border Collie va être utilisée, dans une procédure impliquant un niveau de souffrance modéré, puis proposée à l'adoption. Elle subit sous anesthésie générale une biopsie d'un muscle de la cuisse, acte que le porteur décrit comme douloureux pendant et après la chirurgie, avec un risque de complications au site opératoire. La biopsie doit fournir une lignée de cellules saines servant de contrôle face aux cellules de quatre chiens de la même portée atteints d'une myopathie génétique. Le porteur affirme qu'un prélèvement de tissu chez l'animal ne peut être évité, tout en revendiquant que cette lignée contribuera ensuite au remplacement de l'animal in vitro.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires sont un groupe de maladies génétiques humaines rares touchant le muscle, liées à des mutations dans différents gènes, ayant en commun des lésions du muscle typiques, une faiblesse et une fonte des masses musculaires. Parmi les gènes en cause, une mutation du gène codant pour la dynamine 2 (DNM2) qui entraîne une augmentation de l'activité de la protéine est responsable de formes autosomales dominantes (=mutation présente sur 1 chromosome suffisante pour entraîner la maladie). Récemment, il a été démontré sur des modèles in vitro et dans des modèles murins, que la répression du gène DNM2 permet d'apporter un bénéfice thérapeutique, non seulement dans le cas de la myopathie centronucléaire liée à DNM2, mais aussi dans d'autres formes de myopathies centronucléaires. Cette approche pourrait donc constituer une thérapie génique commune pour tout ce groupe de maladies, bien que liées à des mutations dans des gènes différents. Récemment, un cas de myopathie centronucléaire a été identifié chez un chien Border Collie de compagnie âgé de deux ans, présentant une atrophie musculaire et une faiblesse locomotrice. La mutation en cause a été identifiée et se trouve dans le gène DNM2. Elle est identique à la mutation la plus fréquemment diagnostiquée chez les patients humains. Une portée issue de ce chien a été obtenue, confirmant que cette mutation est bien responsable d'une myopathie centronucléaire peu invalidante, lentement évolutive, et similaire à la maladie humaine. Afin de développer une thérapie génique innovante permettant de réduire la quantité de DNM2, et avant d'envisager les essais précliniques in vivo, il est nécessaire de valider les candidats-médicaments in vitro. Pour ce faire, des biopsies musculaires ont été effectuées sur les 4 chiens porteurs de la mutation (descendance du border collie), mises en culture avec succès au cours d'un projet précédemment autorisé. Afin de disposer d'un contrôle sain, il apparaît nécessaire d'obtenir des cellules de la soeur de portée de ces 4 chiens, non porteuse de la mutation. Ce projet a donc pour objectif la réalisation d'une biopsie musculaire sur cette chienne, en vue d'une mise en culture. Cela contribuera à une validation approfondie du traitement de thérapie génique en cours de mise au point pour ce modèle, et plus largement pour une application à l'ensemble des myopathies centronucléaires humaines.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de disposer d'une lignée stable utilisable comme contrôle sain des cellules issues des animaux malades, déjà disponibles, pour effectuer in vitro toutes les étapes qui peuvent l'être avant de passer à l'in vivo, dans une optique de remplacement.

Procédures

L'animal subira une biopsie d'un muscle de la cuisse sous anesthésie générale, avec une analgésie adaptée. La durée totale (de l'anesthésie au réveil) de l'intervention sera d'environ une heure.

Impact sur les animaux

La biopsie musculaire peut être un acte douloureux, tant pendant qu'après la chirurgie. Cette douleur sera prévenue par administration de morphiniques. Malgré le soin apporté à l'asepsie chirurgicale et aux sutures, des complications sur le site opératoire sont possibles (mais très rarement rencontrées) : collection liquidienne sous-cutanée, déhiscence des points, infection de la plaie (exceptionnel) par exemple. Les soins vétérinaires adaptés seront apportés au cas par cas.

Devenir

La chienne sera proposée à l'adoption, étant une chienne saine et la récupération attendue à l'issue de ce projet étant complète.

Remplacement

L'établissement d'une lignée de cellules musculaires issues d'un animal directement apparenté aux animaux malades dont les cellules sont déjà utilisées ne peut s'affranchir d'un prélèvement de tissu chez l'animal. Par contre, l'établissement de cette lignée contribuera au remplacement dans les étapes de mise au point de produits thérapeutiques, limitant donc au maximum les étapes de validation chez l'animal.

Réduction

Un prélèvement sur un seul animal (par ailleurs le seul existant) de la même portée que les animaux malades, dont les cellules ont déjà fait l'objet d'une mise en culture, sera nécessaire et suffisant pour obtenir la quantité de cellules musculaires nécessaires pour mettre en oeuvre les expériences prévues in vitro. Cette quantité sera également suffisante pour répéter la procédure plusieurs fois si jamais la première tentative ne fonctionnait pas.

Raffinement

Les biopsies musculaires seront réalisées chirurgicalement, sous anesthésie générale, et une analgésie adaptée sera mise en place. La cicatrisation de la plaie sera suivie quotidiennement dans les jours suivant la biopsie, et jusqu'au retrait des points cutanés 12 jours après. Sur le plan de l'hébergement, la chienne sera hébergée sur litière, et aura à sa disposition une plateforme, une corbeille de couchage et des jouets. Elle bénéficiera de sorties quotidiennes 7j/7 et d'interactions quotidiennes avec l'Homme. Un vétérinaire est présent 7j/7.

Choix des espèces

Sans doute parce qu'il coévolue avec l'Homme depuis sa domestication, le chien, lorsqu'il est atteint par une maladie génétique, développe des signes cliniques proches de ceux des patients. C'est le cas des maladies neuromusculaires, telles que la myopathie centronucléaire (CNM): plusieurs chiens ayant développé des CNM liées à des mutations dans des gènes connus chez l'Homme ont été décrits, et manifestent des signes cliniques semblables à ceux des patients. Une portée générée à partir du border collie présentant la mutation spontanée dans le gène DNM2 a pu permettre une première description des 4 chiens malades rapprochant les signes cliniques et anomalies fonctionnelles observées de la maladie humaine. Il existe d'autres modèles spontanés canins de CNM liées à différents gènes, et le développement d'une thérapie "multi-myopathies" ciblant DNM2 dans notre modèle permettrait de réaliser une preuve de concept dans d'autres CNM canines avant un essai clinique. La chienne est maintenant une jeune adulte de 4 ans. Des cellules musculaires peuvent être cultivées à partir de biopsies musculaires issues d'animaux de tout âge.