Lapins

18 404 animaux non-humains, dont 13 048 rats, 2 780 souris et 2 576 lapins, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un produit par gavage quotidien pendant jusqu'à seize semaines, les femelles subissent des lavages vaginaux répétés et une partie des animaux a été ovariectomisée ou castrée, pour évaluer la toxicité de produits sur la reproduction selon des lignes directrices réglementaires. Le porteur indique que le produit testé peut altérer l'accouplement, la gestation, la mise bas et le développement des descendants, et que la nature des nuisances dépend de chaque substance. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne remplace ces essais et les présente comme "indispensables" à la mise sur le marché.

Objectifs

Ce projet doit permettre l’évaluation de la toxicité d’un produit chez le rongeur et le lagomorphe sur les fonctions de reproduction notamment, et/ou sur la santé, conformément aux lignes directrices : - ICH M3 (R2), S5 (R2). - OCDE 421 et/ ou 422. - OCDE 440 et/ou 441. Les procédures peuvent être indispensables pour une mise sur le marché ou un enregistrement de produit, et permettre la sélection de doses pour des études postérieures. Les études de cette procédure permettent aussi l’évaluation du risque en termes d’exposition en fournissant des informations sur les effets toxiques majeurs (détermination d’une dose sans effet adverse, d’une marge de sécurité pour l’utilisation/exposition humaine).

Bénéfices attendus

Ces études permettent d’intégrer globalement l’impact de l’exposition maternelle (notamment en termes de biodistribution et de métabolisme) ou l’impact global sur la fonction de reproduction (production, transport des gamètes, fécondation, implantation, parturition, lactation, développement post-natal précoce). En effet, à ce jour, l’ECVAM propose quelques modèles in vitro permettant d’identifier le potentiel tératogène de certains produits, mais des études in vivo restent indispensables pour une évaluation complète de l’exposition maternelle à certains produits. Les études réalisées selon les lignes directrices OCDE 440/441 correspondent au Niveau 3 de test de screening in vivo dans le contexte du « Cadre conceptuel de l'OCDE pour les essais et l'évaluation des perturbateurs endocriniens » (GD 150 (OCDE, 2018)) et ne sont effectuées uniquement si elles sont identifiées comme nécessaires dans le contexte de la démarche et dans la suite des tests précédents, comme test de screening essai in vivo fournissant des données sur un seul mécanisme endocrinien.

Procédures

Les animaux sont traités le plus souvent par voie orale (gavage ou mélange alimentaire) de façon journalière (jusqu’à 16 semaines, mais dépend du type d’étude), avec un produit, pour évaluer l’effet de ce produit sur l’appareil reproducteur. Avant accouplement, les femelles sont soumises à des lavages vaginaux pour observer les cycles œstraux (jusqu’à 5 semaines). Les petits générés sont soumis à des tests non invasifs de suivi de développement sexuel ou de maturité sexuelle (jusqu’à positivité du test), observations ophtalmologiques (en général 1 occasion par étude), mesures de pattes (1 à 2 fois par semaine jusque l’âge adulte), évaluations du comportement et/ou des signes neurologiques (ex : batterie de tests fonctionnels, en général 1 occasion par étude). Des prélèvements sanguins et urinaires sont également possibles pour bilan hémato-biochimique ou hormonal par exemple ; ils sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations en vigueur. Chaque technique (administration par voie orale, réalisation d’un frottis vaginal, examen ophtalmologique, mesure de la longueur de la pattes, évaluation du comportement) dure moins d’une minute par paramètre par animal. Les animaux utilisés dans le cadre des OCDE 440/441 pourront avoir fait l’objet d’une chirurgie (femelles ovariectomisées ou mâles castrés), tel que demandé par les lignes directrices. Cette chirurgie aura été réalisée chez le fournisseur d’animaux, selon autorisation du fournisseur.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent essentiellement aux effets du produit administré, qui peut cibler chaque phase du cycle de reproduction : altérations du comportement à l’accouplement, des difficultés à la nidation, à la gestation, à la mise-bas, à la lactation, des altérations du comportement maternel et du développement sexuel des adultes ainsi que du développement fœtal et post-natal des descendants. La toxicité du produit administré peut cibler chaque phase. L’inconfort lié aux procédures (prélèvements, administration répétée) et des effets systémiques (ex : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) peuvent aussi être observés.

Devenir

La caractérisation de l’effet de l’administration de produits comprenant l’évaluation des tissus et organes cibles, tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour ces types de procédure en raison de la complexité que représente un organisme vivant et celle des processus de développement des concepti et des échanges dynamiques entre mère et descendance. Ces études in vivo, ne sont effectuées uniquement si elles sont identifiées comme nécessaires au cours de cette démarche et dans la suite des évaluations et tests précédents. Les études réalisées selon les lignes directrices OCDE 440/441, font partie d’une batterie d’essais in vitro et in vivo permettant d'identifier les substances susceptibles d’interagir avec le système endocrinien, et, à terme, d’évaluer les risques et les dangers pour la santé humaine ou l’environnement.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est en moyenne de 20 par sexe afin d'obtenir au moins 16 portées par groupe permettant d'avoir des résultats cohérents. Au-dessus de 20-24, il n'y a pas d'amélioration de la cohérence et de la précision des résultats. Ce nombre de portées par groupe (entre 16 et 20-24) est recommandé par la ligne directrice ICH. Le nombre d’animaux par groupe est lui aussi celui recommandé dans les lignes directrices ICH ou OCDE, et correspond au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats fiables et atteindre les objectifs de l’étude.

Raffinement

L'état de santé des animaux est contrôlé tous les jours et évalué par rapport à des points limites définis de façon à éviter tout inconfort ou souffrance prolongé(e). Si nécessaire, un vétérinaire peut intervenir, mais si la souffrance d'un animal est jugée trop importante et si aucun soin ne peut lui être apporté, il sera euthanasié selon une procédure éthiquement acceptable (i.e., en conformité avec la réglementation en vigueur). Des enrichissements variés (buchette en bois, tunnel, coton, litière…) sont fournis aux animaux permettant le fouissement et la nidification. En cas de plaie et/ou douleur, possibilités de traitement avec un cicatrisant cutané local et/ou un anti-inflammatoire. En cas d’observations dommageables dans le comportement sexuel et maternel des animaux ou de la mise bas et du développement post-natal par exemple, des mesures seront prises dès que possible pour réduire la souffrance des animaux.

Choix des espèces

Les lagomorphes ou rongeurs, notamment le rat, sont les espèces de choix car : - recommandées par les lignes directrices et pertinentes pour atteindre les objectifs des études, - présentent notamment une gestation courte, un hébergement facile, pas de reproduction saisonnière, un nombre conséquent de descendants par portée, - beaucoup d'études de toxicologie générale et de reproduction sont réalisées chez le rat, ce qui permet une bonne comparabilité aux autres études du projet, - font l’objet de données historiques robustes, - l'utérus des rattes est considéré (notamment par les lignes de l'OCDE 440) comme un organe cible approprié pour le dépistage in vivo des agonistes et des antagonistes des œstrogènes, puisque les tissus utérins répondent par une croissance rapide et vigoureuse à la stimulation par les œstrogènes, - l’emploi de rats castrés et des cinq tissus sexuels cibles est jugé pertinent par les lignes directrices de l'OCDE 441 pour le dépistage in vivo d’agonistes et d’antagonistes des androgènes et d’inhibiteurs de 5α-réductase. Le produit sera administré à des animaux juvéniles ou adultes (jeunes ou moins jeunes en fonction de la durée de traitement avant accouplement), car les animaux doivent être sexuellement matures au moment des accouplements et doivent correspondre aux âges requis par les lignes directrices. Dans les OCDE 440/441 : conformément aux exigences des lignes directrices associées, le produit pourra être administré à des animaux ayant subis une chirurgie (femelles ovariectomisées ou males castrés), car l’activité endocrine endogène des animaux doit être réduite au minimum afin de pouvoir évaluer l’effet du produit seul. Les petits qui naissent dans le cadre de certaines études (OCDE 421/422), seront gardés pendant une partie de la lactation (selon les lignes directrices ; observation du développement des petits pendant les premières périodes de vie).

39 600 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit l'injection d'un produit pharmaceutique et sa température est suivie, pour détecter d'éventuelles substances provoquant de la fièvre, environ un lapin sur cinq servant à un second test avant sa mise à mort. Le porteur reconnaît qu'un test sans animaux, décrit dans la Pharmacopée européenne, peut être une "vraie alternative", mais maintient l'essai sur lapins parce qu'il reste inscrit comme obligatoire dans les dossiers d'autorisation. Il présente le nombre et l'espèce comme fixés par les Pharmacopées.

Objectifs

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées internationales, qui sont les référentiels pharmaceutiques pour la réalisation des tests de contrôle qualité. L’objectif de ce test est de détecter la présence de molécules pyrogènes, c’est-à-dire pouvant provoquer une augmentation de la température, à l’intérieur de produits pharmaceutiques, médicaments expérimentaux ou de dispositifs médicaux. Pour cette détection, le produit à tester est injecté à un groupe de lapins, et la température de ces animaux est mesurée afin de déterminer la hausse de température éventuelle.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est de pouvoir mettre à disposition des médicaments ou des dispositifs médicaux à des patients. Ce test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM. Dans ce cadre, ce test est obligatoire comme test libératoire de produits pharmaceutiques.

Procédures

Injection de NaCl 0.9% en intraveineuse (10mL /kg) -Injection de l’échantillon à tester en intraveineux (IV) à la dose maximum de 10 ml/kg ou en intra-musculaire (IM) à 1 ml/lapin maximum -Contention de l’animal durant l’essai.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour l’animal sont : -L’administration des produits pharmaceutiques, -L’euthanasie de l’animal utilisé en fin de protocole, - La contention de l’animal durant le test.

Devenir

Tous les animaux entrant en test pyrogène sont mis à mort : -soit en cas de détection d’un signe clinique -soit à la fin de la réalisation des tests pyrogènes -soit s’il ne réussit pas le prétest 2 fois consécutives, et n’est donc pas éligible pour un test pyrogène A noter néanmoins qu’environ 20% des lapins effectuent un deuxième test pyrogène (réutilisation) avant d’être euthanasiés.

Remplacement

Le test pyrogène sur lapins est décrit dans les Pharmacopées, et dans de nombreux dossiers d’AMM de clients. Dans ce cadre, ce test est obligatoire réglementairement comme test libératoire de produits pharmaceutiques. Cet essai ne peut pas aujourd’hui être réalisé ex vivo pour plusieurs raisons : -Le test des endotoxines bactériennes, qui peut être utilisé comme variante au test pyrogène, ne détectera que les molécules type endotoxines, alors que le test sur lapins pourra détecter tout type de molécules pyrogènes. -Il existe maintenant le test MAT qui est décrit dans la Pharmacopée européenne, et peut être une vraie alternative au test pyrogène. En revanche ce test peut ne pas être validable pour certains produits pour cause d'interférences. -Il s’agit d’un test réglementaire, obligatoire à partir du moment où il est enregistré dans le dossier d’AMM (autorisation de mise sur le marché) du produit.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé est défini par les Pharmacopées (entre 3 et 5 lapins selon les Pharmacopées – note : 3 lapins sont usuellement utilisés) ou le cas échéant dans les dossiers d’AMM des scientifiques. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, une réutilisation des lapins est possible dans un même projet dans la mesure où un lapin ne reçoive pas deux produits immunisants (exemple : antibiotique).

Raffinement

Hébergement : Les Pharmacopées demandent que les lapins utilisés en test pyrogène soient hébergés individuellement or la directive européenne exige un hébergement en groupe sociaux. Afin de respecter la pharmacopée tout en préservant au mieux le besoin d'hébergement social les lapins sont stabulés 2 par cage de 4329 cm². Présence d’une séparation avec ouverture, permettant aux 2 animaux de se déplacer librement sur toute la surface de la cage. La veille du prétest ou test, l’ouverture est condamnée, et chaque lapin est donc stabulé individuellement dans une demi-cage. Quand l’hébergement par groupe de 2 n’est pas possible (ex : incompatibilité sociale) : Stabulation d’un seul lapin dans une cage de 4329 cm² tout en gardant le contact visuel et olfactif avec ses congénères. Enrichissement : Des enrichissements sont fournis aux animaux (e.g. balles de foins, balles en plastique). Surveillance : Pendant la procédure, la présence permanente d'un technicien est planifiée et l’état clinique général des animaux est vérifié toutes les heures après l’injection jusqu’à la fin de l’essai, et la durée d’enregistrement des températures après l’injection est limitée à 5h30 maximum. Les animaux sont ensuite replacés dans leurs cages de stabulation pour qu’ils aient un accès à l’eau et l’aliment. Autre : Lorsque cela correspond à un raffinement de la méthode, l’administration d’un produit approuvé au préalable par le service vétérinaire peut être utilisé dans le cadre d’un test pyrogène (exemple : injection de glucose 5% lors d’un essai de test pyrogène d’une insuline).

Choix des espèces

Le lapin est l’espèce requise par les Pharmacopées pour la réalisation de ce test. Le poids des lapins minimum pour la réalisation de ce test est de 1.5kg (lapins adultes) en accord avec les exigences des pharmacopées.

65 lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisés dans d'autres expériences. Chaque lapin subit une chirurgie d'environ vingt minutes sous anesthésie pour la pose d'un cathéter veineux central, dans le but d'offrir ce dispositif à des chercheurs dans le cadre de prestations ou de collaborations. Le porteur affirme qu'aucune douleur n'est attendue et que les animaux supportent très bien le cathéter et le gilet. Le projet installe le cathéter pour faciliter les prélèvements et injections des expériences ultérieures auxquelles ces lapins seront soumis.

Objectifs

Un cathéter veineux central (CVC) est un tube mince et flexible, introduit dans une veine de la base du cou (jugulaire) ou du thorax (sous clavière) jusqu’à atteindre la veine cave supérieure. Ce dispositif, couramment mis en place chez l’homme en clinique, peut permettre l’injection de traitements par voie intra-veineuse (IV), la perfusion de sang ou de plaquettes, le prélèvement d’échantillons sanguins ou encore la mise en place d’une nutrition parentérale (injection d’éléments nutritifs par voie IV). Le but de ce projet est d’offrir les mêmes possibilités à notre modèle animal qu’est le lapin dans le cadre de prestations ou collaborations avec d’autres chercheurs. 65 lapins cathétérisés sont prévus pour l’année 2022.

Bénéfices attendus

La mise en place d’un CVC apporte plusieurs avantages : -réduction du nombre d’injections et de piqûres d’aiguille ; -atténuation de l’endolorissement/sensation de brûlure parfois causés par un traitement IV administré par une perfusion standard périphérique ; -accroissement du confort et réduction de l’anxiété chez les lapins nécessitant un traitement IV ou des prélèvements sanguins à répétition.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale d’environ 20min sous anesthésie et analgésie pour la pose d’un cathéter veineux central.

Impact sur les animaux

La nuisance la plus importante est lié à l’opération chirurgical en elle-même. Cependant, tout sera mis en œuvre pour limiter au maximum la douleur des animaux (anesthésie + analgésie pré et post-opératoire). D’après notre expérience, les animaux supportent très bien le cathéter ainsi que le gilet. Aucune douleur n’est attendue.

Devenir

Au terme de la procédure, tous les animaux seront utilisés pour des expériences nécessitant des prélèvements ou des injections qui seront facilités par le cathéter limitant ainsi les effets néfastes pour les animaux.

Remplacement

Différents types d’étude seront réalisés chez les lapins cathétérisés : analyse pharmacocinétique d’un nouveau composé, tests de toxicité, évaluation de l’efficacité de nouvelles thérapies. L’ensemble de ces utilisations met en jeu l’organisme dans son entièreté et rend le remplacement du modèle animal difficile.

Réduction

Dans un objectif de Réduction, le nombre d’animaux choisi correspond au minimum de lapins qui nous est habituellement commandé sur une année. Cependant il est possible que ce chiffre varie à la hausse (demande d’industriels). Dans le cas d’une demande plus importante, une nouvelle demande d’autorisation de projet sera rédigée. Le nombre de lapins sera de 65 sur 1 an.

Raffinement

Dans un objectif de Raffinement, la procédure de pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale par du personnel qualifié. Le design du gilet utilisé pour le maintien du cathéter permet la libre circulation de l’animal dans sa cage sans risque d’arrachement. Les conditions d’hébergement ont également été optimisées par l’enrichissement du milieu. Enfin, l’utilisation de l’analgésique buprénorphine a été mise en place pour réduire la douleur liée à l’opération.

Choix des espèces

Le lapin est un modèle de choix pour les essais impliquant des actes chirurgicaux. Sa taille facilite la mise en place de matériel médical tels que les cathéters. De plus, le lapin est en certains points (notamment immunitaire), plus proche de l’homme que la souris, notamment pour les études s’intéressant aux infections bactériennes. Les lapins seront utilisés lorsqu’ils auront atteint un poids compris entre 2,8 et 3,3kg, soit environ 10-12 semaines. Le poids et l’âge de l’animal sont primordiaux. En effet, l’état immunitaire de l’animal est dépendant de son âge et de son poids. Des animaux avec une immunité mature sont souvent nécessaires. Enfin, tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.

260 souris et lapins vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 230 tués à l'issue et 30 lapins proposés à l'adoption. Des tiques sont placées sur leur dos dans des capsules pour se nourrir de leur sang, ce que le porteur reconnaît provoquer une gêne et des démangeaisons. Chaque animal ne sert qu'une fois en raison de l'immunité développée contre les tiques. L'élevage vise à maintenir des colonies de tiques saines pour des expériences d'infection.

Objectifs

Le présent projet vise au maintien, en laboratoire, de colonies de tiques, dont les tiques de l’espèce Ixodes ricinus, « sans agent pathogène» afin de pouvoir réaliser des expériences d’infection expérimentale avec divers agents pathogènes pour analyser leur transmission par cet arthropode. Les tiques étant des hématophages stricts(ne mangent que du sang), il est nécessaire de les nourrir régulièrement avec du sang, ce qui est réalisé suivant les stades concernés sur souris vigiles (pour les larves et les nymphes) ou sur lapin vigile (pour les nymphes et les adultes). Pour cela les différents stades de tiques sont placés sur les animaux (dans une capsule fixée sur le dos des souris ou capsules fixées sur le dos des lapins) afin de permettre leur gorgement. Une fois gorgées, les tiques se détachent toutes seules, sont récupérées puis placées en flasque de culture cellulaire en attendant leur métamorphose.

Bénéfices attendus

Le maintien d'un élevage de tiques saines permet de pouvoir développer des projets de recherche portant sur les tiques elle-mêmes : étude du microbiote des tiques, développement de vaccin antimicrobiote de tique, neurophysiologie des tiques ; mais également sur les interactions entre les tiques et les agents pathogènes qu'elles vectorisent (bactéries, parasites et virus) afin de mieux comprendre ces systèmes et de trouver des moyens de lutte contre les tiques et les agents pathogènes qu'elles transmettent.

Procédures

Il n'y aura aucun prélèvement réalisé sur les animaux, juste la récupération des tiques gorgées présentes dans les capsules.

Impact sur les animaux

Le gorgement des tiques induit une gêne modérée (grattement) pour les souris ou les lapins utilisés mais afin de limiter l’inconfort lié à une démangeaison trop intense due aux piqûres de tiques, le nombre de tiques (larves/nymphes/femelles) par animal est limité. Lorsqu’une douleur ou gêne trop intense est vue chez le lapin ou la souris, nous enlevons les tiques qui ne se sont pas encore gorgées ou réduisons celles déjà attachées afin de réduire l’inconfort du lapin/souris.

Devenir

Pour les souris, tous les animaux seront mis à mort. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements. Pour les lapins: environ la moitié (30) seront mis à mort si les tiques gorgées avaient des agents pathogènes (tiques collectées en forêt) , et l'autre moitié (30) seront proposés à l'adoption via une association. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements.

Remplacement

Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, un système de gorgement artificiel sur membrane a été développé au sein de notre équipe, il est utilisé lors des essais de transmission des agents pathogènes. Cependant son efficacité ne permettant pas toujours de maintenir un assez grand nombre de tiques, il est donc necessaire de maintenir l’élevage de tiques sur lapins et souris.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé a été calculé en fonction du nombre de tiques gorgées que l'on peut récupérer sur l'animal et par rapport à nos besoins en tiques pour nos différentes expérimentations. Pour chaque élevage, les gorgements seront réalisés au rythme de 1 par stade de tiques (3 stades) tous les 3 mois nécessitant à chaque fois 4 lapins et 5 souris. En raison de l’immunité anti-tique, chaque animal ne peut être utilisé qu’une seule fois pour des gorgements.

Raffinement

Les souris et les lapins sont élevées dans les conditions naturelles d'élevage des lapins et souris avec pour les souris : un maison en plastique par cage, un support pour grimper ; pour les lapins : une balle en plastique dure, un baton de bois à ronger. Les souris sont hebergées à raison de une souris par cage pour éviter le retrait de la capsule par ses congénères.

Choix des espèces

Les tiques présentent des spécificités d'hôtes relativement strictes et n'acceptent de se gorger que sur certains animaux dont les souris (larves et nymphes) et les lapins (nymphes et adultes). De plus, afin de maintenir un élevage, il est nécessaire d’obtenir un grand nombre de tiques gorgées pour chaque stade. Les tiques adultes et nymphes prélevant un volume de sang important, le gorgement sur lapin évite (1) la spoliation sanguine de l’animal hôte contrairement au gorgement sur souris, et (2) le recours à plus d’animaux. Adultes pour les souris et les lapins Age Minimum 5 semaines pour les souris pour pose des capsules Age indifférent pour les lapins

9 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement laser oculaire sous anesthésie puis des séances d'imagerie sur trois semaines, pour qu'une entreprise vérifie que son laser de traitement de la rétine ne provoque pas de cataracte avant un passage chez l'humain. Le porteur indique qu'une cataracte est possible, voire systématique dans le groupe le plus exposé, avec perte définitive de la vision de l'œil traité et stress pouvant entraîner une perte de poids. Il affirme que l'essai doit "obligatoirement" être mené in vivo et présente le lapin comme le seul animal à l'anatomie oculaire proche de l'humain.

Objectifs

Une société Suisse a développé un traitement laser (proche infrarouge) des maladies chroniques de la rétine (DMLA, glaucome, Rétinopathie diabétique) qui a pour but d’interagir avec le métabolisme cellulaire rétinien. Dans ce cadre, elle souhaite réaliser une expérimentation animale préliminaire pour vérifier que la technologie laser utilisée n’est pas cataractogène. L’apparition de cataracte est liée soit à un effet photothermal du laser (échauffement de tissus absorbant l’énergie laser comme l’iris) et/ou à un effet photo-chimique. Le traitement laser étudié n’étant pas ciblé sur l’iris et le cristallin étant optiquement transparent (absorption de l’énergie faible à nulle), il est supposé que l’effet photothermal du laser utilisé sera négligeable et non associé à un risque de cataractogenèse. Néanmoins, un effet photochimique (réaction chimique catalysée par la lumière) ne peut être exclu et est variable en fonction de l’intensité d’énergie utilisée. La présente étude propose ainsi d’évaluer l’absence de cataractogenèse liée au traitement laser étudié 1/à une énergie de travail qui serait utilisée chez l’Homme, 2/à une énergie seuil de référence (énergie maximale autorisée par législation par exemple), 3/ainsi qu’une énergie très supérieure à la dose maximale utilisée. Sera étudiée à court terme l’apparition d’une cataracte dans le cristallin de lapins après les tirs lasers.

Bénéfices attendus

Ce projet permetterait de connaître la sécurité pour le cristallin de l'utilisation d'un laser innovant ayant pour but de traiter des rétinopathies chroniques jusqu'ici très difficile à traiter voir impossible. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise developpant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique.

Procédures

Les 9 animaux recevront à j0 un traitement laser sans contact, sans docking et sous anesthésie générale qui a une durée théorique de 1 minute. Puis à J0 (postlaser immédiat), J1, J7, J14 et J21, la rétine et le cristallin des 2 yeux de l'animal seront observés par des techniques d'imageries sans contact (Lampe à fente, tomographie à cohrence optique et rétinographe) et sous anesthésie générale. Les observations ont une durée théorique de 30 minutes.

Impact sur les animaux

Une cataracte (opacification du cristallin) de l'oeil traité par le laser est possible pour les groupes 1 et 2 voir systématique pour le groupe 3. Cette atteinte du cristallin n'est pas douloureuse, mais est accompagné d'une perte de la capacité visuel définitive de l'oeil cataracté et par conséquent cela peut entrainer un stress pouvant se traduire par une perte de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin) comme la constipation (absence de fèces), selles liquides. Les atteintes rétiniennes par un laser n'entraine aucune douleur et hémorragies. Le côté thermique du laser aura pour effet de cautériser les saignements. Le seul impact délétère pouvant être une atteinte de la capacité visuel de l'oeil traité. Si cela était le cas, le stress induit sera alors surveillé selon les mêmes critères que pour les atteintes du cristallin.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par surdose d'anesthésiant sous anesthésie générale.

Remplacement

Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois le laser chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de l'histologie du cristallin.

Réduction

Il a été jugé que le nombre minimum, mais suffisant d’animaux était de 3 lapins par groupe pour l’expérimentation pour prendre en compte les différences interindividuelles pour ce type de traitement laser indolore.

Raffinement

Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant tout manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (anesthésie générale pendant le traitement laser et les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie et la technique laser se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Le traitement est indolore. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale

Choix des espèces

D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que le traitement soit représentatif de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).

720 souris et lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour élever et infecter des moustiques Anopheles vecteurs du paludisme. Les lapins sont exposés vingt minutes par semaine pendant six mois aux piqûres d'environ 500 moustiques femelles, les souris à quarante piqûres par semaine pendant deux mois, certaines étant en outre infectées par des parasites Plasmodium. Le porteur présente ces piqûres et les prélèvements de sang associés comme les seuls effets indésirables. Il justifie le gorgement sur animaux vivants par la difficulté de certaines lignées à se nourrir sur membrane, et met à mort lapins et souris à l'issue de chaque cycle.

Objectifs

L’objectif du projet est de produire régulièrement des moustiques femelles du genre Anopheles pour l’étude des interactions Plasmodium-Anopheles. Selon les questions scientifiques, il s’agira soit de colonies bien établies, soit de nouvelles lignées récemment établies ou à établir à partir de populations sauvages. Trois programmes scientifiques sont en cours. Programme 1 : Etude des bases moléculaires régissant un effet maternel chez Anopheles gambiae (souche Yaoundé) conduisant à une susceptibilité différentielle à Plasmodium falciparum des descendants. Programme 2 : Analyse fonctionnelle de gènes d’Anopheles arabiensis dont l’expression est régulée par P. falciparum et Plasmodium vivax. Programme 3 : Infection d’Anopheles darlingi par P. vivax pour le cyclage au laboratoire de ce parasite.

Bénéfices attendus

Globalement, le projet contribuera à une meilleure compréhension des interactions Anopheles-Plasmodium avec pour objectif principal la recherche de stratégies nouvelles et innovantes pour lutter contre la transmission du paludisme. Spécifiquement le programme 1 (Etude des bases moléculaires régissant un effet maternel chez Anopheles gambiae conduisant à une susceptibilité différentielle à Plasmodium falciparum des descendants) doit permettre d’identifier des facteurs de type épigénétique impliqués dans la susceptibilité du moustique Anopheles gambiae, vecteur majeur du paludisme en Afrique sub-saharienne, à P. falciparum et guider vers le choix de nouvelles stratégies de contrôle des populations de ce moustique sans avoir recours à des insecticides. Le programme 2 a pour objectif une meilleure connaissance des gènes du moustique spécifiquement régulés par P. vivax, un parasite négligé mais d’importance croissante en Asie et Amériques et ainsi orienter les programmes de stratégie de blocage de la transmission de ce parasite, tel que des vaccins bloquant la transmission. Le succès du programme 3 (cyclage au laboratoire de P. vivax) ouvrira un pan nouveau de recherches, notamment pour agir sur les formes quiescentes du parasite au niveau du foie, sensibles à une seule famille de molécule (primaquine et tafénoquine), qui présente de nombreux effets indésirables chez les patients déficients en G6PD. Sur le plan transmission de P. vivax, ce programme permettra de compléter les études développées dans le programme 2, facilitant et accélérant la validation des gènes d’intérêt du moustique.

Procédures

Dans la procédure 1, les lapins sont exposés pendant 20 minutes à une cage contenant environ 1000 moustiques (donc seulement 500 sont des femelles), une fois par semaine, pendant 6 mois. Dans la procédure 1, les souris sont exposées pendant 20 minutes aux piqures de moustiques, à raison de 40 anophèles femelles par souris, une fois par semaine, pendant 2 mois. Dans la procédure 3, les souris reçoivent une injection intra péritonéale (quelques secondes), puis subissent un prélèvement d’un micro-volume de sang par une micro incision à l’extrémité de la queue de la souris à l’aide de ciseaux stérilisés (quelques secondes par prélèvement), puis sont exposées aux femelles adultes d’Anopheles, pour un repas de sang sous anesthésie générale (injection intrapéritonéale/ quelques secondes par injection ; repas sanguin pendant 30 minutes).

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables sur les animaux peuvent être dus à l’inconfort lié aux piqures par moustiques et la quantité de sang qu’il leur sera prélevé à cette occasion.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. Les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure : au bout de 6 mois pour les lapins, au bout de 2 mois pour les souris non infectées par Plasmodium, 3 à 5 jours après l’infection pour les souris infectées par des Plasmodium de rongeurs

Remplacement

Le choix de nourrir les moustiques sur animaux et non par gorgement sur membrane est guidé par la difficulté de lignées à se gorger sur membrane (An. arabiensis, An. darlingi) et l’impact potentiel d’altérer l’effet maternel étudié chez An. gambiae souche yaoundé (programme 1). En effet le comportement et la physiologie du moustique sont très sensibles à l’origine du sang, aux odeurs émises par les animaux et au mode de piqure. Par ailleurs des souris infectées par un Plasmodium de rongeur (P. berghei ou P. yoeli) sont utilisées comme substitut à des infections avec les parasites infectant l’homme (P. falciparum ou P. vivax) difficiles à produire au laboratoire.

Réduction

Le nombre requis d’animaux découle de la longue expérience de l’équipe qui veille à respecter les recommandations 3R. L’utilisation d’un même lapin au-delà de 6 mois résulterait à une production réduite de moustiques incompatible avec les objectifs scientifiques du fait de l’apparition d’un taux trop élevé d’anticorps anti-salive de moustiques ayant pour conséquence une perte de qualité des repas sanguin pour les moustiques et donc une perte en nombre de descendants moustique. Il en va de même pour les souris, auquel s’ajoute l’effet cumulé d’une anesthésie hebdomadaire qui amènerait à avoir recours à des doses d’anesthésiant plus importante et les conséquences possibles sur le bien-être de la souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales d’hébergement répondant aux normes européennes, avec une surveillance de l’état général (observation de la mobilité, du pelage, et de la couleur des oreilles) et du poids. Avant et après chaque repas sanguin des suppléments alimentaires sous forme de gel seront proposés aux animaux.

Choix des espèces

Le choix des lapins et souris pour maintenir ou produire des lignées de moustiques anophèles est guidé par la qualité du sang fourni par les animaux vivants et le fait que certaines lignées ne se gorgent que très faiblement à travers une membrane produisant des progénitures dont la taille est incompatible avec les programmes scientifiques. Le programme 1 interroge une composante épigénétique pour laquelle une modification du mode de gorgement des moustiques (Lapin versus poche de sang) pourrait être dommageable sachant que de nombreux paramètres peuvent être impliqués dans l’expression de signatures épigénétiques. Stade de développement des animaux : souris et lapins adultes jeunes car les animaux vieux sont difficiles à « piquer » et leur poids est trop important et pour les souris hôtes de Plasmodium, pour leur sensibilité aux parasites.