Lapins
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- Rongeurs
Production d’anticorps polyclonaux sur lapins
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
200 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections répétées d'un antigène et d'un adjuvant sous la peau ou dans le derme, puis des prélèvements sanguins aux oreilles sur animaux vigiles, avant un prélèvement terminal au cœur sous anesthésie, pour produire des anticorps polyclonaux destinés à la recherche ou au diagnostic. Le porteur indique que l'inoculation peut provoquer une hyperthermie, une forte inflammation locale, une ulcération ou une nécrose. Sur le remplacement, il affirme que la production d'anticorps polyclonaux ne peut être reproduite in vitro de façon satisfaisante et retient donc le lapin pour son volume sanguin et sa réponse immunitaire.
Objectifs
Produire sur lapins de grandes quantités de très bons anticorps polyclonaux spécifiques avec une haute affinité dirigés contre des protéines d'intérêt, pour des activités de recherche ou de diagnostic.
Bénéfices attendus
L'antigène est produit par le demandeur qui doit fournir des informations permettant d'évaluer une toxicité intrinsèque de la molécule injectée, et les possibles conséquences sur l'état général de la production d'anticorps contre cette molécule. En fonction des informations fournies et du risque évalué, il pourra être demandé de tester la toxicité de la molécule in vitro dans un modèle cellulaire avant de l'injecter au lapin.
Procédures
Injections sous-cutanées ou intra-dermiques sur animaux vigiles : 200 lapins. Durée, quelques secondes Prélèvement sanguin (oreilles) sur lapins vigiles : 200 animaux. Acte qui dure quelques secondes Prélèvement sanguin (cœur) sur lapins anesthésiés (acte terminal) animaux : Acte qui dure quelques minutes
Impact sur les animaux
Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 72h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux). Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement sanguin terminal afin de répondre à l’objectif scientifique
Remplacement
La production d'anticorps polyclonaux dirigés contre un antigène résulte de la stimulation de différentes populations leucocytaires qui ne peut être reproduite de façon satisfaisante et efficace in vitro. Certains tests pour évaluer la toxicité d’antigène seront réalisés in vitro avant l’animal.
Réduction
Dans la très grande majorité des cas, un seul animal est nécessaire pour obtenir la quantité d'anticorps nécessaire pour les travaux scientifiques. Dans certains cas (échec de l'immunisation ou besoin de très grandes quantités d'anticorps), il peut être nécessaire d'utiliser 2 ou 3 animaux. Nous estimons que le nombre de demandes de production d'anticorps polyclonaux portera sur un total d'environ 40 animaux par an.
Raffinement
Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 72h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux…). L’animal sera mis à mort si aggravation des signes clinique malgré le traitement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention, une préparation aseptique et une anesthésie locale. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Le lapin est une espèce de taille intermédiaire (on peut utiliser aussi la souris, des petits ruminants ou des équidés) dont la réponse immunitaire et le volume sanguin circulant permettent d'obtenir les quantités d'anticorps nécessaires aux projets des entités de recherche Jeune adulte de 2,7 à 3 kg (âge optimal pour la réponse immune)
Évaluation de la sécurité d’un nouveau dispositif de tomographie à cohérence optique, le LC-OCT, pour l’ophtalmologie sur l’oeil du lapin NZW
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
6 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur œil est exposé à un laser d'imagerie dont la puissance dépasse d'un facteur dix la norme au niveau de la cornée, le porteur indiquant que des ulcères, des lésions ou une cataracte peuvent apparaître, puis ils sont tués pour analyse histologique des tissus oculaires. L'objet est de vérifier l'innocuité d'un dispositif développé par une entreprise avant un éventuel passage chez l'humain. Le porteur affirme que ce test doit "obligatoirement" être mené in vivo, aucun modèle ex vivo ne pouvant reproduire l'œil.
Objectifs
Une startup française a développé une technologie de tomographie à cohérence optique (OCT) permettant d'effectuer des images proches de l'histologie classique ou des images du type confocale. Ces observations peuvent être compilées sous forme de stack permettant une reconstruction 3D du tissu en haute définition. Cette technologie est un excellent outil de diagnostic dermatologique et pourrait apporter les mêmes avantages en ophtalmologie, surtout dans le domaine des tissus de la surface oculaire. L'utilisation de cet OCT sur l'oeil pour des observations ne doit pas avoir d'effets indésirables sur les tissus de l'oeil. Des calculs de normes portent à penser que la rétine ne subira aucun dommage lors de l'imagerie de la cornée. La présente étude propose ainsi d'évaluer l'innocuité sur les tissus oculaires de cette nouvelle technologie d'OCT lors de l'imagerie de la cornée. Sera étudiée, à court terme, l'apparition d'œdème cornéen, de cataracte et de modifications rétiniennes.
Bénéfices attendus
Le projet permettrait de connaître la sécurité de cette nouvelle technologie d'OCT comme outil de diagnostic clinique des atteintes des tissus de la surface oculaire proche d'une étude histologique. Avec les résultats de ce projet, l'entreprise développant ce dispositif pourra alors se tourner vers une étude clinique (si les résultats ne montrent pas d'effets délétères) et in fine la rédaction de dossiers pour autorisation par les instances de santé. Si des atteintes rétiniennes venaient à être observées, des atteintes de la vision sont possibles et par conséquent un éventuel stress pouvant se traduire par une perte de poids (supérieure ou égale à 10% en 3 jours) ; des perturbations comportementales graves et persistantes comme la piloérection, dos voûté, prostration, isolement, agressivité à l'ouverture de la cage et des perturbations graves et persistantes liées au système digestif (marqueur de stress chez le lapin)comme la constipation (absence de fèces), selles liquides.
Procédures
Les animaux seront soumis à de l'imagerie ophtalmologique contact et sans contact avec l'œil sous sédation. Ces imageries de suivi seront faites 4 fois : à J0 (x2 + imagerie avec la nouvelle technique d'OCT), J2 et J7 pour le groupe 1 ou J0 préop post, J2 et J21 pour le groupe 2. La durée de chaque observation de suivi dure environ 45 minutes. L'imagerie avec la nouvelle technologie OCT (docking + imagerie) durera 10 minutes.
Impact sur les animaux
L'éclairement du laser du LC OCT est de 0.82 mW/cm² au niveau de la cornée, 0.02 W/cm² au niveau de la rétine. En prenant en compte la norme ISO 15004-2, il a été déterminé que cela dépassait d'un facteur 10 la limitation en éclairement au niveau de la cornée, mais pour l'éclairement de la rétine la puissance est très inférieure à la limitation (inférieur à la limite d'éclairement d'un facteur 35).Au vu de ces données il est attendu aucun problème sur la rétine de l'animal, mais il est possible qu'une atteinte des tissus cornéens soit à prévoir (ulcères épithéliaux, lésions de la couche endothéliale). De plus, le système de mesure se fait en contact avec la cornée via une lame de verre. Il est donc possible, là aussi, que nous ayons des atteintes du tissu cornéen. Cette étude est justement faite pour se rendre compte de la présence de ces atteintes avec des paramètres de laser au-dessus de la norme. Le cristallin pourrait aussi être atteint par effet thermique (cataracte).
Devenir
En fin de procédure les animaux seront mis à mort pour étude histologique des tissus oculaires.
Remplacement
Ce nombre doit OBLIGATOIREMENT ÊTRE MIS EN ŒUVRE IN VIVO avant de pouvoir utiliser pour la première fois cet LC-OCT chez l’Humain. Aucun dispositif ex vivo ou in silico ne peut remplacer la complexité de l'organisation de l'oeil et de ses composants, ainsi que la réponse à un passage d'un laser potentiellement néfaste pour les tissus oculaire. L'effet cataractogène peut se déclarer 1 à 2 semaines après le passage du laser.
Réduction
Il a été jugé que le nombre minimum, mais suffisant d’animaux était de 3 lapins par groupe pour prendre en compte les différences interindividuelles pour ce type d'imagerie indolore.
Raffinement
Les animaux arriveront au moins une semaine (7 jours) avant toute manipulation. Tout est mis en œuvre pour LIMITER AU MAXIMUM LE STRESS ET LA DOULEUR DE L’ANIMAL (séfdation pendant les observations). Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérer grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie). Par ailleurs, les lapins sont hébergés en cage règlementaire pouvant communiquer entre elles ; dans un environnement enrichi (jouet kong et autres jeux). Enfin, l'eau et la nourriture (granules et foin) sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux. Toutes les techniques d'imagerie de suivi in vivo se font sans contact avec l'oeil et sans docking. Seul l'observation avec l'OCT en contact avec l'oeil. Toutes les observations se feront sous anesthésie générale et l'OCT sera effectué sous AG + anesthésie locale. La mise à mort de l'animal est faite sous anesthésie générale
Choix des espèces
D'un point de vue éthique et pratique, les lapins sont les seuls animaux communément utilisés en expérimentation animale et présentant une anatomie oculaire proche de l'homme. Pour que l'observation soit représentative de ce qu’il puisse être chez l’homme dans le futur, la chambre antérieure de l’œil de l’animal ne doit pas être trop petite. C’est pour cela que nous optons pour des lapins âgés d’environ 3 mois (12 semaines).
Production de sérum anti-thymocytaire de lapins, principe actif d’un médicament antirejet de greffes, à usage humain.
- Production de routine
- Tests réglementaires
87 500 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures de gravité modérée. Immunisés deux fois, ils subissent des prélèvements sanguins à l'oreille sur animal vigile pouvant provoquer une anémie de plusieurs jours, puis un prélèvement intracardiaque terminal sous anesthésie profonde, pour produire du sérum anti-thymocytaire, principe actif d'un médicament antirejet de greffe. Il s'agit d'une production de routine, pas de recherche. Le porteur revendique l'absence de "méthode alternative validée" et écarte les anticorps monoclonaux, dont les tentatives de substitution auraient échoué, en invoquant aussi la lourdeur des procédures réglementaires de modification des autorisations de mise sur le marché.
Objectifs
Le projet a pour objectif de produire la substance active (sérum anti-thymocytaire de lapin) utilisée comme matière première pour la fabrication d’un médicament à usage humain, destiné d’une part à prévenir ou traiter le rejet de greffes d’organes et d’autre part à traiter l’aplasie médullaire (maladie hématologique). Il n’y a pas de méthode alternative validée et disponible pouvant permettre de répondre à ce besoin. La croissance continue du nombre de patients greffés et/ou en attente de greffe à l’échelle mondiale se traduit par un besoin croissant de sérum anti-thymocytaire de lapin pour pouvoir fabriquer la quantité nécessaire de médicament. Il s’agit d’un médicament fabriqué exclusivement en Europe et distribué dans environ 70 pays.
Bénéfices attendus
Le projet étant destiné à produire la substance active utilisée pour la fabrication d’un médicament à usage humain, les bénéfices attendus concernent directement la santé humaine et découlent de l’utilisation dudit médicament. Ces bénéfices sont : 1/ Prévention et traitement du rejet de greffe chez le patient. 2/ Prévention de la réaction du greffon contre l'hôte aiguë et chronique, en cas de transplantation de cellules souches hématopoïétiques (cellules qui renouvellent en permanence les cellules qui sont dans le sang). 3/ Traitement de la réaction du greffon contre l'hôte aiguë contre lesquelles les corticoïdes sont inefficaces. 4/ Traitement de l'aplasie médullaire (maladie du sang). 5/ Amélioration de la qualité de vie des patients (résultant des bénéfices 1, 2, 3 et 4). 6/Réponse à un problème de santé publique considérant d’une part le nombre de patients concernés (environ 70 000 patients traités par an) et d’autre part le nombre de pays (environ 70 pays) dans lesquels ce médicament est demandé.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont : 1/ Port et contention des animaux lors des interventions : au moins 6 fois pour tous les animaux inclus dans le projet. Durée inférieure à 5 minutes. 2/ Pesée des animaux : 1 fois pour tous les animaux. Durée inférieure à 1 minute. 3/ Immunisations : 2 injections espacées de 14 jours. Durée d’environ 30 secondes. 4/ Prélèvements sanguins aux oreilles, sur animal vigile. Durée inférieure à 5 minutes. 5/ Prélèvement sanguin en intracardiaque : sous anesthésie générale profonde, jusqu’à la mort de l’animal sans reprise de conscience. Durée d’environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont rattachés aux procédures et interventions prévues par le projet sur les animaux : 1/ Stress et inconfort potentiellement induits par le port et la contention des animaux pendant les interventions : durée inférieure à 5 minutes. 2/ Stress et inconfort potentiellement induits lors de la pesée des animaux : durée inférieure à 1 minute. 3/ Douleur induite par l’aiguille (piqure) lors des immunisations : durée d’environ 30 secondes. 4./Douleur induite par l’aiguille (piqure) lors des prélèvements sanguins : durée inférieure à 5 minutes. 5/ Accélération transitoire de la respiration possible suite aux prélèvement sanguins : durée inférieure à 30mn. 6/ Déshydratation possible suite aux prélèvements sanguins : durée de 30mn à 1h. 7/ Fatigue, affaiblissement potentiels suite aux prélèvements sanguins : durée de 30mn à 1h. 8/ Mobilité réduite potentiellement suite aux prélèvements sanguins : durée de 30mn à 1h. 9/ Anémie modérée suite aux prélèvements sanguins : environ 7 jours.
Devenir
Imposé par la finalité du protocole : le protocole se termine par la mort du lapin suite au prélèvement sanguin terminal en intracardiaque sous anesthésie générale profonde sans reprise de conscience.
Remplacement
le remplacement n’est pas envisageable car il n’y a pas de méthode alternative validée et disponible pour produire des anticorps polyclonaux. Les anticorps polyclonaux (sérum animal) obtenus par immunisation d’animaux sont des produits thérapeutiques anciens, utilisés depuis plus d’un siècle. En 1975, l’invention de la technologie de production des anticorps monoclonaux obtenus avec peu ou pas d’animaux a fait naître l’espoir de remplacer les anticorps polyclonaux par des anticorps monoclonaux. Ces anticorps ont d’abord trouvé de nombreuses applications au niveau de la recherche fondamentale et du diagnostic in vitro. Dans les laboratoires de Biologie clinique, les anticorps monoclonaux sont de plus en plus utilisés comme réactifs, souvent en remplacement de sérums polyclonaux traditionnels. Il a fallu cependant des décennies de développement et d’innovation pour rendre les anticorps monoclonaux utilisables en thérapeutique humaine. Fort de ces avancées, plusieurs publications scientifiques proposent de remplacer les anticorps polyclonaux (sérum d’origine animal) par des assemblages d’anticorps monoclonaux appelés anticorps multiclonaux ou cocktail d’anticorps monoclonaux, comme une alternative au recours à l’animal. Malheureusement, les tentatives de remplacer les anticorps polyclonaux à but thérapeutique par des cocktails d’anticorps monoclonaux se sont avérées infructueuses à ce jour. En général, l’extrême diversité naturelle des récepteurs sur les anticorps polyclonaux est un des obstacles au remplacement efficace des polyclonaux thérapeutiques par des cocktails de monoclonaux. De plus, l’antigène utilisé dans ce projet pour induire la production des anticorps polyclonaux par le lapin est une cellule (thymocyte), donc complexe par sa nature, cela rend encore plus improbable le remplacement du sérum antithymocytaire de lapin par cocktail d’anticorps monoclonaux. Enfin, si l’alternative par un cocktail de monoclonaux devenait accessible, l’obligation réglementaire pour le donneur d’ordre de démontrer leur équivalence thérapeutique (efficacité, innocuité) avec le médicament à base de sérum animal puis d’engager des procédures très longues et compliquées pour obtenir la modification de chacune des AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) délivrées par plusieurs dizaines de pays serait l’ultime étape à franchir avant que ce remplacement ne puisse être effectif.
Réduction
Réduction : 1/ Le ciblage de la fenêtre optimale du pic d'anticorps dans le sang permet d’obtenir une quantité maximale de sérum polyclonal en utilisant moins de lapins. 2/ La réalisation de 3 prélèvements sanguins tout en préservant le bien être des lapins, permet de récupérer presque 2 fois plus de sérum par lapin que s’il n’y avait eu qu’un seul prélèvement sanguin par lapin. 3/ En utilisant indifféremment des lapins mâles ou femelles, on évite de faire naître plus de lapins qu’il ne faut pour le projet. 4./ Un très faible pourcentage de sérums anti-thymocytaire rejetés (inférieur à 1%) par le donneur d’ordre. Cela découle d’une parfaite maîtrise de la qualité du sérum produit depuis 40 ans par notre établissement et donc une utilisation optimale de chaque lapin inclus dans le projet. En combinant d’une part le ciblage de la fenêtre optimale pour les prélèvements sanguins et d’autre part le nombre de prélèvements sanguins, le protocole déposé dans le dossier d'AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) du médicament permet d’optimiser la quantité de principe actif produite par lapin tout en préservant leur bien-être.
Raffinement
Raffinement : 1/Minimisation de la durée des contentions des animaux grâce à la compétence des techniciens et à une organisation optimale des interventions. 2/Définition et application de points limites spécifiques au protocole. 3/Surveillance accrue des lapins à des moments sensibles du projet. 4/Application d’une grille décisionnelle (grille de scores) pour atténuer ou abréger la douleur. 5/Recours à l’anesthésie générale profonde avant le prélèvement de sang en intracardiaque jusqu’à la mort du lapin sans reprise de conscience. 6/ Hébergement dans des zones protégées confinées conçues pour les protéger contre les infections. 7/ Lapins rassurés par le personnel qui leur parlent continuellement et les manipule de façon apaisante. 8/ Hébergement en groupe harmonieux et l’accès à un enrichissement varié pour que les lapins puissent exprimer un large répertoire de comportements normaux, notamment d’interactions sociales entre congénères. 9/ Absence de stress de transport ni de stress de changement d’environnement (personnel, mode opératoire, aliment…) car les lapins utilisés pour le projet sont nés sur place et maintenus dans les mêmes conditions, qu’ils soient en élevage ou en expérimentation. 10/ Utilisation de lapins répondant à des critères qui les rendent optimums pour le projet. 11/ 11. Application de techniques d’injection entrainant le moins de douleur possible. 12/ Exclusion de toutes substances douloureuses telles que les adjuvants. 13/ Aliment et eau de boisson à volonté. 14/ Formation intensive du personnel, compétent et sensibilisé à appliquer des points limites adéquats.
Choix des espèces
Le lapin est l’espèce utilisée parce qu’il est imposé par le dossier d’AMM (Autorisation de Mise sur le Marché) du médicament pour lequel notre projet produit le principe actif. Il est utilisé à l’âge adulte quand son système immunitaire est mature pour produire efficacement des anticorps polyclonaux. De nombreuses autres espèces animales dont principalement la souris, le rat, le hamster, le cobaye, le mouton, la chèvre, le lapin et poulet peuvent être utilisées pour la production d’anticorps polyclonaux à visée thérapeutique. Parmi ces espèces, le lapin est celle qui présente le plus d’avantages, notamment pour : sa facilité d’élevage en zone confinée pour le protéger des infections, sa forte prolificité, sa croissance rapide, son cycle de vie court, sa taille « intermédiaire », sa docilité et sa facilité à manipuler, la facilité de lui prélever du sang… Le choix du lapin pour ce projet repose sur ces avantages.
Formation des techniciens animaliers à certains gestes techniques
- Formation professionnelle
300 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures de gravité légère à modérée. Ce sont d'anciens reproducteurs réformés, sur lesquels des techniciens s'entraînent à prélever environ 60 mL de sang à l'artère de l'oreille sur animal vigile maintenu en contention, puis un prélèvement intracardiaque sous anesthésie sans réveil qui met fin à l'animal. Le projet ne vise pas la recherche mais la formation aux gestes techniques pour un projet de production de sérum. Le porteur justifie le recours aux lapins par l'impossibilité d'éviter "un minimum de pratiques" après la formation théorique et le tutorat.
Objectifs
Il s’agit d’un renouvellement de projet. Le projet de formation des techniciens animaliers à certains gestes techniques vise à assurer un complément à la formation pratique de base lors de la prise de poste, afin d’assurer le niveau de maîtrise technique requis par la réglementation de la protection animale et par les Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF). Cette formation aux gestes techniques est précédée par une première période de tutorat, avec atteinte progressive d’acquis techniques préalables en matière d’approche, de contention et de réalisation des gestes techniques simples (telles les injections sous-cutanées). Arrivé à un tel stade, la technicité des gestes qui font l’objet du présent projet requiert un minimum de pratique en situation de formation avant de poursuivre et affiner par la pratique en conditions réelle sous tutorat. Le projet inclus des gestes techniques sur lapin dans le cadre du projet autorisé.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but d'amener les techniciens à acquérir le niveau de maîtrise requis pour les gestes techniques sur le lapin dans le cadre du projet autorisé. La maîtrise technique permet en effet : - de minimiser le risque de douleurs et de stress sur les phases de prélèvements, donc de contribuer à l'objectif de raffinement - de minimiser le risque de pertes de sérum, donc de contribuer à l'objectif de réduction - de répondre aux exigences de qualification au poste exigées par les bonnes pratiques de fabrication (pharmaceutiques)
Procédures
l s'agit de prélèvements sanguins au niveau de l'artère à l'oreille (volume prélevé d'environ 60 mL) sur des animaux vigiles sur lesquels une contention est assurée pendant toute la durée du prélèvement; ainsi que des prélèvements par voie intra-cardiaques sur des animaux préalablement anesthésiés avec une solution constituée par un mélange de xylazine et de kétamine. (anesthésie sans réveil). La durée totale d'utilisation effective d'un lapin est généralement de 5 minutes avec un une limite de 10 minutes avant l'anesthésie sans réveil.
Impact sur les animaux
Les gestes techniques sur le lapin dans le cadre du projet autorisé sont des prélèvements sanguins à l'artère au niveau de l'oreille. Aucune complication ou réaction secondaire n’est observée à la suite de ce prélèvement. Outre l'attention apportée aux gestes techniques, une attention toute particulière est également portée sur la durée de la contention qui est une source notable de stress dans l'espèce concernée. La contention de l'animal est assuré par une boîte adaptée pendant toute la phase de prélèvement. Les manipulations et les gestes techniques sont effectués sous le tutorat d'un technicien formé et confirmé. Comme décrit par ailleurs, les animaux sont euthanasiés en fin de séance de formation, et donc non réutilisés. Ceci permet d'éviter toute complication éventuelle plus tardive.
Devenir
L'ensemble des animaux qui intègre ce projet sont utilisés pour la formation du geste technique du prélèvement intra-cardiaque qui se termine toujours par la mort de l'animal.
Remplacement
Toutes les alternatives et étapes préalables au recours à des animaux ont été mises en œuvre : formation préliminaire sous tutorat, démonstrations mais il n’est pas possible d’éviter un minimum de pratiques pour les actes techniques décrits dans le présent projet. Une partie des actes techniques décrits dans la demande de projet précédente ont cependant pu être retirés du présent projet.
Réduction
Le nombre d’animaux requis est fonction du nombre d’actes techniques justifiant le recours à l’animal, qui est en réduction ainsi que du nombre de techniciens en prise de poste, qui est variable au cours du temps et non prévisible de façon précise. Le nombre d’animaux mentionné dans la présente demande d’autorisation représente un maximum, et ajusté au strict minimum nécessaire. Tous les animaux utilisés à des fins de formation à des gestes techniques spécifiques sont des animaux anciens reproducteurs réformés pour cause de limite d'âge. Aucune utilisation d’animaux élevés à des fins d’utilisation scientifiques n’est prévue.
Raffinement
L’étape d’utilisation d’animaux à des fins de formation à des actes techniques justifiant le recours à l’animal, est soumise au succès des étapes préalables de formation théorique et pratique, qui incluent une formation préliminaire sous tutorat. Le tuteur est obligatoirement présent et, outre son rôle de formateur, est garant du respect de l’animal utilisé (des points limites sont établis). Selon la difficulté du geste et le niveau d’habilité de la personne formée, le tuteur décide ou non de débuter la formation sous anesthésie sans réveil (il s’agit exclusivement d’animaux anciens reproducteurs destinés à l’euthanasie). Les points limites définis sont : - Un temps de contention limité à maximum de 10 minutes en boîte à contention. - Un arrêt du geste technique en cas de difficulté de réalisation après 3 échecs successifs sur animal vigile (en particulier les administrations intra-veineuses et les prises de sang). - Un arrêt des actes sous anesthésie après maximum de 10 minutes afin d’éviter tout risque de réveil ou d’analgésie insuffisante. - Un arrêt d’utilisation immédiat, sous décision et responsabilité du tuteur pour toute observation, pour tout autre évènement ou observation incompatible avec le classement en procédure légère (en se référant à l’Annexe VIII de la directive 201/63/EU). Par ailleurs, seuls les animaux anciens reproducteurs en parfait état général seront utilisés à des fins de formation. En outre, les animaux présentant un comportement incompatible avec une utilisation en formation (stress excessif) seront également écartés.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est celle avec laquelle le technicien en formation sera amené à travailler. L'ensemble des animaux utilisé dans le cadre de ce projet sont des anciens reproducteurs réformés.
Analyse in vivo du transfert de nanoparticules d’oxyde de fer et de dioxide de titane de la mère aux petits, via le lait, dans le modèle lapin (Nanomilk).
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
24 lapines allaitantes vont être utilisées, avec leurs portées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent chaque jour par voie orale des nanoparticules d'oxyde de fer ou de dioxyde de titane pendant dix-neuf jours de lactation, avec prélèvements de lait et de sang, avant que les mères et les petits soient euthanasiés au vingtième jour pour prélèvement d'organes. Le porteur retient le lapin parce que sa lactation ressemble à celle de l'Homme et qu'il entre dans la chaîne alimentaire humaine. Il affirme que le transfert mère-petit par le lait ne peut pas être modélisé in vitro.
Objectifs
La contamination par les nanoparticules métalliques (NPs) dans les écosystèmes est en constante augmentation. Fabriquées pour leurs propriétés industrielles d’agents anti-UVs, antibactériens, dépolluants, colorants, engrais ou pesticides, les NPs sont relarguées en masse dans l’air, les eaux et les sols. Avec les NPs d'oxyde de fer magnétique (Fe2O3), les NPs de dioxyde de titane (TiO2) sont parmi les plus fabriquées. Une littérature émergente suggère l’existence d’une contamination chez l'homme par les NPs de TiO2 dans les tissus placentaires, les selles des nouveau-nés. Quelques études sur des rongeurs en lactation exposés à certaines NPs ont suggéré le passage de NPs dans le lait et chez les petits. Le projet a pour but de démontrer la présence d’un transfert de NPs de la mère au petit et d’étudier les modalités de celui-ci, d’évaluer l’effet de l’exposition des mères sur la qualité du lait et le rôle de certaines structures du lait dans le transport de NPs, et enfin d’évaluer l’impact du transfert des NPs sur le petit.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre le transfert de NPs de la mère aux petits, l’impact sur la qualité des laits et les conséquences de cette contamination sur le développement des organes du jeune. Ces connaissances permettront d’appréhender du rôle du lait dans le transfert de polluants. Les mécanismes de lactation chez le lapin et l’humain étant similaires, le modèle lapin est un modèle de choix pour étudier le transfert des polluants de la mère à l’enfant . En cas de résultats concluants statistiquement significatifs obtenus dès la première dose testée, nous arrêterons la procédure, n'utilisant ainsi que la moitié des animaux prévus.
Procédures
Les animaux sont soumis à 3 types d'interventions : i) Administration quotidienne par voie orale de nanoparticules entre le premier et le 19 ème jour de lactation (19 administrations) ; ii) Prélèvement de lait d’une durée d’environ 5 minutes sur femelles vigiles aux jours 2, 5, 9 et 19 de la lactation (N=4), iii) Prélèvements de sang d’une durée d’environ 10 minutes sous anesthésie locale aux jours 2, 5, 9 et 19 de la lactation (N=4)
Impact sur les animaux
La littérature concernant la toxicité de NPs chez des rongeurs n’a pas mis en évidence de nuisance ou d’effet indésirable à court terme sur la santé et le bien-être des animaux aux doses proposées. Cependant les lapines et leurs petits seront surveillés quotidiennement afin d’évaluer toute altération de leur comportement ou de leurs paramètres physiologiques observables (posture, poils, …). Les nuisances potentielles liées au protocole sont légères et résident dans les prélèvements de lait et de sang, réalisés à 2, 5, 9 et 19 jours de lactation.
Devenir
Les femelles et leurs portées seront euthanasiées au 20ème jour de lactation. Pour l'ensemble des animaux de la procédure, les prélèvements post-mortem suivants seront réalisés : pour les femelles : cœur, foie, rate, estomac, intestin, rein et glande mammaire. Le reste de la carcasse sera conservé pour analyse globale du contenu en nanoparticules. Pour 2 petits de chaque portée (1 mâle et 1 femelle), les prélèvements post-mortem suivants seront réalisés : cœur, foie, rate, estomac, intestin et rein. Le reste de la carcasse sera conservé pour analyse globale du contenu en nanoparticules, comme pour les autres lapereaux des portées.
Remplacement
Le recours aux animaux est indispensable pour ce projet car le transfert de la mère au petit via la lactation ne peut être modélisé in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot à été réduit au maximum, en accord avec les références bibliographiques ainsi que l’expertise des professionnels de l’expérimentation sur le lapin. Le nombre d’animaux a été réduit à 24 femelles et ce nombre pourra être réduit de moitié, soit 12 femelles en cas de résultats significatifs obtenus plus précocement. En effet deux doses de chaque NPs sont prévues, néanmoins si les resultats escomptés sont obtenus dès la dose la plus faible, nous n’aurons pas recours à la seconde dose.
Raffinement
Les procédures d’administration des NPs dans l’eau de boisson, feront l’objet d’un processus d’habituation pour minimiser le stress de l’animal et préserver son bien-être. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie locale et toutes les précautions seront prises pour minimiser toute douleur. Les animaux seront hébergés en cages à nid individuelles, sans contrainte dans le plus strict respect de la Directive Européenne de 2010 relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Les contacts sociaux obtenus par l’hébergement des différents animaux dans des cages adjacentes participeront à l’enrichissement du milieu pour assurer le bien-être des animaux. Celui-ci sera complété par l’apport d’objets dans l’environnement. Ce dernier est strictement contrôlé et maintenu stable (bruits, odeurs, lumière, température, hygrométrie). Les animaux seront surveillés quotidiennement pour détecter le plus rapidement possible d’éventuels signes d’altération de leur santé ou de leur bien-être. Le cas échéant, nous ferons appel au vétérinaire référent afin de les prendre en charge immédiatement, soit par des traitements adaptés soit par un arrêt de l’expérimentation.
Choix des espèces
Nous avons choisi le lapin comme modèle pour l'étude du transfert de NPs de la mère vers le petit via le lait d'une part car le lapin est un animal retrouvé dans les fermes aussi bien en milieu urbain que rural, c'est à dire dans des environnements avec des contaminations variables en NPs, et d'autre part car il est important de pouvoir estimer la biodistribution des NPs dans un modèle d’animal susceptible de rentrer dans la chaine alimentaire humaine. De plus la lapine allaitant ses petits une fois par jour, cela en fait un modèle de choix pour les études de lactation et de transmission aux petits via le lait, comme étudié/validé précédemment par plusieurs projets/publications de notre équipe. Les animaux sont utilisés en lactation puisque les NPs seront administrées quotidiennement du 1er au 19ème jour de lactation. A 20 jours de lactation, correspondant au moment où l'alimentation des petits n'est plus essentiellement assurée par le lait maternel, les animaux seront euthanasiés afin d'évaluer la biodistribution des NPs ingérées par les mères dans l'eau de boisson et par les petits via le lait.
Pneumopathie à Enterobacter aerogenes acquise sous ventilation mécanique chez le lapin : effets des cellules souches mésenchymateuses stromales.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
61 lapins vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie générale, les animaux étant maintenus endormis puis tués sans reprise de conscience. Chaque lapin reçoit un cathéter veineux, est intubé et ventilé mécaniquement pendant 48 heures, reçoit une injection de LPS puis une inoculation d'Enterobacter dans les poumons, pour tester des cellules souches contre une pneumonie acquise sous ventilation. Curarisés, les animaux sont tués par injection létale à la fin de l'expérience et leurs organes prélevés. Le porteur affirme que ce projet chez le lapin est un "prérequis indispensable" avant des essais chez les patients en réanimation.
Objectifs
Objectifs du projet : Objectif principal : Ce travail vise à évaluer l’effet d’une injection intraveineuse de cellules souches mésenchymateuses stromales (CSMs) sur la capacité du lapin à éliminer les bactéries au cours d’une infection du poumon à Enterobacter, acquise au cours de la ventilation mécanique (PAVM pour pneumonie acquise sous ventilation mécanique). Objectifs secondaires : - Evaluer l’effet d’une injection par les veines de CSMs au cours de la PAVM à Enterobacter aerogenes chez le lapin sur : o la capacité à éliminer la bactérie Enterobacter dans le sang, la rate ou le foie. o L’amélioration du fonctionnement immunitaire et des cellules o la correction des dysfonctions des différents organes - Evaluer l’effet d’une injection intraveineuse de CSMs, lorsque l’on associe ce traitement à un antibiotique, au cours de la PAVM à Enterobacter aerogenes chez le lapin sur : o la capacité à éliminer la bactérie Enterobacter dans le sang, la rate ou le foie. o L’amélioration du fonctionnement immunitaire et des cellules o la correction des dysfonctions des différents organes
Bénéfices attendus
Ce projet chez le lapin visant à évaluer l’effet de ce traitement à bases de cellules souches (CSMs), est un prérequis indispensable pour justifier l’évaluation des CSMs dans des essais chez les patients souffrant de pneumonie acquise sous ventilation mécanique en réanimation. De plus, nous pensons que ce travail permettra une meilleure compréhension des mécanismes d’action des CSMs.
Procédures
Les lapins seront soumis, par ordre chronologique durant l’expérimentation : - Pose d’un cathéter veineux central sous anesthésie générale (Kétamine et Xylazine administrées par voie intraveineuse) 72 heures avant le début de l’expérimentation (durée 60’). - Intubation orotrachéale par les voies naturelles sous anesthésie générale (Kétamine et Xylazine administrées par voie intraveineuse) pour mise en place d’une sonde d’intubation (20’). - Ventilation mécanique selon un schéma protecteur utilisant des paramètres ventilatoires similaires à ceux utilisés en pratique clinique (48h). - Injection de LPS (toxine Lipopolysaccharide) par voie intraveineuse via le cathéter central (2’) - Prélèvements sanguins veineux en utilisant le cathéter veineux (vigiles pour les animaux ventilés, sous anesthésie générale chez les animaux ventilés) (2’) - Inoculation intratrachéale bactérienne (inoculum calibré d’Enterobacter aerogenes), par la sonde d’intubation, chez l’animal en cours de ventilation mécanique sous anesthésie générale (2’) - Administration des CSMs et/ ou de l’antibiothérapie par le cathéter (2’) - Autopsie à 48 heures du début de l’expérimentation, après anesthésie par Kétamine et Xylazine puis injection létale d’Euthasol (30’)
Impact sur les animaux
Des études antérieures de notre équipe montrent qu’une ventilation mécanique (VM) prolongée (jusqu’à 48 heures) avec des paramètres de ventilation plus agressifs que ceux utilisés dans cette étude, n’entraine pas de risque vital pour le lapin. De plus, notre modèle de pneumopathie acquise sous ventilation (PAVM) à Enterobacter aerogenes chez l’animal ventilé et subissant une inoculation bactérienne, n’entrainait pas de risque vital pour le lapin dans un précédent travail de l’équipe. En revanche, l’injection de LPS au début de l’expérimentation n’a pas encore été évaluée dans notre modèle de PAVM à Enterobacter. La partie 1 du projet permettra d’évaluer l’effet de cette double agression (VM + LPS) et ainsi de valider notre modèle avant la réalisation des 2 essais thérapeutiques. Néanmoins : - L’ensemble des animaux ventilés sera sous anesthésie générale pendant l’ensemble de l’expérimentation (absence de réveil). - D’autre part, une injection de LPS à la même concentration que celle utilisée dans notre modèle n’entrainait pas de risque vital chez le lapin. Enfin, ce type d’expérimentation a été régulièrement réalisé chez des volontaires sains pour étudier le rôle de l’endotoxémie (effet du LPS), sans complication, en dehors de la fièvre produite par l’injection. Le cathéter veineux central préalablement posé sous anesthésie générale permet un contrôle précis de l’administration des thérapeutiques (afin d’assurer le bon déroulement de la VM) et la réalisation des prélèvements sanguins sans causer de douleur à l’animal. Les animaux seront présents à l’animalerie la veille du début de l’expérimentation. Les animaux resteront sous anesthésie générale pendant toute la durée de la manipulation sous Midazolam et Kétamine, en continu, afin d’éviter toute douleur et tout réveil intempestif. Les animaux sont aussi curarisés par Besilate de cisatracurium permettant une ventilation sans difficulté et sans aucun ressenti pour l’animal.
Devenir
Les animaux seront tous mises à mort à la fin de la procédure sous anesthésie générale par une injection d’un mélange Kétamine + Xylazine suivi d’une injection létale d’Euthasol (0,5mg). Différents prélèvements seront effectués afin de réaliser les différentes mesures immunitaires, métaboliques, et afin d’évaluer les dysfonctions des organes. → Lavage broncho-alvéolaire : mesure de paramètres immunitaires et métaboliques (mitochondriaux) → Prélèvement de tissu pulmonaire : histologie pour apprécier les dommages tissulaires, bactériologie pour apprécier la clairance microbienne, extraction protéique pour mesures immunitaires, extraction d’ADN pour mesure du pool mitochondrial, extraction ARN pour mesures de paramètres mitochondriaux. → Prélèvement de foie et rate : bactériologie, extraction protéique Ainsi, ces différentes mesures permettront d’évaluer l’effet des agressions mécaniques et infectieuses, et l’effet des thérapies investiguées.
Remplacement
Le Remplacement du modèle animal est limité pour ce type d’expérimentation. L’utilisation de modèles d’étirements de cellules pulmonaires ne permet pas de reproduire l’infection, la réponse immunitaire et les conséquences sur le reste de l’organisme qui conduisent au décès. Le lapin est un modèle privilégié pour une VM prolongée par les voies naturelles. La VM de plus petits animaux nécessite en effet des procédures invasives telles que la trachéotomie, ne peut être conduite plus de 6 heures, et se complique fréquemment. Ceci est particulièrement vrai pour obtenir un modèle préclinique de PAVM, où le poumon doit être préalablement soumis à une agression mécanique (ventilation) +/- une première agression infectieuse pendant une durée suffisante (24h dans notre modèle). A cela s’ajoute la 2ème agression infectieuse (pneumopathie acquise sous VM), qui nécessite un temps d’évaluation suffisant (au moins 24 heures). L’ensemble de ces contraintes et la complexité du schéma chronologique ne peuvent être résumées avec l’utilisation de petits rongeurs, encore moins par des expérimentations in vitro. Enfin, lorsqu’injectées par voie intraveineuses, de précédents travaux montrent que les CSMs migrent dans l’organe atteint (poumon) et exercent leurs effets différemment selon l’environnement dans lequel elles se trouvent. Ce mode d’action des CSMs exige leur évaluation dans un modèle in vivo, reproduisant au mieux les conditions cliniques observées chez les patients (administration intraveineuse, au cours d’une pneumopathie sous VM).
Réduction
Pour la partie 1 du projet, l’objectif est de décrire l’effet des agressions (VM +/- LPS) en comparaison au groupe contrôle. Le nombre d’animaux choisi (5/groupe) est le nombre minimal permettant de réaliser des analyses statistiques, et basés sur nos précédents travaux. En revanche, les parties 2 et 3 correspondent à des essais thérapeutiques dont l’objectif principal est de démontrer un effet des CSMs sur la clairance bactérienne pulmonaire. Le nombre d’animaux choisi (10/groupe) a été calculé à partir des résultats obtenus dans un précédent essai thérapeutique chez le lapin évaluant l’effet des CSMs au cours de la pneumopathie à pneumocoque ventilée. Au total, le nombre maximal de lapins sera de 61 sur 24 mois - Partie 1 : n=5/groupe ; 3 groupes +/- 10% de perte attendue (17 lapins) - Partie 2 : n=10/groupe ; 2 groupes +/- 10% de perte attendue (22 lapins) - Partie 3 : n=10/groupe ; 2 groupes +/- 10% de perte attendue (22 lapins)
Raffinement
Chaque procédure (pose de cathéter, intubation, ventilation, inoculation, autopsie) est réalisée sous anesthésie générale. Un cathéter veineux central maintenu par un gilet permet de s’affranchir de ponctions veineuses itératives et assure une anesthésie constante. Les animaux sont hébergés à température réglée. L’intubation et l’inoculation se font sur un animal préalablement anesthésié par voie intra-veineuse par un mélange de Kétamine (27mg/kg) et Xylazine (2mg/kg). Un délai de 5 min est observé avant toute intervention. L’animal est pré-oxygéné. Un laryngoscope pédiatrique permet d’exposer les cordes vocales à la vue et d’insérer sous contrôle de la vue un guide semi rigide à bout mousse atraumatique entre les cordes vocales et par la suite la sonde d’intubation. En cas de mouvements moteur lors de la stimulation endobuccale au début de l’exposition de la filière respiratoire (mâchonnement), l’animal est reposé et une nouvelle dose de mélange anesthésique est administrée. Ainsi, l’intubation ne doit souffrir d’aucune résistance de la part de l‘animal. L’anesthésie est entretenue par administration intraveineuse d’un mélange de Kétamine (1mg/kg/h) et Midazolam (0.2mg/kg/h) ainsi qu’une curarisation Besilate de cisatracurium 0.8mg/Kg/h) à l’aide d’un pousse seringue électrique pendant toute l’expérimentation et jusqu’au décès. Le curare permet de maintenir l’animal immobile pendant toute la durée de l’expérimentation, évitant tout risque d’extubation. Les animaux sont positionnés sur un tapis chauffant (39°C), hydratés par perfusion continue de sérum physiologique (5ml/h) et les yeux hydratés puis occlus. Un scope permettra de dépister les variations de fréquence cardiaque et ainsi une possible dysfonction du système d’anesthésie pour y remédier rapidement. La mise à mort sera effectuée au terme de la durée d’expérimentation (24 ou 48h) par une injection létale d’Euthasol (0,5mg) administrée par le cathéter veineux central. Nous n’attendons pas de mortalité avec ce modèle d’après nos précédents travaux, et ceux d’autres équipes, mais si un décès survient, celui-ci surviendra sous anesthésie générale, sans réveil, jusqu’au décès spontané, ou lors de l’autopsie programmée à 48 heures. Une évaluation rétrospective sera effectuée à la fin du projet.
Choix des espèces
La ventilation prolongée est maitrisée sur de grands animaux (porc, singes). Les modèles sur petits rongeurs (souris, rat), ont de nombreuses limites qui rendent l’interprétation des résultats difficile : - Ventilation invasive par trachéotomie, source de complications (stress de l’animal, hémorragie, décès possible). - Contrôle difficile des volumes du fait de la taille de l’animal (une variation de volume peut entrainer des différences importantes en termes de lésions pulmonaires). - Durée de ventilation limitée (maximum 6h), l’information sera alors incomplète, car ne renseignant que sur les premières heures du processus. Le modèle du lapin permet une ventilation prolongée par les voies naturelles, sans entrainer de répercussion vitale et sur les paramètres d’échange gazeux. La procédure expérimentale est envisagée sur des lapins de 2.8 à 3.3 kg, soit environ 10-12 semaines. Le poids et l’âge de l’animal sont primordiaux. En effet, l’état immunitaire de l’animal est dépendant de son âge et de son poids. Des animaux avec une immunité mature sont nécessaires. La filière respiratoire haute doit être suffisamment large pour permettre une intubation atraumatique (intubation plus difficile lorsque l’animal fait moins de 2,5kg). Enfin, tous les animaux doivent avoir un profil identique afin de ne pas induire de biais dans la comparaison des groupes.
STIMULATION CARDIAQUE DANS LES BLOCS AURICULOVENTRICULAIRES IMMUNS : EVALUATION DE FAISABILITE VIA UN STIMULATEUR CARDIAQUE SANS SONDE CHEZ LE LAPIN
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
15 lapins vont être utilisés dans un modèle de bloc cardiaque du fœtus, dix opérés sous anesthésie et tués sans réveil, cinq maintenus en vie trois mois puis tués. Chaque animal subit l'implantation d'un stimulateur cardiaque sans sonde autour du cœur et une ablation du nœud auriculoventriculaire pour ralentir son cœur, une chirurgie d'environ trente minutes. Le porteur choisit le lapin car son gabarit de 500 à 800 grammes est comparable à celui d'un fœtus humain entre seize et vingt-quatre semaines. Il affirme que le remplacement n'est pas possible et que l'étude doit se faire sur des animaux vivants.
Objectifs
L’objectif de ce projet de recherche est d’évaluer la faisabilité d’implantation d’un pacemaker sans sonde en épicardique (autour du coeur) chez des animaux de gabarit comparable à un fœtus humain (lapin). En effet, les troubles de la conduction chez le fœtus, responsables d’un ralentissement important de la fréquence cardiaque, sont le plus souvent provoqués par la présence d’anticorps chez la mère, qui provoquent une atteinte des voies électriques chez le fœtus. Les blocs auriculoventriculaires complets (BAVc) fœtaux se développent le plus souvent entre 16 et 24 semaines d’aménorrhées (SA), touchent environ 1/10 000 nouveaux nés vivants, et la morbi-mortalité reste très importante avec près de 20% des fœtus qui décèdent. Il n'existe aucune option thérapeutique à l'heure actuelle. En l’absence de thérapeutique efficace chez ces patients, le développement d’un système de stimulation pour les fœtus atteints de BAVc est essentiel pour permettre d’accélérer leur fréquence cardiaque afin de poursuivre le développement normal jusqu’au terme de la grossesse. Des nouveaux systèmes de stimulation ont été développés, notamment des pacemakers miniaturisés sans sonde. Compte tenu le gabarit très limité des fœtus à ces termes (500 gr – 800 gr), l’implantation d’un pacemaker relié à une sonde épicardique est complexe. Si ces pacemakers sans sonde sont habituellement implantés à l’intérieur du cœur (endovasculaire), ces pacemakers de nouvelle génération pourraient être implantés en épicardique avec un boitier en position abdominale chez le fœtus.
Bénéfices attendus
Il n’existe, à l’heure actuelle, aucune thérapeutique efficace chez les fœtus en bloc auriculoventriculaire complet congénital avec mauvaise tolérance (ralentissement extrème du coeur ne permettant pas au foetus de se développer normalement avec risque de mort foetale). La seule option est l’extraction par césarienne si le terme de la grossesse le permet, avec les complications connues de la grande prématurité. Si différentes stratégies de stimulation in utero ont été essayées, sans succès chez l’homme, il apparait que le système de stimulation doit être implanté entièrement dans le fœtus, en raison du déplacement des sondes de stimulation lié aux mouvements du fœtus quand le boitier du stimulateur est externe ou dans le ventre maternel. Le développement d’une technique de stimulation adaptée est essentiel pour permettre d’accélérer la fréquence cardiaque des fœtus afin de poursuivre le développement normal jusqu’au terme de la grossesse. Cela est d’autant plus importants que le taux de mortalité reste très important mais aussi car le risque de récidive pour un futur enfant chez la même mère est aussi considérable (supérieur à 20%). Cette étude sera la première à évaluer la faisabilité d’implantation d’un stimulateur sans sonde en position épicardique (autour du coeur avec boitier en position abdominale) chez des animaux de gabarit comparable aux fœtus humains. Si les résultats sont positifs, cette étude sera complétée par une étude chez l’homme.
Procédures
Les animaux seront soumis à 1 intervention chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie avec implantation d'un stimulateur sans sonde par voie épicardique (autour du coeur avec stimulateur en position abdominale). Dans le même temps, une ablation du noeud auriculoventriculaire sera réalisée pour ralentir le coeur du lapin (création d'un bloc auriculoventriculaire pour ralentir le coeur du lapin afin d'évaluer de façon appropriée si le stimulateur contrôle bien la fréquence cardiaque du lapin). La durée de l'intervention est évaluée à 30 minutes.
Impact sur les animaux
Chirurgie pour implantation d'un stimulateur épicardique (autour du coeur). Chez les 5 lapins non mis à mort à la fin de la chirurgie: cicatrice liée à l'implantation, potentielles douleurs post opératoires, suivi avec electrocardiogramme, échographie cardiaque, radiographie thoracique.
Devenir
Une 1ère procédure sans réveil impliquera 10 lapins. Cette 1ère étape s'arretera après 4 succès d'implantation dont au moins les 2 dernières implantations successives avec succès. Si ces critères sont réunis avant les 10 lapins, la 2ème procédure sera mise en place sans réaliser la 1ère procédure chez les autres lapins. Pour la 2ème procédure, 5 lapins seront implantés d'un stimulateur cardiaque sans sonde (idem procédure n°1) avec réveil pour suivi du fonctionnement du stimulateur cardiaque au long cours pendant 3 mois afin d'évaluer le fonctionnement optimal du stimulateur cardiaque à distance au cours de la croissance puis seront mis à mort.
Remplacement
L’objectif de ce projet de recherche étant d’évaluer la faisabilité d’implantation de stimulateurs cardiaques sans sonde en épicardique chez des animaux de gabarit comparable aux fœtus humains et le fonctionnement optimal de ces stimulateurs cardiaques, ce projet doit être réalisé sur des animaux vivants. Le remplacement n'est donc pas possible.
Réduction
Le nombre d’animaux (n=15 dont 5 avec un suivi chronique pendant 3 mois) a été discuté de façon collégiale avec les cardiologues pédiatriques, les rythmologues, et les chirurgiens cardiaques, pour être réduit au maximum mais permettre cependant de démontrer la fiabilité de l’approche et d’optimiser la technique d’implantation avant les premières implantations chez des fœtus humains. En l'absence de groupe contrôle pour mettre en évidence une différence, une puissance statistique ou nombre de sujets necessaires n'est pas applicable.
Raffinement
Les contraintes subies par les animaux seront minimisées pour que leur bien-être soit préservé au mieux. Les animaux seront pris en charge par les vétérinaires du centre avant l'intervention et dans le cadre du suivi pour les animaux non mis à mort après l'implantation. Les lapins sont hebergés dans des cages Techbiplast (portoirs de 3 cages), 1 lapin par cage avec abrevement au biberon et nourriture en granulé en permanence. Nous avons ajouté de l'enrichissement avec du foin et des jouets (bâton de bois et balle). Les lapins sont visités tous les jours week-end compris avec 2 changes par semaine. Lors de l'intervention, le protocole suivant sera appliqué: Les animaux sont maintenus à jeûn 24 heures avant l’intervention chirurgicale (24 heures pour l’alimentation solide, 8 à 12 heures pour l’eau). Un examen clinique pré-anesthésique est réalisé : couleur des muqueuses, temps remplissage capillaire, auscultation cardiaque et pulmonaire, fréquences cardiaque et respiratoire, température, tympanisme gastrique. Anesthésie: Un cathéter veineux est mis en place dans l’oreille. Injection en intra musculaire Zoletil 100 : 8 mg/kg ; Rompun 5 mg/kg : Une perfusion d’entretien de soluté de Ringer Lactate est mise en place (10-20 ml/kg/heure). Toute perte sanguine sera corrigée par un apport supplémentaire de soluté de Ringer lactate représentant trois fois le volume des pertes sanguines enregistré. Gouttes de lubrifiant oculaire administrées aux lapins pendant la chirurgie. Monitoring de l’anesthésie: les paramètres de surveillance anesthésiques seront évalués toutes les cinq minutes : - Couleur des muqueuses et temps de recoloration capillaire. - Tonus musculaire mandibulaire. - Positionnement du globe oculaire. Myosis/mydriase. Réflexe palpébral. - Fréquences cardiaque et respiratoire. - Oxymétrie de pouls. - Température. Analgésie: l’analgésie est obtenue par injection, lors de l’induction, de chlorhydrate de morphine (0.05 à 0.5 mg/kg par voie intra-musculaire ; morphine Lavoisier, France) renouveler toutes les 4 à 6 heures. Ce traitement analgésique pourra être poursuivi, après évaluation de la douleur de l’animal et examen clinique, pendant les 48 à 72 heures post-opératoires. Une injection de Ketofen 10 % (2 mg/kg par voie intramusculaire ; Ceva, France) est réalisée sur l’animal extubé et en décubitus sternal. Ce traitement anti-inflammatoire sera poursuivi sur une période de 3 à 5 jours (2 mg/kg/24 heures).
Choix des espèces
Le lapin a été choisi car le gabarit des petits lapins (entre 500 gr et 800 gr) est comparable avec le gabarit des foetus humains aux termes de grossesse (entre 16 et 24 semaines d’aménorrhées) ou la survenue de BAV pourrait indiquer la mise en place d'un stimulateur cardiaque. D'autres espèces avec des gabarits compatibles (comme le cobaye) n'ont pas été retenues devant l'absence d'agrément de notre centre pour ces espèces. Par ailleurs, pour les animaux non mis à mort après l'implantation, la croissance des lapins permettra d'évaluer la fiabilité du stimulateur cardiaque au décours de la croissance de l'animal, permettant d'étudier si le système de stimulation restera fiable chez le foetus humain au cours de la grossesse.
Lipiodol et Hystérosalpingographie
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 300
Lapins : 500
1 000 souris, rats et lapins vont être utilisés dans des procédures couvrant tous les niveaux de souffrance, du plus léger au plus sévère, la plupart tués à l'issue et 120 réutilisés dans d'autres procédures. Ils subissent des accouplements, une synchronisation hormonale, des frottis vaginaux répétés, l'administration intra-utérine d'un produit de contraste par voie basse ou chirurgicale et une induction d'endométriose. L'objectif est de comprendre comment le Lipiodol, un produit de contraste iodé, améliore la fertilité féminine. Le porteur affirme que ce mécanisme ne peut s'étudier in vitro et conclut à une "nécessité" du recours à l'animal.
Objectifs
L'hystérosalpingographie est un examen radiographique (aux rayons X) de l’utérus et des trompes utérines généralement indiqué dans les bilans de d’infertilité féminine afin de vérifier la perméabilité des trompes de Fallope et la normalité de la cavité utérine. Elle consiste en une instillation de produit de contraste iodé (radio opaque) dans l’utérus et les trompes via une canule accolée au col de l'utérus. L'absence de passage du produit de contraste depuis les trompes de Fallope dans la cavité péritonéale signe une obstruction tubaire. Cette obstruction tubaire rend compte d’une infertilité féminine dans environ 35% des cas. Des travaux cliniques ont montré que l’hystérosalpingographie, quand elle est réalisée au moyen de l’injection d’une huile iodée, le Lipiodol, se traduit par une augmentation de la fertilité par rapport à la même technique réalisée au moyen de produits de contraste iodés hydrosolubles. Le mécanisme de cet effet n’est pas connu. Il existe quelques hypothèses dans la littérature. L’objet de ce projet est l’élucidation de ce mécanisme et des éventuelles conséquences endocrinologues (thyroïdiennes notamment) de l'administration d'un produit iodé ou huileux.
Bénéfices attendus
Les différentes études de ce projet seront réalisées dans le but de comprendre le rôle du Lipiodol dans l’amélioration de la fertilité et son mode d’action. Plusieurs hypothèses seront isolées et testées afin de connaître précisément le mécanisme du Lipiodol. Si un mécanisme est identifié, des essais cliniques pourront être lancés afin de confirmer l’effet en clinique. L’utilisation du Lipiodol pourra alors être revue et adaptée au mieux, pour les patientes chez lesquelles un effet pourrait être observé. En effet selon le mécanisme, il est possible que la totalité des causes d’infertilité féminines ne soit compatible avec une amélioration de la fertilité par l’administration du Lipiodol. Les patientes présentant un trouble de la fertilité pourraient donc par la suite bénéficier d’une meilleure prise en charge aboutissant à une augmentation des taux de grossesses, et évitant le recours aux procédures les plus invasives (fécondation in vitro ou autre).
Procédures
Imagerie RX, IRM ou échographie (15 minutes environ), accouplement, synchronisation du cycle œstral par supplémentation hormonale (une injection en vigile), frottis vaginal (2 minutes, en vigile): pourra être répété au cours de l’étude, avec un temps de récupération adapté entre chaque procédure. Administration intra-utérine d’un produit de contraste par voies basses ou chirurgie : une fois (1 heure au plus) puis suivi de quelques semaines par imagerie (15 minutes environ), sauf en cas de mise au point ou d’intérêt scientifique de répéter l’administration Induction d’endométriose : une chirurgie (1 heure environ), puis suivi clinique de quelques semaines.
Impact sur les animaux
Les procédures d’imagerie RX, IRM ou échographie, d’accouplement, de synchronisation ou d’identification par frottis vaginal du cycle oestral sont légères. Les nuisances attendues sur les animaux suite à ces procédures sont un potentiel inconfort au réveil dû à la durée de l’anesthésie ou lors de l’injection pour les procédures le nécessitant, ou du stress lors des contentions. La mise sous lampe chauffante ou sur tapis chauffant pendant les procédures d’anesthésie sera mis en place afin de maintenir la température corporelle, ainsi qu’au réveil. La procédure d’administration d’un produit par instillation intra-utérine, peut induire un inconfort gynécologique de l’animal, une irritation ou inflammation locale suite à l’insertion des cathéters, à la dilatation des trompes par l’injection du produit, ou à son écoulement. La procédure d’administration intra-utérine d'un produit par une procédure chirurgicale, et la procédure d’induction d’un modèle d’endométriose impliquent une chirurgie sous conditions stériles suivie d’une suture. Malgré la prise en charge analgésique post-opératoire, une démangeaison et/ou une douleur peuvent se manifester au niveau de la suture à cause de la tension des tissus et la cicatrisation. Une moindre activité et prise de nourriture peuvent être observées pendant quelques jours, suite à la chirurgie et l’anesthésie. Une collerette pourra être placée sur l’animal s’il touche trop leur plaie, et une hydratation pourra être envisagée au cas par cas si besoin. Les animaux seront surveillés quotidiennement et une prise en charge adaptée à chaque observation sera mise en place.
Devenir
En dehors des phases de mises au point, les animaux sont réveillés à l'issue de toutes les procédures. Les animaux seront suivis à leur réveil, plusieurs fois par semaine, pour évaluer leur état. En cas d'atteinte des points limites, une dernière procédure d'imagerie peut être effectuée sous anesthésie. A l’issue d’une étude (succession de plusieurs procédures), une mise à mort peut être réalisée sous anesthésie profonde à des fins d’analyse histologique ou de dosage, afin par exemple de caractériser la biodistribution et le mode d’action des produits testés.
Remplacement
La fertilité est le résultat de multiple processus complexes et interconnectés. Le mécanisme d’action du Lipiodol sur la fertilité est inconnu. L’étude de son effet est alors difficilement réalisable sur des modèles simplifiés in vitro. De plus, le Lipiodol n'est pas soluble dans les milieux de culture. Il semble donc nécessaire d'effectuer des études in vivo plus proche de la pratique clinique afin de mieux comprendre les effets induits par la présence de Lipiodol. Le recours au modèle animal apparaît donc comme une nécessité, au moins pour une partie des études. L’une des hypothèses mécanistiques de l’effet pro-fertilisant du Lipiodol est l’effet mécanique, par un meilleur débouchage des trompes, un effet viscosité du produit ou autre. Afin de remplacer le recours à des animaux, l’étude de cette hypothèse sera faite uniquement in vitro. Des études de cultures cellulaires in vitro pourront aussi être effectuées en complément afin d'étudier par exemple plus en détails la réponse immunologique sur un certain type cellulaire.
Réduction
Analyse bibliographique préclinique en amont pour ne pas refaire ce qui a déjà été fait, identifier les pistes à suivre, les erreurs à éviter, et faciliter les phases de mise au point. Macro-analyse de la littérature clinique pour en tirer les produits et donc paramètres qui semblent corréler avec les résultats de fertilité (guide vers une hypothèse mécanistique plutôt qu’une autre), et les pathologies répondant le mieux à l’amélioration de la fertilité après HSG (modèle le plus adapté). Recherche et contact d’équipes à contacter spécialistes dans les différents domaines (HSG clinique et préclinique, endométriose, fertilité et PMA) pour nous guider dans nos recherches (aide technique, pertinence des études, modèles, paramètres à suivre). Réutilisation des animaux pour les mises au point : - Lorsque cela est possible, premiers essais sur animaux post-mortem ou sans réveil d’animaux qui doivent être euthanasiés dans d’autres projets - Lors des étapes suivantes de mise au point, avec réveil, réutilisation d’un animal plusieurs fois si pertinent (échec précédent, non interférence avec les paramètres évalués) et procédure légère ou modérée - Un délai de 14 jours sera respecté avant réutilisation afin de permettre à l’animal de récupérer pour les HSG Lapins. Pour les souris, l’essai du passage du col et éventuellement l’injection vigile intra-utérine et contrôle par imagerie pourra être réalisé jusqu’à 3 fois par semaine, suivi d’un repos de 7 jours si une réutilisation pour le même usage est envisagée. Pour le protocole de synchronisation oestral des souris, un délai de 2 semaines sera respecté entre 2 administrations hormonales. Réutilisation des animaux au sein des études : - un échec de procédure légère ou modérée (par exemple échec d’administration intra-utérine d’un produit par voie naturelle) mènera à la réutilisation de l’animal pour un second essai, après temps de récupération nécessaire, à condition que les points limites ne soient pas atteints et si le protocole d’étude le permet. - suivi longitudinal de la distribution du produit en imagerie sur un même animal plutôt que par dosage sur prélèvement, pour réduire le nombre d’animaux en étude. - Les animaux dont l’euthanasie n’est pas nécessaire pour la finalité de l’étude pourront être réutilisés pour des mises au point de techniques/modèles, dans un autre projet, pour la formation, le prélèvement de matrices pour mises au point de techniques d'analyses.
Raffinement
Surveillance et relevé quotidien de l’état clinique, pesée régulière et scoring adapté à chaque protocole afin de quantifier l’état clinique, envisager un traitement et déterminer un score « point limite ». Enrichissement des cages d’hébergement : • Balle et bâtons en bois à ronger (lapins) • Bâtons à ronger, tubes en plexiglass pour l’abri, frisures de papier kraft pour le nid (rongeurs en groupes sociaux). Système de maintien de la température et monitoring de paramètres physiologiques lors des anesthésies. Anesthésie et analgésie : •Chez la Souris, l’administration intrautérine sera idéalement vigile en simple contention, comme cela est fait dans le cadre de l’insémination artificielle. La mise au point sera réalisée en premier lieu sous anesthésie gazeuse. Une habituation des animaux à la contention sera réalisée avant le début de la procédure afin de réduire le stress. •Chez la Ratte, si l’administration par voies naturelles est possible, elle se fera sous anesthésie gazeuse. •Dans les deux cas, si des signes de gêne ou de douleur apparaissent, une administration d’antispasmodique ou d'analgésique sera mise en place en curatif et/ou en préventif selon la fréquence d’observation de ces symptômes et la durée d’action de ces médicaments. •Chez la Lapine, la procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse de préférence, après administration d’un mélange d'un analgésique, d'un myorelaxant et sédatif, et d'un tranquillisant et sédatif. Une fois endormie, un antispasmodique sera administré afin de faciliter l’accès aux trompes en réduisant les spasmes tubaires. L’ensemble de cette médication devrait assurer le bon déroulement de la procédure et limiter les lésions éventuelles du tissu. Pour l’administration du produit par voie chirurgicale, ou chirurgie en vue de l’induction d’un modèle d’endométriose, une analgésie sera réalisée en pré-opératoire ainsi qu’en post-opératoire. Une nouvelle administration sera effectuée ultérieurement en cas de signe de souffrance les jours qui suivent. Mise en place d’une alimentation adaptée post chirurgie : •chez la Lapine, gel hydratant, quartiers de pommes, foin •chez le Rongeur, pellets placés dans la sciure plutôt qu’en hauteur, gels hydratants, friandises.
Choix des espèces
Notre espèce de choix est le Rat car c’est l’animal qui est classiquement utilisé dans les études de fertilité (réglementaires). De plus, des études de biodistribution et de toxicité à visée réglementaire seront effectuées sur cette espèce. Cela nous permettra de comparer certains résultats et d’être complémentaire à ces travaux destinés aux Autorités de Santé. Si la mise au point du modèle n’est techniquement pas possible chez le Rat, nous pourrons effectuer des études chez la Souris ou le Lapin, comme cela a aussi pu être fait dans la littérature. Ce sont également des espèces utilisées dans le domaine de l’étude de la reproduction. Les animaux seront des jeunes adultes, idéalement sexuellement matures. Pour les rats : 8-16 semaines. Pour les souris : 7-14 semaines. Pour les lapins : 3-8 mois. Pour la génération F1 : de la naissance jusqu’au sevrage.
Conception d’un système d’élevage des lapins avec accès à l’extérieur , 1 – volet élevage en bâtiment
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
180 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils sont logés à six en cages grillagées de 0,8 m² sans traitement antibiotique, avec prises de sang et rasages du dos pour mesurer le cortisol, dans une étude censée améliorer le bien-être des lapins d'élevage. Le porteur indique que 60 lapins seront tués pour des prélèvements de tissus et de cerveau, et que les 120 autres partiront à l'abattoir à 77 jours. Il présente comme "urgent" de faire évoluer un élevage critiqué, tout en menant l'essai en cages grillagées sans possibilité de soigner les malades.
Objectifs
Contexte : Le mode d’élevage des animaux est aujourd’hui critiqué par la société car jugé non respectueux du bien-être animal. En France, l’élevage de lapins est réalisé en grande majorité dans des cages grillagées de petite taille (
Bénéfices attendus
Les lapins font partie des espèces d'élevage élevées en totale claustration. Il y a donc une nécessité à faire évoluer les conditions d'élevage pour améliorer le bien-être des lapins, anticiper l’évolution réglementaire et prendre en compte la demande sociétale. Mais il est nécessaire que ce progrès ne se fasse pas au détriment de la santé des animaux. Les connaissances générées par le projet contribueront à guider l'évolution des conditions d'élevage des lapins en éclairant sur le choix d’une lignée génétique adaptée à un élevage avec accès à l’extérieur.
Procédures
Nous souhaitons évaluer la santé, le stress, le comportement (observation directe), la croissance (pesées) et les modifications de l'ADN. Les interventions contraignantes sont les suivantes : 1) Les 180 lapins seront logés par 6 pendant 5 semaines dans des cages collectives grillagées de 0,8 m2 du sevrage (35j) à 70 j d'âge. Afin d'étudier l'impact de leurs conditions de vie et de leur type génétique (sélectionnés ou témoins) sur leur santé, les animaux sont élevés sans traitements antibiotiques. 2) Pour 160 lapins : (a) une prise de sang unique d'un petit volume de sang réalisée à 60 jours d’âge minimum (durée < 5 minutes), (b) deux rasages du dos de 10 cm2 (durée < 2 minutes par rasage) fait avec une petite tondeuse électrique à 35 et 63 jours. Les échantillons de sang permettront d'évaluer la santé, l'immunité des lapins (formule sanguine, dosage d'anticorps) et les modifications de l'ADN (marques épigénétiques). Les échantillons de poils permettront d'analyser les quantités de cortisol (hormone du stress) accumulées dans le poil tout au long de la période d'élevage des lapins. 3) Pour 20 lapins : euthanasie par électronarcose suivie d'une saignée pour des prélèvements post-mortem de tissus intestinaux et de sang. Ces échantillons permettront de déterminer le microbiote (flore intestinale) des lapins, et d'évaluer leur santé et leur immunité (formule sanguine, dosage d'anticorps).
Impact sur les animaux
Certaines actions sont légèrement stressantes pour les animaux : (a) la contention et la douleur liée à l’introduction d’une aiguille pour la prise de sang, (b) la contention et le bruit de la tondeuse peuvent aussi être brièvement stressants lors du prélèvement de 10 cm² de poil sur le dos de l'animal, (c) La vie en cage contraint l'expression des comportements propre à l'espèce et restreint les mouvements des animaux, (d) par ailleurs, l'absence de recours à des traitements antibiotiques ne permet pas de soigner les malades ou de faire des traitements préventifs.
Devenir
20 lapins seront euthanasiés à 42 jours pour des prélèvements de tissus. A la fin de l'engraissement, à 77 jours d’âge, 40 lapins (10 lapins de chaque sexe pour les deux lignées génétiques) seront euthanasiés par une overdose d'anesthésiant pour pouvoir relier, par méthode d’imagerie, le comportement des animaux et leur anatomie cérébrale, tandis que les 120 autres lapins intègreront la chaine alimentaire à 77 jours d’âge.
Remplacement
Le but du projet est d'améliorer les conditions d’élevage du lapin afin qu’elles soient plus respectueuses du bien-être tout en préservant la santé des animaux. Pour que ces résultats aient un impact sociétal et soient repris par les éleveurs voire les organismes professionnels de sélection, en lapin ou sur d’autres animaux d’élevage, les résultats doivent être obtenus sur l’espèce cible ou une espèce proche, dans des conditions d’élevage. Il n'est pas possible d'utiliser des simulations ou des approches in-vitro.
Réduction
Les effectifs de lapins ont été définis pour pouvoir comparer les résultats obtenus sur les animaux sélectionnés pour la résistance aux maladies versus témoins et pour chacun des sexes. Il y a donc deux lots de 90 lapins comportant chacun 45 mâles et 45 femelles, soit 180 lapins. Cet effectif tient compte d'un taux de mortalité moyen attendu de 12%, et permet d'observer des faibles différences de poids, de taux de cortisol, de modifications de l'ADN, statistiquement significatives.
Raffinement
Les méthodes de prélèvements employées sont peu ou pas invasives (prise de sang à l’oreille, coupe de poils dans le dos), et seront mises en œuvre par un personnel formé et disposant des autorisations nécessaires à l'expérimentation animale, et expérimenté dans la manipulation des lapins, utilisant une contention manuelle douce et rassurante pour l'animal. Pour éviter de manipuler plusieurs fois les lapins, les prélèvements de poil seront réalisés au moment de la pesée à 35 jours et 63 jours. Les animaux seront logés par 6 en cages collectives de grande dimension (0,8 m2) équipées d'une plateforme et d'un bloc à ronger. Les conditions d'ambiance du bâtiment seront maîtrisées : température de 19°C, renouvellement de l'air en continue, lumière naturelle, hygiène scrupuleuse). L'état de santé (présence de diarrhées, poil piqué, animal abattu) sera surveillé au quotidien. Les animaux malades qui ne présenteraient pas de perspectives de guérison seront euthanasiés de façon compationnelle.
Choix des espèces
Les travaux ont un objectif finalisé d’application au sein de la filière de production de lapins française, dans le but d'améliorer le bien-être tout en respectant la santé des lapins. Il n’est donc pas pertinent de choisir une autre espèce animale que le lapin. Les animaux seront utilisés entre le sevrage (35 jours) et la fin de l’engraissement (77 jours). Le projet a pour objectif de proposer des améliorations de l'élevage des lapins destinés à la consommation humaine. Il est donc nécessaire de faire des observations et mesures sur les lapins de chair habituellement commercialisés.
Analyse de la bio-compatibilité dans la cornée, de lenticules cornéens lyophilisés à des fins de greffes.
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
Greffés d'un lenticule de cornée lyophilisé sur chaque œil, 24 lapins New Zealand adultes sont gardés en vie trois mois, puis tous tués pour le prélèvement de leurs cornées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'opération, menée sous sédation profonde et anesthésie locale par collyre, dure dix minutes par œil, et les yeux sont photographiés chaque semaine pour suivre l'intégration du greffon. Le projet vise à vérifier qu'un stroma cornéen décellularisé et lyophilisé, stockable à température ambiante, s'intègre et reste transparent, en vue de greffes chez l'humain, notamment dans les pays qui manquent de cornées. Pour justifier l'opération des deux yeux, le porteur la qualifie de "totalement indolore en post opératoire", alors qu'il annonce une vision floue pendant 72 heures et une douleur possible les 24 premières heures.
Objectifs
La cornée est la membrane transparente située en avant de l’oeil. Elle est constitué de plusieurs couches : - L’épithélium, qui constitue la couche la plus externe - La membrane de Bowman - Le stroma - La membrane de Descemet - L’endothélium, la couche la plus interne Les atteintes de la cornée peuvent toucher son épaisseur sur la totalité ou en partie (épithéliale, stromale ou endothéliale). Ces atteintes génèrent une opacité ou une déformation, dans ce cas l’individu devient non voyant et il est nécessaire de réaliser une greffe de cornée, soit sur toute l’épaisseur, soit sur une partie de son épaisseur. Cependant, le nombre de cornées disponibles pour les greffes, le mode de conservation et sa durée reste limités. Dans le but de surmonter les pénuries et les contraintes, d’autres alternatives sont mises en places. Dans le cas où il est nécessaire de réaliser une greffe lamellaire antérieure (stromale) de la cornée, la mise au point de stroma cornéen décellularisé et lyophilisé serait extrêmement intéressante. Cela permettrait de répondre plus aisément aux différents problèmes de conservation, transport, urgence de greffes et disponibilité. En France, le mode de conservation de la cornée d’origine humaine est l’organoculture à +31°C. Cette méthode nécessite des conditions de stockage volumineux et contraignant. Une alternative à l’organoculture est la lyophilisation de la cornée qui permettra une facilité de stockage ( à température ambiante). Ce projet s’inscrit également dans un but humanitaire pour faciliter l’accès à la greffe lors de perforation dans les pays n’ayant pas les capacités d’approvisionnement en cornées. Les méthodes d’analyses permettent d’évaluer la conservation de l’intégrité structurale avant et après réhydratation ainsi que sa transparence. Cependant, il reste nécessaire de confirmer la bonne intégration de ces greffes in vivo (chez le lapin) avant une application chez l’homme.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est d’évaluer la compatibilité, l’intégration ainsi que la transparence au sein de la cornée du lapin du lenticule de stroma décellularisé lyophilisé. L’objectif est à terme une application pour la greffe chez l’humain. Ce projet s’inscrit également dans un but humanitaire pour faciliter l’accès à la greffe lors de perforation dans les pays n’ayant pas les capacités d’approvisionnement en cornées.
Procédures
Chaque lapin suivra une procédure chirurgicale sur chaque œil d'une durée de 10 minutes soit un temps opératoire de 20 minutes maximum. Cette intervention consiste à greffer des lenticules lyophilisés au niveau de la cornée. Ce geste est réalisé par un chirurgien ophtalmologiste hautement qualifié.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de la greffe de corné chez le lapin sont les même que chez l'humain. Une vision légèrement floue durant les premiers 72h. Une légère douleur pourrait apparaitre durant les 24 premières heures due à l'inflammation engendrée par le geste opératoire.
Devenir
Tous les animaux sont gardés vivant pour une période de 3 mois à la fin de la procédure de greffe des lenticules, puis ils seront mise à mort pour l'evaluation des greffes.
Remplacement
Remplacement : la technique de lyophilisation de des cornées a été mise au point dans notre laboratoire et testée dans de nombreuse conditions in vitro. Aujourd’hui, nous devons confirmer la bonne intégration et la transparence des greffons stromaux lyophilisés sur la cornée animale avant de pouvoir l’utiliser chez l’homme. La dimension et la composition de la cornée du lapin est proche de celle de l'homme, cela permet une insertion plus facile par le chirurgien. De plus, le stroma cornéen sera préalablement décellularisé pour faciliter l’intégration dans la cornée du lapin.
Réduction
Dans le cadre de la règle des 3Rs : Réduction : Chaque lapin sera opéré des deux yeux. Cette intervention n’est pas cécitante, elle est régulièrement pratiquée en médecine humaine et totalement indolore en post opératoire ce qui nous permet de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés : - L’oeil droit recevra un lenticule dans l'épaisseur du stroma cornéen (INLAY) - L’oeil gauche recevra un lenticule à la surface du stroma cornéen (OVERLAY) Le nombre de lapins utilisé fait référence aux études antérieures et est nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement fiables et interprétables. Nous utiliserons un test de Wilcoxon ou un test Q de Cochran pour l'interprétation de statistique de nos résultats.
Raffinement
L’ensemble des procédures seront effectuées sous sédation profonde monitorée, couplée à une anesthésie locale médiée par un collyre ophtalmique. Les temps opératoires seront très courts maximum 10 minutes par oeil et pratiqué par un chirurgien qualifié. Afin de garantir une parfaite transposition chez l’humain les soins post opératoire seront les mêmes qu’en médecine traditionnelle : -Injection sous conjonctivale d’anti-inflammatoire en fin d’intervention. -Pommade ophtalmique deux fois par jour jusqu’à cicatrisation totale soit 5 à 7 jours. Chaque semaine, des photos seront réalisées sur les yeux afin de suivre la bonne intégration du greffon cornéen. A 3 mois post-greffe les cornées seront prélevées pour analyses histologiques. La manipulation des lapins sera facilitée par des séances d’entrainement récompensée (Fruity bites) durant les deux semaines d’acclimatation pré-opératoire. Des Bunny Block, des briquettes de bois et de luzerne seront disposés dans la cage de façon alterné afin d'assurer l'enrichissement du milieu et de la musique douce sera diffusée quotidiennement. Les points limites seront déterminés en se basant sur le Rabbit Grimace Scale et essentiellement sur l’Orbital tightening.
Choix des espèces
L’espèce choisie est le lapin new zealand. L’expérimentation proposée est relativement facile chez le lapin car la dimension de la cornée est proche de celle de l’homme et permet à un chirurgien d’insérer les lenticules de 7-8mm de diamètre avec facilité. Les lapins peuvent sous sédation être facilement examinés au biomicroscope pour la réalisation de photos post-opératoires et sont de très bons candidats pour cette mise au point. L’intervention réalisée chez l’homme sous forme de greffe de cornée n’est pas douloureuse et ne nécessite habituellement aucun antalgique. Stade adulte afin que l'oeil de l'animale ait atteint sa taille maximale. Soit 2kg à 2.5 kg 24 lapins seront utilisés 12 pour une correction à 2 lenticules et 12 pour une correcrtion à 3 lenticules.
Conception d’un système d’élevage des lapins avec accès à l’extérieur , 1 – volet élevage avec accès à l’extérieur
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
180 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Élevés en semi-plein air sans traitement antibiotique, ils subissent des prises de sang et des rasages du dos, 20 étant tués à 42 jours et 40 à 77 jours pour des prélèvements de tissus tandis que les 120 autres partent à l'abattoir pour la consommation. Le porteur présente le projet comme une réponse au bien-être des lapins et à la demande sociétale contre l'élevage en cage. Il indique que l'absence d'antibiotiques ne permet pas de soigner les malades et que l'exposition extérieure peut provoquer un stress thermique.
Objectifs
Contexte : Le mode d’élevage des animaux est aujourd’hui critiqué par la société car jugé non respectueux du bien-être animal. En France, l’élevage de lapins est réalisé en grande majorité dans des cages grillagées de petite taille (
Bénéfices attendus
Les lapins font partie des espèces d'élevage élevées en totale claustration. Il y a donc une nécessité à faire évoluer les conditions d'élevage pour améliorer le bien-être des lapins, anticiper l’évolution réglementaire et prendre en compte la demande sociétale. Mais il est nécessaire que ce progrès ne se fasse pas au détriment de la santé des animaux. Les connaissances générées par le projet contribueront à guider l'évolution des conditions d'élevage des lapins en éclairant sur le choix d’une lignée génétique adaptée à un élevage avec accès à l’extérieur, en évaluant la pertinence d’un enrichissement du parcours herbagé pour gérer les pics de température.
Procédures
Nous souhaitons évaluer la santé, le stress, le comportement (observation directe), la croissance (pesées) et les modifications de l'ADN. Les interventions contraignantes sont les suivantes : 1) Les 180 lapins seront logés en semi-plein air, avec une exposition aux conditions naturelles, et donc un potentiel stress thermique suivant la météo (durée 42 jours). Afin d'étudier l'impact de leurs conditions de vie et de leur type génétique (sélectionnés ou témoins) sur leur santé, les animaux sont élevés sans traitements antibiotiques. 2) Pour 160 lapins : (a) une prise de sang unique d'un petit volume de sang réalisée à 60 jours d’âge minimum (durée < 5 minutes), (b) deux rasages du dos de 10 cm2 (durée < 2 minutes par rasage) fait avec une petite tondeuse électrique à 35 et 63 jours. Les échantillons de sang permettront d'évaluer la santé, l'immunité des lapins (formule sanguine, dosage d'anticorps) et les modifications de l'ADN (marques épigénétiques). Les échantillons de poils permettront d'analyser les quantités de cortisol (hormone du stress) accumulées dans le poil tout au long de la période d'élevage des lapins. 3) Pour 20 lapins : euthanasie par étourdissement électrique suivie d'une saignée pour des prélèvements post-mortem de tissus intestinaux et de sang. Ces échantillons permettront de déterminer le microbiote (flore intestinale) des lapins, et d'évaluer leur santé et leur immunité (formule sanguine, dosage d'anticorps)
Impact sur les animaux
Certaines actions sont stressantes pour les animaux : (a) la contention et la douleur liée à l’introduction d’une aiguille pour la prise de sang, (b) la contention et le bruit de la tondeuse peuvent aussi être brièvement stressants lors du prélèvement de 10 cm² de poil sur le dos de l'animal, (c) l'élevage en semi plein-air avec un accès libre à un pâture herbagée expose les lapins aux conditions extérieures et peut engendrer un stress thermique pendant l'été, (d) par ailleurs, l'absence de recours à des traitements antibiotiques ne permet pas de soigner les malades ou de faire des traitements préventifs.
Devenir
20 lapins seront euthanasiés à 42 jours pour des prélèvements de tissus. A la fin de l'engraissement, à 77 jours d’âge, 40 lapins (10 lapins de chaque sexe pour les deux lignées génétiques) seront euthanasiés chimiquement pour pouvoir relier, par méthode d’imagerie, le comportement des animaux et leur anatomie cérébrale, tandis que les 120 autres lapins intègrent la chaine alimentaire à 77 jours d’âge.
Remplacement
Le but du projet est d'améliorer les conditions d’élevage du lapin afin qu’elles soient plus respectueuses du bien-être tout en préservant la santé des animaux. Pour que ces résultats aient un impact sociétal et soient repris par les éleveurs voire les organismes professionnels de sélection, en lapin ou sur d’autres animaux d’élevage, les résultats doivent être obtenus sur l’espèce cible ou une espèce proche, dans des conditions d’élevage. Il n'est pas possible d'utiliser des simulations ou des approches in-vitro.
Réduction
Les effectifs de lapins ont été définis pour pouvoir comparer les résultats obtenus sur les animaux sélectionnés pour la résistance aux maladies versus témoins et pour chacun des sexes. Il y a donc deux lots de 90 lapins comportant chacun 45 mâles et 45 femelles, soit 180 lapins. Cet effectif tient compte d'un taux de mortalité moyen attendu de 12%, et permet d'observer des faibles différences de poids, de taux de cortisol, de modifications de l'ADN, statistiquement significatives.
Raffinement
Les méthodes de prélèvements employées sont peu ou pas invasives (prise de sang à l’oreille, coupe de poils dans le dos), et sont mises en œuvre par un personnel formé et disposant des autorisations nécessaires à l'expérimentation animale, et expérimenté dans la manipulation des lapins, utilisant une contention manuelle douce et rassurante pour l'animal. Pour éviter de manipuler plusieurs fois les lapins, les prélèvements de poil seront réalisés au moment de la pesée à 35 jours et 63 jours. Le parcours herbagé sera équipé de 8 parasols de 2m² minimum chacun pour limiter le stress thermique. En cas de pic de chaleur, seront aussi mis en place l'arrosage du bâtiment et une brumisation / aspersion sur le parcours, ainsi que des ventilateurs à l'intérieur du bâtiment. L'état de santé (présence de diarrhées, poil piqué, animal abattu) sera surveillé au quotidien. Les animaux malades qui ne présenteraient pas de perspectives de guérison seront euthanasiés de façon compationnelle.
Choix des espèces
Les travaux ont un objectif finalisé d’application au sein de la filière de production cunicole française, dans le but d'améliorer le bien-être tout en respectant la santé des lapins. Il n’est donc pas pertinent de choisir une autre espèce animale que le lapin. Les animaux seront utilisés entre le sevrage (35 jours) et la fin de l’engraissement (77 jours). Le projet a pour objectif de proposer des améliorations de l'élevage des lapins destinés à la consommation humaine. Il est donc nécessaire de faire des observations et mesures sur les lapins de chair habituellement commercialisés.
Culture et isolement de Treponema pallidum dans les testicules de lapin dans le cadre du développement de milieux de culture axéniques
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Diagnostic des maladies
- Maladies infectieuses
20 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque lapin reçoit une injection de la bactérie de la syphilis directement dans les testicules sous anesthésie générale, puis des prises de sang à l'oreille deux fois par semaine pendant six semaines, jusqu'au développement d'une orchite. Les animaux sont ensuite tués pour prélever les tréponèmes présents dans le tissu testiculaire. Le porteur présente le lapin comme le seul modèle connu et affirme qu'une fois la culture en milieu axénique maîtrisée, il s'abstiendra du recours à l'expérimentation animale.
Objectifs
Notre projet a pour but l'obtention de suffisamment de matière infectieuse prélevée sur des lésions de syphilis primaire induites chez le lapin au niveau des testicules inoculé à partir de souche établit ou de prélèvements cliniques. Ce broyat testiculaire de lapin sera mis en culture dans les différents milieux mis au point par notre équipe. L’infectiosité sera suivie au cours du temps par PCR mais aussi par inoculation à d’autres lapins. Nous cherchons à montrer qu’un protocole de culture axénique est valable. Ainsi nous nous abstiendrons du recourt à l’expérimentation animale quand cette technique sera maîtrisée.
Bénéfices attendus
Nous cherchons à montrer qu’un protocole de culture axénique est valable pour l'isolement de nouvelles souches cliniques ainsi que pour leur production. L'étape d'injection des testicules de lapin est primordiale pour la mise au point de milieu de culture optimum afin de s'abstenir à terme de l'utlisation d'animaux ou d'en réduire au maximum son utilisation.
Procédures
Inoculation par injection intra testiculaire sous anesthésie générale pour une durée prévue entre 15 à 20 minutes maximum. Le prélèvement sanguin auriculaire sera effectué sur des animaux vigiles après application de crème anesthésiante locale de type EMLA 5%. Les animaux sont placés dans des boites de contention le temps du prélèvement pour une durée prévue entre 10 à 15 minutes, 2 fois par semaine pendant 6 semaines.
Impact sur les animaux
Le suivi des lapins se fera pendant les six semaines qui suivront l’inoculation. Le développement d’une orchite est attendu. D’après la littérature, les lapins sont sacrifiés dès l'apparition de l'orchite afin de prélever les treponema présents dans le tissus testiculaire. Des prises de sang auront lieu 1 fois par semaine (suivi PCR et sérologie). A l’issu, ils seront euthanasiés et prélevés.
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de la procédure. En effet, les individus infectés ne peuvent pas être utilisés dans une nouvelle procédure ni proposé à l'adoption.
Remplacement
La syphilis est due à Treponema pallidium, bactérie spirochète, observée au microscope au début du siècle dernier, mais qui n’a jamais été mise en culture axénique. Depuis un an, notre équipe tente la culture ultrapure de l’agent de la syphilis (T. pallidium) dans un milieu axénique (en absence de tout autre organisme, dans un milieu stérile, exempt de tout autre agent biologique). Les résultats obtenus, s’ils montrent que des cultures restent positives au test moléculaire (détection de l’ADN) de réaction de polymérisation en chaîne (PCR), ne peuvent pas objectiver la viabilité des éventuelles bactéries cultivées. Le passage à l’essai in vivo chez le lapin (seul connu pour être un bon modèle) devient une étape obligatoire d’une recherche scientifique, qui une fois que la culture axénique de T. pallidum sera maîtrisée, s’abstiendra d’avoir recours à l’expérimentation animale. Des animaux destinés à la recherche seront donc utilisés, de manière ponctuelle, dans ce projet.
Réduction
Afin d'estimer au mieux le nombre d'animaux pour l’isolement de souche clinique et leur production, nous avons utilisé le concept de l'effet de taille (effect size). On s'attend à ce que plus l'effet soit fort (donc la différence est grande), plus la taille de l’échantillon nécessaire sera petite. Pour se faire, deux moyennes ont été comparées, une moyenne théorique (mt) de 25% a été choisie en se référant aux données bibliographiques, et la comparaison a été faite pour un effet fort (80%), qui représente ici le taux d’infections réussies avec une puissance de 0,9 et un risque (alpha) de 0,05. Le nombre de lapins nécessaires pour la production est fixé à 2 lapins pour chaque inoculum bactérien, si 10 souches par an, nous aurons besoin de 20 lapins par an, soit 100 lapins sur 5 ans. En ce qui concerne l’isolement d’une souche clinique, la faible quantité et concentration de départ nous oblige à ne prévoir qu’un seul lapin par souche, ce qui correspond à 10 lapins par souche clinique par an, soit sur 5 ans: 50 lapins. Au total, sur 5 ans, nous pensons avoir recours à 150 lapins.
Raffinement
Par ailleurs, les animaux bénéficient d’une attention et de soins de qualité pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin de leur assurer un bien-être optimal tout au long des études. Ce suivie est réalisé par du personnel habilité. Des éléments à ronger, de la paille à ronger et d'autres enrichissement seront fournis aux lapins afin qu’ils puissent se divertir. Les lapins seront hébergés dans des cages individuelles munies d’une plateforme non métallique répondant aux normes. Les manifestations de la douleur seront suivies rigoureusement grâce à une grille d’évaluation (voir annexe) (adaptée de celle de Morton et Griffiths 1985) et tout signe de douleur sera tout de même soulagé par une pommade anti-inflammatoire (Betneval® 0,1 %). De plus, une anesthésie profonde est préconisée avant l’euthanasie des lapins de laboratoire afin de réduire le plus possible la douleur et la détresse de l’animal. Cela est préconisé dans la directive du Parlement Européen et du Conseil relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques : (https://eurlex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=COM:2008:0135:FIN:FR:PDF ). La voie IM est la voie préconisée pour l’administration de la combinaison kétamine/xylazine chez le lapin, car elle est non douloureuse. Cela a été décrit par Lipman et al. (Lab Anim Sci. 1990, 40(4):395-8).
Choix des espèces
Le choix du lapin est basé sur les informations bibliographiques dans le domaine de laproduction et isolement d'agent de la syphilis. Le modèle lapin a déjà été prouvé et validé pour l'infection par Treponema pallidum. Nous allons utiliser des sujets adultes dont le volume des organes cibles de cette infection (testicule de lapin) est suffisant et capable de contenir l’infection sans induire de choc infectieux(septicémie) fatal.