Poissons

140 poissons et élasmobranches issus d'une liste de 31 espèces vont être utilisés, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque individu est capturé à l'hameçon, anesthésié, puis subit une chirurgie de cinq à dix minutes pour implanter une marque acoustique dans sa cavité abdominale, avant d'être relâché sur son site de capture. Le porteur reconnaît que les connaissances manquent sur les points limites applicables aux poissons marins et que leurs réponses à la douleur varient fortement selon les espèces. Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'est possible pour caractériser les mouvements en milieu naturel, et justifie l'étude par le développement des parcs éoliens en mer.

Objectifs

Le développement des parcs éoliens offshores (OWF) est aujourd’hui en plein essor notamment en Europe. Ces infrastructures génèrent des modifications de l’habitat au sein des écosystèmes marins ayant un impact potentiel sur les communautés biologiques. Les OWF peuvent agir comme des récifs artificiels pour certaines communautés de poissons avec des espèces présentant une forte résidence pour ces milieux. De surcroît, les câbles électriques sous-marins au sein des OWF génèrent des champs électromagnétiques (CEM) qui peuvent affecter le comportement d’espèces électro- et magnéto-sensibles. La forte croissance de l’éolien offshore risque d’amplifier ces effets mais les informations existantes sur les conséquences induites sur les communautés de poissons restent aujourd’hui encore insuffisantes. Les études réalisées sont limitées à quelques espèces d’intérêt commercial et sur une durée relativement courte. Ce projet vise à faire un point zéro sur un site potentiel d’implantation éolien en Méditerranée, à étudier le comportement d’espèces marines sous des structures physiques immergées, et à identifier et évaluer les effets potentiels de ces structures sur les poissons marins et les requins/raies (aucune, aggrégation, association spécifique, effet saison…). Pour cela, ce projet se base sur la télémétrie acoustique passive comme méthodologie. Le suivi par télémétrie acoustique est devenu un outil de plus en plus utilisé pour étudier les déplacements de nombreuses espèces de poissons à grande échelle. Cette méthode permet de déterminer différents processus écologiques, notamment de comprendre comment une espèce utilise un habitat spécifique et se déplacent au niveau régional dans l’espace et dans le temps, information essentielle pour mieux comprendre son rôle dans l’écosystème ou l’effet d’une modification d’habitat comme l’implantation d’OWF

Bénéfices attendus

L’implantation d’un parc éolien offshore entraine une modification de l’habitat. Au vu de la forte croissance de ces projets de développement, il est nécessaire de mieux connaitre les effets de ces structures sur les écosystèmes marins. L’objectif de cette expérimentation est de faire un point zéro sur un site spécifique potentiel d’implantation d’un parc éolien. A terme, les résultats de ce projet permettront de comprendre plus précisément l’écologie du mouvement des espèces suivies et ainsi répondre aux questions suivantes : comment ces espèces réagissent-elles à l’implantation d’une structure physique ancrée en mer ? Quel est la fidélité dans le temps de ces espèces à la zone OWF ? Quel est le degré de connectivité entre cette zone OWF et les autres habitats marins de la région par ces espèces, au cours des années, et d’une année à l’autre ? Font-ils preuve d’une fidélité pluriannuelle au site ? Si oui, à quelle saison ? Comment les conditions environnementales influencent-elles ces tendances ? Il existe très peu de connaissances à ce sujet sur les espèces de poissons et d’élamosbranche fréquentant la zone hauturière de Méditerranéen. Ces connaissances relatives à l'écologie du mouvement de ces espèces d’intérêt, que le marquage en milieu naturel rend possible, serviront de cas concrets pour la mise en place de suivis pérennes des populations aux sein des OWF à venir afin d’atteindre le double objectif de conservation et d'exploitation durable des espèces marines.

Procédures

140 indivdus issus d'une liste de 31 espèces seront soumis à une intervention chirurgicale courte pour implanter une marque acoustique dans la cavité intra-peritonéale. La durée de cette intervention est en moyenne entre 5 et 10 mn

Impact sur les animaux

La littérature récente souligne le manque de connaissances s'agissant des points limites (objectifs et quantitatifs) applicables pour l'expérimentation sur les poissons marins, les réponses à la douleur étant par ailleurs très variables entre les espèces. Le stress à la capture est probablement l’effet indésirable principal et afin de limiter ce stress, l’hameçon sera exclusivement utilisé pour la capture, permettant de limiter au maximum ce traumatisme (durée de capture et blessure). L’ensemble des manipulations (capture, mise en bassin, anesthésie, acte chirurgical, réveil) seront réalisées sur une période de temps limitée (

Devenir

Les poissons sont relachés sur le site de capture pour étudier leur comportement dans leur milieu naturel

Remplacement

Dans le cadre d’une étude destinée à caractériser les mouvements individuels en milieu naturel, il n’est pas possible de faire appel à des méthodes de remplacement. L’apport de la télémétrie acoustique (détection de la présence de poissons marqués à proximité d’un récepteur) devrait permettre l’amélioration de connaissance sur les habitats occupés par les espèces et de leurs mouvements, ce qui permettra à terme d’identifier les effets des parcs éoliens en mer sur ces peuplements

Réduction

Le nombre d’individus a été réduit au minimum et défini au seuil de la pertinence scientifique et statistique. En l’absence de connaissance sur le niveau de fréquentation spécifique du site ciblé par cette étude, le nombre de 20 individus par espèce a été estimé de manière arbitraire afin de capturer la majorité des comportements spatiaux à l’échelle d’une zone spécifique. Aucune approche statistique n’a été réalisée afin de définir le nombre d’individus marqués en raison de l’étendue de la zone d’étude (réseau régional à l’échelle de la façade Méditerranéenne France-Espagne) et de la forte mobilité spatiale des espèces concernées en zone hauturière. Mais, en se basant sur la biomasse de ces espèces péchées en Méditerranée (plusieurs dizaines à centaines de tonnes débarquées), l’impact de ce projet sur les populations semble extrêmement limité. Enfin, en prenant en compte les contraintes de la télémétrie acoustique (ex : probabilité de détection) et la littérature existante, un nombre minimum de 20 individus par espèce est conseillé afin d’intégrer une variabilité naturelle représentative et ainsi garantir la robustesse des analyses statistiques associées aux populations concernées.

Raffinement

Dans le cadre des procédures, plusieurs mesures ont été mis en place afin de limiter la souffrance et le stress des individus lors du marquage, incluant la capture (utilisation d’un engin sélectif en direct, l’hameçon, pour limiter au maximum le temps où l’animal est en phase « capture »), ainsi que des procédures d’anesthésie optimales quand possible (sinon utlisation de l’immobilité tonique et anesthésiant local – voir plus bas) durant les phases pré opératoire, opératoire et post opératoire. Les individus seront surveillés en permanence de manière régulière avec une attention particulière à la respiration branchiale afin de s’assurer de la bonne oxygénation des animaux. Les individus seront retirés de la procédure dès que le point limite sera atteint. Les points limites sont identifiables à travers le comportement des poissons (activité de nage anormale) ou des signes extérieurs de stress (e.g. couleur de peau, plaies).

Choix des espèces

Le nombre d’espèce capturable sur la zone d’étude étant extrêmement variée, il est proposé dans cette étude de ne pas cibler d’espèces particulières, mais de (1) fournir une liste d’espèces potentielles, (2) limiter le nombre d’individus rentrant dans une procédure à N= 20 et (3) de limiter le nombre de marque déployer à N= 140, soit un équivalent de 7 espèces à N=20, ou 14 espèces à N=10. La maturité des poissons est très variable d’une espèce à l’autre et est déterminée généralement à partir de la taille. Afin de limiter l’impact sur la population et le choix de maturité de l’individu susceptible d’être choisi (nécessitant donc la capture, la mesure puis soit le relâchage ou soit l’inclusion dans une procédure), des individus matures et immatures seront utilisés dans cette expérimentation sans estimation de la répartition en fonction de la maturité. La taille de l’hameçon utilisé permettra juste de limiter la capture d’individus trop petit ou trop gros. Les espèces de cette liste sont des espèces de premier plan en Méditerranée française, tant pour l'importance de leur exploitation (volume) et leur valeur commerciale (€). De nombreux aspects du cycle de vie de ces espèces restent inconnus, limitant la capacité des scientifiques à fournir un appui aux gestionnaires pour leur gestion notamment en lien avec l’impact de l’implantation d’éoliennes dans leur milieu naturel. Pour la majorité de ces espèces, l’acquisition de connaissances sur leur dynamique spatiale est une première étape primordiale pour améliorer nos connaissances sur l’impact potentiel de l’implantation de ces structures offshores sur ces populations.

585 larves de poisson zèbre vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Âgées de sept jours, elles sont surnourries par un bain enrichi en graisses et exposées à onze extraits de plantes, puis tuées pour mesurer l'accumulation de lipides et l'inflammation, afin d'évaluer ces extraits contre les désordres métaboliques. Le porteur indique que les procédures ne comportent aucun geste invasif, la seule contrainte tenant à la dégradation possible des solutions. Il affirme que les modèles in vitro n'ont pas la complexité suffisante et justifie le recours au poisson vivant.

Objectifs

Le projet consiste à évaluer les propriétés de 11 extraits de plantes issues de la biodiversité de La Réunion sur les pertubations métaboliques chez le poisson-zèbre au stade larvaire, suite à un régime enrichi. Dans le cas de maladies métaboliques telles que l'obésité et le diabète, différents processus sont dérégulés. Les données de la littérature décrivent la mise en place d'une inflammation chronique, d'un stress oxydant, d'une dyslipidémie ou d'une insulino-résistance pouvant entrainer des effets délétères sur l'ensemble des systèmes de l'organisme tels que le foie, le coeur, les reins ou le système nerveux. Dans le cadre de notre projet, les larves sont surnourries avec un régime riche en lipides et traitées avec les extraits de plantes aux concentrations maximales non toxiques afin d'évaluer leurs effets sur différents paramètres métaboliques, notamment l'accumulation lipidique, le stress oxydant et l'inflammation.

Bénéfices attendus

Ce projet participera au développement d'approches thérapeutiques innovantes reposant sur la biodiversité végétale, permettant d'évaluer leurs impacts dans un contexte de pathologies métaboliques et des complications associées (dyslipidémie).

Procédures

Les animaux ne seront soumis à aucun intervention invasive. Ils seront incubés pendant 5 jours (avec renouvellement des solutions toutes les 24h) dans une solution à base de nourriture sèche (Contrôle) pour 45 larves, une solution à base de jaunes d'oeuf (HFD) pour 45 larves et des solutions à base de jaune d'oeuf + extrait de plante (HFD traités) pour 495 larves.

Impact sur les animaux

La qualité des solutions à base de jaunes d'oeuf et extraits de plantes (à des concentrations non toxiques déterminées au préalable) dans lesquelles les larves sont incubées (balnéation) peut se dégrader au cours du temps et induire un stress aux animaux. Les solutions seront donc re-préparées, renouvelées toutes les 24h et les animaux seront examinées chaque jour de l'expérimentation.

Devenir

A la fin de l’expérimentation, après mise à mort des animaux, l'accumulation lipidique sera analysée par coloration Oil Red O. Des larves seront conservées et d'autres analyses au niveau de l'expression génique ou protéique pourront être effectuées afin d’évaluer les effets sur l’inflammation ou le stress oxydant, par exemple.

Remplacement

Les modèles in vitro ne présentent pas une complexité suffisante capable de prendre en considération l'ensemble des signaux intrinsèques et extrinsèques qui se mettent en place à la suite d'un régime riche en graisses. Seul le modèle animal permet de prendre en considération une telle complexité et de réellement tester l'impact de ces extraits sur l'ensemble des processus métaboliques.

Réduction

Les expérimentations ont été conçues afin d’utiliser le moins d’animaux possible. 3 expérimentations indépendantes seront réalisées afin de permettre la réalisation d'études statistiques. Les expériences seront réalisées en triplicat : 3 x 15 larves pour chaque condition.

Raffinement

Les larves seront placées dans des conditions optimales (température : 26.5°C ; oxygénation ; pH). Notre protocole a été développé afin que les larves bénificient d'un espace suffisant limitant au maximum les contraintes subies et permettant un comportement normal. Chaque solution sera fraichement préparée et renouvelée toutes les 24h. Les larves seront nourries suffisamment avec de la nourriture spécialisée et adaptée. Les larves seront examinées chaque jour de l'expérimentation et tout signe de souffrance selon des points limites adaptés sera étudié afin de prendre les mesures adéquates.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle solidement reconnu pour l’étude de nombreux processus physiologiques et physiopathologiques. Il existe une forte conservation de ces processus au cours de l’évolution. C'est un modèle d’étude de l’immunité, d’oncologie, de réparation cellulaire, de neurogenèse et depuis quelques années, des maladies métaboliques. Il est en effet très utilisé dans l’étude de l'obésité et du diabète puisque les gènes intervenant dans ces processus physiopathologiques sont très conservés chez le poisson-zèbre. Les animaux utilisés seront des larves âgées de 7 jours. A ce stade de développement, les larves sont capables de se nourrir de manière autonome et disposent déjà d'un tractus gastroinstestinal fonctionnel.

2 900 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les adultes sont génotypés jusqu'à deux fois par prélèvement d'un morceau de nageoire sous anesthésie, et des alevins subissent une ablation d'un nerf moteur au laser suivie d'une observation par fluorescence, pour étudier la régénération nerveuse. Les adultes sont tués par surdose d'anesthésiant une fois la génération suivante obtenue, les alevins par anesthésie puis commotion cérébrale pour l'histologie. Le porteur affirme à plusieurs reprises que la douleur est "minimisée", en s'appuyant sur le stade précoce des alevins et la rapidité de régénération de l'espèce.

Objectifs

Les motoneurones qui résident dans la moelle épinière constituent le relai final entre le système nerveux central et le muscle squelettique, responsable du mouvement. Au cours de leur différenciation, les motoneurones émettent des axones qui sortent de la moelle épinière pour suivre une trajectoire stéréotypée pour atteindre leur cible musculaire. Ce processus est orchestré par tout un répertoire de molécules présentes dans l’environnement des axones. Après lésion des nerfs moteurs, l’environnement va à nouveau servir pour le guidage des nerfs afin qu’ils puissent retourner vers leur cible musculaire initiale. L'importance de l'environnement au cours de la régénération des nerfs moteurs sera étudié chez des jeunes alevins de poissons zèbres dont deux gènes de molécules de guidage ont été mutés. Les mutations ne devraientt pas induire de phénotype dommageable permettant l’élevage des poissons. Afin de visualiser les nerfs moteurs et les cellules impliquées dans le processus de régénération, ces poissons auront préalablement été croisés avec 5 lignées transgéniques fluorescentes. Les nerfs sont lésés par ablation laser chez les jeunes alevinsde 4 jours post-fécondation (stade non couvert par la loi sur l'expérimentation animale). Le processus de régénération sera ensuite suivi in vivo par fluorescence, de manière non invasive pendant 2 jours.

Bénéfices attendus

Depuis plus de 40 ans, le poisson zèbre a été un modèle très utilisé pour comprendre la fonction des gènes. Il a même permis de corréler entre un locus donné et une pathologie humaine. Notre étude permettra de comprendre l’importance des deux protéines de l'environnement dans le développement et la régénération des nerfs moteurs et pourra apporter des arguments supplémentaires sur leur implication potentielle dans les maladies neuro-musculaires. En effet ll'une d'entre elle a déjà été mentionné comme candidat potentiel pour des neuropathies bien qu’aucune maladie humaine n’ait été associée avec une mutation dans ce gène pour l’instant. Chez l'homme, les nerfs périphériques sont aisément lésés et leur régénération est lente et souvent incomplète. En fait, moins de la moitié des patients qui subissent une réparation après lésion récupèrent de bonnes fonctions motrices et sensorielles. L’amélioration des connaissances fondamentales dans les molécules impliquées dans la régénération des nerfs moteurs est donc essentielle et ces données auront une application dans la médecine régénérative

Procédures

Les poissons seront génotypés au maximum 2 fois durant leur vie à partir de 3 mois (âge adulte) par prélevement d'un petit échantillon de la nageoire caudale afin de déterminer les poissons homozygotes à l'aide de ciseaux stérilisés à l'alcool 70% puis rincés à l'eau stérile. Le prélèvement se fait sous anesthésie et la procédure totale dure trois minutes. L'animal est immédiatement transféré dans le bac de réveil dont l'eau est correctement aérée jusqu'à la reprise totale de ses capacités soit 1 à 2 min. La nageoire régénère naturellement en 10 jours sans que cela n'impacte sur la nage du poisson.

Impact sur les animaux

Compte tenu des données obtenues chez les souris invalidées pour les deux gènes et du fait de leur faible fonction chez l'organisme adulte, les poissons adultes homozygotes ne devraient pas présenter de phénotype dommageable. En revanche, les poissons doublement mutants pourraient être plus sensibles aux conditions d'élevage avec un vieillissement plus précoce consistant en une baisse de la reproduction et des animaux amaigris. Concernant les alevins subissant une ablation du nerf moteur, la douleur devrait être minime compte tenu du stade auquel l'expérimentation est effectué : 4 jour post-fécondation alors que le poisson est hors cadre de la législation. A ce stade, le système nerveux central n'est pas encore mature et les comportements complèxes ne sont pas encore présents. De plus la lésion d'un seul nerf moteur dans le tronc correspond à 1,7% des nerfs totaux. Des études ont aussi montré que chez des alevins de 5 jours post-fécondation (stade couvert par la législation), les marqueurs de la douleur revenaient rapidement à la normale en 24 h suivant le stimulus nociceptif. Aussi, les alevins agés de 5 jours-post fécondation ne devraient pas non plus ressentir de douleur puisque cela correspond à 24 h suivant l'ablation. Enfin, le poisson zèbre est un modèle animal qui a une forte capacité de régénération de nombreux organes comme le coeur et le cerveau. Une complète régénération du nerf moteur est observé 48 h après ablation chez le jeune alevin wt.

Devenir

Les animaux d’environ 1 an et 4 mois sont mis à mort par surdose d'anesthésiant quand ceux de la génération suivante atteignent la maturité sexuelle et sont capables de se reproduire afin de donner de nouveaux embryons, et donc alevins qui serviront à l’étude de la régénération. Tous les alevins pour l’étude de la régénération seront mis à mort par anesthésie suivie d'une commotion cérébrale afin de pouvoir réaliser des études histologiques.

Remplacement

Le processus de régénération des nerfs intervient dans un environnement complexe qu’il n’est pas possible de reproduire in vitro. Nous utiliserons le poisson zèbre plutôt que le modèle de la souris déjà établi car il permet de visualiser in vivo le processus de régénération par fluorescence de manière non invasive.

Réduction

La capacité de fécondation externe du poisson zèbre permet d'obtenir facilement des embryons sans mise à mort des parents et donc de réduire le nombre d’animaux à utiliser. Le nombre de poissons a été réduit au minimum de deux lots de 20 pour chaque lignée. Ce nombre est nécessaire à la fois pour assurer la pérénité de chaque lignée et pour permettre aux poissons de se développer correctement et d'avoir correctement accès à la nourriture. Contrairement à la souris, chez le poisson zèbre il est nécessaire d'effectuer un brassage génétique en utilisant suffisamment de couples pour obtenir une nouvelle génération. De plus, il n'y a pas de chromosome sexuel, aussi il est difficile de contrôler le ratio mâles/femelles. Enfin ce nombre de 20 poissons par bac est important pour le bien être de l'animal puisque le poisson zèbre est un animal grégaire il est nécessaire de l'élever en un nombre suffisamment important pour permettre les interactions sociales.

Raffinement

Des points limites adaptées à la procédure et suffisament prédictifs et précoces ont été établis pour éviter tout mal être de l'animal. Au cours de l'élevage, le bien être des poissons sera vérifié de manière hebdomadaire tout au long de la vie des animaux. Les animaux qui présentent des phénotypes tels que animaux ne se nourrissant pas, animaux amaigris, animaux présentant des défauts musculo-squelettique (scoliose, lordose, ...), animaux présentant un comportement indicatif d'un stress chronique (animaux isolés au fond d'un bac, décolorés, ...) seront mis à mort afin d'éviter toute souffrance. Après ablation d’un nerf moteur, le réveil des alevins sera surveillé. Un retour à l'activité motrice en absence d'anesthésiant apparait en quelques minutes. Puis l’état des alevins sera suivi quotidiennement sous stéréoscope (soit à 5 et 6 jours post-fécondation). Tout alevin présentant un défaut de flotabilité, restant au fond du puit dans la boîte 12 puits sera mis à mort.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un bon modèle pour l'étude du développement des nerfs moteurs. Le développement du système nerveux périphérique moteur est relativement simple. Concernant l’étude de la régénération des nerfs périphériques, grâce à l'utilisation de lignées transgéniques fluorescentes la régénération des nerfs peut être suivie in vivo en temps réel par fluorescence donc de manière non invasive chez les alevins. Les embryons sont obtenus sans souffrance après accouplement naturel de poissons adultes puisque la fécondation se fait ex utero. De plus chez les alevins de type sauvage, les nerfs régénèrent rapidement, en 48 h après ablation. Enfin, lorsque le nerf est sectionné par ablation laser, l'alevin est âgé de 4 jours post-fécondation, il peut encore se nourrir à partir de son sac vitellin et est ainsi indépendant. Il ne devient sous la dépendance de la loi qu’à partir de 5 jours post-fécondation alors que le phénomène de régénération a déjà commencé, ce qui signifie que la condition de souffrance est minimisé Des poissons adultes de 4 à 16 mois homozygotes et hétérozygotes adultes seront utilisés pour obtenir des embryons homozygotes ou hétérozygotes par accouplement naturel puisqu'à ce stade, ils sont pleinement fertiles. Des alevins de 4 à 6 jours post-fécondation seront utilisés pour étudier le processus de régénération. Tandis que les organes se développent rapidement chez les embryons et alevins de poisson zèbre; le système nerveux central reste encore primitif jusqu'à 5 jours post-fécondation. De plus il a déjà été montré que la régénération s'effectuait de manière rapide : en 2 jours il y a régénération complète ce qui signifie que la douleur ressentie est minimisée.

1 800 larves de bar vont être utilisées et gardées en vie, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger. Chaque larve reçoit deux micro-injections sous anesthésie pour tenter une greffe de cellules souches germinales, avec une survie annoncée de 66 à 86 %, avant marquage électronique et collecte de gamètes. Le porteur présente ce projet comme une "preuve de concept" devant à terme réduire le nombre de poissons utilisés, tout en indiquant que neuf bars donneurs seront tués pour prélever leurs cellules. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative non animale, le bar étant lui-même le sujet de l'étude.

Objectifs

L'objectif du projet et de faire la preuve de concept de l'utilisation de la greffe de cellules souches germinales pour rétablir les fonctions reproductives de bars stériles. En outre, ce projet contribuera à réduire l'utilisation de poissons expérimentaux. L'expérimentation se propose en utilisant la technique de greffe des cellules servant à produire les spermatozoïdes et les ovules, de rendre fertile des bars stériles ce qui est une étape nécessaire à la production de certaines lignées expérimentales de bars comme les lignées ayant une absence de variabilité génétique au sein du groupe.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de reproduire des bars stériles en faisant porter leurs gamètes par des poissons non stériles. Cette méthode si elle est validée permettra de: 1/ produire les lignées ayant une absence de variabilité génétique au sein d'un groupe) 2/ de régénéré des populations ou lignés de bars dont les gonades ont été cryconservées.

Procédures

Les larves de bar utilisées pour ce projet seront injectées deux fois et seront anesthésiées lors des 3 manipulations, dont les 2 injections. L'ensemble de la procédure durent moins de 9 min, 3 minutes par manipulation.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivantes: les larves âgées de 30 jours utilisées pour ce projet sont anesthésiées et micro-injectées. La survie des larves suite à cette injection varie de 66 à 86%. Il est à noter que, due à la stratégie de reproduction de type r du bar (forte prolificité), la survie d’un élevage larvaire classique de bar est aux alentours de 20% et que les mortalités interviennent massivement durant les premiers jours de l’élevage, mais perdure jusqu’à la métamorphose des larves à 80 jours. Âgés de 6 mois, les poissons seront marqués avec une puce électronique afin de les identifier. Ce marquage est classiquement utilisé en aquaculture et se fait sous anesthésie et est équivalent à une piqure, il n’entraine pas de nuisance pour l’animale (c'est la même technique que celle employée pour identifier les chiens et chats). La collecte des gamètes à l'âge de 2 ans se fait sous anesthésie et n’entraine pas de nuisance pour l’animale.

Devenir

À l'issue de la greffe, du marquage et de la collecte des gamètes, les poissons sont gardés en vie.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternatives non animales disponibles pour cette expérimentation. Le sujet de l'étude étant le bar lui-même.

Réduction

L’objet de ce projet est de produire in fine 9 lignées de bar ayant une absence de variabilité génétique au sein du groupe en faisant la preuve de concept de la reproduction de poissons stériles d’intérêt par le transfert de leurs cellules souches germinales dans des poissons-receveurs pleinement fonctionnel. 9 poissons portant très peu de variabilité génétique seront donc euthanasiés pour ce projet. Les cellules souches germinales (donnant les spermatozoïdes ou ovules) extraites des gonades de ces 9 poissons seront injectées dans 9x200 larves. Le taux de réussite du transfert de cellules souches germinales étant chez le bar de 15%, cela permettra d’avoir les 15 à 20 géniteurs porteurs des gamètes des poissons nécessaires au développement des 9 lignées de bar ayant une absence de variabilité génétique. Cela permettra d’ici 6 ans de réduire le nombre d’animaux utilisé dans de nombreux projets de recherche portant sur le bar.

Raffinement

Pour favoriser le rétablissement des larves microinjectées, celles-ci sont maintenues dans de l’eau stérile dont la salinité a été abaissée pour être à l'équilibre osmotique avec le poisson et gardées sous une surveillance particulière pendant les 4 heures suivant l’injection. Les larves ne récupérant pas rapidement leurs équilibres sont euthanasiées.

Choix des espèces

Le bar est le sujet de l’étude. Pour ce projet un total de 1800 animaux seront utilisés : 1800 larves de bar âgées de 30 jours, c'est à cet âge que les larves sont manipulables et que le transfert de cellule souche germinale donne les meilleurs résultats.