Poissons zèbres
Evaluation des effets des substances chimiques (toxicité aiguë) sur le poisson zèbre
- Protection de l’environnement
Déterminer la concentration d'un produit chimique qui tue la moitié d'un groupe de poissons en 96 heures : c'est l'objet de ces essais, pour lesquels 855 poissons zèbres juvéniles vont être utilisés. 705 d'entre eux subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, les 150 autres un niveau léger. Ils sont plongés dans une eau chargée du produit à tester, sans nourriture pendant les quatre jours de l'essai et sans aucun enrichissement du bac, celui-ci risquant de relarguer des substances. Les survivants exposés sont tués, seuls les témoins pouvant être adoptés, et le porteur indique disposer au laboratoire d'un essai de substitution sur embryons que les autorités ne reconnaissent pas.
Objectifs
La production de substances chimiques n’a cessé d’augmenter depuis le siècle dernier et s’est inéluctablement accompagnée de rejets incontrôlés dans l’environnement, occasionnant de lourdes conséquences environnementales et sur la santé humaine, comme l’ont malheureusement montré de trop nombreuses catastrophes sanitaires et écologiques. Il apparaît donc essentiel de recueillir les informations sur leurs propriétés intrinsèques avant leur mise sur le marché, afin d’évaluer leur dangerosité ou leur innocuité vis-à-vis de l’environnement. C'est dans ce contexte que seront menées des études d'écotoxicité, selon des procédures bien cadrées et spécifiques, afin de s'assurer de l'innocuité des produits chimiques testés sur l'environnement (avant leur mise sur la marché) ou au contraire de révéler leur toxicité. Il s'agira ainsi d'évaluer l'innocuité ou la capacité de substances à générer des effets de toxicité aigüe sur les poissons, dans le but de déterminer, si possible, la concentration létale médiane (CL50), c'est-à-dire la concentration qui tue 50% d’un groupe de poissons après une certaine période d’exposition (96 heures en général).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet rentrent dans le cadre de l'évaluation de l'impact des substances chimiques sur l'environnement, visant à réduire l'utilisation de substances dangereuses pour l'environnement.
Procédures
Les animaux sont exposés à différentes concentrations de la substance chimique à tester via le milieu aquatique. Il n'y a pas de prélèvements ni de procédures chirurgicales.
Impact sur les animaux
Cet essai visant à déterminer la toxicité aiguë vis-à-vis des poissons, il est probable qu'un certain nombre d'individus meurent au cours de la procédure.
Devenir
Les poissons survivants exposés aux élément d'essai sont euthanasiés en fin de test car ils ne peuvent pas être réutilisés pour d'autres essais. Les témoins peuvent être adoptés, tout comme les poissons en stabulation non utilisés pour les tests (le cas échéant).
Remplacement
Des essais alternatifs comme par exemple l'essai de toxicité sur embryons de poissons peuvent être mis en place au sein du laboratoire. Toutefois, les modèles alternatifs ne sont pas reconnus par les autorités compétentes. L’acceptation ou non du modèle alternatif (embryon) revient aux autorités compétentes.
Réduction
Utilisation du nombre minimal d'individus recommandé (7 par traitement) par la ligne directrice utilisée pour l'essai. Possibilité de mutualiser les témoins négatifs si deux essais réalisés en parallèle. De plus, les essais sur gamme complète (généralement 5 concentrations d’exposition) classiquement utilisés dans les évaluations des risques peuvent être réduits à des essais limites (1 seule concentration seuil). Ceci permet de vérifier que le modèle poisson n'est pas plus sensible que les autres organismes testés sur la même susbtance (mico-algues et invertébrés) et de réduire d'un facteur 5 le nombre de poissons utilisés.
Raffinement
Diverses stratégies d’enrichissement sont mises en place afin d’améliorer le bien-être des poissons au sein de l’environnement dans lequel ils sont hébergés avant les tests (nourriture variée et/ou vivante (exemple : daphnies, artémies…) ; environnement extérieur décoratif (couleur / poster représentation environnement marin ...)). Les poissons maintenus au laboratoire font l’objet d’un suivi régulier de leur état de santé et des caractéristiques physicochimiques de leur eau d'aquarium. Les poissons ne doivent pas être nourris durant l'essai (durée 4 jours). L'environnement n'est pas enrichi durant les tests, car non réalisable techniquement (de plus, aucun élément décoratif ne doit être ajouté afin d'éviter les relargages éventuels de matière), mais dans tous les cas la présence de témoins négatifs (non traités avec la substance) permet de vérifier tout comportement anormal qui ne serait pas lié à la substance à tester. Toutes les manipulations sont réalisées par du personnel formé.
Choix des espèces
Les espèces utilisées sont celles préconisées dans les normes imposées par les règlementations. Les poissons utilisés sont au stade juvénile (entre 1 et 3 mois).
Prélèvement des tissus pour la caractérisation génétique (génotypage) et gestion des mutations entrainant des nuisances chez des modèles animaux génétiquement modifiés.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
Poissons zèbres : 12500
162 500 animaux non-humains vont être utilisés pour un seul geste chacun, trois millimètres de queue ou d'oreille coupés en cinq secondes chez 150 000 souris vigiles, quatre millimètres carrés de nageoire caudale prélevés sous anesthésie chez 12 500 poissons zèbres. Les procédures sont déclarées légères pour 156 750 d'entre eux et modérées pour 5 750, ce dernier niveau correspondant aux lignées dont les mutations provoquent, selon le porteur, "des douleurs, de l'inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités". Le projet relève de la gestion d'élevage, identifier génétiquement les animaux produits et repérer les lignées dont les mutations nuisent, pour constituer les lots destinés à d'autres projets. Le porteur écarte la pommade anesthésiante, qui allongerait l'intervention et pourrait gêner le génotypage, ainsi que l'analgésie par injection, et estime à 60 000 les animaux gardés vivants sur cinq ans pour renouveler les reproducteurs ou partir en expérimentation, les autres étant tués quand leur combinaison de gènes ne sert ni à l'élevage ni aux expériences.
Objectifs
L'établissement utilisateur est constitué de deux instituts de recherche qui s’intéressent à différents domaines (neuroscience, cardiologie, génétique, physiologie, cancérologie,...). Dans le cadre des projets utilisant des animaux à fins scientifiques (soumis indépendamment à des demandes d’autorisation de projet), des modèles animaux précliniques génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important de détecter et gérer les pathologies induites par les mutations dans les élevages (appelé phénotypes dommageables) de ces modèles et de bien caractériser génétiquement les animaux produits (appelé : le génotypage). L’ensemble permet un élevage adapté pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et optimisée aux besoins des scientifiques de ces instituts.
Bénéfices attendus
Pour le bénéfice direct, ce projet permet d'optimiser la gestion et l’élevage des modèles animaux génétiquement modifiés qui seront mis à disposition des chercheurs pour les expérimentations qui seront faites à l'issue de ce projet. Il permet également de prendre en charge rapidement et donc de minimiser les souffrances qui pourraient être induites par les mutations des modèles animaux. Il y a également un bénéfice indirect, car les modèles précliniques génétiquement modifiés permettent de reproduire chez l’animal des pathologies humaines. Ce projet permet la caractérisation génétique ces modèles qui sont ensuite utilisés sur des projets dont l’objectif est la compréhension ou le traitement de ces pathologies et pour notre établissement dans de nombreux domaines (neuroscience, cardiologie, génétique, physiologie, cancérologie, …)
Procédures
Les souris vigiles seront prélevées d’un petit bout de tissu à l’oreille ou à la queue (3mm maximum de tissu), l’intervention dure 5 secondes et se fait une seule fois par animal. Les poissons subiront une anesthésie par balnéation suivie d’un prélèvement d’une portion de 4mm² (5% maximum) de la partie cartilagineuse de la nageoire caudale, capable de régénération complète en 20 jours. Des mutations chez des souris génétiquement modifiées peuvent entrainer des nuisances (phénotype dommageable) durant l’élevage chez l’animal. Elles apparaissent à différents temps de la vie de l’animal et sont directement pris en charge. Il y a également une procédure spécifique pour évaluer le bien-être des animaux lors de la création d'une lignée génétiquement altérée. Elle est non invasive et est basé sur l’observation de paramètres zootechniques et physiologiques en élevage.
Impact sur les animaux
Les nuisances lors d'un prélèvement de tissu pour le génotypage sont essentiellement du stress léger lors de la contention, de la pêche par épuisette ou de la sédation (poisson) et de la douleur légère lors de la coupe du tissu. En fonction du modèle de pathologie, les mutations entrainant un phénotype dommageable, induisent en général et à des degrés divers, des douleurs, de l’inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités selon le génotype. La procédure d'évaluation du bien-être des animaux est sans douleur sauf si un phénotype s'avère dommageable par cette évaluation. Cette demande de projet traite ces nuisances pour en minimiser aux maximum les souffrances animales.
Devenir
Les procédures d'évaluation et de gestion des phénotypes dommageables s'appliquent durant toute la vie des animaux. Les animaux pourront être mis à mort en élevage pour la gestion de la colonie ou bien partir en utilisation continue en expérimentation. Pour les procédures de prélèvement de tissus pour la caractérisation génétique des animaux le devenir peut-être soit la mise à mort car la combinaison de gènes n’est pas utilisable pour les expérimentations et l’élevage, soit les animaux sont gardés en vie pour renouveler les reproducteurs en élevage ou sont utilisés sur des projets expérimentaux prévus pour ces animaux (estimé à 60000 animaux sur 5 ans).
Remplacement
Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement altérés pour des projets scientifiques . Les modèles animaux sont justifiés par la nécessité de caractériser des mécanismes ou pathologies complexes qui font intervenir plusieurs grands systèmes biologiques entre eux (en neuroscience, cardiologie, oncologie par exemple). Les chercheurs des instituts développent ces modèles le plus souvent après avoir testé leurs hypothèses sur des systèmes moléculaires et cellulaires et justifié le remplacement dans leurs demandes d’autorisation de projet expérimentaux. Dans l’institut nous encourageons l’utilisation de modèles alternatifs. Par exemple une équipe a mis en place des organoïdes intestinaux qui leurs a permis de développer et consolider leurs hypothèses avant le passage sur leurs modèles de souris génétiquement modifiées. Des modèles cellulaires sont également utilisés. Enfin les projets des instituts explorent les mécanismes de pathologies complexes faisant intervenir de nombreux tissus et interactions cellulaires, le recours à l’animal dans son ensemble est indispensable.
Réduction
Les animaux produits, issus de ce projet, et utilisés en expérimentation font tous l’objet d’une analyse statistique pour permettre la détermination des lots expérimentaux et l’analyse des résultats. Chaque chercheur a défini ses outils et échantillons pour ses expérimentations qui sont évalués indépendamment. L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages et à limiter la surproduction d’animaux non utilisés dans les projets scientifiques. Pour cela, les chercheurs définissent et mettent en place les accouplements avec les zootechniciens pour des objectifs de production adaptés aux projets scientifiques. La production est suivie avec des rapports trimestriels avec des indicateurs de productivité adaptés. Chaque trimestre, la production peut donc être revue et réajustée. Elle sera réduite au strict besoin, limitant le nombre de prélèvements de tissus pour génotypage. Nous cherchons au maximum à optimiser les schémas d’accouplements (mutations portées par les parents) pour réduire le génotypage ou éviter l’apparition d’un phénotype dommageable. Nous favorisons les élevages qui fournissent 100% d’animaux utiles ce qui permet de réduire le nombre d’animaux à produire d’une part et d’autre part permet de ne pas génotyper tous les individus. Pour le génotypage en gestion de colonie, nous recherchons systématiquement les lignées non ou peu utilisées. La production de ces lignées est soit fortement réduite, soit arrêtée. Elles sont en parallèle sécurisées par cryoconservation des gamètes ou des embryons. Il est compliqué d’apprécier l’impact de ces mesures sur la réduction mais il est aisé de comprendre qu’elles concourent toutes à l’optimisation de la production aux seuls animaux qui seront utilisés dans les projets scientifiques ou en gestion de colonies et donc de réduire le nombre d’animaux à génotyper ou exprimant le phénotype dommageable. Enfin, nous cherchons à améliorer nos pratiques. Tout d’abord, si le prélèvement invasif est indispensable, nous nous orienterons vers la coupe à l’oreille par rapport à la coupe de queue plus douloureuse et nous sommes en cours de mise au point de la technique de prélèvement de follicule de poil considérée sans douleur que nous espérons pouvoir mettre progressivement en place dans les années à venir. La procédure d'évaluation du bien-être des animaux est basée sur les recommandations du guide Européen sur les animaux génétiquement altérés soit 14 animaux sur 2 générations.
Raffinement
Les techniques de prélèvement de tissus pour le génotypage sont effectuées en routine et le geste est très court et précis. La douleur est légère. Le raffinement est de s’assurer d'un process cadré et éprouvé, appliqué par des zootechniciens expérimentés pour réduire le stress des animaux, l’intensité et la durée de la douleur induite. L’utilisation de pommade anesthésiante n’est pas envisagée pour éviter une intervention plus longue et le produit pourrait interférer avec la technique de génotypage. L’analgésie par injection n’est aussi pas recommandée car la piqûre augmente la nuisance sur l’animal. Toutefois, les éléments suivants sont mis en place : manipulation par un zootechnicien expérimenté, le poste de prélèvement est codifié et préparé en amont pour éviter les gestes parasites pendant le prélèvement pour réduire le stress des animaux. L’animal est pris en contention et la biopsie est rapidement et précisément effectuée avec un matériel désinfecté et aiguisé pour réduire le temps et intensité de douleur. L’animal, remis dans sa cage est observé. En cas de mauvaise reprise de l’activité ce qui constitue le principal point limite, il sera pris en charge. Les observations quotidiennes permettent de s’assurer de la bonne cicatrisation. En cas de mauvaise cicatrisation (point limite) des pommades cicatrisantes peuvent être utilisées. Chez le poisson un raffinement particulier est apporté aux conditions d’isolement maintenues dans le système d’hébergement en circulation, maintenant des paramètres d’eau stables. Le point limite est de s’assurer de la bonne nage des poissons. Pour le raffinement des phénotypes dommageables, les lignées sont aujourd’hui bien connues et le phénotype bien caractérisé. La stratégie de raffinement est de mettre en place le plus tôt possible une procédure de surveillance de l’apparition des nuisances (le caractère spécifique du phénotype ne nécessite pas l’utilisation d’une grille pour la détermination du point limite). Il peut s’agir également d’avoir une procédure d’hébergement adapté avec l’ajout d’un enrichissement ou des manipulations très douces pour les lignées modèles d’épilepsie par exemple. La procédure d’évaluation du bien-être animal est non invasive et sans douleur basée sur l’utilisation d’une grille de paramètres zootechniques et physiologiques. Le risque est la détection d‘un phénotype dommageable qui sera immédiatement pris en charge et classifié selon la procédure sur la gestion des phénotypes dommageables.
Choix des espèces
La création de modèles pour comprendre des pathologies humaines est très développée chez la souris car les outils pour générer ces modèles génétiquement modifiés sont très efficaces. D’autre part, la souris est un mammifère avec de nombreuses similitudes dans les processus biologiques avec l’homme. Son temps de génération est considéré court (3 mois) et son élevage simple en laboratoire. Le poisson-zèbre est un modèle incontournable pour la recherche : une fécondation et un développement embryonnaire externe rapide et transparent, la facilité d’accès au matériel génétique permettant le développement des techniques d’ingénierie génétique. Son génome présente 70% d’homologie avec celui de l’homme (85% pour les gènes impliqués dans des pathologies humaines), il présente également des capacités originales de régénération des tissus (système nerveux, rétine, cœur, etc.) qui en font un modèle idéal pour la compréhension de ces mécanismes, pouvant aboutir à l’identification de pistes thérapeutiques majeures transposables chez l’homme. Pour les biopsies : souris à partir de 14 jours jusqu'à 4 semaines maximum. L'essentiel des lignées sont génotypées à 14 jours pour permettre d'avoir le résultat de génotypage au sevrage et de sélectionner uniquement les animaux d'intérêt à l’âge adulte. La biopsie de nageoire : majoritairement jeune adulte entre 1 et 3 mois avant maturité sexuelle afin de ne conserver que les animaux de génotype d'intérêt à l'âge adulte, des animaux plus vieux peuvent être concernés en cas de doute ou erreur sur le génotype.
Etude de la réversibilité de la réponse induite par des perturbateurs endocriniens à l’aide de poissons zèbres génétiquement modifiés
- Protection de l’environnement
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Une lignée de poissons zèbres génétiquement modifiés, dont la fluorescence suit l'activité d'un gène du métabolisme intestinal, est mise au point pour évaluer les perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire, dans le cadre d'un projet européen. 700 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue pour le prélèvement de leurs intestins, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés à des substances entre 72 et 120 heures après la fécondation, ils passent cinq séances d'imagerie au microscope sans anesthésie, à 5, 7, 10, 15 et 20 jours, et sont suivis jusqu'à trois mois. Le porteur qualifie cette expérience d'"essentielle" à la caractérisation de la lignée et invoque l'"organisme entier" pour écarter les cellules en culture.
Objectifs
Dans le cadre de l’étude des perturbateurs endocriniens en lien avec les pathologies métaboliques telles que l’obésité, le diabète ou la stéatose, nous développons une lignée transgénique de poisson zèbre apte à rendre compte d’effets de substances au niveau du métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme. La quantification de la fluorescence dans cette lignée transgénique permet de suivre l'expression de notre gène d'intérêt et est réalisée après exposition d’embryons issus de cette lignée à des substances pendant 48h, de 72 heures post-fécondation (hpf) à 120hpf. Afin d’étudier la réversibilité de la réponse de ce modèle nous souhaitons poursuivre les mesures de fluorescence au microscope au-delà de 120hpf, jusqu’à 3 mois. Les animaux ne seront donc pas exposés aux substances passé 120hpf. L’utilisation de la lignée transgénique apportera des informations complémentaires sur les mécanismes d’action des substances sans augmenter le nombre de poissons nécessaires à la réalisation des essais pour l’identification des perturbateurs endocriniens. A terme, le modèle que nous développons permettra d’évaluer l’impact de perturbateurs endocriniens en ayant recours à des embryons âgés de moins de 120hpf et les données générées au cours de ce projet permettront le développement/l’amélioration de voies de toxicité impactant le métabolisme qui pourront être utilisées pour une meilleure évaluation des dangers et des risques des perturbateurs endocriniens au niveau réglementaire.
Bénéfices attendus
L’étude la réversibilité de la réponse après exposition des embryons de poissons zèbres aux substances de 72hpf à 120hpf permettra d’approfondir notre connaissance des mécanismes régulant cette réponse. Nous pourrons ainsi analyser si l’expression de la fluorescence, induite ou inhibée à la suite de l’exposition aux substances, persiste ou au contraire revient à la normale alors que les poissons n’y sont plus exposés. Ainsi, la fluorescence étant relative à l’expression de notre gène d'intérêt, acteur clé du métabolisme intestinal chez le poisson zèbre, cette expérimentation permettra d’étudier les effets au long terme (jusqu’à 3 mois) sur ce métabolisme à la suite d’une exposition courte (48h) aux substances inductrices ou inhibitrices de de ce gène. Dans le cadre du développement d’un modèle de poisson zèbre apte à rendre compte des impacts des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme intestinal, y comprit chez l’Homme, l’étude de la réversibilité de la réponse aux substances a toute son importance. Ces données participeront à la caractérisation du modèle et de fait à l’élaboration d’un outil d’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme chez l’Homme, au cœur des objectifs du projet européen dans lequel s’inscrivent ces travaux.
Procédures
Les poissons zèbres seront soumis à des prises d'image en microscopie à fluorescence. Les animaux (5, 7, 10, 15 et 20 jours post fécondation) ne seront pas anesthésiés mais resteront dans de l'eau tout le temps de l'imagerie qui ne durera que 10 secondes environ. Chaque animal sera soumis à 5 imageries au cours de l'expérimentation.
Impact sur les animaux
L’exposition aux substances réalisée en début d’expérimentation (de 72hpf à 120hpf) aura un effet sur l'expression de notre gène d'intérêt (et probablement d'autres qui ne seront pas mesurés) sur le court terme et peut être le long-terme mais aucun effet toxique ou développemental n'est attendu aux concentrations sélectionnées. Les manipulations répétées tout au long de l’expérimentation (la prise d'image au microscope à fluorescence) pourraient entrainer un stress chez les animaux.
Devenir
Les animaux seront tous mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de prélever les intestins pour réaliser des mesures d'expression du gène d'intérêt à l'aide de techniques de biologie moléculaire.
Remplacement
L’étude de la réversibilité de la réponse dans le modèle poisson zèbre que nous développons ne peut s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants. En effet, cette expérimentation est essentielle à la caractérisation de ce modèle biologique, permettant de renseigner de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme à l’échelle de l’organisme entier, une problématique encore peu investiguée. Les modèles cellulaires ne permettent pas cette approche. Quant aux modèles mathématiques, s’agissant d’une problématique émergente, la modélisation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme est encore balbutiante. A terme, l’expérimentation menée ici permettra d’établir un modèle de poisson zèbre pertinent pour l’évaluation de l’impact des perturbateurs endocriniens sur le métabolisme.
Réduction
L'utilisation d'animaux transgéniques pour le suivi des effets dans le temps des substances permet de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés en réutilisant les mêmes individus à chaque temps d'étude. Les effectifs ont été calculé en tenant compte de la variabilité de l'expression de notre gène d'intérêt et de la mortalité normale au cours du développement afin de pouvoir mettre en évidence des effets des substances de plus de 50% (test statistique).
Raffinement
Les animaux sont conservés dans un environnement controlé connus pour engendrer un minimum de stress (aquariums teintés en bleu si possible avec un fond en décors graviers, paramètres physico-chimiques de l'eau et photopériode contrôlés). Ils sont hébergés en groupe afin de respecter leur comportement grégaire et limiter l’anxiété que pourrait entrainer l’isolement, en gardant des populations faibles afin d’éviter les comportements agressifs. Les poissons sont également nourris en partie avec des artémies vivantes, leur permettant ainsi d’enrichir l’éventail de leurs comportements sociaux, notamment celui de la chasse. Tout au long des expérimentations, les animaux seront suivi avec une grille de bien-être adaptée à chaque stade de développement. L'ensemble de ces procédures est réalisé par des personnes formées et sensibilisées à l'évaluation de la souffrance animale.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est une des espèces recommandées pour la réalisation de tests réglementaires sur les perturbations endocriniennes. Sa petite taille permet des expositions dans de faibles volumes d’eau d’où une faible consommation de substances toxiques et une quantité de déchets générés moindre. Ces dernières années un nombre croissant de lignées de poissons zèbres génétiquement modifiés ont été développées et se sont avérées être des outils pertinents pour la détection des perturbateurs endocriniens tout en réduisant le nombre d'animaux.
Détermination de la toxicité aiguë de substances chimiques vis-à-vis de Danio rerio
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Exposés pendant 96 heures à une substance chimique dissoute dans leur eau, 366 poissons zèbres juvéniles sont utilisés pour mesurer la concentration qui tue la moitié d'entre eux. 312 subissent des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 54 un niveau léger, et tous sont tués à la fin de l'essai. Le porteur décrit par ailleurs un hébergement pensé contre l'anxiété, groupes d'au moins sept poissons et posters posés sur les parois pour qu'ils ne soient pas effrayés par les silhouettes humaines, alors que la mort d'une partie des individus est le résultat recherché. L'essai est réalisé pour un donneur d'ordre, afin de classer la substance au titre des obligations réglementaires.
Objectifs
Les données générées à partir de ces essais sont essentiellement utilisées pour évaluer le danger pour l’environnement des substances chimiques et le classement correspondant. Les valeurs obtenues peuvent également servir de données d’entrée pour la démarche d’évaluation des risques liés à l’utilisation de ces substances chimiques.
Bénéfices attendus
Acquérir une meilleure connaissance de la toxicité des substances vis à vis des poissons pour répondre aux obligations réglementaires.
Procédures
Aucun prélèvement pendant la durée de la procédure. Exposition des animaux à la substance à tester dissoute dans l'eau avec renouvellement pendant 96 heures.
Impact sur les animaux
De par la nature de cet essai et le critère mesuré (concentration provoquant la mort de 50 % des organismes), une mortalité liée à la toxicité des substances est attendue pour une partie des concentrations testées. Des effets indésirables sont attendus sur la pigmentation, l’apparence, le comportement, la position de nage. Ils sont susceptibles d’entrainer de l’inactivé/mobilité réduite, la perte d’équilibre ou de la douleur ; ils seront suivis quotidiennement à l’aide d’une une grille d'évaluation de points limites sublétaux tout en permettant d’assurer le respect des exigences relatives à la détermination d’une concentration provoquant la mort de 50% des organismes. La durée entre l’apparition de signes cliniques et leur évolution est courte (quelques heures) si la substance d’essai présente une toxicité aigüe, à l’inverse il n’y a parfois pas d’effet observé pour certaines substances testées. La durée totale de l’essai est 96 heures.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure
Remplacement
La vérification de la disponibilité de données bibliographiques acceptables dans un cadre réglementaire sur la substance soumise à essai sera effectuée au préalable de la réalisation de l'essai. Si ces données étaient insuffisantes (disponibilité ou qualité), il n'existe pas d'alternative à la réalisation de tests sur animaux.
Réduction
La démarche s’inscrit dans un objectif de réduction du nombre d’animaux à utiliser pour obtenir une valeur de toxicité aigüe après 96 heures. La mise en oeuvre de ces essais dépend à la fois des informations mises à disposition de l’établissement utilisateur par le donneur d’ordre et également de l’objectif spécifique de réalisation. Dans le cadre réglementaire, la stratégie expérimentale qui est proposée est conforme aux recommandations de l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Économiques) pour limiter le nombre de poissons nécessaires et ainsi satisfaire aux critères de réduction selon la règle des 3Rs . Ainsi, l’essai de toxicité aiguë sur poissons ne sera mis en oeuvre qu’après avoir déterminé les valeurs de toxicité sur deux autres types d'organismes : algues et daphnies. Un essai limite sera effectué, en premier lieu, à la valeur de toxicité médiane la plus faible obtenue pour ces deux espèces ; la réalisation d’un essai complet n’étant nécessaire que si des effets létaux sont observés.
Raffinement
Dans le cadre du raffinement, le lot de poissons est maintenu en acclimatation pendant une période d’au moins 12 jours précédent l’essai : l’acclimatation-adaptation est effectuée dans les conditions environnementales contrôlées et dans une eau identique au milieu d'essai. Si cette période est plus longue, les poissons sont placés dans un bac recevant en continu un mélange d’eau produite à l'animalerie. Les autres conditions environnementales restent inchangées. Les poissons sont nourris quotidiennement jusqu'au démarrage de l'essai. L’apport de nourriture est stoppé 24 heures avant le lancement de l’essai. Les poissons zèbres sont hébergés en groupes d'au moins 7 poissons afin d’éviter les comportements d’anxiété engendrés par l’isolement, dans des environnements connus pour engendrer un minimum de stress. Des posters sont disposés sur certains côtés et le fond des aquariums transparents pour créer des zones de repos et éviter que les poissons soient effrayés par la vue des humains ou des silhouettes qui passent.
Choix des espèces
Cette espèce, au même titre que le vairon tête de boule et le medaka, fait partie des espèces recommandées dans les différents textes normatifs de référence. Selon la ligne directrice de l’essai, il est recommandé de choisir l’espèce de poissons en fonction de certains critères pratiques importants, tels que leur disponibilité tout au long de l’année, leur facilité d’élevage, leur commodité pour l’essai, ainsi que tous facteurs économiques, biologiques ou écologiques susceptibles d’être pris en considération. Les poissons doivent être en bonne santé et exempts de toute malformation visible. Le poisson-zèbre peut être facilement produit et élevé en laboratoire, avec un contrôle des maladies ou des parasites, ce qui permet d’obtenir des sujets sains et d’ascendance connue. Les poissons-zèbres utilisés sont des juvéniles ayant une taille comprise entre 1 et 2 cm comme préconisé par les normes de référence.
Edition du genome de poisson zebre par CRISPR-Cas9 en vue de creation de lignees
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Le génome de ces poissons est modifié par CRISPR-Cas9 pour livrer des lignées stabilisées à des laboratoires privés ou publics, clients de la prestation, qui réaliseront ensuite leurs propres expériences. 6 500 poissons zèbres sont utilisés dans des procédures déclarées légères et sévères, ceux qui portent le génotype recherché étant gardés comme géniteurs, les autres tués. Chacun subit une biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, et le porteur reconnaît que les modifications génétiques apportées peuvent être physiquement dommageables, occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Il décrit une espèce dont les femelles pondent jusqu'à 200 œufs par semaine et qui atteint l'âge adulte en trois mois, l'élevage d'un grand nombre d'individus étant "aisé".
Objectifs
Ce projet a pour but de créer des lignées génétiquement modifiées par la technique CRISPR-Cas9 sur le modèle poisson-zèbre pour des laboratoires privés ou publics dans le cadre de prestations. Les lignées stabilisées seront alors délivrées à l’organisme demandeur pour réaliser ses expériences. Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. En 3 mois il atteint l’âge adulte et est capable de se reproduire. Les femelles peuvent pondre jusqu’à 200 œufs par ponte et ce chaque semaine. Son développement externe permet la micro-injection et donc facilite les procédures d’édition du génome.
Bénéfices attendus
Notre unité d’appui et de recherche a pour mission de fournir de nouvelles lignées de poissons zèbres à la communauté de chercheurs utilisant les modèles poissons zèbres. Les lignées ainsi produites permettront de mieux comprendre la fonction des gènes invalidés (knock-out) ou modifiés (mutations ponctuelles) ou insérés (knock-in).
Procédures
Biopsie de la nageoire caudale sous anesthésie, de maximum 3 mm², 1 fois par animal. Temps de la biopsie (anesthésie incluse) : environ 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les modifications génétiques apportées peuvent potentiellement être physiquement dommageables pour le poisson, lui occasionner des douleurs imprévues ou induire des comportements anormaux. Le génotypage, qui s’opère par une biopsie de la nageoire caudale, est réalisé rapidement sous anesthésie en balnéation (pas d’injection traumatisante). Le prélèvement n’impacte que temporairement voire pas du tout l’animal grâce à la régénération totale du membre en quelques jours. Parmi les effets indésirables potentiels nous pouvons donc lister : comportement d'aversion pour l'anesthésique, douleur suite à la biopsie si le geste est mal effectué, comportements de stress (tels que la désorientation) suite au réveil ou à la manipulation à l'épuisette.
Devenir
Les animaux présentant le génotype d’intérêt seront gardés en vie et utilisés comme géniteurs. Les animaux ne présentant pas le génotype d’intérêt seront euthanasiés.
Remplacement
Notre projet est de générer de nouvelles lignées de poisson zèbre pour étudier des phénotypes complexes par exemple des modifications du comportement ou des modifications à l’échelle d’organes entiers, l’espèce animale utilisée ne peut donc être remplacée par des expériences sur cellules ou organoïdes.
Réduction
Une attention particulière sera portée à la gestion du cheptel, notamment via un suivi informatisé, afin de ne produire que le nombre d’individus nécessaires à la création de lignée. Un bon suivi des lignées permet par exemple d’éviter de produire davantage d’individus alors que des juvéniles sont déjà prêts à être utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera particulièrement observé. Si les animaux montrent des signes de mal-être, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Comme le poisson zèbre est une espèce grégaire, il est donc placé en groupe dans les aquariums d'élevage. Pendant le moment où les individus sont isolés (génotypage) les aquariums sont enrichis avec des structures ou objets (algues synthétiques, tuyaux de PVC) permettant aux individus de s’isoler temporairement si nécessaire ou de pallier un manque de compagnie (statut temporaire, généralement durant un séquençage pour identification génétique ou lors d’un isolement dû à une lésion observée sur un animal et qui requiert une convalescence). Deux ou trois congénères au phénotype différent visible (long fin ou nacre) seront également ajoutés à l’aquarium afin de limiter l’isolement pendant la période d’isolement qui n'excède pas deux semaines. Les paramètres de la qualité de l‘eau seront surveillés, ainsi que le bien-être et la santé des poissons. Pour cela nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, modification de la pigmentation. Si des signes de douleur sont observés suite à la biopsie, une administration par balnéation de lidocaïne (analgésique) à 2 mg/L sera effectuée.
Choix des espèces
Le modèle poisson zèbre possède 71% de gènes équivalents à des gènes humains dont 86 % sont liés à des maladies humaines, ce qui en a fait, ces dernières années, un très bon candidat à la modélisation des maladies humaines. Il permet l’obtention non invasive et indolore de plusieurs centaines d'œufs par ponte nécessaires à la mutagénèse. L’élevage d’un nombre important d'individus est aisé et la caractérisation génétique est peu traumatique. La création de lignée nécessite d’utiliser des animaux en âge de se reproduire, dans notre cas le poisson zèbre atteint ce stade à 3 mois. Ils seront utilisés pour générer une lignée mutante stable afin que l’organisme demandeur puisse effectuer ses expériences sur le modèle. Pour le génotypage, les biopsies des nageoires sont effectuées sur des individus entre un mois et trois mois.
Évaluation de l’efficacité des anesthésiants pour l’euthanasie des poissons zèbres en fonction de leur âge.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
Pour déterminer quel anesthésique tue le plus vite les poissons zèbres selon leur stade de développement, 945 individus vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun passe une heure dans un bain d'anesthésique, puis vingt-quatre heures de suivi pendant lesquelles les expérimentateurs observent ses battements de cœur et ses réflexes à trois, six et vingt-quatre heures. Ceux qui survivent peuvent présenter des signes d'intoxication, des difficultés respiratoires ou des troubles de la nage, avant d'être tués au terme des vingt-quatre heures pour cause de détérioration jugée irréversible. Le porteur range ce travail sous le principe de raffinement : neuf méthodes de mise à mort testées sur trois stades de développement, à trente-cinq individus par méthode.
Objectifs
La Directive européenne 2010/63/CE autorise l'euthanasie des poissons par surdose d'anesthésiques ou l'étourdissement électrique. Chez le poisson zèbre, la directive prend effet à partir de 5 jours post-fécondation. Dès lors, la méthode d'euthanasie la plus utilisée dans les laboratoires est la surdose de tricaine (MS-222). Bien que l'efficacité de cet anesthésique soit démontrée chez les poissons zèbres adultes, peu d'informations sont disponibles sur son efficacité pour les stades larvaires, juvéniles. Toutefois, il a été montré que le MS222 est inefficace pour l'euthanasie des poissons zèbres aux stades embryonnaires. La différence d'efficacité du MS222 par rapport aux adultes peut être expliquée par les transitions importantes lors du développement du poisson, liées aux changements métaboliques et au développement des organes, qui peuvent affecter la sensibilité des poissons aux anesthésiants en fonction de leur stade de développement. L'objectif de l'étude est d'identifier des protocoles d'euthanasie respectueux du bien-être animal pour parvenir à l'euthanasie des poissons zèbres, pendant leurs premiers stades de vie, notamment pour les stades larvaires, juvéniles. L'accent est mis sur la réduction de la durée de la procédure et l'amélioration du confort des animaux lors de l'euthanasie. Cette étude s'inscrit dans le cadre du principe de « Raffinement » en expérimentation animale, visant à minimiser la douleur et la détresse des animaux de laboratoire lors de l'euthanasie. Dans cette optique, l'étude vise à déterminer le meilleur choix d'anesthésiant pour garantir une euthanasie rapide et sans souffrance à différentes étapes du développement du poisson zèbre, couvrant les stades larvaires, juvéniles.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à déterminer la méthode d'euthanasie la plus efficace et rapide à différents stades de vie des poissons zèbres, tout en minimisant la douleur et la détresse de l'animal. Les résultats de ce projet serviront de base à des recommandations qui seront bénéfiques à la communauté des chercheurs qui travaillent sur le modèle du poisson zèbre en France et en Europe.
Procédures
Les animaux seront soumis à une exposition aux anesthésiques pendant 1 heure par balnéation (dans l’eau de nage), suivie d'une période de suivi de 24 heures. Les battements du cœur et les réflexes des animaux sont observés pendant 1 heure en présence d'anesthésiants, puis pendant 1 heure de récupération. Ensuite, les poissons sont surveillés, pour les mêmes paramètres, trois fois post-récupération : à 3 heures, à 6 heures et à 24 heures. A l’issue de cette période, les animaux seront euthanasiés (24h post-exposition).
Impact sur les animaux
Lors de la phase de récupération, les animaux peuvent présenter des signes d'inconfort ou des effets indésirables, notamment des signes d'intoxication, tels que des difficultés respiratoires ou des troubles de la nage.
Devenir
Étant donné que l'exposition aux surdoses d'anesthésiants pendant une heure pourrait entraîner une détérioration irréversible et un inconfort prolongés des animaux, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.
Remplacement
L'étude dont il est question vise à trouver des méthodes d'euthanasie qui soient rapides, efficaces et qui minimisent la souffrance des animaux. Le remplacement des animaux par des modèles in vitro ou in silico n'est pas possible dans ce cas. En effet, ces modèles ne permettent pas de reproduire l'expérience de l'euthanasie chez les animaux. Ils ne peuvent donc pas être utilisés pour évaluer l'efficacité et la sécurité des protocoles d'euthanasie.
Réduction
La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance. Nous aurons ainsi besoin de 35 individus pour chaque méthode d'euthanasie, totalisant ainsi 315 individus pour les neuf méthodes. En testant ces méthodes sur les trois stades de développement, nous utiliserons un total de 945 animaux sur une période de 5 ans. Cette approche nous permettra d’obtenir des données statistiquement valides et une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les conditions d’hébergements des animaux sont très précises afin de préserver le bien-être animal et d’enrichir l’environnement. Les poissons zèbres sont enlevés dans une eau circulante (renouvellement de l’eau de l’aquarium environ 8 fois par heure). Les alevins (5 à 15 jours post-fécondation) sont nourris avec des rotifères (nourriture vivante), ce qui leur permet de chasser. Les poissons sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens. Un suivi des animaux rigoureux sera effectué avec attribution de note qui dicteront des actions (point limites). Les poissons zèbres sont maintenus à une température de 26 degrés Celsius. Les poissons sont surveillés quotidiennement par les zootechniciens.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est largement utilisé dans la recherche scientifique, notamment en raison de la transparence de ses larves et de sa génétique similaire à celle des humains. L'euthanasie par immersion de surdose d'anesthésiants est une pratique courante pour ces poissons. Bien qu'elle soit efficace chez les adultes, aucune étude n'a encore évalué son efficacité aux premiers stades du développement du poisson zèbre. Notre objectif est de déterminer l'efficacité de différents agents anesthésiques pour l'euthanasie des poissons zèbres à trois moments clés de leur développement : la formation des organes (embryons), l'acquisition des comportements sociaux (larves) et la transition de la larve au stade juvénile. En étudiant l'euthanasie par immersion de surdose d'anesthésiants à ces moments critiques du développement du poisson zèbre, nous pourrons mieux comprendre leur efficacité et garantir une euthanasie sans douleur pour ces animaux. Cette étude contribuera à améliorer les pratiques d'euthanasie des poissons zèbres dans les laboratoires de recherche.
Impact de l’hyperglycémie sur la réparation cérébrale chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour mesurer comment l'hyperglycémie freine la réparation du cerveau, 280 poissons zèbres adultes vont être utilisés, tous tués à l'issue pour analyse de leurs tissus. 140 relèvent de procédures menées sous anesthésie sans réveil, 140 d'un niveau de souffrance léger. Une partie des animaux passe quatorze jours immergée dans une eau sucrée à 20 grammes de glucose par litre, renouvelée deux fois par jour, et 140 subissent une lésion du cerveau sous anesthésie, l'acte durant moins de quinze secondes. Le porteur n'attend aucune nuisance notable tout en reconnaissant que la littérature ne rapporte pas cette information, et fixe comme points limites des nages en cercle, une flottabilité anormale, une couleur anormale ou l'incapacité de se nourrir.
Objectifs
Le diabète est une maladie caractérisée par une hyperglycémie chronique (glycémie à jeun supérieure à 1,26g/L). Cette pathologie constitue un enjeu majeur de Santé Publique à l’échelle mondiale car sa prévalence augmente depuis plusieurs décennies. De façon intéressante, il a été démontré que le diabète/hyperglycémie était associé à une perturbation de l’homéostasie cérébrale (trouble de la mémoire, perte de substance grise) favorisant les accidents vasculaires cérébraux et aggravant leurs conséquences neurologiques. Ainsi, la condition d’hyperglycémie semble être délétère pour le fonctionnement du cerveau. Plus largement, lors des dommages cérébraux, l'hyperglycémie/diabète a un impact négatif sur la taille des lésions et la récupération fonctionnelles (élocution, locomotion, sensibilité, ...). Cependant, les impacts réels de l'hyperglycémie sur les mécanismes propres à la réparation cérébrale ne sont pas bien connus. Les objectifs du projet sont de comprendre l'impact de l'hyperglycémie sur les mécanismes de réparation cérébrale en utilisant le poisson zèbre. Cet animal est un modèle reconnu de plasticité et de réparation cérébrales. C'est aussi un modèle permettant de mimer des situations d'hyperglycémies chroniques. Dans ce contexte, nos sous-objectifs sont de déterminer l'impact de l'hyperglycémie sur la mort cellulaire à la suite d'une lésion cérébrale, (2) sur l'angiogenèse régénérative (création de nouveaux vaisseaux), (3) sur le recrutement de la microglie (cellule immunitaire du cerveau) au site de la lésion, et enfin (4) la neurogenèse régénérative permettant de générer de nouveaux neurones pour remplacer ceux qui sont morts à la suite de la lésion.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes mis en jeu et affectés par l'hyperglycémie lors d'un dommage cérébral. Il pourrait permettre d'identifier des problèmes de réparation induite par l'hyperglycémie (ex: suractivation microgliale, problème d'activation des cellules souches). Ainsi, cette meilleure compréhension du fonctionnement régénératif en condition hyperglycémique pourrait permettre de mettre en œuvre des thérapies favorisant ou limitant ces processus (ex: limiter la mort cellulaire, limiter la neuroinflammation, favoriser la neurogenèse). A terme, ce projet a pour but de favoriser la réparation cérébrale dans des conditions qui lui sont délétères (ex: hyperglycémie) afin de limiter les conséquences de dommages cérébraux.
Procédures
La moitié des animaux (soit 70) sera plongée dans de l'eau contenant du D-glucose (20g/L) afin de mettre en place une hyperglycémie chronique chez ces derniers. Ce traitement est effectuée pendant une période de 14 jours. La solution eau/D-glucose dans laquelle sont immergés les animaux est renouvellée 2 fois par jour (une fois le matin et une fois le soir). L'eau des animaux contrôles est également changée deux fois par jour pour respecter les mêmes contraintes expérimentales (cela se fera donc sur les 70 animaux contrôles). Les animaux seront soumis à des lésions cérébrales (140 animaux) avant la fin de l'expérimentation pour étude de la mort cellulaire induite par la lésion cérébrale (1 jour après lésion, soit lésion à J13), de l’angiogenèse et réactivité des microglies (2 et 3 jours après lésion, soit lésion à J11 et J12) et neurogenèse (3 jours après lésion, soit lésion à J11). La durée de la lésion est de moins de 15 secondes une fois l'animal anesthésié. La durée totale anesthésie, lésion et réveil est inférieure à 5 minutes.
Impact sur les animaux
Des expériences précédentes sur les modèles de lésions chez le poisson zèbre n'ont pas révélé de nuisances notables (ex: surmortalité, troubles du comportement, stress, douleur). Il en est de même sur les modèles d'hyperglycémie chez le poisson zèbre. Aussi, même si des lésions cérébrales chez le poisson zèbre hyperglycémique pourraient impacter certains processus régénératifs, nous n'attendons pas de nuisances et/ou effets indésirables par rapport aux données précédentes de la littérature pour lesquelles ces informations importantes n’ont pas été rapportées, ni même observées au laboratoire.
Devenir
A la fin de l'expérimentation, tous les animaux seront euthanasiés pour analyse tissulaire par immunohistochimie.
Remplacement
La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de la réparation cérébrale ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de réparation impliquent plusieurs types cellulaires: microglies, oligodendrocytes, macrophages, cellules endothéliales, neurones, et cellules souches neurales. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de la réparation : hypoxie, inflammation, stress oxydatif, sécrétion de facteurs trophiques et neurotrophiques ainsi qu'endothéliaux. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.
Réduction
Chaque expérimentation sera scindée dans la mesure du possible en deux expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont suffisamment étayés. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le deuxième groupe d'animaux. De part notre expérience et les données de la littérature, de tels effectifs permettent de fournir des données statistiques solides. Nous réaliserons des tests statistiques (t-test) pour déterminer la significativité de nos résultats.
Raffinement
Les animaux seront observés plusieurs fois par jour dans leur milieu contrôle et/ou hyperglycémique. Après lésion, ils seront observés de façon intensive dans les premières 30 minutes, puis une fois toutes les heures. Tout signe de souffrance ou de comportement anormal sera rapporté au vétérinaire référent afin de prendre les mesures adéquates. Un espace suffisant limitant au maximum les contraintes subies et permettant un comportement normal sera assuré. Les procédures invasives seront réalisées sous anesthésie générale par une personne qualifiée. Différents points limites spécifiques tels qu'un comportement anormal (mouvements circulaires), nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), flottabilité anormale, couleur anormale seront analysés. Si un de ces paramètres ou points limites est atteint, nous en ferons part au vétérinaire pour arrêt de l’expérimentation et par conséquent euthanasie pour limiter les souffrances de l’animal (sédation profonde puis euthanasie). Les données bilbiographiques et notre expérience ne montre pas de signes de souffrance, stress, modifications majeures du comportement alimentaire et locomoteur à la suite de la balnéation dans le glucose ou de la lésion. Nous resterons néanmoins vigilants sur l'ensemble des points limites.
Choix des espèces
Le poisson zèbre partage de 70 à 85 % de gènes en commun avec l’espèce humaine, impliqués dans les processus physiologiques et pathophysiologiques, respectivement. La situation diabétique (d'hyperglycémie) peut être mimée en mettant les animaux dans de l'eau supplémentée en D-glucose. De plus, c’est également un modèle de réparation cérébrale reconnu avec des processus de réparation similaires à ceux des mammifères. Animaux adultes entre 3 mois et 18 mois. A ces stades, les activités neurogéniques sont globalement similaires.
Création et maintien de nouvelles lignées transgéniques de poissons zèbres dans des modèles tumoraux pour l’étude du rôle physio-pathologique des vésicules extracellulaires
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Anesthésiés cinq minutes, amputés d'un morceau de nageoire caudale, puis isolés jusqu'à trois jours pour le génotypage, 910 poissons zèbres subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous anesthésie, au stade larvaire, et sont tués au plus tard huit jours après la fécondation. Le porteur écrit avoir réduit à dix le nombre de poissons reproducteurs, tout en prévoyant qu'un grand nombre d'œufs sera produit puis trié avant cinq jours. Les poissons retenus pour perpétuer les lignées sont gardés en vie jusqu'à un an et demi, puis mis à mort.
Objectifs
La communication intercellulaire est indispensable pour réguler les grandes fonctions de l’organisme. Récemment, une nouvelle voie de communication prend une place croissante dans la plupart des processus physiopathologiques : les vésicules extracellulaires. Ces vésicules de 100nm à 1µm sont relarguées par tous les types cellules dans tous les organismes. Leurs propriétés ouvrent de nouvelles perspectives, aussi bien du point de vue fondamentale que thérapeutique, notamment dans leur utilisation comme marqueurs ou véhicules thérapeutiques. Ces vésicules sont impliquées dans la progression des cancers mais leur étude se fait principalement in vitro, du fait que leur taille limite leur étude et utilisation in vivo. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé un modèle de poisson zèbre qui permet de suivre ces vésicules en temps réel, à l’échelle de la vésicule unique par imagerie. L’utilisation du poisson zèbre apparait maintenant comme une solution incontournable pour étudier les vésicules dans la communication entre la tumeur et son micro-environnement, dans une situation la plus physiologique possible que ne permet pas les études in vitro. Notre projet aura pour but de générer différentes lignées transgéniques pour suivre ces vésicules et manipuler leur production et leur ciblage, en exprimant de façon stable des constructions d’ADN modifié. Nous pourrons alors étudier la communication médiée par ces vésicules entre différents types cellulaires et entre ces types cellulaires, des cellules cancéreuses greffées dans les larves obtenues à partir de ces lignées. L’évolution et le maintien de ces lignées seront suivis afin de parer à l’éventuelle apparition de phénotypes dommageables. Pour cela, une observation macroscopique quotidienne sera réalisée dès la microinjection, puis une vérification du génotype sera réalisée à partir du deuxième mois. Par la suite, pour perpétuer ces lignées, une sélection d’animaux reproducteurs sera réalisée après maturité sexuelle qui apparait vers 3 mois. Ces lignées permettront ensuite de caractériser les propriétés biologiques et fonctionnelles des vésicules in vivo en temps réel, dans des protocoles expérimentaux effectués dans des embryons de moins de cinq jours post fertilisation. Ce projet permettra alors une meilleure compréhension de la biologie des vésicules, notamment sur leur rôle dans la propagation des cancers et plus particulièrement dans le cancer de la prostate ou le cancer cérébral (glioblastome).
Bénéfices attendus
La création de ces nouvelles lignées contribuera à une meilleure compréhension de la biologie des vésicules extracellulaires chez l’animal et fournira des données cruciales sur leur rôle dans la progression tumorale in vivo dans un contexte physiologique (flux sanguin, barrière biologique). Nos études sur les embryons de poisson zèbre permettront également d’établir cet organisme modèle comme un modèle préclinique pour tester in vivo le potentiel thérapeutique notamment en tant que véhicules thérapeutiques dans le cadre des cancers.
Procédures
Prélèvement de morceau de nageoire caudale, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes. Isolement pour génotypage, en une fois, pendant 3 jours maximum. Injection de cellules, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes.
Impact sur les animaux
D’après la littérature, aucun phénotype dommageable n’est attendue par l’expression de nos constructions. Bien que peu probable, le ou les phénotypes dommageables pourront se traduire par : l’apparition de malformations de l’animal au cours de son développement (tératogenèse), la formation d’œdème, ou une altération du comportement. Les seules nuisances attendues seront le stress de l’anesthésie, la douleur liée au prélèvement pour le génotypage.
Devenir
A la fin de la procédure 1, les animaux seront toujours utilisés notamment pour maintenir leur lignée et donc perpétuer les futures générations. Cependant, les animaux seront gardés en vie jusqu’à leur un an et demi, après cela, ils seront mis à mort. En ce qui concerne la deuxième procédure, les animaux seront mis à mort après observation de la propagation ou progression des cellules injectées (maximum 8 jours post-fécondation).
Remplacement
Ce projet repose sur la création de nouvelles lignées transgéniques de poissons zèbres pour l’étude du comportement des vésicules extracellulaire en temps réel chez un organisme vivant. En ce sens, aucune méthode de remplacement in vitro n’est possible pour cette question.
Réduction
Dans le but de réduire et selon des calculs de puissance ainsi que des différentes observations concernant le taux d’intégration d’ADN modifié et le pourcentage de survie de nouveaux descendants en général, nous estimons et avons réduit le nombre de poissons à 10, de manière à toujours avoir 90% de chance d’obtenir des différences significatives, bien que la morbidité et viabilité de ces nouvelles lignées transgéniques restent encore inconnues. Dans le but d’obtenir ces 10 poissons, il faut prendre en compte ces différents paramètres de viabilité et morbidité, ainsi théoriquement, un grand nombre d’œufs seront générés, mais seront triés avant les 5 jours post-fertilisation, pour leur expression de l’ADN injecté, de manière à réduire le nombre de poissons nécessaires. Dès l’obtention des 10 poissons avec autant de mâles que de femelles, le génotypage sera stoppé. Dans le cadre des greffes, nos études utilisent des approches de microscopie qui limitent le nombre de poissons à une dizaine de larves de 6 à 8 jours post-fertilisation par expérience.
Raffinement
Afin d’améliorer la qualité de vie des animaux, nous porterons une attention toute particulière à l’apparition très peu plausible de phénotypes dommageables. Nous effectuerons un enrichissement de milieu, notamment par l’utilisation d’un fond imagé lors des accouplements, mais également par l’approvisionnement en plancton une fois par jour, en fonction de la production de plancton au sein de l’animalerie. De la même manière, afin de limiter la souffrance et/ou stress de l’animal lors du prélèvement de nageoire pour le génotypage, un analgésique et un anesthésique seront utilisés. Nous veillerons également à réduire au minimum la quantité du prélèvement, pour cela nous prélèverons un morceau de 1mm au niveau de la nageoire caudale. Un système d’hébergement spécifique au génotypage sera également mis en place et relié au système aquatique, de manière, à ce que les poissons soient séparés les uns des autres mais qu’ils puissent se voir au travers de parois transparentes et bénéficie des mêmes conditions (alimentation en eau donc en oxygène continue) que les poissons hébergés dans le système aquatique. De plus, le temps d’isolement sera le plus court possible, c’est-à-dire le temps de la réalisation des techniques de génotypage, soit maximum 3 jours.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle animal où son développement rapide et en dehors de leur mère permet de réaliser facilement des manipulations génétiques pour l’obtention de lignées dont le génome a été modifié. Du fait de la transparence des embryons, l’observation des organes internes à l’échelle de l’organisme entier est facilitée. Cette caractéristique ainsi que la taille de ce modèle sont un grand avantage pour la visualisation des vésicules extracellulaires (notamment dans les fluides biologiques) et de leur interaction avec des tissus récepteurs. Les poissons seront utilisés jusqu’à leur un an et demi de manière à pouvoir vérifier le génotype de ces poissons, à partir de leur deuxième mois, lorsqu’ils auront une taille suffisamment grande ; mais également pour perpétuer les lignées dont le génome a été modifié, par reproduction sexuée.
Evaluation des effets comportementaux de perturbateurs endocriniens chez le poisson-zèbre.
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 860 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 1 500 d'entre eux et modéré pour 360. Le résumé annonce une série de sept tests comportementaux et un test de nage spontanée sans nommer lesquels, et prévoit un isolement en bac individuel pendant cinq jours pour conserver l'identité de chaque poisson. Les 360 individus exposés à un perturbateur endocrinien entre le quatorzième et le vingt-huitième jour de vie sont tués parce que le traitement chimique interdit de les réemployer, les autres pour des analyses moléculaires. Le porteur affirme qu'aucun effet délétère n'est attendu sur la survie ou la croissance, tout en reconnaissant que la molécule testée pourrait entraîner des effets modérés encore non décrits sur leur bien-être.
Objectifs
Le projet vise à 1) évaluer les conséquences à court et long-terme d’une exposition précoce à divers perturbateurs endocriniens et à 2) élucider le rôle de la perturbation d'une protéine impliquée dans la synthèse des oestrogènes dans le cerveau (l’aromatase cérébrale) dans ces effets. L’ambition globale du projet est d’apporter des connaissances essentielles au développement d’une stratégie permettant l’évaluation systématique et efficace du risque posé par les perturbateurs endocriniens neurotoxiques.
Bénéfices attendus
L’ambition globale du projet est d’apporter des connaissances essentielles au développement d’une stratégie permettant l’évaluation systématique et efficace du risque posé par les perturbateurs endocriniens neurotoxiques.
Procédures
Les individus inclus dans la procédure 1 subiront des tests comportementaux non-invasifs. Trois (3) lots distincts de poissons subiront à 3 mois, 12 mois ou 24 mois une série de 7 tests comportementaux non-invasifs. Quatre (4) lots d'individus différents subiront un test comportemental de nage spontanée (non-invasif) à 2, 3, 4 ou 5 mois (pour un total de 144 individus). Lors de la procédure 2, une partie de l'effectif (soit 360 individus) est soumise à une exposition à un produit chimique pouvant entraîner des modification de l'activité de nage et du stress. Ces expositions sont restreintes dans le temps (entre 14 jours et 28 jours de vie). Ensuite, l'ensemble de l'effectif (soit 960 poissons) est soumis à un test comportemental de nage spontanée (non-invasif).
Impact sur les animaux
Aucun effet délétère n'est attendu sur la survie ou la croissance des animaux. Des effets pourront être observés concernant les aptitudes comportementales (e.g. niveau d'activité de nage, capacités d'apprentissage) des individus. Une partie des poissons (360 individus) seront exposés à une molécule connue pour interférer avec la différenciation sexuelle du poisson-zèbre à forte concentration. La concentration testée est relativement faible et sélectionnée sur la base d’effets non-léthaux. Cependant, il est possible qu’elle entraîne des effets modérés encore non-décrits sur le bien-être des poissons, qui sera quotidiennement surveillé afin d’anticiper toute souffrance qui entraînera l’arrêt de l’expérimentation.
Devenir
A l'issue de la procédure 1, les individus sont euthanasiés pour prélèvements et analyses moléculaires ultérieures. A l'issue de la procédure 2, les individus sont euthanasiés. En effet ils ne peuvent être réemployés dans la mesure où ils ont été soumis à un traitement chimique.
Remplacement
La substitution par des modèles non-animaux et/ou des stades non-protégés n’est pas envisageable dans la mesure où nous faisons des analyses comportementales complexes seulement caractérisables chez l’adulte.
Réduction
Les effectifs ont été calculés à partir de données d’expérimentations précédentes et de la littérature pour assurer une puissance de détection suffisante des effets escomptés (15 traitements différents au plus). Le sexe des individus sera intégré aux analyses et celles-ci requièrent 15 mâles et 15 femelles par traitement pour les tests comportementaux, excepté pour l’analyse du comportement de groupe qui requiert un total de 54 poissons (18 poissons par réplicat) et ainsi conditionne le nombre maximal de poissons utilisés. En estimant un risque de perte avant la fin de manipulation autour de 10%, nous allons donc utiliser au plus 900 poissons-zèbres pour la procédure 1. Suivant un raisonnement similaire, les expériences de la procédure 2 utiliseront 960 poissons-zèbres. L’analyse des résultats se fera grâce à des tests statistiques appropriés pour mettre en évidence des effets biologiques des traitements testés. D’une façon générale, un soin a été apporté afin d’utiliser les mêmes individus pour l’étude des différents traits comportementaux ainsi que pour les prélèvements à fins d’analyses moléculaires.
Raffinement
Les individus, élevés en groupe dans des structures adaptées à l’espèce, sont observés trois fois par jour lors du nourrissage, ainsi l’atteinte d’un des points limites fixés est identifié de manière précoce. Le poisson est ensuite immédiatement isolé en bac individuel. Si son état ne s’améliore pas dans un délai de 24 h, l’individu est euthanasié à l’aide d’une surdose d’anesthésiant par balnéation. Pendant les expériences menées pour l’étude des aptitudes comportementales, les individus sont gardés en bacs individuels pendant 5 jours afin de pouvoir conserver leur identité. Le stress qui pourrait être provoqué par l’isolement est réduit par la mise en place d’un contact visuel de proximité entre les poissons.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre, un modèle en écotoxicologie et à la base de plusieurs lignes directrices européennes en matière d’évaluation du risque environnemental lié aux polluants, est caractérisé par une reproduction non-saisonnière, une bonne fécondité et par des cycles de vie courts (3-4 mois) qui permettent d’aborder aisément la question des effets à long-terme après exposition embryonnaire. Les différents traits de son comportement ont été également bien caractérisés. Les expériences seront menées à différents stades de développement (larves, juvéniles, jeunes et vieux adultes) afin de pouvoir suivre l'évolution des différences comportementales selon l'âge de l'individu dans la mesure où des résultats préliminaires nous suggèrent une forte dépendance de ces différences en fonction du développement.
Etude d’une surnutrition sur la neurogenèse constitutive et régénérative chez le modèle poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
640 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils subissent des lésions du cerveau sous anesthésie et des injections, pour étudier l'effet d'une surnutrition sur la formation et la réparation des neurones. Le porteur affirme une mortalité quasi nulle et l'absence de signe visible de souffrance après lésion. Il conclut que la complexité de la réparation cérébrale ne peut être reproduite in vitro.
Objectifs
Les objectifs du projet sont de mieux comprendre l'impact d'une surnutrition sur les mécanismes de neurogenèse (création de nouveaux neurones) en condition constitutive et régénérative (sans et avec lésions cérébrales). Pour cela, nous avons pour sous objectifs de comprendre : (1) l'impact de désordres métaboliques (obésité/prédiabète) sur la prolifération des cellules souches neurales, sur la neuroinflammation et l'angiogenèse (création de nouveaux vaisseaux sanguins), (2) par quels mécanismes la surnutrition impacte la régulation des gènes modulant la création de nouveaux neurones), (3) et enfin d'étudier l'impact de la surnutrition sur les mécanismes de réparation cérébrale (mort cellulaire, angiogenèse et neurogenèse régénératives).
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre comment un déséquilibre nutritif entrainant une obésité et une dérégulation de la glycémie peut avoir des répercussions sur la plasticité cérébrale et les mécanismes de réparation (mort cellulaire, angiogenèse, neurogenèse). En situation non lésée, nous pourrons mieux comprendre l'impact de la surnutrition sur la prolifération des cellules souches neurales, sur la vascularisation cérébrale et sur la neuroinflammation du tissu. De plus, nous pourrons étudier l'expression de facteurs clés dans les mécanismes de neurogenèse, plasticité et vascularisation cérébrales en situation dite homéostatique (non lésée). En outre, un focus particulier sera fait sur les voies de signalisation Notch, Id1 et des glucocorticoïdes. En situation de lésion, nous pourrons comprendre comment les désordres métaboliques induits impacte les mécanismes de réparation cérébrale impliquant entre autres la mort cellulaire associée à la lésion, le recrutement des cellules microgliales et la création de nouveaux neurones. A termes, cela pourra permettre d'identifier des voies thérapeutiques d'intérêt pour contrecarrer les effets délétères de désordres métaboliques sur le cerveau mais aussi sur les mécanismes de réparation à la suite d'accidents vasculaires cérébraux ou de traumatismes crâniens.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions - lésions du télencéphale (mortalité inférieure 1%) - Injections intrapéritonéales
Impact sur les animaux
Les points limites sont un comportement anormal (mouvements circulaires), une nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), une flottabilité anormale dans la colonne d’eau, et une couleur anormale ou une hyperventilation, indiquant une souffrance ou un stress. Peu voire pas d'effets indésirables sont attendus dans ces modèles. Bien que la surnutrition puisse entrainer des diminutions de plasticité cérébrale et de locomotion, les animaux surnutris dans ces conditions expérimentales ne semblent pas présenter de stress particulier dans de tels temps d'étude De plus, les lésions du télencéphale réalisées sous anesthésie générale sont rapides (moins de 30s) et parfaitement maitrisées. La mortalité associée est quasi nulle . De plus, après lésion cérébrale sous anesthésie, le poisson est remis immédiatement dans l'eau et se réveille en moins de 1 à 2 minutes. Il ne présente visuellement aucun signe de souffrance, de séquelles visibles ou de stress (cités précédemment). Il est presque impossible à l'œil de distinguer un animal qui a subi une lésion d’un non lésé car aucun différence notable et significative de locomotion ou autres paramètres de nage n’est perçu. Pour voir de subtils changements, il est nécessaire de monitorer l'activité avec des équipements comportementaux très fins. Ceci s'explique aussi probablement par le fait que le cerveau n'est pas innervé d'un point de nociceptif. Aussi, les injections de BrdU en intrapéritonéale sont maitrisées et se font sous anesthésies du poisson dans de la tricaine (MS-222). Elles n'induisent pas d'effets indésirables.
Devenir
A l'issue finale du projet, l'ensemble des animaux sera euthanasié. Si jamais les résultats scientifiques sont suffisamment etayés ou si un problème survenait, la segmentation du projet en sous-expérimentations indépendantes nous permettra de réduire le nombre d'animaux et de les utiliser pour d'autres expérimentations.
Remplacement
La complexité des processus physiologiques se déroulant lors de la surnutrition (obésité/situation prédiabétique) sur les effets du cerveau ne sont pas modélisables in vitro. Des facteurs périphériques et centraux sont modulés et ont un impact sur l'homéostasie cérébrale. De plus, lors de la réparation cérébrale les mécanismes ne sont pas modélisables par des techniques in vitro. Les processus de réparation impliquent plusieurs types cellulaires: microglies, oligodendrocytes, macrophages, cellules endothéliales, neurones, et cellules souches neurales. De plus, plusieurs processus physiologiques se mettent en place lors de la réparation : hypoxie, inflammation, stress oxydatif, sécrétion de facteurs trophiques et neurotrophiques ainsi qu'endothéliaux. A l'heure actuelle, nous ne pouvons réaliser des procédures in vitro permettant d'intégrer l'ensemble de ces acteurs cellulaires et de signalisation.
Réduction
Chaque expérimentation sera scindée en des expériences indépendantes. Cela permettra de ne pas utiliser l'ensemble des animaux si nous observons que les résultats obtenus sont suffisamment étayés. De plus, si jamais une souffrance ou une mortalité inattendue venait à apparaitre, cela éviterait de relancer une expérimentation avec le deuxième groupe d'animaux. A noter que chaque expérimentation sera menée sur des groupes de 20 poissons par condition (4 x 20 poissons nourris normalement et 4 x 20 poissons surnutris). Cette segmentation de l'expérimentation en 4 expérimentations indépendantes permettra de stopper l'expérimentation en cas d'une souffrance insoupçonnée ou de données scientifiques suffisamment étayées.
Raffinement
Les poissons seront maintenus dans des conditions optimales. La procédure invasive sera réalisée sous anesthésie générale par une personne qualifiée. Les points limites sont un comportement anormal (mouvements circulaires), une nutrition anormale (voire incapacité à se nourrir), une flottabilité anormale dans la colonne d’eau, une couleur anormale et/ou une hyperventilation, indiquant une souffrance ou un stress. Chaque situation d'animal montrant des signes de souffrances sera rapportée au vétérinaire responsable de l'animalerie (ou responsables du bien-être animal) pour conseils ou directives de traitement approprié, en général sédation profonde et euthanasie.
Choix des espèces
Le poisson zèbre partage de 70 à 85 pour cent de gènes en commun avec l’espèce humaine, impliqués dans les processus physiologiques et pathophysiologiques, respectivement . C’est également un modèle de réparation cérébrale reconnu avec des processus de réparation similaires à ceux des mammifères Mâles et femelles : à part égale afin d'avoir une meilleure appréciation des effets observées chez les mâles et femelles et étudier d'éventuels dimorphismes sexuels. Les animaux auront le même âge au sein d'un groupe contrôle et traité.
Analyse des performances de nage chez une lignée de poisson zèbre présentant une hypertrophie cardiaque
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
60 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. On leur prélève un fragment de nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, puis on les soumet à deux séries de test d'effort en couloir de nage forcée à courants croissants, à deux âges différents, pour relier une hypertrophie cardiaque d'origine génétique à leurs capacités de nage. Le porteur qualifie de modéré le stress lié à ces épreuves de nage. Il affirme que l'étude dynamique du cœur à l'effort n'a de sens qu'à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Les hormones thyroïdiennes contrôlent un grand nombre de processus biologiques en régulant l’expression de nombreux gènes. Des perturbations de ces hormones sont à l’origine de diverses pathologies qui peuvent se manifester tout au long de la vie et donc constituent des problèmes majeurs de santé publique. L’étude des régulations physiologiques par les hormones thyroïdiennes constitue donc un axe de recherche important, notamment pour l’étude de la fonction cardiaque. Nous avons montré dans différents travaux que ces hormones jouent un rôle essentiel dans le contrôle de la régénération du tissu cardiaque. Afin d’avoir une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu pendant la régénération cardiaque lorsque les hormones thyroïdiennes sont perturbées, nous avons étudié les effets de l’inactivation d’un gène clé contrôlant ces hormones, le gène dio2, en utilisant une lignée de poisson zèbre mutante pour ce gène. Ainsi, l’inactivation du gène dio2 entraine une hypothyroïdie des animaux. Lors de nos analyses, nous avons observé que chez les poissons mutants pour le gène dio2 la région cardiaque était différente comparés à celle des poissons non mutants et que ces poissons mutants présentaient les signes d’une hypertrophie cardiaque, confirmée par des analyses morphologique et moléculaire des cœurs chez ces poissons mutants. Dans le but de relier ces observations à un test comportemental, nous voulons réaliser une analyse des performances de nage en soumettant les poissons mutants à un test d’effort en couloir de nage forcée dans l’objectif de compléter l’étude de cette lignée de poisson zèbre présentant une hypertrophie cardiaque quand le gène dio2 est inactif.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à étudier l’effet d’une hypothyroïdie congénitale induite par une mutation d’un gène clé impliqué dans la signalisation thyroïdienne sur les performances de nage et la résistance à l’effort chez un poisson adulte.
Procédures
Deux types d’interventions sont utilisées dans ce projet : 1) Le génotypage des poissons se fait par prélèvement d’un fragment de 5 mm2 à l’extrémité de la nageoire caudale sur les poissons âgés de 2-3 mois (l’acte se fait sous anesthésie et dure moins de 10 secondes ; il concerne 60 poissons utilisés dans l’étude ; il est à noter que le bout de nageoire régénère rapidement) ; 2) Les 60 poissons sont soumis individuellement ou en groupe à deux séries de test d’effort en couloir de nage forcée, en appliquant des courants de vitesses croissantes (3 vitesses pour les tests de nage individuelle ; 5 vitesses pour les tests de nage en groupe) et en observant leur capacité de nage pendant des durée de 20-30 secondes (pour les tests de nage individuelle) et 10 secondes (pour les tests de nage en groupe) : un test fait sur les poissons âgés de 6-8 mois, puis un deuxième test fait sur les mêmes poissons âgés de 1,5-2 ans (permettra de voir si il y a une évolution des effets de l’hypertrophie cardiaque sur la capacité de nage des poissons en fonction de l’âge).
Impact sur les animaux
- Dans le cadre de la lignée dio2 utilisée, une hypothyroïdie des poissons mutants a été diagnostiquée. Cependant, les poissons mutants ne présentent pas de handicaps majeurs, excepté une taille plus petite et une certaine infertilité qui rend la production d’animaux plus difficile que chez les poissons non mutants (les femelles mutantes ont une période de reproduction plus courte et plus de difficulté à pondre). - Les challenges (test d’effort en couloir de nage forcée) sont susceptibles d’entrainer un stress ponctuel des animaux, mais ces variations étant contenues dans des gammes proches de celles pouvant être rencontrées dans le milieu naturel (nage en eau courante/nage à contre-courant), les stress induits devraient être modérés.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans la procédure seront euthanasiés en fin de procédure ; ces animaux seront utilisés pour réaliser des analyses histologique, moléculaire ou anatomique, en particulier concernant leur cœur.
Remplacement
L’étude dynamique du processus cardiaque n’a de sens qu’à l’échelle de l’organisme entier, d’autant plus dans le cadre d’un test d’effort qui fait appel à la locomotion de l’animal. Notre étude nécessite donc de recourir à des organismes modèles animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux qui seront testés (10 poissons mâles et 10 poissons femelles pour chacun des 3 génotypes : Dio2 mutant (-/-) ; Dio2 sauvage (+/+) ; Dio2 hétérozygote (+/-) ; donc en tout 60 poissons) s’appuie sur l’expérience passée de l’équipe collaboratrice qui a déjà mis en œuvre ce type d’expérimentation. Néanmoins, les expériences seront conduites par lots successifs de façon à pouvoir être arrêtées dès que les résultats obtenus seront concluants.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions optimisées pour leur croissance et leur reproduction. Dans le cadre du test d’effort en nage forcée, les animaux font l’objet d’un suivi particulier pendant toute la durée de l’expérience, afin de surveiller l’éventuelle apparition d’un trouble locomoteur ou comportemental (point limite) qui imposerait l’interruption du challenge. Ce suivi sera maintenu de manière particulièrement attentive par le personnel formé pendant les 2 à 3 jours suivant chaque expérience pour s’assurer que les poissons conservent un comportement normal.
Choix des espèces
Le projet vise à étudier l’effet d’une hypothyroïdie congénitale induite par une mutation d’un gène clé impliqué dans la signalisation thyroïdienne sur les performances de nage et la résistance à l’effort chez un poisson adulte. Le poisson-zèbre, par sa facilité d'élevage, par sa croissance rapide et par les possibilités qu'il offre pour la réalisation d’études du comportement natatoire, est un excellent modèle pour notre projet. Les animaux des 3 génotypes (dio2+/+, dio2+/- et dio2-/-) seront utilisés à 2 âges différents : une mesure de leur capacité à nager à contre-courant sera évalué au stade jeunes adultes (6-8 mois), puis une deuxième mesure sera faite sur ces mêmes poissons à un âge plus avancé (1,5-2 ans). Le but est de voir l’effet de la mutation du gène dio2 sur la capacité de nage du poisson zèbre, et de voir l’effet de l’âge sur cette capacité.
Création et maintien de lignées de poissons zèbres génétiquement altérées pour l’étude de syndromes neuro-développementaux rares.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
9 550 poissons zèbres vont être utilisés, classés en gravité légère, dans un projet de création et de maintien de lignées génétiquement altérées. Chaque animal subit à quatre mois une amputation d'un morceau de la nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, geste que le porteur présente comme le plus invasif du projet. Les géniteurs et génitrices retenus sont conservés jusqu'à dix-huit mois, tandis que les autres, porteurs de modifications génétiques et jugés non nécessaires, sont mis à mort. Le porteur affirme que seul un organisme vivant complexe permet d'étudier ces syndromes neuro-développementaux et met en avant la transparence des embryons et les pontes nombreuses pour justifier le choix de l'espèce.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de permettre l'étude d’un ensemble de maladies génétiques rares du neuro-développement caractérisés par une microcéphalie et un nanisme. Actuellement, la prise en charge clinique des patients est strictement symptomatique; aucun traitement curatif n’existe à ce jour. Ces syndromes sont dus à des mutations dans un gène spécifique identifié. Le projet de recherche vise à comprendre les mécanismes qui mènent à ces syndromes et pourquoi des mutations distinctes de ce gène conduisent à des pathologies différentes. Afin de mener ces études à bien, le poisson-zèbre a été choisi comme modèle car il permet de reproduire et ainsi de comprendre ces maladies. Le projet proposé ici vise à établir et maintenir des lignées de poissons-zèbre présentant deux mutations emblématiques de ce gène, ainsi qu’une invalidation fonctionnelle totale de ce gène. Ces lignées permettront de mettre en évidence les particularités propres à chaque type de mutation expliquant la variabilité́ des symptômes observés chez les patients, et ce, tout particulièrement sur le développement cérébral.
Bénéfices attendus
Ce projet s’inscrit dans une démarche de recherche fondamentale permettant de mieux comprendre comment les mutations d'un gène sont impliquées dans la survenue de syndromes présentant des pathologies plus ou moins sévères. A court terme, l’établissement de ces lignées permettra d’établir un modèle de référence de la maladie pour l’étude de ces syndromes. A moyen terme, l’analyse de l’expression des gènes dans les premiers stades de développement du poisson-zèbre aidera à mieux comprendre quels sont les gènes impliqués dans la survenue de retard de croissance et de microcéphalies et de mettre en lumière pourquoi ces symptômes sont plus prégnants pour certaines mutations que pour d’autres. A long terme, ces résultats pourront permettre un éclairage sur les mécanismes cellulaires les plus affectés dans ces syndromes. Ces lignées pourront s’avérer être d’une grande aide dans le test de molécules à visée thérapeutique visant à soulager les patients et à améliorer leur vie.
Procédures
La création de lignées de poissons-zèbre implique de pouvoir identifier les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt. Aussi, un génotypage des individus s’avère obligatoire. La procédure nécessite le prélèvement d’un morceau de tissu de la nageoire caudale du poisson afin d’en extraire l’ADN. Le choix d’un prélèvement de la nageoire caudale tient au fait que celle-ci se régénère très rapidement. Ce prélèvement sera réalisé une seule fois au cours de la vie de l’animal, à 4 mois. Afin de limiter la douleur liée au prélèvement, celui-ci sera effectué sous anesthésie générale brève de l’animal et à l’aide d’un scalpel dont la lame sera préalablement stérilisée à l’alcool et changée à chaque série de prélèvement. Après le prélèvement, le poisson sera immédiatement transféré dans un bac individuel contenant de l’eau sans anesthésique pour permettre son réveil. Le poisson sera surveillé pendant 10mn pour vérifier son état général. Classiquement, cette technique ne génère pas de mortalité.
Impact sur les animaux
La transmission des syndromes, par le biais de mutations est de type « autosomique récessive » indiquant que les parents sont porteurs sains et asymptomatiques. L’ensemble des progéniteurs de nos lignées seront des poissons porteurs des modifications génétiques, sains et asymptomatiques. De même, il est attendu que la génération de ces lignées poissons-zèbres porteurs des modifications génétiques d’intérêt conduise à des individus sains, libre de se mouvoir et ne présentant aucun signe de mal être. Néanmoins un suivi régulier des poissons-zèbre sera réalisé pour s’assurer de leur bien-être. Lors de la création de ces lignées, certains poissons zèbres seront amenés à subir un prélèvement d’un morceau de la nageoire caudale afin de pouvoir identifier les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt. Il s’agit là du geste le plus invasif qu’auront à subir les poissons zèbres dans ce projet.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux d’intérêt (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 18 mois. Les autres seront mis à mort afin de ne pas garder d’animaux, non nécessaires à la conduite de ce projet et porteurs de modifications génétiques, qui ne peuvent pas être replacés.
Remplacement
L’étude du développement neuronal à partir de cellules souches issues de patients et d’un modèle animal, le poisson-zèbre, permet de comprendre les mécanismes de ces maladies. Seul un organisme vivant complexe comme l’animal permet de récapituler l’ensemble des phénomènes physiologiques et de les étudier avec pour objectif une possible application à l’Homme. Le poisson zèbre présente de nombreux avantages, notamment la transparence optique des embryons ce qui permet le suivi, en temps réel, du développement embryonnaire et notamment du système nerveux (deux marqueurs majeurs affectés dans les syndromes étudiés). De précédentes études ont déjà démontré la pertinence du poisson-zèbre comme modèle d’étude car la perte temporaire de la fonction du gène d’intérêt provoque chez cet animal un éventail de symptômes/syndromes spécifiques des maladies humaines, dont une microcéphalie. L’apparition de l’ensemble de ces symptômes/syndromes peut être bloqué par la réexpression de la forme « saine » du gène humain chez le poisson mais pas par les formes « malades », qui portent les mutations identifiées chez l’Homme. Pour poursuivre la caractérisation de ces maladies, l’établissement des lignées poisson-zèbre présentant des mutations stables du gène d’intérêt permettra de disposer de modèles physiologiquement pertinents.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre de poissons de la génération F0 à élever jusque l’âge de 4 mois, une estimation préalable de l’efficacité des systèmes de modification génétique sera réalisée en amont sur des œufs de poisson zèbre de type sauvage à 24-48h heures post fécondation. Le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de la nageoire caudale sera limité au maximum, en réalisant des prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres, afin de ne sélectionner que le nombre minimum de poissons zèbres hétérozygotes nécessaires. Dès lors que le nombre de poissons d’intérêt sera atteint, les prélèvements seront interrompus. Pour le maintien des lignées, seuls les poissons zèbres hétérozygotes nécessaires au maintien de chaque lignée seront conservés, ce qui correspond à une vingtaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. Dès lors que le nombre d’animaux d’intérêt sera obtenu, les prélèvements de nageoire caudale pour génotypage seront interrompus. Dans le cas de figure où la génération de poissons-zèbre avec une invalidation totale du gène d’intérêt se révélait trop difficile à obtenir, les autres lignées de poissons-zèbre ne seront pas générés.
Raffinement
Seul le strict minimum d’animaux nécessaires à la génération et au maintien des lignées subira le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale. Le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale se fera uniquement sur des animaux anesthésiés et le temps d’isolement des poissons-zèbres pendant cette phase de caractérisation sera limitée au minimum en maintenant les animaux dans des bacs avec des séparateurs transparents afin qu’ils soient au minimum 2 par 2 le temps de la procédure. Les individus d’intérêt seront ensuite regroupés en fonction de leur génotype. Les poissons-zèbres conservés seront tous hétérozygotes et ne présenteront pas de phénotype dommageable (le syndrome étudié étant récessif). Toutefois, une surveillance hebdomadaire pour détecter tout éventuelle anomalie du comportement des animaux sera réalisée. L’observation de blessures sur l’animal ou d’anomalies de comportement (nage anormale, prostration au fond du bac…) conduira à la mise à mort de l’animal afin de limiter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Avec la grande conservation fonctionnelle de ses gènes avec l’Homme, le poisson zèbre constitue un modèle idéal pour étudier des maladies génétiques dans un contexte physiologique et à l'échelle d’un organisme complexe entier. De plus, ce modèle présente de nombreux avantages avec notamment une fertilisation externe et des pontes supérieures à 100 œufs, permettant ainsi de limiter le nombre de génitrices nécessaires au projet et ainsi de les préserver, tout en obtenant une puissance statistique optimale avec peu de croisements. Enfin, la transparence optique des embryons permet le suivi en temps réel du développement embryonnaire et notamment du système nerveux (deux marqueurs majeurs affectés dans le syndrome étudié). Lors de la création des lignées de poissons-zèbres, les animaux subiront un unique prélèvement de nageoire caudale, à l’âge de 4 mois. Ce prélèvement s’effectue à ce stade car les poissons-zèbres sont suffisamment développés et la quantité de tissu prélevé suffisante pour le génotypage. La cicatrisation et la régénération de la nageoire s’opèrent de manière optimale à ce stade de développement. Par la suite, ces mêmes poissons-zèbres seront les géniteurs et génitrices du projet (à partir de l’âge de 5 à 6 mois).