Poissons zèbres
Identifier les gènes responsables de la dégradation ou de la réparation du neurone et du muscle
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
5 040 poissons-zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués puis conservés à -80 degrés pour analyses. Les interventions ont lieu sur des larves de 48 à 72 heures : lésion du cartilage de la mâchoire, de la moelle épinière ou de la nageoire caudale, ou injection de cellules, sous anesthésie et en moins de quinze minutes. Le porteur annonce une récupération complète en cinq à six jours grâce aux capacités de régénération de l'espèce, et prévoit la mise à mort des larves trop affectées par l'intervention, le suivi allant jusqu'à trente jours pour les gènes dont la suppression tue précocement. Il présente cet usage de larves comme un moyen de "remplacer l'utilisation de modèles mammifères, en ligne directe avec les recommandations des 3R", alors que le projet en mobilise 5 040.
Objectifs
Le projet global vise à identifier les zones de notre ADN responsables des maladies génétiques qui contrôlent la locomotion. Nous cherchons notamment à découvrir les mécanismes qui poussent un tissu à dégénérer, ou qui au contraire, permettent sa réparation (c’est-à-dire sa régénération). Pour ce faire, nous supprimerons chez le poisson-zèbre, les gènes qui sont mutés chez des patients atteints de maladies neuromusculaires. Nous observerons alors comment l'absence de ces gènes peut impact les neurones, les muscles et les cartilages du poisson. Objectif 1: Découvrir les zones de l'ADN impliquées dans les maladies du système nerveux et musculaire. Objectif 2: Déterminer l'impact de ces gènes sur les mécanismes de réparation de tissus (régénération). Objectif 3: Tester des molécules potentiellement thérapeutiques sur ces modèles pour identifier de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de mieux comprendre les gènes qui assurent le fonctionnement de nos neurones et de nos muscles, et plus généralement, de l’appareil locomoteur. Notre étude permettra surtout de mettre en avant les processus qui ont lieu au cœur de nos cellules, en regardant les compartiments qui sont à l'intérieur même de nos neurones ou de nos myocytes. Enfin, l'identification de nouveaux agents thérapeutiques permettra de mettre en place de nouveaux traitement pour les maladies qui affectent la capacités des patients à se déplacer.
Procédures
Les larves de 48 et 72heures post-fertilisations seront soumises à des injections cellulaires ou à des lésions des tissus locomoteurs (lésion du cartilage, de la moelle épinière ou de la nageoire caudale). Chaque intervention n'excèdera pas 15 minutes et sera effectuée sous anesthésie totale. Les procédures de lésion pourraient engendrer un défaut de locomotion transitoire qui perdurera de 2 à 3 jours avant réparation des tissus. Etant donnée les capacités régénératrices du poisson-zèbre, une récupération totale est observée entre 5 et 6 jours post-fertilisation. Au stade où la larve acquiert un comportement de chasse et de prise alimentaire, la locomotion de l’animal n’est donc plus altérée. Les différentes interventions seront effectuées sous anesthésie et les larves trop affectées par l’intervention sont mises à mort.
Impact sur les animaux
En mimant certaines pathologies humaines, la suppression ou la surexpression de nos gènes d’intérêt pourrait mener à la diminution de la locomotion de la larve, comme décrit chez les patients. Les différents modèles utilisés dans ce projet (mutants ou transgéniques), ne seront conservés au-delà de 6 jour post-fertilisation que si la prise alimentaire de l’animal n’est pas compromise. Toute apparition de point limite entrainera la mise à mort du poisson. La lésion de la moelle épinière et de la nageoire à 3 jours post-fertilisation pourraient entraîner une réduction transitoire de la locomotion chez la larve. Ce défaut ne devrait pas dépasser 6 jours post-fertilisation étant donnée les capacités de réparation tissulaire existant chez le poisson-zèbre. La lésion de la mâchoire quant à elle, ne devrait pas affecter la prise alimentaire de la larve au-delà de 6jours post-fertilisation.
Devenir
Afin de réduire au maximum le nombre de poissons utilisés dans notre étude, chaque procédure prendra fin avec la mise à mort de l'animal puis le stockage des tissus à -80°c pour des analyses ultérieures. Ceci permettra d'utiliser une même larve pour les procédures in vivo puis pour les analyses histologiques et biochimiques.
Remplacement
Afin de décrypter les pathologies qui affectent le système locomoteur, il est important d’utiliser un modèle qui modélise à la fois les systèmes nerveux, musculaires et cartilagineux, tout en reproduisant les interactions complexent qui les lient. Des modèles cellulaires seront utilisés autant que possible dans notre étude, mais nous seront contraints de faire appel à des modèles animaux pour prendre en compte l’appareil locomoteur dans son ensemble. Dans ce cadre, le modèle du Danio rerio représente la meilleure stratégie. L’utilisation de la larve de poisson-zèbre permet de remplacer l’utilisation de modèles mammifères, en ligne directe avec les recommandations des 3R. La caractérisation des nouveaux modèles de pathologies humaines proposée dans notre étude représente autant de nouveaux outils pour comprendre les désordres génétiques sans recourir aux modèles rongeurs.
Réduction
En travaillant sur le meilleur design possible pour notre étude, nous avons pu faire en sorte que chaque animal participe à plusieurs parties du protocole, via des approches non-invasives. Ainsi, nous pouvons, à partir d’une même larve, assurer le suivi de la morphologie globale de l’animal, l’analyse microscopique de ses tissus, le suivi locomoteur, puis l’étude biochimique après euthanasie des individus. Ceci permet de réduire drastiquement le nombre de larves utilisées dans le projet global.
Raffinement
Lors de notre étude, chaque procédure sera effectuée sous anesthésie, avant un retour rapide dans les conditions d'élevage. Après chaque intervention, un suivi quotidien des animaux sera effectué tout au long de l’étude. Les nourrissages manuels assurés chaque jour permettront une observation régulière de chaque individu tout au long des procédures pour détecter une altération de la nage ou de la prise alimentaire. La mise en place de points de contrôle et de critères d’arrêt bien définis permettra d’assurer le maintien des animaux dans les meilleures conditions.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre donne accès à de nombreuses procédures non-invasives pour suivre les structures locomotrices chez l’embryon et la larve (à la fois d’un point de vue anatomique et fonctionnel). De plus, le modèle est totalement adapté aux études thérapeutiques, aux suivis microscopiques et aux approches génétiques décrits dans le projet. En outre, l’utilisation du poisson-zèbre, notamment à l’état larvaire, permet de remplacer l’utilisation de modèles mammifères. Enfin, de par sa transparence et son développement externe, le poisson-zèbre représente un modèle unique pour visualiser ce qui se passe au cœur de nos cellules, pour explorer des processus impossibles à voir chez d'autres modèles. Pour l’étude de l’appareil locomoteur, les animaux seront étudiés entre 24 heures post-fertilisation et 6 jours post-fertilisation. Ceci permet de prendre en compte la totalité du développement de la mandibule et des structures neuromusculaires, et de considérer le temps nécessaire à leur régénération. Pour les gènes présentant une potentielle létalité développementale, le suivi sera prolongé jusqu’à 30 jours, stade auquel la plus part des défauts génétiques conduisent à la mort prématurée de la larve.
Utilisation du poisson zèbre pour l’étude des métastases EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une partie des poissons zèbres utilisés ici portent un vieillissement accéléré qui les amaigrit et les fait mourir prématurément, d'autres développent des mélanomes. 1 040 individus sont concernés, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et tous sont tués à l'issue. Les embryons reçoivent une injection de cellules tumorales 48 heures après la fécondation, puis passent jusqu'à deux heures par jour sous anesthésie pour être imagés pendant quinze jours, les adultes du troisième groupe étant intubés quatre heures toutes les deux semaines sur une période pouvant atteindre 52 semaines. Le porteur décrit chez les malades des œdèmes, des abcès, une nage dégradée et un éloignement des congénères, et justifie la mise à mort par la nécessité d'éviter que les tumeurs continuent de croître.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier les interactions entre les cellules tumorales circulantes et l'endothélium dans le réseau vasculaire, la sortie des vaisseaux de ces cellules et leur croissance métastatique. Il s'attache notamment à définir la contribution des facteurs sécrétés par les tumeurs et le rôle des cellules non cancéreuses (endothéliales, fibroblastiques et immunitaires) dans ces processus . L'embryon de poisson zèbre permet de visualiser les étapes précoces de la formation des métastases: sortie des vaisseaux sanguins (extravasation), invasion, prolifération dans l'animal vivant. Nous allons comparer le comportement de lignées de cellules tumorales de différentes origines et ayant différentes propriétés biomécaniques et déterminer leurs interactions avec différents composants de la circulation et de la niche métastatique (vaisseaux sanguins, plaquettes, globules rouges, macrophages, neutrophiles etc..). De plus, nous comptons évaluer le rôle de facteurs secrétés par les cellules tumorales, en particulier les vésicules extracellulaires, dans ces processus. Finalement nous allons déterminer si ces processus se déroulent de la même manière chez des poissons jeunes et chez des poissons ayant un vieillissement accéléré. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est d'accroitre les connaissances fondamentales sur les étapes précoces de la formation des métastases.
Procédures
Groupe 1: Une injection au stade embryonnaire (48 heures après fécondation). Durée 10 secondes (EU1). Imagerie non invasive au maximum une fois par jour (EU1). Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 2: Deux injections au stade embryonnaire (48 heures après fécondation) (EU1). Durée 10 secondes chacune. Imagerie non invasive au maximum une fois par jour (EU1). Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 3 Une injection au stade embryonnaire (au stade une cellule) (EU1). Durée 10 secondes. Photographie une fois par semaine au maximum (EU1), sous anésthésie. Imagerie par microscopie sous intubation avec anésthésie et analgésie, jusqu'à une fois toutes les deux semaines (EU2). Durée 4 heures. De 8 à 52 semaines maximum. Groupes 4 et 5: prélèvements d'un petit morceau de nageoire sur animaux anésthésiés pour génotypage (EU1).
Impact sur les animaux
Chez l'embryon ou la larves, on peut observer un retard de développement suite à l'injection, mais cela reste très rare. Les larves de moins de 15 jours peuvent souffrir de l'isolement. Chez l'adulte, la formation de mélanomes peut entrainer des changements de comportement généralement associés au stress ou à une maladie. Ceux-ci comprennent : une diminution de la qualité de la nage (moins droite et régulière, moins rapide), la formation d'abcès ou d'oedèmes, des difficultés de respiration (visibles par un rythme anormal de dilatation des branchies) ou de prise de nourriture. Les animaux malades peuvent également s'éloigner de leurs congénères. Le vieillissement accéléré conduit à un amincissement des individus et une mort prématurée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer des prélèvements et pour éviter que les tumeurs ne continuent à croître et entrainent plus de nuisances.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable à la réalisation de ce projet car il n'existe pas de modèle permettant de reproduire in vitro toute la complexité du microenvironnement entre le moment où la cellule tumorale quitte la circulation envahit un nouveau tissu et le colonise. Néanmoins, certaines étapes ou certaines interactions sont étudiées in vitro. Nous avons par exemple développé un système de microfluidique permettant de reproduire les interactions entre cellules tumorales soumises à un flux et cellules endothéliales. Nous utilisons également un modèle d'invasion en matrice de collagène in vitro, ainsi que des systèmes de co-culture cellules tumorales-cellules immunitaires. Nous utilisons des lignées de cellules tumorales dérivées de mélanome ou de carcinome mammaire.
Réduction
Nous utilisons des systèmes d'imagerie qui permettent un suivi longitudinal d’un même animal et donc une réduction du nombre total d’animaux nécessaires. Une étude exhaustive des données récentes de la littérature n'a pas permis d'identifier une équipe réalisant des expériences similaires ailleurs dans le monde. Nous avons établi le nombre d'animaux pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.
Raffinement
Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Un traitement analgésique et anesthésique est prévu avant imagerie des adultes. Les larves en procédure seront hébergés individuellement pour permettre leur suivi longitudinal. Les adultes en procédure seront hébergées en groupe de 10 à 20 pour conserver les interactions sociales essentielles à leur bien être. Les aquariums, en particulier lorsque les larves sont isolées, sont enrichis avec des fonds imprimés représentant des cailloux de rivières. Certains adultes sont isolés pendant 12h pour vérifier qu'ils récupèrent bien des séances d'imagerie. Dans ce cas, ils sont hébergés par 2, mais séparés par une vitre pour leur permettre de maintenir un contact visuel et réduire leur stress. Lors de leur transport, les animaux sont conservés dans leur eau d'origine et une fois arrivés sur place un temps de récupération est prévu.De plus larves et adultes seront nourris quotidiennement avec de la nourriture vivante, ce qui induit des comportements de chasse et augmente le bien être. Cet enrichissement est particulièrement important pour limiter le stress dans les rares cas où les animaux doivent être isolés (plaie ou blessure apparente). Tous les animaux utilisés sont obtenus par croisements sur place et sont donc habitués à notre animalerie.
Choix des espèces
Depuis quelques années, il apparait que la progression tumorale chez le poisson zèbre présente d'importantes similarités avec l'homme, d'un point de vue génétique et histologique. Par ailleurs, le poisson zèbre présente l'avantage, notamment par rapport à la souris, de permettre l'observation des tumeurs par imagerie non-invasive dans l'animal vivant. Nous avons récemment montré que des cellules de mélanomes de poisson zèbre sécrètent des vésicules extracellulaires très semblables à celles sécrétées par des lignées de mélanomes humaines (en morphologie et en contenu protéique). Nous avons également montré que nous pouvions suivre ces vésicules extracellulaires marquées par fluorescence dans l'embryon vivant. Nos expériences portent majoritairement sur les stades embryonnaires et larvaires, mais aussi sur les adultes pour certaines investigations.
Utilisation du poisson zèbre pour l’étude des métastases EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Injectés de cellules tumorales quarante-huit heures après la fécondation, des embryons de poisson zèbre passent ensuite une à deux heures par jour sous anesthésie et sous microscope, quinze jours durant, isolés dans leur bac. D'autres, injectés au stade d'une seule cellule, développent des mélanomes et sont imagés sous intubation pendant quatre heures, une fois toutes les deux semaines, de la huitième à la cinquante-deuxième semaine de vie. 1 040 poissons zèbres sont concernés, dont 60 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le porteur décrit chez les adultes malades une nage dégradée, des abcès, des œdèmes, des difficultés respiratoires et un éloignement de leurs congénères, et indique que le vieillissement accéléré provoque un amincissement et une mort prématurée. Tous sont tués en fin de procédure, pour les prélèvements et pour éviter que les tumeurs ne continuent à croître.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'étudier les interactions entre les cellules tumorales circulantes et l'endothélium dans le réseau vasculaire, la sortie des vaisseaux de ces cellules et leur croissance métastatique. Il s'attache notamment à définir la contribution des facteurs sécrétés par les tumeurs et le rôle des cellules non cancéreuses (endothéliales, fibroblastiques et immunitaires) dans ces processus . L'embryon de poisson zèbre permet de visualiser les étapes précoces de la formation des métastases: sortie des vaisseaux sanguins (extravasation), invasion, prolifération dans l'animal vivant. Nous allons comparer le comportement de lignées de cellules tumorales de différentes origines et ayant différentes propriétés biomécaniques et déterminer leurs interactions avec différents composants de la circulation et de la niche métastatique (vaisseaux sanguins, plaquettes, globules rouges, macrophages, neutrophiles etc..). De plus, nous comptons évaluer le rôle de facteurs secrétés par les cellules tumorales, en particulier les vésicules extracellulaires, dans ces processus. Finalement nous allons déterminer si ces processus se déroulent de la même manière chez des poissons jeunes et chez des poissons ayant un vieillissement accéléré. Le projet se déroule dans deux établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
L'objectif principal de ce projet est d'accroitre les connaissances fondamentales sur les étapes précoces de la formation des métastases.
Procédures
Groupe 1: Une injection au stade embryonnaire (48 heures après fécondation). Durée 10 secondes (EU1). Imagerie non invasive au maximum une fois par jour (EU1). Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 2: Deux injections au stade embryonnaire (48 heures après fécondation) (EU1). Durée 10 secondes chacune. Imagerie non invasive au maximum une fois par jour (EU1). Durée 1 à 2h, sous anésthésie. pendant 15 jours. Groupe 3 Une injection au stade embryonnaire (au stade une cellule) (EU1). Durée 10 secondes. Photographie une fois par semaine au maximum (EU1), sous anésthésie. Imagerie par microscopie sous intubation avec anésthésie et analgésie, jusqu'à une fois toutes les deux semaines (EU2). Durée 4 heures. De 8 à 52 semaines maximum. Groupes 4 et 5: prélèvements d'un petit morceau de nageoire sur animaux anésthésiés pour génotypage (EU1).
Impact sur les animaux
Chez l'embryon ou la larves, on peut observer un retard de développement suite à l'injection, mais cela reste très rare. Les larves de moins de 15 jours peuvent souffrir de l'isolement. Chez l'adulte, la formation de mélanomes peut entrainer des changements de comportement généralement associés au stress ou à une maladie. Ceux-ci comprennent : une diminution de la qualité de la nage (moins droite et régulière, moins rapide), la formation d'abcès ou d'oedèmes, des difficultés de respiration (visibles par un rythme anormal de dilatation des branchies) ou de prise de nourriture. Les animaux malades peuvent également s'éloigner de leurs congénères. Le vieillissement accéléré conduit à un amincissement des individus et une mort prématurée.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'effectuer des prélèvements et pour éviter que les tumeurs ne continuent à croître et entrainent plus de nuisances.
Remplacement
Le modèle animal est indispensable à la réalisation de ce projet car il n'existe pas de modèle permettant de reproduire in vitro toute la complexité du microenvironnement entre le moment où la cellule tumorale quitte la circulation envahit un nouveau tissu et le colonise. Néanmoins, certaines étapes ou certaines interactions sont étudiées in vitro. Nous avons par exemple développé un système de microfluidique permettant de reproduire les interactions entre cellules tumorales soumises à un flux et cellules endothéliales. Nous utilisons également un modèle d'invasion en matrice de collagène in vitro, ainsi que des systèmes de co-culture cellules tumorales-cellules immunitaires. Nous utilisons des lignées de cellules tumorales dérivées de mélanome ou de carcinome mammaire.
Réduction
Nous utilisons des systèmes d'imagerie qui permettent un suivi longitudinal d’un même animal et donc une réduction du nombre total d’animaux nécessaires. Une étude exhaustive des données récentes de la littérature n'a pas permis d'identifier une équipe réalisant des expériences similaires ailleurs dans le monde. Nous avons établi le nombre d'animaux pour obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes.
Raffinement
Des points limites ont été établis pour éviter toute souffrance animale. Un traitement analgésique et anesthésique est prévu avant imagerie des adultes. Les larves en procédure seront hébergés individuellement pour permettre leur suivi longitudinal. Les adultes en procédure seront hébergées en groupe de 10 à 20 pour conserver les interactions sociales essentielles à leur bien être. Les aquariums, en particulier lorsque les larves sont isolées, sont enrichis avec des fonds imprimés représentant des cailloux de rivières. Certains adultes sont isolés pendant 12h pour vérifier qu'ils récupèrent bien des séances d'imagerie. Dans ce cas, ils sont hébergés par 2, mais séparés par une vitre pour leur permettre de maintenir un contact visuel et réduire leur stress. Lors de leur transport, les animaux sont conservés dans leur eau d'origine et une fois arrivés sur place un temps de récupération est prévu.De plus larves et adultes seront nourris quotidiennement avec de la nourriture vivante, ce qui induit des comportements de chasse et augmente le bien être. Cet enrichissement est particulièrement important pour limiter le stress dans les rares cas où les animaux doivent être isolés (plaie ou blessure apparente). Tous les animaux utilisés sont obtenus par croisements sur place et sont donc habitués à notre animalerie.
Choix des espèces
Depuis quelques années, il apparait que la progression tumorale chez le poisson zèbre présente d'importantes similarités avec l'homme, d'un point de vue génétique et histologique. Par ailleurs, le poisson zèbre présente l'avantage, notamment par rapport à la souris, de permettre l'observation des tumeurs par imagerie non-invasive dans l'animal vivant. Nous avons récemment montré que des cellules de mélanomes de poisson zèbre sécrètent des vésicules extracellulaires très semblables à celles sécrétées par des lignées de mélanomes humaines (en morphologie et en contenu protéique). Nous avons également montré que nous pouvions suivre ces vésicules extracellulaires marquées par fluorescence dans l'embryon vivant. Nos expériences portent majoritairement sur les stades embryonnaires et larvaires, mais aussi sur les adultes pour certaines investigations.
Etude de l’initiation du cancer chez le poisson zèbre à partir d’une seule cellule, et criblage de molécules pharmacologiques à visée thérapeutique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
14 820 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, dont 10 500 larves pour cribler 500 molécules, à raison de deux doses par groupe de dix larves. Chacune passe quinze minutes par jour sous microscope pendant dix jours, immobilisée dans l'agarose ou anesthésiée, après une illumination aux ultraviolets proches qui active un oncogène dans une cellule unique. Les 720 fondateurs des lignées transgéniques sont conservés et renouvelés, tous les autres poissons étant tués pour analyser leurs tumeurs. Le porteur qualifie l'imagerie de non invasive et affirme qu'elle ne cause aucune souffrance particulière, tout en indiquant que les poissons développant un cancer ne survivent pas plus de quinze jours et que les molécules testées peuvent provoquer une nage erratique, des postures sur le flanc et la mort.
Objectifs
Le projet a pour but de réaliser des expériences de recherche fondamentale et translationnelle en cancérologie en mesurant la probabilité de cancérogénèse à partir d’une cellule mutée sur un oncogène, un gène dont l’expression favorise la survenue de cancers. Il s’agit de comprendre, dans un contexte physiologique, pourquoi certaines cellules développent une tumeur et d’autres non, d’identifier les marqueurs biologiques de la transformation maligne, et d’en suivre l’évolution en présence ou non de composés pharmacologiques à visée thérapeutique. Nous utilisons le modèle poisson-zèbre (Danio rerio), modèle utilisé dans l’étude de pathologies humaines, notamment le cancer. Transparent aux stades embryonnaires et larvaires, ce modèle permet l’utilisation de méthodes optiques pour contrôler l’expression de gènes (optogénétique) in vivo, et l’imagerie in vivo, pour suivre l’évolution de tumeurs locales. Ces méthodes sont non invasives. Nous avons mis au point une méthode qui permet la transformation maligne d’une cellule somatique, déjà différenciée et spécialisée, en cellule cancéreuse. Nous modifions l’homéostasie cellulaire, c’est-à-dire les paramètres physiologiques de la cellule, par l’expression photocontrôlée d’un oncogène muté et d’une protéine particulière qui confère à la cellule un potentiel de dédifférenciation. Nous utiliserons un système CRISPR/cas9 photoactivable (les fameux ciseaux moléculaires capables de modifier le génome en des endroits spécifiquement choisis), pour modifier l’environnement de la tumeur (c’est-à-dire modifer l’homéostasie des cellules qui entourent les cellules tulmorales) après l’invalidation ciblée de gènes, impliqués par exemple dans la réponse immunitaire ou le métabolisme énergétique. Dans ces différents contextes nous évaluerons la probabilité de développement de tumeurs par suivi en imagerie in vivo, à l’aide de rapporteurs fluorescents spécifiques, et en présence ou non de composés pharmacologiques. Après euthanasie, les tumeurs qui se seront développées seront analysées et comparées au tissu sain. Le projet devrait mener à l’identification de nouveaux biomarqueurs prédictifs du cancer et de substances pharmacologiques à visée thérapeutique prophylactique.
Bénéfices attendus
La caractérisation des étapes initiales de la transformation maligne d’une cellule in vivo permettra d’identifier des biomarqueurs de la cancérogénèse et son évolution depuis son initiation dans un contexte physiologique. Nous utiliserons des gènes dont les mutations sont associées à la survenue de cancers humains de mauvais pronostic, notamment des tumeurs du pancréas et du cerveau, observées dans notre modèle d’activation contrôlée. Ces biomarqueurs pourraient donc être prédicitifs du développement de tumeurs de mauvais pronostic chez l’humain. Le criblage de composés pharmacologiques devrait permettre l’identification de substances d’intérêt prophylactique et thérapeutique, pouvant conduire à un développement pharmacologique. Inversement, certains composés pourraient apparaître toxiques ou favorables au développement tumoral.
Procédures
Injection de constructions moléculaires pour la création de lignées transgéniques : intervention indolore sur œufs fécondés ne dépassant pas quelques secondes par œuf. Exposition à des temps courts d’illumination aux UV proches sur des larves immobilisées en agarose ou anesthésiées. Durée totale de la procédure : 5 à 10 minutes, réalisées 1 ou 2 fois par animal selon le protocole. Exposition à des faisceaux lumineux de différentes longueurs d’onde sous microscope (ou loupe binoculaire) pour prendre des images des larves anesthésiées. Durée totale de la procédure : 15 minutes par animal, une fois par jour pendant 10 jours. Exposition aux molécules pharmacologiques : 1 bain de 48h dès la photoactivation.
Impact sur les animaux
Nous anticipons les nuisances suivantes sur les larves de poissons zèbres : Toxicité potentielle des composés pharmacologiques testés, identifiés par des comportements anormaux (ex. nage erratique, postures sur le flanc), pouvant entraîner la mort des animaux selon les doses appliquées. Influence directe de certaines longueurs d’onde de lumière lors des séances d’imagerie : léger inconfort de courte durée.
Devenir
Les animaux fondateurs des lignées transgéniques permettant le contrôle par la lumière de l’expression de gènes d’intérêt seront conservés et renouvelés. Les animaux utilisés pour l’étude de la cancérogénèse à partir d’une cellule unique in vivo, et pour le criblage de molécules pharmacologiques à visée thérapeutique seront euthanasiés pour analyser les tumeurs qui se seront développées. Les tissus cancéreux seront comparés aux tissus restés sains.
Remplacement
Le projet nécessite l’utilisation de larves de poissons transgéniques, dont la peau est transparente, et qui expriment des protéines fluorescentes. Les tumeurs induites après illumination seront suivies par imagerie fluorescente sur plusieurs jours, voire plusieurs semaines. Toutefois, nos résultats actuels montrent que la survie des poissons développant les tumeurs, et par conséquent des cancers, ne dépasse pas 15 jours post-induction. Cette approche est la seule actuellement qui permet de caractériser l’initiation de la transformation maligne d’une cellule somatique et d’en suivre l’évolution en tumeurs et métastases, dans un contexte physiologique intégré. Les modèles de cultures cellulaires humaines ou animales in vitro en trois dimensions, peuvent amener au développement d’organes, mais sont souvent opaques (nécessitant la microscopie multi-photonique) et ne permettent pas d’étudier la relation entre la tumeur et son microenvironnement cellulaire sain, ni la progression tumorale et la motilité des cellules cancéreuses in vivo. D’autre part, et dans le cadre du criblage de molécules pharmacologiques d’intérêt thérapeutique, le modèle animal permettra d’apprécier la toxicité éventuelle des composés sur l’ensemble de l’organisme. Ainsi pourraient être identifiés des composés efficaces contre le développement tumoral, mais nocifs pour d’autres tissus sains. Cet aspect ne peut pas être évalué par l’utilisation de modèles in vitro.
Réduction
La mesure de la probabilité de cancérogénèse suite à l’activation d’un ou plusieurs oncogènes (gènes dont l’expression d’une mutation est associée à la survenue de cancers) dans des environnements génétiques et physiologiques différents nécessite des expériences sur un grand nombre d’embryons (plusieurs dizaines par essai) dans lesquels des oncogènes auront été exprimés globalement dans plusieurs dizaines de cellules (pour tester l’efficacité des constructions transgéniques et des oncogènes), et localement dans une (ou plusieurs) cellule(s) d’un embryon. 3600 larves de poissons seront utilisées pour cette expérimentation. Concernant le criblage de molécules pharmacologiques, une évaluation bibliographique de composés potentiellement pertinents sera réalisée pour le choix du panel de molécules à tester. Deux doses de chaque composé seront testées par groupe de 10 larves de poissons. Les tests seront organisés et groupés en fonction des pontes (100 à 300 œufs par couple) afin de minimiser les groupes contrôles nécessaires pour tester la viabilité des pontes et la toxicité du solvant des composés dans un batch d’œufs. Par exemple l’obtention de 500 œufs (2 à 4 couples) permettra de tester 20 composés à raison de 2 doses par groupe de 10 larves (400 larves) et d’obtenir au moins 2 groupes contrôle de 10 larves. 10500 larves de poissons seront utilisées pour le criblage de 500 molécules. Les embryons sur lesquels la photo-activation n’aura pas fonctionné, absence d’expresssion d’un rapporteur fluorescent dans les 24h suivantes, seront euthanasiés pour n'élever que le nombre minimal d'embryons nécessaires aux expériences. Les larves, après la fin des expériences, seront immédiatement euthanasiées et utilisées pour les analyses post-mortem. La population de 720 poissons adultes fondateurs ne sera utilisée que pour produire des embryons et garder des lignées transgéniques et mutantes. Un nombre total de 14820 animaux est nécessaire à la réalisation du projet.
Raffinement
Nous utilisons des techniques d'imagerie, méthode non invasive, sur des larves intactes de Danio rerio. Ceci ne cause aucune souffrance particulière aux larves. De plus, nous manipulons les larves avec une extrême précaution, car nos projets de contrôle de l’expression de gènes par la lumière exigent le minimum de perturbation et une grande précision pour récolter des données fiables. Afin de respecter le bien-être des animaux les manipulations aux stades larvaires et adultes se feront sous anesthésie. Les animaux seront suivis individuellement, mais élevés en groupe afin de respecter leur instinct grégaire. Une surveillance quotidienne de leur comportement permettra de prévenir des états de souffrance (mobilité, nage erratique, prostration, isolement, etc.). Les animaux developpant des tumeurs, soit au point limite de l’expérience, ou après identification d’un état de souffrance seront euthanasiés.
Choix des espèces
Le projet de l'équipe consiste à étudier les étapes la cancérogénèse à partir d’une seule cellule. L’environnement génétique, physiologique et immunitaire jouant un rôle crucial dans ces étapes initiales et très peu étudiées de la cancérogénèse, il est impératif d’utiliser un modèle animal. Par ailleurs la nécessité d’obtenir une statistique significative sur des événements rares nous oriente vers un organisme capable de générer des centaines de larves identiques. Pour ces raisons, Danio rerio s’est imposé ces dernières années comme modèle animal de choix en cancérogénèse. La complexité du développement tumoral ne nous permet pas encore l'utilisation de modèles in silico. Notre projet implique l'analyse des relations entre cellules normales, cellules mutées, environnement tissulaire et fond génétique. L'utilisation de modèles in vitro ne peut donc pas être envisagée à ce stade. Les larves de poissons zèbre sont utilisées entre 1 et 9 jours après fertilisation car, à ce stade de développement, l'alevin peut respirer par diffusion de l'oxygène à travers la peau. Il est alors possible de les immobiliser dans l'agarose sans risque d'asphyxie et de photo-activer localement oncogènes et protéines responsables de la cancérogénèse. Les animaux ayant développé une tumeur seront suivis jusqu’au point limite de l’expérience défini, puis euthanasiés.
Etude chez le poisson zèbre des effets des polluants sur les stades précoces du développement des leucémies
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
1 215 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Exposés à des polluants entre deux et cinq jours après la fécondation, ils sont ensuite élevés jusqu'à trois ou six mois, puis tués pour prélever les cellules de leur moelle et y chercher une multiplication de clones sanguins, stade très précoce d'une leucémie. Le porteur affirme ne pas pouvoir dire à l'avance s'il y aura des nuisances ni lesquelles, et dépose sa demande par précaution, tout en soutenant que cette multiplication clonale est indolore. Il juge le recours à l'expérimentation animale "indispensable" et écrit qu'il est "généralement admis" que l'utilisation de poissons soulève moins de préoccupations éthiques que celle de mammifères.
Objectifs
Des clusters de leucémies pédiatriques font suspecter que des polluants environnementaux pourraient jouer un rôle dans la transformation oncogénique de cellules hématopoïétiques. L’objectif de notre projet est de déterminer si certains polluants environnementaux contribuent à la genèse de leucémies dans un modèle expérimental utilisant le poisson zèbre (Danio rerio). L’utilisation de la lignée de poissons zèbres (PZ) Zebrabow permet de détecter une amplification clonale de cellules du sang, ce qui correspond à un stade très précoce de la transformation leucémique.
Bénéfices attendus
La mise en évidence d’effet pro-leucémique de polluants chez le poisson zèbre fournira un argument important pour limiter l’exposition des populations humaines. Nos données scientifiques pourront ainsi être utilisées par les instances de régulation pour limiter l'exposition des populations à certains polluants afin de prévenir la survenue de cancers.
Procédures
Les larves seront exposées aux polluants environnementaux de 2 à 5 jours après fertilisation. Les animaux seront surveillés quotidiennement pour veiller à leur bien-être. Ils seront euthanasiés à 3 ou à 6 mois.
Impact sur les animaux
Nous cherchons à mesurer une amplification clonale des cellules sanguines chez les PZ exposés aux polluants, ce phénomène n’entraîne pas d’effet nuisible pour l’animal. En effet l’amplification clonale des cellules du sang est un phénomène indolore qui survient naturellement au cours du vieillissement. Les tests de toxicité seront réalisés sur les formes larvaires (2-5 jpf). Ceux-ci seront nécessaires pour déterminer les concentrations non-toxiques ; seules les doses sub-toxiques (n'entrainant ni mortalité, ni malformation des larves évaluées à 5 jpf), seront utilisées pour déterminer leur effet sur l’expansion des clones chez les animaux plus âgés. Les animaux seront exposés aux substances toxiques entre 2 et 5 jpf, puis élevés en conditions normales jusqu'à 3 ou 6 mois. La raison de cette DAP repose sur la possibilité que des effets néfastes sur la santé des poissons se développent au delà de 5 jpf. Nous ne pouvons pas indiquer à priori s'il y aura des nuisances et quelle sera leur nature et c'est par précaution que nous déposons cette DAP. L'euthanasie des animaux sera réalisée, après anesthésie, par exposition à des doses létales d’anesthésique.
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever les cellules de moelle hématopoïétique pour réaliser les analyses des populations de cellules sanguines en cause dans le développement de leucémies.
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est indispensable pour évaluer l'effet de substances chimiques sur le développement des stades précoces des leucémies. Toutefois l'utilisation de modèle poisson zèbre reste une alternative préférable à l'usage de modèles rongeurs pour étudier l'effet des polluants sur l'incidence des leucémies. Bien que cela puisse être discuté, il est généralement admis que l'utilisation de poissons dans la recherche soulève moins de préoccupations éthiques que celles associées à l'utilisation de mammifères.
Réduction
Les plans expérimentaux ont été conçus de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés en vue de l'obtention de résultats significatifs et d'éviter les réplicats inutiles. La détermination du nombre d'animaux nécessaires par groupe se base sur des études antérieures.
Raffinement
Les études seront conduites en respectant scrupuleusement les normes en matière de soins des animaux et d'évaluation de la souffrance animale (qui ne devrait pas être causée par nos expérimentations). Les animaux seront maintenus dans des installations récentes et agréées pour assurer leur confort (qualité de l'eau, accès à la nourriture, température, cycle jour/nuit, nombre de poissons par bac...). Nous utiliserons la grille de points limites chez le poisson, présentée en annexe I, pour identifier les animaux à retirer de l'expérimentation et à euthanasier.
Choix des espèces
Bien qu'ayant un degré d'évolution moindre que celui des mammifères, le PZ possède néanmoins un fort degré de conservation avec l'humain, partageant avec lui 70% de son génome et une grande similitude physiopathologique. Le PZ est particulièrement pertinent pour modéliser les phénomènes de leucémogenèse. En effet le système hématopoïétique, ses étapes de développement au cours de l'embryogenèse et les mécanismes moléculaires qui le régulent, sont extrêmement bien conservés entre l'humain et le PZ. On retrouve ainsi chez le PZ toutes les lignées cellulaires du sang : érythroïde, myéloïde (macrophage, monocyte, granulocytes), lymphoïde (B et T), et thrombocytaire (équivalent des plaquettes). Le PZ a de ce fait été utilisé pour modéliser de multiples leucémies myéloïdes ou lymphoïdes humaines ainsi que des myélodysplasies ou syndromes myéloprolifératifs. Les animaux seront utilisés dès les premiers jours après fertilisation des œufs, ce qui correspond au début du développement du système sanguin chez le poisson. Nous exposerons les poissons aux polluants aux stades embryonnaires (entre 2 et 5 jours post fertilisation) afin de mimer l'exposition humaine pendant la grossesse. Nous analyserons ensuite les poissons adultes (à 3 et 6 mois d'âge) lorsqu'il est possible de prélever les cellules de moelle sanguine, et afin de laisser le temps à l'effet inducteur de leucémies des polluants de se manifester
Evaluation de gènes candidats dans des modèles de mélanome dans le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Les poissons qui montrent une nage modifiée, une respiration accélérée ou une apathie sont retirés et tués avant le terme prévu. 10 380 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacun subit un prélèvement de nageoire caudale sous anesthésie pour le génotypage, puis, dès l'apparition de la première tumeur, un suivi hebdomadaire pouvant inclure des photographies sous anesthésie, sur six à douze mois. Le porteur affirme que le poisson zèbre est une bonne alternative à la souris parce qu'il offre de meilleures possibilités de manipulation génétique, et tous les poissons sont tués au terme du suivi, qu'ils aient ou non développé une tumeur.
Objectifs
Le cancer est la première cause de mortalité en France et dans de nombreux pays. Malgré des progrès thérapeutiques importants au cours des 20 dernières années, le taux de survie à 5 ans des patients atteints de tumeurs solides demeure faible. Une compréhension approfondie des mécanismes d’initiation et de progression des cancers est nécessaire pour concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques. Une approche de ces mécanismes consiste à décrypter les anomalies génétiques dont l’accumulation est à l’origine des cancers. Leur description s’est beaucoup améliorée, notamment grâce à l’essor de technologies de séquençage appliquées aux tumeurs humaines. Cependant, certains cancers comme le mélanome, une tumeur agressive de la peau qui touche près de 10000 personnes par an en France, présentent un très grand nombre d’altérations génétiques. De plus, leur description ne peut se traduire par une meilleure compréhension des mécanismes tumoraux qu’à travers l’étude approfondie de la fonction biologique des gènes altérés. L'étude de l’influence de ces gènes sur le développement des tumeurs nécessite le recours à des modèles in vivo qui reflètent l'évolution du cancer au cours du temps. L’objectif de ce projet est de tester dans des modèles de mélanome dans le poisson zèbre le rôle de 5 gènes candidats fréquemment altérés dans les mélanomes humains et pour lesquels des indications in vitro suggèrent qu’ils pourraient réguler l’initiation et la progression des tumeurs. Le poisson zèbre est un vertébré particulièrement utile pour l’étude de la génétique du cancer et plusieurs modèles très fiables de mélanome sont disponibles. Ces modèles seront utilisés pour évaluer les conséquences de l’expression ou de l’inactivation des gènes candidats sur la survenue des tumeurs et sur leurs caractéristiques. L’expression et l’inactivation de gènes proposées ici sont restreintes à certaines cellules de la peau et ne sont donc pas censées induire de pathologies autres que la formation de mélanomes à l’âge adulte. Les études présentées ici devraient permettre de découvrir la fonction de nouveaux gènes impliqués dans le développement du mélanome humain et pourraient révéler de nouvelles vulnérabilités des cellules cancéreuses permettant d’ouvrir des perspectives thérapeutiques innovantes.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de découvrir de nouveaux gènes impliqués dans l’initiation et la progression du mélanome. La compréhension de leur mécanisme d’action pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques contre ces tumeurs.
Procédures
Le génotypage des poissons implique un prélèvement unique sous anesthésie d’une petite partie de la nageoire caudale qui repousse dès la première semaine. La procédure ne dépasse pas 2 minutes. A partir de l’apparition de la première tumeur, les poissons sujets au développement de tumeurs seront soumis à une observation hebdomadaire et individuelle. Pour suivre l’évolution des tumeurs, une documentation photographique pourra être réalisée sous anesthésie au plus une fois par semaine. Le suivi des poissons sera réalisé sur une durée de 6 à 12 mois en fonction du génotype des tumeurs, après quoi tous les poissons seront mis à mort, qu’ils aient ou non développé une tumeur.
Impact sur les animaux
La procédure de génotypage peut induire un stress passager ainsi qu’une modification temporaire de la nage due au prélèvement d’un fragment de nageoire. Certains animaux peuvent présenter des signes de stress ou de mal-être dus au développement de tumeurs primaires. Les signes les plus précoces et les plus légers comprennent des modifications de la nage, une respiration accélérée ou une apathie passagère. Pour éviter toute souffrance, les animaux seront observés au moins 2 fois par semaine et des points limites précoces ont été mis en place. La manipulation des poissons pour le comptage des tumeurs et pour la prise de photos introduit un stress supplémentaire.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure.
Remplacement
Des modèles de croissance et de prolifération cellulaires in vitro sont utilisés à chaque fois que cela est possible, notamment pour les analyses du mécanistique d’action des gènes d’intérêt. Cependant, les lignées cellulaires de cancers humains modélisent mal les étapes précoces de l’initiation tumorale et d’évolution temporelle des tumeurs. La plupart des lignées cellulaires de mélanome humain proviennent de métastases, donc de stades tumoraux avancés, et se sont adaptées à leurs conditions de culture in vitro. Les méthodes alternatives telles que la culture en 3D ont aussi été envisagées mais ne peuvent à l’heure actuelle reproduire la complexité chimique, biologique et physique d’un organisme vivant pour étudier le comportement des cellules dans un environnement physiologique.
Réduction
Dans un but de réduction, l’analyse des caractéristiques biologiques des tumeurs sera réalisée sur le même groupe d’animaux que la mesure de leur vitesse d’apparition. Dans la mesure du possible, les manipulations génétiques seront en outre regroupées au maximum de manière à mettre en commun les groupes témoins et réduire ainsi le nombre total d’animaux utilisés. Des analyses statistiques a priori basées sur notre expérience du type de manipulations proposées ont permis d’établir les nombres minimums d’animaux nécessaires pour observer des différences significatives.
Raffinement
La souffrance éventuelle associée au développement de tumeurs peut être prévenue par une surveillance attentive des animaux et l’application de points limites définis, facilités par notre connaissance du modèle. Les poissons sujets au développement de tumeurs seront observés au moins deux fois par semaine à la recherche de signes ou de changements de comportement précoces et prédictifs de la maladie. Le stress éventuel pourra être réduit par le recours à l’anesthésie lors des manipulations de génotypage et de documentation photographique. Dans un souci de raffinement, les poissons seront également nourris une fois par jour avec des artémias pour préserver leurs instincts prédateurs et enrichir leur milieu.
Choix des espèces
Le poisson zèbre représente un organisme modèle particulièrement adapté à l'étude de la génétique du cancer. Les gènes impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'homme et le poisson et nous disposons de très bons outils pour reproduire les altérations génétiques trouvées dans les tumeurs humaines spécifiquement dans certains types de cellules dans les poissons adultes. C’est ainsi qu’ont été générés des modèles très fiables de mélanome dans le poisson zèbre. Des espèces d'animaux invertébrés pourraient être envisagées mais leurs organes diffèrent considérablement de ceux de l’homme, ce qui limite leur utilité pour l’étude du cancer. Le poisson représente une bonne alternative à la souris parce qu'il offre d'excellentes possibilités de manipulation génétique pour tester l'influence de gènes particuliers sur le développement tumoral.
Prélèvement de tissus pour sélection génétique et identification de lignées Poisson-zèbre
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Pêchés à l'épuisette, anesthésiés par balnéation, amputés d'un morceau de nageoire caudale en cinq minutes, 3 750 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le prélèvement sert à génotyper des lignées génétiquement modifiées et à repérer celles qui portent la combinaison de gènes attendue. Le porteur affirme que la nageoire se régénère complètement en vingt jours et que la douleur au réveil reste légère, et il pratique aussi ce prélèvement sur des larves de trois jours. 2 812 poissons au bon génotype sont gardés comme géniteurs, les 938 autres sont mis à mort.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de garantir la sélection et l’identification par génotypage de lignées de "poisson-zébre" génétiquement modifiées, à phénotype non dommageable.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est l’optimisation des effectifs des animaux et la gestion des élevages d’animaux génétiquement modifiés nécessaires aux expérimentations des chercheurs. L'élevage de ces modèles permettra de valider de nouveaux traitements contre des maladies neurologiques.
Procédures
Après anesthésie par balnéation, un prélèvement de la nageoire caudale sera réalisé, ce prélèvement est limité au minimum de tissus nécessaire, la nageoire caudale est capable de régénération complète en 20 jours. Temps de la biopsie (anesthésie incluse): 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables suite au prélèvement de tissus de la nageoire caudale sont un stress léger au moment de la pêche par épuisette, de l’anesthésie et une douleur légère suite au réveil associée à la coupure. Ce projet a pour but de minimiser au maximum tout signe de nuisances.
Devenir
Les poissons présentant le génotype d'intérêt sont gardés et utilisés comme géniteurs, les animaux ne présentant pas la bonne combinaison de gènes seront mis à mort.
Remplacement
Le développement du modèle animal poisson-zèbre est pour nous un choix incontournable car l'étude des maladies humaines comme les maladies neurodégénératives nécessite de considérer l'organisme entier. Il n'existe pas de méthode de remplacement pour le génotypage des animaux.
Réduction
Les animaux produits, issus de ce projet, et utilisés en expérimentation font tous l’objet d’une analyse statistique pour permettre la détermination des lots expérimentaux et l’analyse des résultats. Chaque chercheur a défini ses outils et échantillons pour ses expérimentations qui sont évalués indépendamment. L’enjeu et l’objectif majeur d’une réduction consistent à optimiser les élevages et à limiter la surproduction d’animaux non utilisés dans les projets scientifiques. Pour cela, les chercheurs définissent et mettent en place les accouplements avec les zootechniciens pour des objectifs de production adaptés aux projets scientifiques. La production est suivie avec des rapports trimestriels avec des indicateurs de productivité adaptés. Chaque trimestre, la production peut donc être revue et réajustée. Elle sera réduite au strict besoin, limitant le nombre de prélèvements de tissus pour génotypage. Les effectifs pour chaque lignée sont discutés avec les utilisateurs, qui ont estimé leurs besoins par des méthodes statistiques. Nous nous appuyons également sur l’expérience zootechnique d’élevage, c’est-à-dire la variabilité individuelle des performances de reproduction. Afin d’améliorer nos pratiques, nous avons également mis au point un protocole de génotypage pour les larves de 3 jours, ce qui permet de sélectionner les animaux portant le génotype correct avant le stade de larve autonom. La croissance de la larve n’est pas altérée du fait des capacités de régénération de la queue en quelques jours. Le nombre d’animaux en élevage est donc réduit. Ce protocole à un stade précoce est limité au génotypage simple, sans séquençage des mutations, soit 1/4 des lignées.
Raffinement
Chez le poisson-zèbre, bien que la cicatrisation et la régénération des tissus de la queue soient rapides, les conditions d’isolement seront maintenues au strict minimum et les capacités de nage et de prise alimentaire seront contrôlées dès les premières heures après la biopsie. Une surveillance accrue au cours des 24h suivantes se fera en surveillant les points limites définis et validés avec la Structure du Bien Etre Animal: la prise alimentaire , le comportement de nage et l'activité globale .
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle incontournable pour la création de modèle de pathologie humaine. Son développement embryonnaire rapide et externe, permet de modifier facilement son génome qui présente plus de 70% d’homologie avec celui de l’homme. La possibilité d’étudier les mécanismes biologiques dès les stades larvaires permet de suivre en microscopie à fluorescence et en comportement sensori-moteur, le développement des maladies modèlisées. Ce modèle permet de tester et valider de nouvelles stratégies thérapeutiques, qui pourront être appliquées chez l’Homme. La procédure s'applique aux animaux adultes.
Maintien de lignées de poissons-zèbres génétiquement modifiées pour l’étude d’une maladie génétique affectant la coordination des mouvements.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Attrapés à partir de l'âge de deux mois, anesthésiés, amputés d'un fragment de nageoire caudale pour être génotypés, puis isolés jusqu'à 72 heures en attendant le résultat : 2 250 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Le projet porte sur l'entretien de lignées génétiquement modifiées pour l'étude d'une maladie humaine de la coordination des mouvements, dont les retombées thérapeutiques annoncées sont renvoyées à plus de cinq ans. Une quarantaine de reproducteurs et de reproductrices par lignée et par an sont gardés en vie jusqu'à 18 mois, puis remplacés tous les huit mois. Les autres sont tués pour ne pas garder d'animaux "non nécessaires" à la conduite du projet.
Objectifs
La maladie sur laquelle nous travaillons est une maladie génétique caractérisée par une dégradation progressive des fonctions sensorielles et motrices qui conduit à une perte des mouvements volontaires. Celle maladie est due à une diminution d’une protéine essentielle pour le bon fonctionnement des neurones. Plusieurs mutations ont été identifiées à ce jour, qui mènent à des symptômes différents d’un patient à l’autre. L'objectif de notre projet est de comprendre comment différentes altérations dans un même gène présentent des pathologies différentes. Nous utilisons des poissons-zèbres, un modèle particulièrement adapté à la recherche neurologique, car ils ont un système nerveux similaire à l’Humain et sont transparents au stade où nous allons les étudier. Dans notre projet, nous allons étudier des modifications génétiques chez ces poissons pour qu'ils produisent une protéine défectueuse équivalente à celle retrouvée chez les patients. De plus, nous utiliserons des poissons présentant une absence du gène en question, entraînant l'absence de la protéine. En comparant ces deux mutations chez le poisson zèbre, nous voulons mieux comprendre comment les altérations du gène associé à la maladie conduisent à la pathologie, dans le but ultime de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'acquérir des connaissances fondamentales sur la protéine associée avec cette maladie. Ces connaissances permettront la compréhension des mécanismes pathologiques, avec l'objectif à long terme (>5 ans) de développer des stratégies thérapeutiques ciblant ces mécanismes.
Procédures
Le maintien de lignées de poissons-zèbres implique de pouvoir identifier les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt. Ainsi, l’identification génétique (génotypage) des individus par prélèvement d’un morceau de nageoire caudale (
Impact sur les animaux
L’ensemble des progéniteurs de nos lignées seront des poissons porteurs sains. Cependant, un suivi régulier des poissons-zèbres sera effectué pour garantir l’absence de développement de phénotypes dommageables au fil du temps. Nous nous concentrons principalement sur les anomalies qui pourraient être liées à un système nerveux défectueux, comme d’anomalies de comportement (prostration, comportement de fuite) et d’une nage anormale dans l’aquarium (attitude de nage anormale, défaut de flottabilité). Lors du maintien de ces lignées, certains poissons zèbres seront amenés à subir un prélèvement d’un morceau de la nageoire caudale (
Devenir
Les animaux d’intérêts (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 18 mois. Les autres seront mis à mort afin de ne pas garder d’animaux non nécessaires à la conduite de ce projet.
Remplacement
Le projet vise à mieux comprendre comment les altérations dans notre gène d'intérêt retrouvées chez l’Homme entraînent différentes pathologies. Bien que la maladie affecte les neurones, on s'attend à ce que d'autres types de cellules entourant le neurone malade jouent un rôle important dans la pathologie. Les méthodes de culture cellulaire actuelles pour étudier cela en laboratoire ont des limites, car elles ne reproduisent pas fidèlement l'environnement complexe des tissus. Ainsi, nous nous tournons vers les embryons de poisson-zèbre comme alternative. Ils possèdent un système nerveux similaire à l’homme, avec tous les types de cellules, et ils sont déjà fonctionnels dès leur stade larvaire. De plus, nous pouvons les rendre transparents sans les endommager, ce qui facilite l'imagerie des processus biologiques en direct. En bref, le poisson-zèbre est un modèle approprié pour répondre à nos questions biologiques car il combine la complexité nécessaire avec la capacité d'observer les processus en direct.
Réduction
Le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de la nageoire caudale sera limité au minimum, en réalisant des prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres, afin de ne sélectionner que le nombre minimum de poissons zèbres porteurs sains nécessaires. Dès lors que le nombre de poissons d’intérêt sera atteint, les prélèvements seront interrompus. Pour le maintien des lignées, seuls les poissons zèbres porteurs sains nécessaires au maintien de chaque lignée seront conservés, ce qui correspond à une quarantaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. Les renouvellement des géniteurs/génitrices ne se feront tous les 8 mois afin de réduire le nombre d’animaux. Dès lors que le nombre d’animaux d’intérêt sera obtenu, les prélèvements de nageoire caudale pour génotypage seront interrompus.
Raffinement
Seul le strict minimum d’animaux nécessaires au maintien des lignées subira le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale. Le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale se fera uniquement sur des animaux anesthésiés et le temps d’isolement des poissons-zèbres pendant cette phase de caractérisation sera limitée au minimum en maintenant les animaux dans des bacs avec des séparateurs transparents afin qu’ils soient au minimum en couple le temps de la procédure. Les individus d’intérêt seront ensuite regroupés en fonction de leur génotype. Les poissons-zèbres conservés seront tous porteurs sains et ne présenteront pas de phénotype. Toutefois, une surveillance hebdomadaire pour détecter tout éventuelle anomalie du comportement des animaux sera réalisée. Des points limites précis et prédictifs ont été définis, et l’observation qu’un de ces points limites est atteint telles que blessures sur l’animal, anomalies de comportement (nage anormale, prostration au fond du bac...) conduira à la mise à mort de l’animal afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle privilégié pour l’étude des gènes et les protéines liés à la physiologie et aux maladies humaines en raison de la similitude fonctionnelle de ses gènes avec ceux de l'homme. Les embryons de poisson-zèbre partagent un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, incluant toutes les cellules pertinentes pour nos recherches. De plus, la transparence optique des embryons permet de suivre les processus biologiques dynamiques dans l'ensemble de l'organisme de manière non invasive. Les poissons présentant le bon génotype seront utilisés pour la reproduction lorsqu'ils atteindront la maturité sexuelle, généralement à l'âge de 3 ou 4 mois.
Création et maintien de lignées de poissons-zèbres génétiquement modifiés pour l’étude d’une maladie génétique affectant la coordination des mouvements.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 300 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, chacun subissant sous anesthésie le prélèvement d'un morceau de nageoire caudale, puis jusqu'à 72 heures d'isolement en attendant le résultat de son génotypage. L'objet est de créer et d'entretenir des lignées porteuses de mutations reproduisant une maladie humaine de la coordination des mouvements. Une quarantaine de géniteurs et génitrices par lignée sont gardés jusqu'à 18 mois, puis renouvelés tous les huit mois. Tous les autres sont tués, le porteur expliquant qu'il s'agit "de ne pas garder d'animaux non nécessaires à la conduite de ce projet".
Objectifs
La maladie sur laquelle nous travaillons est une maladie génétique caractérisée par une dégradation progressive des fonctions sensorielles et motrices qui conduit à une perte des mouvements volontaires. Celle maladie est due à une diminution d’une protéine essentielle pour le bon fonctionnement des neurones. Plusieurs mutations ont été identifiées à ce jour, qui mènent à des symptômes différents d’un patient à l’autre. L'objectif de notre projet est de comprendre comment différentes altérations dans un même gène présentent des pathologies différentes. Nous utilisons des poissons-zèbres, un modèle particulièrement adapté à la recherche neurologique, car ils ont un système nerveux similaire à l’Humain et sont transparents au stade où nous allons les étudier. Dans notre projet, nous allons introduire des modifications génétiques chez ces poissons pour qu'ils produisent une protéine défectueuse équivalente à celle retrouvée chez les patients. De plus, nous utiliserons des poissons présentant une absence du gène en question, entraînant l'absence de la protéine. En comparant ces deux mutations chez le poisson zèbre, nous voulons mieux comprendre comment les altérations du gène associé à la maladie conduisent à la pathologie, dans le but ultime de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'acquérir des connaissances fondamentales sur la protéine associée avec cette maladie. Ces connaissances permettront la compréhension des mécanismes pathologiques, avec l'objectif à long terme (>5 ans) de développer des stratégies thérapeutiques ciblant ces mécanismes.
Procédures
La création de lignées de poissons-zèbre implique de pouvoir identifier les animaux porteurs des modifications génétiques d’intérêt. Ainsi, l’identification génétique (génotypage) des individus par prélèvement d’un morceau de nageoire caudale (
Impact sur les animaux
L’ensemble des progéniteurs de nos lignées seront des poissons porteurs sains. Cependant, un suivi régulier des poissons-zèbres sera effectué pour garantir l’absence de développement de phénotypes dommageables au fil du temps. Nous nous concentrons principalement sur les anomalies qui pourraient être liées à un système nerveux défectueux, comme d’anomalies de comportement (prostration, comportement de fuite) et d’une nage anormale dans l’aquarium (attitude de nage anormale, défaut de flottabilité). Lors de la création de ces lignées, certains poissons zèbres seront amenés à subir un prélèvement d’un morceau de la nageoire caudale (
Devenir
Les animaux d’intérêts (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 18 mois. Les autres seront mis à mort afin de ne pas garder d’animaux non nécessaires à la conduite de ce projet.
Remplacement
Le projet vise à mieux comprendre comment les altérations dans notre gène d'intérêt retrouvées chez l’Homme entraînent différentes pathologies. Bien que la maladie affecte les neurones, on s'attend à ce que d'autres types de cellules entourant le neurone malade jouent un rôle important dans la pathologie. Les méthodes de culture cellulaire actuelles pour étudier cela en laboratoire ont des limites, car elles ne reproduisent pas fidèlement l'environnement complexe des tissus. Ainsi, nous nous tournons vers les embryons de poisson-zèbre comme alternative. Ils possèdent un système nerveux similaire à l’homme, avec tous les types de cellules, et ils sont déjà fonctionnels dès leur stade larvaire. De plus, nous pouvons les rendre transparents sans les endommager, ce qui facilite l'imagerie des processus biologiques en direct. En bref, le poisson-zèbre est un modèle approprié pour répondre à nos questions biologiques car il combine la complexité nécessaire avec la capacité d'observer les processus en direct.
Réduction
Afin de réduire au minimum le nombre de poissons de la génération fondatrice, une estimation préalable de l’efficacité des systèmes de modification génétique sera réalisée en amont sur des œufs de poisson zèbre de type sauvage à 24-48h heures post fécondation. Le nombre de poissons zèbres ayant à subir un prélèvement de la nageoire caudale sera limité au minimum, en réalisant des prélèvements par groupe de 16 poissons zèbres, afin de ne sélectionner que le nombre minimum de poissons zèbres porteurs sains nécessaires. Dès lors que le nombre de poissons d’intérêt sera atteint, les prélèvements seront interrompus. Pour le maintien des lignées, seuls les poissons zèbres porteurs sains nécessaires au maintien de chaque lignée seront conservés, ce qui correspond à une quarantaine de géniteurs mâles et de génitrices femelles par an et par lignée. Les renouvellement des géniteurs/génitrices ne se feront tous les 8 mois afin de réduire le nombre d’animaux. Dès lors que le nombre d’animaux d’intérêt sera obtenu, les prélèvements de nageoire caudale pour génotypage seront interrompus.
Raffinement
Seul le strict minimum d’animaux nécessaires à la génération et au maintien des lignées subira le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale. Le prélèvement d’un morceau de nageoire caudale se fera uniquement sur des animaux anesthésiés et le temps d’isolement des poissons-zèbres pendant cette phase de caractérisation sera limitée au minimum en maintenant les animaux dans des bacs avec des séparateurs transparents afin qu’ils soient au minimum en couple le temps de la procédure. Les individus d’intérêt seront ensuite regroupés en fonction de leur génotype. Les poissons-zèbres conservés seront tous porteurs sains et ne présenteront pas de phénotype. Toutefois, une surveillance hebdomadaire pour détecter tout éventuelle anomalie du comportement des animaux sera réalisée. Des points limites précis et prédictifs ont été définis, et l’observation qu’un de ces points limites est atteint telles que blessures sur l’animal, anomalies de comportement (nage anormale, prostration au fond du bac...) conduira à la mise à mort de l’animal afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle privilégié pour l’étude des gènes et les protéines liés à la physiologie et aux maladies humaines en raison de la similitude fonctionnelle de ses gènes avec ceux de l'homme. Les embryons de poisson-zèbre partagent un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, incluant toutes les cellules pertinentes pour nos recherches. De plus, la transparence optique des embryons permet de suivre les processus biologiques dynamiques dans l'ensemble de l'organisme de manière non invasive. Les poissons présentant le bon génotype seront utilisés pour la reproduction lorsqu'ils atteindront la maturité sexuelle, généralement à l'âge de 3 ou 4 mois.
Raffinement de la chirurgie cardiaque chez le poisson-zèbre
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Mettre au point un protocole de chirurgie cardiaque que la communauté scientifique pourra réutiliser suppose d'abord de blesser des cœurs. 610 poissons-zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit sous anesthésie l'ablation ou la brûlure par le froid d'environ 20 % de l'extrémité du muscle cardiaque, reste deux minutes hors de l'eau, puis récupère six heures en isolement, une partie passant cinq séances d'échographie sous anesthésie jusqu'à soixante jours. Le porteur affirme qu'aucune alternative au poisson-zèbre n'existe pour ce travail, dont le produit final est un protocole standardisé mis à disposition des laboratoires.
Objectifs
Depuis la première démonstration de la capacité de régénération complète du cœur du poisson-zèbre suite à une lésion en 2002, bien que largement utilisé par la communauté scientifique s’intéressant à ce phénomène, le protocole de lésion mis-en œuvre sur le poisson-zèbre n’a que très peu évolué. En parallèle, durant ces 20 dernières années, les connaissances sur la perception de la douleur chez les téléostéens, poissons dits « évolués », ainsi que la prise de conscience éthique de la nécessité de prise en charge de la souffrance animale ont grandement avancé. Il apparaît aujourd’hui impératif d’apporter un protocole robuste, éthiquement compatible avec les obligations réglementaires, apportant une réelle prise en charge de la douleur lors des interventions chirurgicales via l’utilisation systématique d’analgésiques, mais également en apportant un environnement et un contrôle des paramètres post-opératoires efficaces, favorisant une récupération optimale des poissons-zèbres. Il est également essentiel de démontrer que la mise en œuvre de ce protocole amélioré ne rentre pas en interaction avec les mécanismes de la régénération cardiaque déjà démontrés. Enfin, il existe une variabilité potentiellement importante entre les individus d’un même lot expérimental, et également lors de la réalisation des chirurgies, dépendantes du manipulateur. L’utilisation de l’échographie/photo-acoustique à haute résolution, une technique non-invasive de caractérisation de la fonction cardiaque, permettra d’évaluer cette variabilité et d’identifier des individus non-compatibles avec la procédure (par exemple avec un défaut cardiaque), tout en évaluant l’étendue du dommage cardiaque initial. Afin d’avoir accès à un équipement de haute technologie, le projet sera réalisé sur 2 établissements utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Bien que largement utilisé par la communauté scientifique dans le cadre des recherches sur la régénération cardiaque depuis plus de 20 ans, il n’existe pas aujourd’hui de protocole standardisé de chirurgie prenant en compte la gestion de la douleur chez le poisson-zèbre. Notre projet aboutira à la mise à disposition de la communauté d’un protocole standardisé de chirurgie cardiaque, proposant une prise en charge efficace de la douleur via l’utilisation d’un cocktail analgésique / anesthésique, et la mise en place de mesures de raffinement (environnement per- et post-opératoire) adaptée à une récupération optimale des animaux après la chirurgie. En complément, la mise au point du suivi de la régénération cardiaque par échographie permettra de diminuer le nombre de poissons nécessaires dans les protocoles de lésion du myocarde. Chaque poisson pourra être suivi individuellement au cours du temps nécessaire à la régénération et être son propre contrôle, améliorant également la robustesse des résultats.
Procédures
Les interventions chirurgicales seront réalisées dans l'EU1 : une simulation d’infarctus cardiaque sera réalisée chirurgicalement sur les poissons, en effectuant une lésion mécanique ou par le froid d'une petite partie de l'extrémité du muscle cardiaque.; une chirurgie sous anesthésie générale de 2 minutes sera réalisée. Au sein de l'EU2, une partie des poissons-zèbres passera en échographie cardiaque sous anesthésie générale : 5 séances de 5 à 10 minutes maximum maintenus immobiles dans un bain d’anesthésique.
Impact sur les animaux
La chirurgie sera réalisée sous anesthésie, le poissons seront maintenus hors de l’eau pour une durée de 2 minutes. Une ablation de l’extrémité du muscle du cœur de l’ordre de 20% ou bien une lésion par le froid de cette même zone sera réalisée. La zone d’incision présentant une implantation musculaire faible chez le poisson et une absence de plexus osseux, la douleur perçue pendant et après la procédure chirurgicale est estimée modérée. La faible hémorragie consécutive à la résection peut entrainer une légère hypoxie durant les quelques minutes suivant le réveil. Les animaux seront socialement isolés durant la période de récupération (6 heures). Les animaux suivis par échographie seront anesthésiés 5 fois à J-1, J7, J15, J30 et J60 afin suivre la régénération du cœur.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des histologies et evaluer la régénaration cardiaque.
Remplacement
Les mécanismes de régénération du myocarde sont très complexes, impliquant la participation de nombreux types cellulaires différents. Le développement des techniques alternatives d’organoïdes actuelles s’attache aux modèles mammifères qui ne présentent malheureusement pas cette capacité régénérative. Il n’y a pas aujourd’hui à notre connaissance d’alternative à l’utilisation de poisson-zèbre pour la mise en œuvre de ce projet.
Réduction
L’évaluation du nombre d’animaux s’appuie sur nos précédents travaux publiés qui nous ont permis de réduire efficacement le nombre d’animaux nécessaires. La procédure « échographie » au cours de laquelle chaque individu sera son propre contrôle permet d’autant plus la réduction du nombre d’animaux nécessaires au projet. Les études longitudinales en échographie vont permettre de s'assurer de la qualité des interventions chirurgicales, la dynamique de régénération de chaque poisson pouvant être évaluée avec des tests paramétriques aux différents étapes des procédures.
Raffinement
L’objectif principal de notre projet est d’apporter des éléments majeurs de raffinement au protocole de chirurgie cardiaque communément mis-en-œuvre chez le poisson-zèbre, et au suivi post-opératoire. Une attention maximale sera portée aux conditions environnementales (maitrise de l’asepsie, des paramètres physico-chimique), à la prise en charge efficace de la douleur post-opératoire, et l’observation des animaux avec la mise en place d’une grille de score étudiée spécifiquement pour ce projet, nous permettant d’estimer l’atteinte d’un point limite de manière précoce, et nous permettant de mettre en œuvre les mesures adaptées à la prise en charge de la souffrance des animaux. Afin de limiter le stress au maximum, le transport des animaux entre les 2 sites sera réalisé dans une boite en polystyrène afin de maintenir une température optimale pendant les 450m séparant les 2 établissements. Les poissons seront placés individuellement dans des contenants hermétiques et adaptés au transport. Le transport n’excédera pas 10min.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est devenu au cours des dernières décennies l’espèce-modèle aquatique de prédilection en recherche scientifique, représentant désormais plus 5% des animaux utilisés à des fins scientifique en Europe. Le génome du poisson-zèbre présente 70% d’homologie avec le génome humain (estimé à 85% pour les gènes impliqué dans des pathologies), le poisson-zèbre dispose également d’une capacité originale de régénération cardiaque, ces éléments en font un modèle idéal pour la compréhension des mécanismes à l’œuvre dans la régénération cardiaque, pouvant aboutir à l’identification de pistes thérapeutiques majeures transposables chez l’homme. Les poissons utilisés seront tous des adultes matures sexuellement, âgés de 6 à 18 mois. Les mécanismes de régénération ne peuvent être étudiés que sur des animaux ayant terminé leur développement.
Utilisation du modèle poisson-zèbre pour évaluer l’efficacité des nanovecteurs ciblant le cancer.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Pour tester des nanoparticules activées par laser contre le cancer, 7 200 poissons zèbres sont utilisés au stade larvaire dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque larve reçoit une injection de cellules cancéreuses humaines sous anesthésie à deux jours de développement, puis une injection de nanoparticules dans la veine caudale à quatre jours, avant une heure d'anesthésie pour l'observation au microscope confocal et une irradiation laser. Le porteur signale que la croissance tumorale peut provoquer des œdèmes et modifier la mobilité. Toutes les larves sont tuées à l'issue, les expériences devant être arrêtées avant le stade de larve autonome capable de s'alimenter, et l'effectif de 7 200 individus n'est rapporté à aucun calcul.
Objectifs
Actuellement, les campagnes de dépistage ainsi que les progrès technologiques permettent de détecter des cancers de petite taille. Cependant, les traitements proposés ne sont pas toujours adaptés. Dans ce contexte, la thérapie focalisée utilisant des nanoparticules biodégradables, ciblées et par un laser infrarouge peut répondre à ce besoin médical. En effet cette stratégie thérapeutique peu invasive peut permettre de visualiser et traiter un cancer solide de petite taille tel que le rétinoblastome ou le cancer de la prostate. Ce projet concerne le développement de nanoparticules pour une thérapie combinée anti-cancéreuse. Ces nanoparticules peuvent être activées par illumination laser et libérer des facteurs permettant d’inhiber l’expression de protéines impliquées dans le développement de cancer. L'efficacité de ces nanoparticules sera testée sur le modèle de poisson-zèbre.
Bénéfices attendus
Avec ce projet, nous pourrons rapidement définir, grâce à l'utilisation du modèle du poisson-zèbre, les critères nécessaires pour obtenir la meilleure efficacité de ces nanoparticules permettant à la fois le diagnostic et la thérapie: cibler les cellules du cancer et administrer des médicaments anticancéreux. Notre projet pluridisciplinaire correspond à des approches transversales basées sur la synthèse de matériaux et procédés nouveaux et innovants tels que les nanoparticules capables de réaliser de l'imagerie, la thérapie sous irradiation à deux photons et l’inhibition de gène. A long terme, cette première étape préclinique permet de poser les bases pour une application en thérapie humaine.
Procédures
Tout d’abord, des cellules cancéreuses seront injectées sous anesthésie au stade embryonnaire, durée de l'injection 3 minutes. Par la suite, les nanoparticules seront injectées également sous anesthésie chez les mêmes larves à 4 jours de développement par la veine caudale, durée de l'injection 5 minutes. Le ciblage des cellules cancéreuses par les nanoparticules sera observé par microscopie confocale, ce qui implique une anesthésie d'une heure pour la prise d'image et un réveil juste après l'observation. L’efficacité sera évaluée par la résorption des cellules cancéreuses après activation des nanoparticules par rayonnement laser. Bien entendu, l’efficacité de ces nanoparticules sera préalablement établie sur des cellules en culture. Aucun prélèvement ne sera effectué sur les animaux vivants.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont liés à une croissance exagérée des cellules tumorales, ce qui pourrait induire des œdèmes et un changement de mobilité. Cependant, le suivi quotidien des animaux entre 2 et 5 jours de développement permettra de stopper les expériences dans ce cas avant le stade de larves autonomes et la prise alimentaire.
Devenir
A la fin de chaque procédure (irradiation biphotonique et observation au microscope), toutes les larves seront mises à mort et utilisées pour l'analyse des cellules tumorales et des tissus.
Remplacement
Les premières expérimentations sur des cellules tumorales en culture ont d’ores et déjà été réalisées. Les nanoparticules activées par rayonnement laser ont montré une efficacité intéressante en thérapie ciblée. Cependant, les expériences sur cellules en culture ne permettent pas de de suivre le devenir des nanoparticules (bio-distribution) et l’efficacité de ciblage tumoral. Pour cela l’expérimentation animale in vivo, en l’occurrence le poisson-zèbre, devient une étape indispensable et non remplaçable.
Réduction
Avant toute expérimentation avec les larves de poisson-zèbre, des mises au point des conditions expérimentales seront réalisées sur des cellules en culture afin de choisir les nanoparticules qui ne présentent pas de toxicité et qui ont une meilleure activité. Ainsi, nous pourrons choisir les nanoparticules les plus efficientes et réduire par conséquent le nombre de larves à utiliser.
Raffinement
Un suivi quotidien est réalisé dès le début de la procédure et les points limites surveillés plusieurs fois par jour. Dès l'apparition de ces points limites, l'expérience sera interrompue et les larves seront mises à mort avec une surdose d'anesthésique pour éviter toute souffrance des animaux.
Choix des espèces
Le modèle poisson zèbre présente des avantages en cancérologie ; robustes, reproductibles, faciles d’utilisation et peu coûteux. Il constitue un modèle de choix puisqu’il offre la possibilité de criblage de composés dans un organisme vertébré entier, dont la pertinence est incomparable avec des modèles in vitro de cultures cellulaires. Les animaux utilisés pour ces travaux seront des embryons de poisson-zèbre au cours des premiers stades de leur développement (2 jours post-fécondation) afin de permettre l’implantation de cellules tumorales humaines sans impliquer de phénomène de rejet et suivre la formation des tumeurs et leur traitement après injection des nanoparticules ciblant les cellules tumorales. Ces expérimentations peuvent être menées jusqu'à 15 jours post-fécondation. La procédure décrite implique des stades précoces de larves de poisson-zèbre, permettant ainsi de faire des premières expérimentations précliniques.
Génotypage de poissons zèbres, sans phénotype dommageable, pour l’étude de mécanismes impliqués dans un type de mémoire , l’habituation.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
8 000 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. À deux mois, chaque poisson est anesthésié à la tricaïne par balnéation, puis une extrémité de sa nageoire caudale est coupée sur une surface inférieure à 0,25 mm², en moins de deux minutes. L'objectif déclaré est de repérer les poissons hétérozygotes pour organiser les croisements, les expériences sur la mémoire portant ensuite sur des larves de moins de cinq jours, hors du champ réglementaire. Seuls les hétérozygotes sont gardés vivants pour la reproduction, tous les autres génotypes sont tués, et tout poisson présentant un trouble de la flottabilité, une immobilité, une scoliose ou, pour les femelles, un ventre rempli d'œufs est tué immédiatement.
Objectifs
Le projet est une caractérisation génétique de 8 lignées de poissons âgés de 2 mois, génétiquement modifiés. Ces poissons seront ensuite élevés puis croisés entre eux afin d'obtenir des larves âgées de moins de 5 jous, non soumis à l'expérimenation animale, pour les études afin de comprendre comment les animaux apprennent et forment des souvenirs. S'il est clair que les souvenirs se forment grâce à la plasticité des réseaux neuronaux, de nombreuses questions restent ouvertes. Par exemple, dans un circuit neuronal complexe de vertébrés, lesquels et combien de neurones sont soumis à la plasticité ? Quels sont les mécanismes moléculaires impliqués dans cette plasticité ? Pour répondre à cette question des poissons zèbres sont utilisées car leur cerveau est relativement simple (~100 000 neurones), petit (0,25 mm3) et l'activité de tous les neurones peut être mesurée de façon indépendante. Lorsqu'il est stimulé par un flash de lumière ou un bruit, le poisson zèbre réagit par un sursaut. En cas d'éclairs ou de bruits répétés, cette réponse diminue, formant un type de mémoire à long terme connu sous le nom d’habituation. Afin d'étudier cette habituation, nous disposons de 8 lignées de poisson zèbre portant des mutations, non dommageables, sur différentes protéines. Ces poissons seront croisés entre eux pour étudier le comportement de leur descendance, âgèe de moins de 5 jours et donc non soumise à l'expérimentation animale. L'étude du comportement des poissons correspondra à l'étude de leur habituation suite à l'extinction de la lumière.
Bénéfices attendus
La caractérisation génétique des lignées pour optimisation de la gestion des élevages est nécessaire car l'étude de l'habituation chez le poisson zèbre âgé de moins de 5 jours, nécessite d'avoir tous les génotypes possibles analysés en simultanée dans la même expérience. Par exemple pour un simple mutation, en croisant deux poisson +/-, nous aurons des larves âgées de moins de 5 jours ayant les généotypes +/+;+/- et -/-. Le fait de garder, après génotypage, les parents sous forme +/- est le seul moyen, le plus rationnel, d'avoir les larves âgées de moins de 5 jours avec les 3 génotypes voulus.
Procédures
Les poissons agès de 2 mois, seront génotypés par prélèvement d 'une partie infime de leur nageoire caudale afin de ne garder que les individus hétérozygotes. Le génotypage sera fait par balnéation et anesthésie du poisson à la Tricaine; un bout de la nageoire caudale sera coupée . Le temps total de la procédure sera le plus court possible (moins de 2 min). Les poissons seront placés rapidement dans un bac de réveil rempli d'eau avant d'être transféré dans son aquarium. Cette procédure concerne tous les poissons de cette demande mais seuls le nombre de poissons nécessaires à obtenir les effectifs souhaités subiront le génotypage, les autres ne seront pas génotypés dés lors que les effectifs voulus sont atteints. Les chiffre donnés sont donc des maximums et le prélèvement sera le seul geste invasif faits sur les animaux et une seule fois dans leur vie.
Impact sur les animaux
Le génotypage des poissons se fera par découpe d'une extrémité de la nageoire caudale d'une surface inférieure à 0.25 mm2 sous anesthésie dans un délai très court. Les nuisances ou effets indésirables, extrêment rares avec ce protocole établi et utilisé en routine, seront visibles au moment de l'endormissement, du réveil (trop long ou visualisé par une nage inhabituelle), des lésions suite à la biopsie ou de la non repousse, dans des cas exceptionneles, de la nageoire (qui doit être totale au bout de 15 jours). Tout phénotype inhabituel entrainera la mise à mort immédiate du poisson.
Devenir
Les poissons une fois génotypés seront divisés en deux catégories. Les poissons hétérozygotes seront maintenus en vie pour être mis en croisement afin de faire des expériences d'habituation sur leurs descendants âgès de moins de 5 jours (non sousmis à une demande) et pour être mis en croisement pour obtenir la génération suivante. Les poissons ayant tous les autres génotypes possibles seront mis à mort car nous souhaitons maintenir les lignées sous forme hétérozygote. En effet, ce n'est que par croisement de poissons hétérozygotes entre eux que nosu obtiendrons des larves (non soumis à une dap) ayant tous les génotypes souhaités.
Remplacement
Au niveau du génotypage aucun remplacement n'est possible pour la biopsie de la nageoire caudale. L'étude de la mémoire et du comportement ne peut se faire que sur un cerveau entier, dans des animaux vivants. Le poisson zèbre présente le modèle vertébré ayant un cerveau le plus simple nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre la plasticité neuronale dans le cerveau des vertébrés. En tant que vertébrés, le cerveau et le génome du poisson zèbre partagent des homologies majeures avec les mammifères et les humains. Travailler sur un modèle vertébré est essentiel pour nos projets visant à découvrir les mécanismes conservés de plasticité et leur pertinence potentielle pour la fonction psychiatrique humaine et le dysfonctionnement du cerveau dans les maladies neurologiques. Nous utilisons des lignées transgéniques connues pour être impliquées dans l'habituation afin de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu et mieux caractériser l'action de certaines molécules impliquées dans les défauts de mémoire. Aucun modèle cellulaire in vitro ne peut se substituer à cette étude.
Réduction
Nous faisons une nouvelle génération que les 8 à 10 mois (au lieu de tous les 6 mois) ce qui permet sur 5 ans de diminuer le nombre de générations. Un nombre minium de 20 individus est élevé pour maintenir la lignée et obtenir des alevins. Ce chiffre permet d'avoir suffisament de mâles et femelles pour les accouplements. Seul le nombre de poissons nécessaires à obtenir les effectifs souhaités subiront le génotypage, les autres ne seront pas génotypés dés lors que les effectifs voulus sont atteints. Les chiffres donnés sont donc des maxima. Nous ne gardons que les poissons hétérozygotes (au lieu de garder des +/+ et -/-) car en le croisant entre eux nous obtenons tous les génotypes voulus pour vos expériences sur des larves de moins de 5 jours. Les études sur la mémoire se font sur des larves âgées de moins de 5 jours, non soumises à une DAP. Les poissons possèdent deux ou trois mutations, nous permettant ainsi de ne pas maintenir des lignées avec une seule mutation. Les lignées non utilisées dans le futur seront cryoconservées.
Raffinement
Tout poisson, quel de soit sont stade de développement, qui présente un comportement anormal, ou un signe de mal être a ou un des points limites tels que problème de flottabilité, immobilité, mouvements anormaux, scoliose, siphose, femelle avec ventre rempli d'oeufs, sera mis à mort immédiatement. Les poissons sont maintenus dans les aquariums en nombre suffisant pour leur permettre de se déplacer en banc. Une fois par jour des artémias vivants leur sont donnés afin de maintenir leur activité de prédation. Le prélèvement pour le génotypage sera le seul geste invasif fait sur les animaux et une seule fois dans leur vie. Lors du processus de génotypage, les poissons sont maintenus par deux par bac de 700 ml un minimum de temps ne dépassant pas 48h. Durant ces 48h, les poissons sont maintenus deux par deux dans les bacs avec un séparateur entre les deux afin de pouvori les identifier suite au génotypage.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un animal modèle facile à élever (animal petit, robuste, possédant d'excellentes capacités de reproduction). De plus, 70% des gènes du poisson zèbre ont un équivalent chez l'homme. Enfin, ce génome s'est montré facilement manipulable, ce qui a conduit à la création de milliers de mutants dont ceux utilisés dans ce projet. Les études comportementales associées à des approches d’imagerie sur l’organisme entier, à une résolution pouvant atteindre l’échelle cellulaire (poisson optiquement transparent jusqu'à 4 semaines) fait du poisson zèbre un modèle pertinent. Ces approches d'étude de comportement à haut débit et l'imagerie sur animal entier, ne sont absolument pas applicables en routine sur d'autres modèles vertébrés ce qui fait du poisson zèbre comme modèle vertébré un modèle idéal. Du plus il s'agit d'un modèle dont le cerveau est relativement simple comparativement à d'autres modèles et il est donc plus facile d'obtenir des résultats interprétables Les lignées sont déjà établies. Les génotypages des adultes pour chaque génération se feront au stade 2 mois. A ce stade les poissons sont assez grands pour que le génotypage de la nageoire caudale se fasse sans séquelle, celle-ci étant assez développée