Poissons zèbres
Rôle de la télomérase et de la maintenance des télomères dans le mélanome chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Oncologie
4 380 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. La plupart développent un mélanome avant trois mois, d'autres reçoivent une injection intramusculaire de cellules tumorales, avec des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que ces tumeurs peuvent altérer durablement la mobilité, la forme du corps et la respiration des poissons. Il affirme que le vieillissement et le cancer sont des processus de "l'organisme entier" et retient le poisson zèbre pour la ressemblance de ses télomères avec ceux de l'humain.
Objectifs
Ce projet vise à comprendre le rôle de la télomérase dans l'initiation et la progression du mélanome. La télomérase est réactivée dans 80 à 90 % des cellules cancéreuses, ce qui permet l'immortalisation des cellules et, par conséquent, l'échappement à la sénescence réplicative. En accord avec cette idée, des thérapies anti-télomérase font actuellement l'objet d'essais cliniques dans le traitement du cancer. La plupart des études in vivo ont été réalisées à l'aide de modèles murins, dans lesquels les télomères sont beaucoup plus longs que chez l'homme. Nous avons donc l'intention d'étudier l'effet de l'absence de télomérase dans le mélanome en utilisant un modèle de télomères semblable à celui de l'homme, le poisson zèbre. Objectifs spécifiques : 1- Évaluer l'impact de l'absence de télomérase sur l'incidence du mélanome. Notre objectif est de démontrer si l'absence de télomérase influence l'initiation du mélanome, la taille de la tumeur ou entraîne une régression de la tumeur à un stade ultérieur. Nous évaluerons également la taille des télomères, l'expression des gènes et la stabilité génomique. Enfin, nous évaluerons si l'activité de la télomérase est modulée par l'activation de son promoteur. 2- Chercher à savoir si la télomérase limite la malignité des mélanomes. Nous cherchons à évaluer si l'absence de télomérase limite le potentiel de malignité du mélanome. 3- Évaluer l'efficacité de la thérapie anti-télomérase dans le mélanome et les avantages des thérapies combinatoires qui agissent en synergie avec l'inhibition de la télomérase. Ici, notre objectif est d'évaluer l'efficacité de la thérapie anti-télomérase à différents stades de développement du mélanome (progression précoce et tardive). Nous voulons également évaluer l'effet des thérapies combinatoires qui agissent en synergie avec l'inhibition de la télomérase.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le rôle de la télomérase et du maintien des télomères dans l'initiation et la progression du mélanome. Nous espérons découvrir si le manque de télomérase a un impact sur l'initiation du mélanome, la malignité, la taille de la tumeur ou même la régression de la tumeur à un stade ultérieur. De plus, nous espérons réaliser si la thérapie anti-télomérase est efficace dans le traitement du mélanome. La réactivation de la télomérase se produit dans 85 à 90 % des cancers, et elle a été décrite comme une étape fondamentale de la progression du cancer. C'est pourquoi des thérapies anti-télomérase font actuellement l'objet d'essais cliniques dans le traitement du cancer. Étant donné que la longueur des télomères du poisson zèbre est plus proche de celle de l'homme que d'autres modèles animaux, ce projet a le potentiel d'être directement traduit en essais cliniques chez l'homme. Il est important de noter que nous évaluerons l'efficacité de la thérapie anti-télomérase dans les tumeurs précoces et tardives. Ce dernier point est crucial pour comprendre si les thérapies anti-télomérase sont appropriées à tous les stades du mélanome. Nous combinerons également les thérapies anti-télomérase avec un médicament endommageant l'ADN et évaluerons leur effet synergique. En résumé, ce projet contribuera à une meilleure compréhension du rôle de la télomérase dans le mélanome, mais surtout, il apportera une contribution importante pour évaluer l'efficacité de la thérapie anti-télomérase dans le cancer.
Procédures
Les poissons de 2 procédures seront imagés en direct à différents moments. Dans la procédure 2, les poissons porteurs de mélanome seront imagés à l'âge de 4, 7 et 9 mois, tandis que dans la procédure 4, les poissons immunodéprimés seront imagés 1 et 2 mois après l'injection. Les individus seront anesthésiés avant d'être transférés dans une boîte de Pétri recouverte d'agarose à 1%. L'anesthésie est obtenue en immergeant le poisson dans une dose de Tricaine. Cette immersion sera effectuée pendant au moins 10 min et jusqu'à ce qu'aucun signe de réflexe ne soit détecté (toucher et pincement léger de la nageoire caudale). Les poissons seront ensuite imagés par une caméra et sous un stéréoscope à fluorescence. L'imagerie durera au maximum 5 minutes. Les poissons récupéreront ensuite dans des bassins séparés pendant 30 minutes avant d'être transférés dans les aquariums précédents. Nous ferons l'image de 102 poissons dans la procédure 2 et de 60 poissons dans la procédure 6. Dans la procédure 4, des poissons immunodéprimés seront injectés avec des cellules de mélanome pour évaluer la malignité des tumeurs. Les poissons seront anesthésiés avant d'être transférés sur une éponge humide. L'anesthésie est obtenue en immergeant les poissons dans une dose de Tricaine. Environ 500 000 cellules de mélanome seront injectées par voie intramusculaire avec une seringue Hamilton. Les poissons seront ensuite placés dans un réservoir séparé pendant 30 minutes avant d'être transférés dans les aquariums précédents. Nous injecterons 20 poissons immunodéprimés /groupe, au total nous utiliserons 960 poissons. Dans la procédure 5, les larves deux jours après la fécondation seront anesthésiées et ensuite micro-injectées avec environ 500 cellules de mélanome. Quatre groupes de traitement différents seront testés : un groupe témoin (juste le milieu embryonnaire) ; le groupe du médicament A, le groupe du médicament B et le groupe du médicament A + B. Le traitement durera 4 jours et l'expérience se terminera à 7 jours après la fécondation, où toutes les larves seront euthanasiées. Nous utiliserons 40 larves par groupe pour permettre de réaliser 2 analyses moléculaires différentes, au total nous utiliserons 2560 larves.
Impact sur les animaux
Nous utilisons un modèle de poisson zèbre atteint de mélanome. 90 % des poissons développent un mélanome avant l'âge de 3 mois. L'évaluation histopathologique a révélé une propagation maligne de mélanocytes atypiques sous le derme ainsi que dans le tissu conjonctif lâche entourant les fascicules musculaires du tronc et, occasionnellement, dans l'épiderme. On a également constaté que les cellules tumorales exprimant HRAS(V12G) se dispersaient dans les os, les muscles et la moelle épinière, mais qu'elles n'avaient pas envahi le péritoine ni formé de métastases viscérales. Ces tumeurs ont le potentiel d'affecter la mobilité, la forme du corps, le comportement respiratoire du poisson, ainsi que son appétit. Certains de ces effets sont permanents, comme la mobilité et la forme du corps, et d'autres peuvent être temporaires (moins de 24 heures), comme l'appétit. En ce qui concerne les greffes de tumeurs sur des poissons immunodéficients, le poisson hôte peut avoir quelques effets temporaires après l'injection. L'effet le plus courant est un saignement au niveau du site d'injection, qui ne dure généralement pas plus de 1 ou 2 minutes. En ce qui concerne les traitements médicamenteux que nous prévoyons d'effectuer sur des embryons de poisson zèbre, nous devrons évaluer la dose maximale tolérée du médicament, car les doses les plus élevées pourraient entraîner la mort des embryons. Les poissons sont surveillés trois fois par jour par le personnel de la pisciculture lors de l'alimentation, en plus des chercheurs responsables de la procédure. Si un phénotype anormal est observé chez l'un des poissons, une fiche d'évaluation du bien-être animal, spécifique à chaque procédure, est utilisée pour évaluer les signes de détresse et définir l'action à entreprendre au vu du score total.
Devenir
Les poissons de la procédure 1 doivent maintenir la ligne, nous sacrifierons les poissons à 6 mois ou avant s'ils atteignent une limite de points. Les poissons de la procédure 2 seront sacrifiés à la fin de l'expérience (9 mois) et utilisés dans la procédure 3 pour l'analyse post-mortem. Les poissons des procédures 3 à 6 seront sacrifiés à des points spécifiques pour des analyses post-mortem (par exemple histologie et analyse transcriptionnelle).
Remplacement
Les études in vitro ont apportés de nombreuses avancées sur la compréhension du vieillissement de la cellule et le rôle des raccourcissements des télomères dans ce phénomène. Cependant, les modèles in vitro ne permettent pas d’appréhender les questions du niveux de l'organisme. De plus, nous nous intéressons à l’étude du développement des pathologies associées à l'âge, qui est un processus au niveau de l'organisme entier, et nécessite donc l'utilisation d'animaux vivants. Nous devons utiliser un organisme modèle multicellulaire qui vieillit de la même manière que les humains, c’est à dire de manière dépendante de la taille des télomères. C’est pourquoi nous utilisons le modèle poisson.
Réduction
Nous générerons nos lignées expérimentales afin de pouvoir obtenir des animaux expérimentaux et des animaux témoins à partir du même croisement (procédures 2 et 3). Cette méthode permet non seulement de garantir une identité génétique maximale entre les animaux (en limitant le nombre de copies du transgène à une seule), mais aussi d'éviter d'avoir recours à des animaux supplémentaires comme témoins, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les expériences de xénogreffe (procédures 4 et 5), nous utiliserons des échantillons de tumeurs dérivés d'autres procédures comme source de mélanome, éliminant ainsi le besoin d'animaux supplémentaires porteurs de mélanome. Notre estimation du nombre d'individus est basée sur des expériences précédentes réalisées dans notre laboratoire et elle est étayée par une analyse statistique. Par exemple, nous nous attendons à ce que 30% des poissons présentant une régression du mélanome à 9 mois dans la procédure 2. Dans ce cas, nous avons effectué un test de Chi-deux, avec une puissance de 80% pour déterminer le minimum d'animaux requis.
Raffinement
Toutes les expériences susceptibles d'infliger de la douleur aux animaux seront réalisées sous anesthésie générale et pendant une courte durée (5 min maximum). Après la procédure, les poissons seront placés dans un bassin individuel et seront surveillés jusqu'à leur rétablissement complet. En outre, un contrôle de suivi sera effectué tous les trois jours par le personnel de l'animalerie et par les chercheurs. Une carte de pointage du bien-être animal adaptée à chaque procédure sera utilisée pour évaluer les signes de détresse. Certaines procédures qui nécessitent un suivi plus fréquent des individus et, en cas d'atteinte des seuils, ces poissons seront euthanasiés. Les cartes de pointage comprennent, en fonction de la procédure, l'évaluation des modes de nage, de la forme du corps, du comportement nutritionnel, du comportement respiratoire et des saignements/ulcères.
Choix des espèces
Nous souhaitons étudier le rôle de la télomérase et du raccourcissement des télomères dans le cancer. Par conséquent, nous devons utiliser un modèle multicellulaire qui, d'une part, récapitule l'hétérogénéité du cancer en termes de types de cellules et, d'autre part, présente des télomères similaires à ceux des humains. Le poisson zèbre pour le mélanome est largement étudié et il a été démontré qu'il comprend tous les principaux types cellulaires tels que les cellules de mélanome, les fibroblastes, les neutrophiles, les macrophages et les cellules immunitaires. De plus, le poisson zèbre possède des télomères similaires à ceux de l'homme, tant au niveau du complexe shelterin que de la taille des télomères. Nous considérons donc que le poisson zèbre est le modèle le plus approprié pour ce projet. Toutes nos expériences reposent sur l'initiation et la progression du mélanome dans notre modèle de poisson zèbre. Dans ce modèle, les poissons commencent à développer un mélanome dès la sixième semaine et pratiquement tous les individus auront un mélanome à la seizième semaine (4 mois). Dans la procédure 2, nous suivrons visuellement (par microscopie à lumière et à fluorescence) la progression du mélanome de 4 mois (progression précoce) à 9 mois (progression tardive) chez des animaux par ailleurs non perturbés. Pour comprendre l'effet de l'absence de télomérase dans le mélanome, les procédures 3 et 6 nécessiteront l'euthanasie des poissons à différents points dans le temps (4, 7 et 9 mois) dans une étude longitudinale. Afin d'étudier la capacité des cellules de mélanome mutantes de la télomérase à former de nouvelles tumeurs, dans les procédures 4 et 5, nous utiliserons les échantillons de tumeurs dérivés de la procédure 3 et transplanterons les cellules de mélanome dans des poissons adultes immunodéprimés (procédure 4). Dans la procédure 5, les cellules de mélanome seront allogreffées dans des larves de poisson zèbre 2 jours après la fécondation et nous suivrons l'impact des agents de chimiothérapie sur la progression de la tumeur.
Evaluation de la douleur chez le poisson dans le but de créer une grille de score
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
Autres poissons : 636
636 poissons zèbres et 636 autres poissons vont être utilisés, une partie tuée et une partie remise en élevage, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à sévère. Ils sont plongés dans un bain de substances provoquant douleur ou anxiété, puis isolés pour un test comportemental d'une heure, avant de recevoir un analgésique ou d'être tués. Le porteur reconnaît que la douleur est attendue et inévitable, l'objectif étant de bâtir une grille d'évaluation de la douleur chez le poisson. Il affirme que les comportements observés ne sont ni prévisibles ni reproductibles autrement que sur l'animal vivant.
Objectifs
L’objectif de ce projet consiste à mettre au point une grille de score de la douleur chez le poisson. En effet, chez l’Homme ou chez les autres modèles animaux, on utilise des grilles de score basées notamment sur les expressions faciales, afin d’évaluer la douleur ; une telle grille n’existe actuellement pas chez les poissons, bien qu’ils soient de plus en plus étudiés en recherche. L’objectif de ce projet est donc de trouver d’autres critères afin de pouvoir créer une grille de score de la douleur chez le poisson, facilement utilisable par tous. Afin d’établir une grille de score qui soit représentative des différents niveaux de douleur et comportements associés, nous réaliserons ces tests sur 2 espèces de poissons modèles : le poisson zèbre (Danio rerio) et le médaka (Oryzias latipes). Dans un premier temps, nous souhaiterions comparer l’effet de la phéromone d’alarme fraiche (Schreckstoff) et de son substituant chimique sur les comportements associés au stress des poissons. Des études préliminaires nous ont permis de voir que le substituant chimique de la phéromone d'alarme ne permettrait pas d’obtenir un panel complet des comportements observés lors des situations de stress ou de douleur. Il est donc important de pouvoir terminer cette étude préliminaire afin de comparer les deux molécules et de caractériser tous les comportements à inclure dans la grille de score. En effet, le stress a un impact important sur le comportement et la physiologie des poissons et est une composante à part entière de la douleur, il est donc difficile de les différencier. C’est pourquoi le stress doit donc être pris en compte dans la création de cette grille de score de la douleur afin de discriminer les deux états. Lors de la phase 1, nous déterminerons par des tests la molécule la plus pertinente pour mesurer le stress. Puis, lors de la phase 2, nous établirons la grille de score en applicant sur les poissons les différentes combinaisons de molécules (dont celle déterminée en phase 1), connues pour induire ou réduire le stress ou la douleur, et en analysant leur comportement à travers différents tests.
Bénéfices attendus
La création d’une grille de score de la douleur est un atout pour la bonne utilisation du modèle poisson à des fins d’utilisation scientifique. Celle-ci permettra de mieux évaluer la douleur du poisson aussi bien lors des pratiques utilisées en conditions d’élevage que lors de la réalisation des projets scientifiques. Une meilleure compréhension de la douleur chez le poisson permettrait d’améliorer le raffinement des procédures.
Procédures
Les poissons serons soumis à un bain contenant un principe actif provoquant ou stoppant la douleur ou l’anxiété pendant maximum 5min. Ils seront ensuite transférés dans un aquarium de test afin de réaliser un test comportemental dont la durée maximale sera d’une heure. Lors de ce test il est isolé de ces congénères. A la suite de ce test, le poisson recevra une dose d’analgésique ou sera euthanasié.
Impact sur les animaux
Cette étude vise à évaluer les différents signes de douleurs aussi bien comportementales que physiologiques. Une douleur est donc attendue et inévitable dans ces procédures. Nous veillerons à ce que celle-ci soit la plus courte possible et les poissons seront sous surveillance constante pendant la procédure. A la fin de la procédure la douleur sera stoppée à l’aide d’analgésique ou par la mise à mort de l’animal.
Devenir
A l’issu de chaque procédure et en fonction de l’avis vétérinaire les animaux seront soit récupérés et remis en élevage, soit mis à mort.
Remplacement
Dans le cas de notre projet, les espèces animales utilisées ne peuvent être remplacées par des méthodes alternatives. Les comportements observés sur les animaux aquatiques sont non prévisibles ou reproductibles. Notre projet nécessite donc une approche in vivo sur l’animal. Les études comportementales se font directement sur l’animal vivant. De plus elles peuvent apporter des informations fondamentales en relation avec de grandes questions biologiques.
Réduction
Nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux utilisés pour chacune des procédures. Pour cela nous avons limité précisément le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses . De plus des expériences précédentes nous ont permis de valider ce nombre d’animaux nécessaire à l’obtention de résultats. Le groupe contrôle de la phase 1 sera soumis à tous les tests comportementaux afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera particulièrement observé lors de l’élevage. Si les animaux montrent des signes de mal-être lors de l’élevage, des actions seront menées afin de réduire le stress ou la douleur. Pour vérifier le bien-être lors de l’élevage nous utilisons une grille d'évaluation des points limites qui prend en compte des comportements ou signes visibles tels que la nage en position anormale, recherche active d’oxygène, isolement au fond de l’aquarium, rétraction des pigments. Afin de prévenir le stress dû à l'isolement de l'animal en plus de celui du nouvel environnement, l'animal aura accès à l'espace de test. Des tests préliminaires ont montré qu'une habituation à l'isolement s'effectue au bout d'une semaine. La surveillance des animaux sera réalisée visuellement par du personnel compétent et de façon constante lors des traitements et des tests de comportements jusqu’à ce que la douleur ou le stress soit supprimé par l’application de médicaments.
Choix des espèces
Les poissons téléostéens ont été cooptés au rang d’animaux modèles pour les analyses comportementales, aussi bien pour des comportements « innés » (fonctions motrices et sensorielles) que pour des comportements dits « de fonctions cérébrales supérieures » (émotions, motivation, apprentissage). Ces comportements ont été observé chez plusieurs espèces de poissons. De plus la croissance rapide du poisson-zèbre et du médaka, son développement externe dans un oeuf avec tous les stades de développement directement accessibles et sa facilité de modification génétique en font des modèles de choix. Ces modèles étant de plus en plus utilisés, il est alors important de pouvoir établir une grille de score de la douleur. Les poissons seront étudiés au stade adulte, soit à partir de 6 mois qui correspond à la maturité sexuelle et jusqu’à deux ans qui correspond au maximum de ses capacités de reproduction. Ces stades de développement nous permettent d’effectuer les différents tests de comportement pour évaluer les critères de la douleur.
Régulation du développement de l’épithélium intestinal par l’interaction entre la colonisation du microbiote et la signalisation des cytokines.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
16 430 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées en gravité légère. Élevés au stade larvaire dans un milieu antibiotique pour supprimer leur microbiote, ils sont collectés à différents jours, anesthésiés et enrobés dans une matrice de cellulose pour observation au microscope, puis mis à mort pour prélèvement de l'intestin ou séquençage. Le porteur indique que la privation de microbiote entraîne un sous-développement de l'intestin et que la collecte peut être une source de stress. Il justifie le choix de l'espèce par la transparence des larves et leur développement hors de l'utérus, et affirme que la culture in vitro d'un intestin colonisé est impossible à l'heure actuelle.
Objectifs
Les cytokines sont des agents essentiels du système immunitaire et constituent une partie des molécules indispensables à la communication intercellulaire. L'activité d'une cytokine est assurée par la présence à la surface de la cellule cible, de récepteurs spécifiques : ceux-ci permettront de transmettre le message. Elles sont donc des médiateurs, et leur production a lieu en réponse, principalement, à la présence d'un agent infectieux tels qu'un virus ou une bactérie, ou de l'un de leurs constituants. La colonisation de l'intestin par les micro-organismes commensaux (hôte habituel d'un organisme sans lui causer de dommage) commence avec l'ingestion de nourriture, et augmente massivement en nombre et en complexité avec les changements alimentaires tels que l'inclusion d'aliments secs dans le repas des poissons. La génération d'animaux sans germes par l'élimination de la flore commensale en début de vie entraîne un sous-développement des cellules épithéliales et immunitaires intestinales, ce qui conduit à un dysfonctionnement durable de l'organe. Les poissons zèbres dépourvus de microbiote intestinal (ensembles des micro-organismes présents dans l’intestin) présentent une prolifération épithéliale intestinale et une différenciation cellulaire défectueuses au cours du développement. Par exemple, les maladies inflammatoires intestinales peuvent résulter d’un problème d’échange entre la lumière intestinale (espace intérieur de l’intestin) et les cellules épithéliales qui la composent. En fait, la perturbation du dialogue entre le microbiote, le système immunitaire et les cellules épithéliales via les cytokines peut avoir des effets délétères sur l’état d’équilibre de l'intestin, compromettre l'absorption des nutriments et avoir un impact au-delà de l'intestin. Plusieurs études ont révélé des mécanismes par lesquels le microbiote contrôle la maturation du système immunitaire intestinal. Cependant, la manière dont le microbiote régule le développement de l'épithélium intestinal reste largement inconnue. Nous voulons donc comprendre comment les bactéries présentes dans notre intestin et l’interaction qu’elles ont avec les cytokines d’intérêt, peuvent réguler le développement de l’épithélium intestinal.
Bénéfices attendus
Le système immunitaire est bien connu pour son rôle important lors d'infections par des bactéries, des virus et d'autres agents pathogènes. Cependant, au-delà de l'immunité et de la défense, le rôle des signaux du système immunitaire, tels que les cytokines, dans le développement et la maturation des organes n'est pas bien compris. En outre, on ne sait pas comment les cytokines interagissent avec l’ensemble des micro-organismes colonisateurs, qui favorise la maturation des organes. Ces questions peuvent être facilement étudiées dans le modèle du poisson zèbre puisqu'il se développe en pleine eau et qu'il est transparent, ce qui permet d'observer directement les organes en développement dans le contexte de l'organisme complet. En outre, la manipulation de l'environnement est également très facile avec ce modèle animal. Ces avantages expérimentaux nous permettent de comprendre en détail comment les cytokines et leur interaction avec le microbiote modulent le développement et la maturation des organes intestinaux. En outre, ce projet nous permettra de révéler comment le dysfonctionnement du système immunitaire, au-delà de l'altération de la défense et de l'immunité, peut entraîner une altération de la maturation correcte de l'intestin. Ces résultats peuvent potentiellement ouvrir la voie à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour les maladies intestinales, y compris celles liées à l'inflammation intestinale, ainsi que pour les pathologies dans lesquelles le bon fonctionnement physiologique de l'intestin est compromis.
Procédures
Les différentes interventions sur les larves dépourvues de toute flore seront les suivantes : - Observation rapide sans ouverture de boite tous les jours ou presque - Changement du milieu antibiotique, tous les jours ou tous les 2 jours - Aux temps J5, J8, J12, J15, 25 larves seront collectées, anesthésiées et incluent délicatement dans une matrice de cellulose le temps de l’observation au microscope. L’observation avec prise de photo de chaque larve pourrait prendre jusqu’à deux heures. Les larves seront mises à mort pour analyse post-mortem. - Aux temps à J12 et J15, 30 larves seront collectées et mises à mort avant de prélever l’intestin pour analyse. - Collecte de 225 larves pour séquençage. Les larves seront mises à mort pour analyses. - 15 larves seront collectées, anesthésiées et incluent délicatement dans une matrice de cellulose le temps de l’observation au microscope et seront mises à mort pour analyse post-mortem.
Impact sur les animaux
Nous allons étudier des larves de 5 jours post-fertilisation (dpf) jusqu’à 15dpf, avec prise alimentaire sans germe à partir de 7 dpf. La formule de cette nourriture contient tous les nutriments nécessaires à leur croissance en dehors des germes. Les concentrations d’antibiotiques dans lesquels les larves vont se développer sont adaptées pour leur développement. L’effet indésirable qui pourrait apparaitre serait une mortalité des larves au cours du processus. Un risque de stress lors de la collecte des larves pour analyse au microscope est possible.
Devenir
Toutes les larves seront mises à mort pour analyse post-mortem
Remplacement
L'étude de cellules souches en culture extraite de l'organisme vivant n'est pas suffisante pour comprendre les processus de l'embryogénèse (processus de formation d'un organisme pluricellulaire, de la cellule initiale issue de la rencontre des cellules reproductrices parentales à un être vivant autonome). La culture in vitro d’intestin et sa colonisation avec un microbiote est impossible à l’heure actuelle. Il n’existe aucune donnée sur d’autre modèle de Vertébré. Néanmoins, il existe des données de séquençage de l’ARN (technique pour identifier et quantifier le matériel génétique à un moment donné) issues du modèle poisson sur lesquelles nous nous sommes basés.
Réduction
Nous combinons, autant que possible, des méthodes d’analyse multiples à partir des mêmes animaux (les animaux observés en microscopie seront mis à mort pour utiliser leur intestin pour extraire l’ARN.) de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet. De plus, nous aurons souvent recours à des méthodes d’analyse non-invasives grâce à des marqueurs fluorescents pouvant être suivis facilement du vivant de l’animal. Les tailles des lots ont été déterminés en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. Les prélèvements seront réalisés de manière à pouvoir mettre en œuvre le maximum d’analyses pour une larve donnée (études génomiques, cellulaires, histologiques). Cette optimisation des échantillons permet de réduire le nombre total d’animaux utilisés dans le projet
Raffinement
Les espacements des observations ont été déterminés en fonction de notre expérience passée ou celle de collaborateurs proches. D’une façon générale, les expériences sont de courte durée. Les larves seront lors de la manipulation pilote surveillées quotidiennement puis la fréquence du suivi sera ajustée. Les larves mortes seront enlevées et le milieu avec antibiotique sera changé pour garder les larves dans un environnement optimal. Pour réduire au maximum la douleur, la souffrance et l'angoisse de l'animal, ce dernier sera anesthésié durant toute la procédure expérimentale d’analyse au micrsocope par le biais de la tricaïne diluée dans l’eau.
Choix des espèces
Notre compréhension de la manière dont cellules, gènes de l'hôte et microbiote contrôlent le développement des organes des vertébrés est limitée dans les modèles mammifères. Il n'est pas pratique d’y réaliser des manipulations précises dans l'environnement, dans l’animal, et en même temps, de suivre en image l'intestin en développement. Pour surmonter ces limites, notre nouvelle approche consiste à combiner les avantages du modèle du poisson zèbre avec les nouvelles technologies. Le poisson zèbre est un modèle animal idéal pour étudier le développement des vertébrés en raison de sa facilité de manipulation génétique, de sa grande descendance, de sa transparence et de son développement ex utero rapide. Il est également un système modèle puissant pour étudier le microbiome (environnement spécifique d’un microbiote) des vertébrés. Enfin, la plupart des lignées et des voies immunitaires sont conservées entre poissons et mammifères. Cette étude s’effectuera sur des larves de 5dpf jusqu’à 15 dpf. Nous avons choisi cet espace du stade de développement car nous souhaitons caractériser l’expression de ces cytokines au cours des stades du développement précoces sous deux conditions environnementales différentes (présence de germes conventionnels et sans germe).
Approches génétiques pour la régénération de la moelle épinière chez le poisson zèbre
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
22 250 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré pour 6 300 d'entre eux et sévère pour 15 950. On leur sectionne la moelle épinière, ce qui les paralyse, on pratique des microinjections, des ablations de populations cellulaires et des tests de nage, avec une mortalité d'environ 10 % après la chirurgie. Le porteur exploite la capacité de régénération spontanée du poisson zèbre pour comprendre, à terme, comment stimuler la réparation médullaire chez les mammifères, bénéfice renvoyé à l'avenir. Il affirme que la lésion médullaire implique "l'animal entier" et ne peut être reproduite en culture.
Objectifs
Chez l’homme, la section de la moelle épinière est actuellement irréversible, perturbant les mouvements et de nombreuses fonctions physiologiques. Chaque année, dans le monde, entre 250 000 et 500 000 personnes subissent une lésion médullaire, nécessitant des interventions thérapeutiques, chirurgicales et de réadaptation. Les lésions de la moelle épinière peuvent être causées par des traumatismes (accidents de voiture, chutes, violences), des maladies neurodégénératives (sclérose latérale amyotrophique) ou par des cancers. Après une coupure de la moelle épinière, les axones endommagés ne repoussent pas vers les motoneurones périphériques. Si cette lésion est partielle (certaines connexions restent intactes), des interventions chirurgicales, des mesures de soutien et de réadaptation permettent de diminuer la mortalité et d’améliorer les capacités motrices de certains patients. Pourtant, de nombreux déficits sont durables et la moitié des personnes touchées restent paralysées et handicapées à vie. Il est désormais admis que la voie vers une guérison efficace des lésions médullaires nécessite une combinaison d'approches biologiques et d'ingénierie. Ces approches doivent être guidées par une compréhension plus approfondie de la capacité de régénération innée de la moelle épinière de certaines espèces. Contrairement aux humains et aux mammifères adultes, le poisson zèbre possède une capacité étonnante à se régénérer et à nager de nouveau après avoir été paralysé. Ce processus de régénération implique l'activation des cellules mères qui prolifèrent et génèrent de nouveaux neurones rétablissant les connections neurales endommagés. Ce projet vise à explorer le processus de régénération observé chez le poisson zèbre pour répondre aux questions suivantes : Quels sont les facteurs et mécanismes permettant la régénération innée de la moelle épinière ? Comment ces mécanismes sont-ils régulés ? Est-il possible d'améliorer la régénération chez les mammifères adultes par le rétablissement de programmes pro-régénératifs innés ? Comprendre ces signaux de régénération nous aidera à étudier les possibilités de stimuler la régénération tissulaire des structures du système nerveux central chez les mammifères adultes.
Bénéfices attendus
Les informations et les réactifs développés ici seront précieux à plusieurs égards : i) nous contribuerons à la compréhension des mécanismes innée de régénération de la moelle épinière, en exploitant la valeur du poisson zèbre comme système modèle; ii) nos travaux permettront de comprendre comment et pourquoi la régénération a évolué en tant que mécanisme naturel chez certains vertébrés et s'est perdue chez les mammifères; iii) ce projet révélera de nouveaux gènes capables de stimuler une réponse régénérative, à utiliser comme cibles thérapeutiques pour la régénération de la moelle épinière lésés chez les mammifères; iv) en raison de leur pertinence dans le contexte d'une maladie dévastatrice, actuellement incurable, les résultats obtenus avec ces expériences résonnent auprès d'un large public. Ils ouvriront la voie à des collaborations avec des groupes étudiant la régénération de la moelle épinière chez les mammifères, en France et à l'étranger.
Procédures
1. Microinjections; 3-5 sec. 2. Lésion de la moelle épinière : 3-5 min anesthésie, 30-40 sec chirurgie. 3. Essai comportemental de nage : Le temps est défini par la capacité du poisson à nager contre l'augmentation des courants d'eau. 4. Application de protéines recombinantes: 3-5 min anesthésie, 2 min chirurgie. 5. Traçage d’axones : 3-5 min anesthésie, 2 min chirurgie pour l'application du traceur. 6. Analyse de la prolifération : 3-5 min anesthésie, 30 sec pour injection. 7. Traçage de cellules : 3-5 min anesthésie, 30 sec injection ou incubation pendant 18h. 8. Ablation de sous-populations cellulaires : 3-5 min anesthésie, traitement de l'agent d'ablation pour incubation pendant 18h. 9. Imagerie in vivo de la moelle épinière chez les larve : les larves sont soumises à une anesthésie constante et elles sont imagées pendant 18h maximum.
Impact sur les animaux
La lésion de la moelle épinière chez le poisson zèbre est une technique bien établie et robuste. Son effet majeur est la paralysie, soit la perte de la fonction motrice, ainsi que la perte de sensation. Dans nos expériences, les lésions de la moelle épinière sont pratiquées dans la région thoracique et n'affectent donc que la partie inférieure du corps du poisson (partie caudale). Après chirurgie, les poissons présentent une mobilité réduite, bien qu'ils puissent se déplacer avec la partie rostrale de leur corps et puissent se nourrir par eux-mêmes. Parfois ils maigrissent après la procédure. La mortalité observée est de ~ 10% des poissons subissant une intervention chirurgicale coupant complètement la moelle épinière. Pour la majorité des adultes, dès une semaine après la lésion, les poissons sont capables de recommencer à bouger. À 6 semaines après la lésion, les adultes nagent comme s’ils n'avaient jamais été blessés auparavant. Ce processus de régénération est encore plus rapide chez les larves, qui peuvent à nouveau nager dès quatre à six jours après la lésion. L'implantation de mousse de gel en soi ne pose aucun dommage majeur. Cependant, additionnée à de la biocytine, celle-ci nécessite une seconde section médullaire et s'accompagne de toutes les conséquences décrites ci-dessus pour la section médullaire. L'ablation des populations cellulaires pourrait entraîner des anomalies dans la capacité de régénération et/ou dans le comportement et la santé générale des poissons soumis à la procédure. Pourtant, les populations de cellules que nous allons ablater sont spécifiques à la moelle épinière et n'apparaissent que de manière transitoire après une blessure, nous ne nous attendons donc pas à des dommages majeurs en dehors du tissu que nous étudions. Chez le poissons-zèbre les nuisances engendrées lors de l’établissement des transgénique se limite au stress lié à la manipulation des animaux et leur isolement lors des périodes de fécondation/réintroduction avec les congénères. La transgenèse I-Sce1 avec l'insertion d'ADN dans le génome se produit de manière aléatoire et, dans de nombreux cas, sur plusieurs sites. Les effets de position associés et les différences de nombre de copies rendent le phénotype des poissons moins prévisible. D'une manière similaire, la perturbation génique constitutive avec Crispr/Cas9 peut entraîner des effets secondaires tels la létalité embryonnaire, ce qui peut représenter une limite importante à l'analyse des phénotypes.
Devenir
1. Microinjections: Les animaux non porteur de transgène/mutation et les animaux F0 pour lesquels une population de porteurs F1 de transgène/mutation a été établi seront mis a mort. 2. Animaux soumis à une lésion de la moelle épinière: Finalement, tous les animaux utilisés pour les procédures énumérées dans ce protocole seront mis à mort pour évaluer la régénération de la moelle épinière sur des coupes de tissus.
Remplacement
La régénération de la moelle épinière est actuellement incurable chez les mammifères, mais se produit spontanément chez les vertébrés non mammifères comme les poissons téléostéens. La lésion de la moelle épinière est une condition impliquant l'animal entier, qui ne peut pas être reproduite de manière adéquate en culture tissulaire. Les interactions cellulaires complexes au cours de la régénération limitent l'utilisation de systèmes in vitro pour la découverte de facteurs de régénération du poisson zèbre. Par conséquent, il s'agit d'un problème qui ne peut pas encore être modélisé avec précision par un ordinateur ou des cellules en culture. À ce jour, il n'existe pas de moyen alternatif, sans l'utilisation d'animaux vivants, pour comprendre les signaux génétiques et les conséquences physiologiques impliqués après une lésion de la moelle épinière.
Réduction
Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés en effectuant une recherche documentaire approfondie définissant les connaissances existantes sur les approches expérimentales spécifiques. Nous avons réalisé des expériences pilotes pour optimiser les méthodes et les protocoles avant d'étendre les méthodes à un nombre statistiquement significatif d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront gardés dans une plateforme d’expérimentation animale équipées pour assurer un maximum de confort et de soins avec des aquariums enrichis. Ils seront gardés en groupes et logés dans des bacs offrant un espace de vie suffisant (espèce grégaire, environ 5 poissons//litre). Des conditions d'élevage et des nourrissages appropriées seront assurés. Pour minimiser autant que possible la mortalité, nous garderons les réservoirs propres autant que possible, éviterons les dépôts et l'accumulation de nourriture, maintiendrons un débit d'eau faible et constant pour éviter de déranger les poissons et maintiendrons une densité de poissons faible (mais adéquate). Tout le personnel impliqué dans la recherche sera formé de manière appropriée pour savoir identifier la souffrance physique et émotionnelle, la quantifier via une échelle et agir lorsque les critères d’interruption (points limites) prédéfinis sont atteints. Spécifiquement, les animaux seront mis à mort en cas de i) Changement soudain du niveau d’activité (bien que les animaux soient paralysés après une lésion de la moelle épinière, ils devraient pouvoir bouger activement avec la partie rostrale de leur corps); ii) Signes de douleur ou de détresse modérée à sévère qui n'a pas été prévue par le plan d'étude; iii) Amaigrissement. Nous surveillerons les animaux pour un amaigrissement nul/faible/sévère en observant et en comparant le groupe expérimental et le groupe contrôle, et par rapport à une référence appariée selon l'âge. Les animaux présentant un amaigrissement sévère seront mis à mort. Les animaux seront surveillés quotidiennement pendant trois jours après la chirurgie, et après trois fois par semaine. Ceux montrant des signes de souffrance dépassant les limites définies seront mis à mort. Les conditions seront soigneusement consignées dans les journaux chirurgicaux pendant la chirurgie, où nous noterons également la viabilité et les animaux qui atteindront les point limites.
Choix des espèces
La régénération de la moelle épinière se produit sur plusieurs jours et implique plusieurs types cellulaires et signaux différents. Sa complexité explique le manque de modèles de régénération in vitro or informatique. Le poisson-zèbre a été sélectionnée pour les raisons suivants : i) Il possède une capacité étonnante à se régénérer spontanément après une lésion de la moelle épinière et à inverser complètement la paralysie ; ii) L'anatomie et la physiologie est particulièrement adaptée à cette étude. Les poissons zèbres sont petits, se reproduisent bien et régénèrent plusieurs organes de manière robuste ; iii) Il s'agit d’une espèce réputée moins sensible pour ces études ; iv) C'est le seul système où nous pouvons étudier la régénération avec de méthodes génétiques ; v) Une base de données existe permettant des comparaisons avec des données existantes. Ce site répertorie les réactifs et les publications de plus de 500 laboratoires utilisant ce modèle. Pour nos expériences de régénération, nous utiliserons des larves et des poissons zèbres adultes. - Pour les expériences larvaires (imagerie in vivo), nous utiliserons des animaux à 3 jours après la fécondation. Les larves permettent l'imagerie in vivo de plusieurs types de cellules de la moelle épinière, pour étudier leur comportement in situ lors de la régénération. Ceci n'est toujours pas possible dans la moelle épinière adulte. - Les larves offrent l'avantage de visualiser les processus in vivo, cependant le taux basal de neurogenèse dans la moelle épinière larvaire est plus élevé que chez les adultes. En outre, les tissus associés à la moelle épinière (c. méningées, squelettiques, vasculaires) et les cellules immunitaires adaptatives non présentes aux stades larvaires pourraient influencer régénération en fournissant des signaux supplémentaires. Par conséquent, la plupart de nos études emploieront des adultes, que seront âgés de 2 à 12 mois. La régénération de la moelle épinière dépend de la taille du poisson zèbre, et des études précèdent ont montré que les animaux de plus de 2,5 cm perdent leur capacité de régénération. Par conséquent, nous utiliserons des animaux mesurant environ 2,5 cm.
OCDE210 essai de toxicité aux premiers stades de la vie
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
5 600 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Du stade œuf jusqu'à trente jours après l'éclosion, ils sont exposés dans l'eau à plusieurs concentrations d'une substance chimique, avec pour effets déclarés possibles malformations, immobilité, hyperventilation et mortalité. À la fin de l'essai, tous les survivants sont tués par surdose d'anesthésique, mesurés et pesés. Le porteur inscrit ces essais dans le cadre réglementaire REACH pour évaluer le danger environnemental de substances, et présente le recours aux poissons comme un "dernier recours" après examen des méthodes sans animaux.
Objectifs
Cette demande d’autorisation concerne la réalisation d’essais de toxicité chez le poisson zèbre aux premiers stades de la vie (ligne directrice OCDE 210) pour répondre à des exigences réglementaires notamment l’enregistrement à l’Annexe 9 du règlement REACH (Enregistrement, Evaluation, Autorisation et Restriction des Produits Chimiques). Les données générées, à partir de ces essais, sont essentiellement utilisées pour évaluer le danger pour l’environnement des substances chimiques et éventuellement contribuer à l’établissement du classement correspondant. Les valeurs obtenues peuvent également servir de données complémentaires pour la démarche d’évaluation des risques liés à l’utilisation de ces substances chimiques. La mise en oeuvre de ces essais dépend à la fois des informations mises à disposition de l’établissement utilisateur par le donneur d’ordre et également de l’objectif spécifique de réalisation. Dans le cadre de l’enregistrement de substances chimiques selon le règlement REACH, la stratégie expérimentale qui est proposée est conforme aux recommandations de l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Économiques), reprises par l’ECHA (Agence Européenne des Produits Chimiques).
Bénéfices attendus
Ces études sont conduites dans le cadre strict de demandes règlementaires et contribuent à améliorer les connaissances des effets sur l’environnement des proquits testés.
Procédures
Les poissons aux premiers stades de leur vie sont exposés à une série de concentrations du produit chimique testé dissout dans l’eau du stade oeuf jusqu'à 30 jour après éclosion.
Impact sur les animaux
Des effets chroniques seront mesurés pour une partie importante du cycle de vie des poissons. L'accent n'est pas mis sur la mortalité des poissons (bien qu'elle soit également enregistrée), mais sur des paramètres chroniques tels que le temps d'éclosion, les malformations, la longueur et le poids du corps. D'autres effets peuvent également survenir dans ce type d’études selon les stades de développement considérés : mortalité, immobilité, hyperventilation ou absence de mouvement respiratoire, anomalie comportementale et/ou corporelle et/ou de croissance.
Devenir
A la fin du test, tous les poissons survivants sont mis à mort par une surdose d'anesthésique, la longueur de chaque poisson est mesurée et ils sont ensuite pesés (poids humide, poids sec).
Remplacement
Le donneur d’ordre doit d'abord évaluer l'ensemble des données disponibles sur les propriétés intrinsèques d'une substance. Des essais supplémentaires ne peuvent être nécessaires que lorsque ces données ne répondent pas aux exigences règlementaires. Il est cependant nécessaire d'envisager l'utilisation de méthodes alternatives et toutes autres options avant de procéder à des essais sur des animaux vertébrés. Il existe des lignes directrices utilisant des embryons ou des larves de poissons mais ces essais ne permettent pas d’évaluer la toxicité sur l’ensemble des premiers stades de la vie et notamment la croissance et le développement. La vérification de la disponibilité de données bibliographiques acceptables dans un cadre réglementaire sur la substance soumise à essai sera effectuée, au préalable, afin de ne réaliser que les essais strictement nécessaires. Si de nouvelles données doivent être produites, les essais sur les animaux ne peuvent être utilisés qu’en dernier recours. Les méthodes alternatives seront évaluées en amont être utilisées au lieu d’essais directs pour tirer des conclusions aux fins de plusieurs exigences d’information. Les méthodes alternatives présentées dans REACH sont les suivantes: l’approche des éléments de preuve, les méthodes in vitro, les modèles de la relation quantitative structure-activité (RQSA) et les références croisées/catégories. Toutefois, les exigences réglementaires varient en fonction des effets spécifiques. Le niveau d’information doit être équivalent à celui atteint avec des essais standard.
Réduction
Pour répondre aux critères statistiques de la ligne directrice 210 de l’OCDE, un essai complet doit être effectué en utilisant un minimum de 80 oeufs fécondés pour chacune des cinq concentrations de la substance d'essai, aussi bien que dans le groupe témoin (et le groupe témoin-solvant si nécessaire). Un essai complet utilise entre 480 et 560 œufs fécondés. Dans certains cas un essai limite, ou un essai limite prolongé, impliquant moins de cinq concentrations comme l’essai complet, peut être acceptable si l’on cherche à établir une Concentration Sans Effet Observé (CSEO) de façon empirique uniquement. L'effectif sera réduit en conséquence entre 160 et 240 œufs fécondés. Si une donnée de CL50 (Concentration Létale pour 50% des organismes) après 96 heures est disponible, il n’est pas nécessaire de tester les concentrations au-delà de cette valeur ou de 10 mg/L si la CL50 est supérieure à cette concentration.
Raffinement
En amont du lancement de l’essai, les données disponibles sur la toxicité aiguë, obtenues de préférence à partir d’essais sur les mêmes espèces et/ou d’un essai de détermination de l’ordre de grandeur, devront être prises en considération pour délimiter la gamme des concentrations d’essai. Cependant, toutes les sources d’informations devraient être prises en compte lors de la sélection des concentrations d’essai, y compris des données de substitution, des données issues d’essais de toxicité aiguës sur des embryons de poissons, etc. Les observations quotidiennes du comportement et des effets seront réalisées sur les oeufs et les larves après éclosion. En cas de malformations et donc d’apparence anormale telles que l’organisme est en état de souffrance considérable et irréversible, l’organisme sera retiré de l’essai. Les animaux concernés seront mis à mort de façon anticipée et comptabilisés comme morts aux fins de l’analyse statistique ultérieure. Durant la phase d'exposition les volumes d'hébergement seront adaptés pour évoluer avec la taille et l'age des poissons du jour 1 jusqu'à la fin de l'essai pour permettre une croissance correcte des animaux. Le nourrissage en conditions d'exposition correspondra à celui distribué en élevage avec des quantités ajustées pour maintenir une bonne qualité d'eau pendant toute la durée de l’essai.
Choix des espèces
Le poisson zèbre fait partie des espèces recommandées dans les différents textes normatifs de référence. Il est recommandé de choisir l’espèce de poissons en fonction de certains critères pratiques importants, tels que leur disponibilité tout au long de l’année, leur facilité d’élevage, leur commodité pour l’essai, ainsi que tous facteurs économiques, biologiques ou écologiques susceptibles d’être pris en considération. Les poissons doivent être en bonne santé et exempts de toute malformation visible. Le poisson zèbre peut être facilement produit et élevé en laboratoire, avec un contrôle des maladies ou des parasites, ce qui permet d’obtenir des sujets sains et d’ascendance connue. Les stades de développement utilisés sont des oeufs fertilisés de poisson au lancement de l’essai jusqu’à des juvéniles de 30 jours après éclosion à la fin de l’essai.
Caractérisation des cellules d’origine d’un cancer pédiatrique du muscle dans un modèle poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
700 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modifiés génétiquement dès l'embryon pour exprimer des mutations cancéreuses, ils sont suivis jusqu'à douze mois et anesthésiés chaque mois pour détecter des tumeurs internes par fluorescence, afin d'étudier l'origine cellulaire de cancers du muscle de l'enfant. Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer des troubles de la nage, une léthargie, des œdèmes et une incapacité à se nourrir, déclenchant la mise à mort. Il affirme que les cellules en culture ne modélisent pas l'apparition des tumeurs et que le poisson zèbre partage 80 % de ces programmes génétiques avec l'humain.
Objectifs
Les cancers touchent chaque année plus de 2500 enfants en France. On estime qu’un enfant sur 440 sera atteint par un cancer avant 15 ans. Malgré des essais cliniques, leur taux de survie ne s’améliore plus depuis 20 ans. Il est donc indispensable de développer des traitements plus efficaces et moins toxiques. Ce projet vise à déterminer si les cancers du muscle fréquemment observés chez les enfants et les adolescents peuvent dériver non pas seulement de la transformation de cellules du muscle mais aussi d’une autre population de cellules. Cette question est importante, car on sait que la réponse aux chimiothérapies peut varier en fonction de la cellule à l’origine des tumeurs. In vitro, il a été montré que lorsqu’on exprime des gènes mutés, fréquemment retrouvés chez les patients atteints par ces cancers, dans les cellules neuronales, celles-ci prolifèrent et expriment des marqueurs de ces cancers. Il est maintenant nécessaire de vérifier à l’aide du modèle de poisson que lorsque ces mutations sont introduites dans ces cellules neuronales, elles conduisent bien à la formation de tumeurs. L’objectif de ce projet est de pouvoir déterminer si des cellules neuronales constituent l’une des cellules d’origine des cancers du muscle chez l’enfant lorsqu’elles expriment des mutations fréquemment retrouvées dans ces pathologies. Or, on sait que la réponse aux traitements peut varier en fonction de la cellule d’origine du cancer. Le poisson est un modèle de vertébré particulièrement utile pour l’étude de la génétique du cancer. Les gènes et programmes génétiques impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'Homme et le poisson et de très bons outils sont disponibles pour reproduire les altérations génétiques trouvées des patients dans les cellules de poissons. Pour tester l’hypothèse d’une origine neuronale de certains cancers du muscle chez l’enfant, ces mutations seront introduites dans des embryons de poissons. Ensuite, un suivi attentif de la formation de tumeurs sera réalisé sur une durée 12 mois maximum. Le nombre de poisson a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique des résultats.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre l’origine des cancers des muscles chez les enfants. Cette étape est indispensable pour adapter la prise en charge thérapeutique des jeunes patients, car la cellule d’origine des cancers impacte la réponse aux traitements.
Procédures
Pour les poissons zèbres de 5 jours à 3 mois : Les poissons seront transférés provisoirement de leur aquarium à un autre plus petit (1 litre), par groupe de 3, 2 fois par semaine, pour réaliser l’observation attentive de l’apparition des tumeurs et d'éventuels signes de mal-être. Durée maximale de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 24. Les poissons sont également suceptibles d'etre anesthésiés et observé sous une loupe 1 fois par mois pour évaluer la présence de tumeur interne (fluorescence). Durée de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 3. Pour les poissons zèbres de plus de 3 mois : Les poissons seront transférés provisoirement de leur aquarium à un autre plus petit (1 litre), par groupe de 5 poissons, 1 fois par semaine, pour réaliser l’observation attentive de l’apparition des tumeurs et d'éventuels signes de mal-être. Durée maximale de l'intervention : 15 minutes. Nombre maximal : 36. Les poissons sont également suceptibles d'etre anesthésiés et observé sous une loupe 1 fois par mois pour évaluer la présence de tumeur interne (fluorescence). Durée de l'intervention : 10 minutes. Nombre maximal : 9.
Impact sur les animaux
La fréquence d'observation a été définie de manière à anticiper la détection des tumeurs tout en réduisant le malêtre animal associé à leur manipulation répétée. L'observation attentive des poissons nécessite leur transfert transitoire dans un autre bac (par groupe de 3 ou 5 poissons suivant leur âge). Les poissons seront également légèrement anesthésiés (Tricaïne methasulfonate tamponnée à pH7, 100mg/L) une fois par mois pour permettre d'observer par fluorescence, d'eventuelles tumeurs interne aux poissons. Chez les patients, aucun symptôme majeur n'est observé dans les premiers stades de la maladie en dehors de l'apparition d'une masse préférentiellement proche des muscles. De fait, certains animaux peuvent présenter des signes de malêtre dus au développement de ces tumeurs. Les signes les plus précoces comprennent des modifications de la nage, une incapacité à maintenir sa position dans la colonne d'eau, une respiration accélérée passagère ou une apathie. Les animaux qui présentent un ou plusieurs de ces signes cliniques seront identifiés et observés pendant une durée maximale de 48h. En absence d’amélioration des signes mal-être listés ci-dessus, les poissons seront mis à mort. La présence de tumeur, le hérissement des écailles, la présence d’oedèmes, une léthargie (immobilité au fond de l’aquarium) prolongée ou une incapacité à se nourrir constituent des points limites nécessitant une mise à mort immédiate.
Devenir
En cas de mal-être, les poissons zèbres seront mis à mort. Dans le cas d'apparition de tumeurs, afin de récupérer les tumeurs, et permettre leur analyse, les poissons seront mis à mort. A la fin de la procédure (soit à 1 an maximum), les poissons seront mis à mort pour prévenir la survenu d'éventuelle altération tardive du à la procédure.
Remplacement
Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer expérimentalement les conséquences des modifications génétiques impliqués dans les maladies humaines telles que le cancer. Les cellules cancéreuses humaines en culture sont très utiles pour comprendre les mécanismes moléculaires en place lorsque le cancer est déjà établi. En revanche, elles ne représentent pas la complexité des comportements cellulaires là où la tumeur est établie, l’interaction avec les tissus sains et le reste de l’organisme. Les cellules cancéreuses en culture ne peuvent pas modéliser les étapes permettant l’apparition et l’évolution temporelle des tumeurs.
Réduction
Dans un but de réduction et en accord avec la littérature scientifique, la taille de chaque groupe a été calculée pour obtenir des résultats significtifs tout en incluant le minimum d'individus dans cette étude. Des tests statistiques seront utilisés pour s'assurer de la significativité des résultas. De plus, l’analyse des caractéristiques biologiques des tumeurs sera réalisée sur le même groupe que la mesure du taux d’incidence des tumeurs. Dans la mesure du possible, nous essaierons de grouper au maximum les manipulations génétiques de manière à mettre en commun les groupes témoins et réduire ainsi le nombre total d’animaux utilisés. Nous réaliserons en priorité le modèle transitoire (350 poissons) puis nous développerons le système constitutif (350 poissons) si besoin, et en cas d’échec du premier modèle (soit un maximum de 700 poissons).
Raffinement
Tout signe de mal-être des animaux potentiellement dus au développement de tumeurs pourront être prévenus par une surveillance attentive des poissons à la recherche de signes ou de changements de comportement généralement associés à une maladie par l’application de critères d’arrêt définis.
Choix des espèces
Le poisson zèbre représente un bon organisme modèle pour l'étude de la génétique du cancer. Les gènes et programmes génétiques impliqués dans le développement des cancers sont conservés à 80% entre l'Homme et le poisson et nous disposons de très bons outils pour reproduire les altérations génétiques trouvées dans les tumeurs humaines spécifiquement dans certains types de cellules dans les poissons adultes. D'autres espèces d'animaux pourraient être envisagées comme alternative au poisson zèbre, tels que Caenorhabditis elegans et Drosophila melanogaster, mais ce sont des invertébrés dont de nombreux organes diffèrent considérablement de l’Homme, ce qui limite leur utilité pour l’étude du cancer. Le poisson représente une bonne alternative à la souris à la fois parce qu'il est un vertébré moins évolué et parce qu'il offre d'excellentes possibilités de manipulation génétique pour tester l'influence de gènes particuliers sur le développement tumoral. Les micro-injections de vecteurs ADN seront réalisées dans des embryons au stade d’une cellule. L’étude de la survenue des tumeurs primaires sera faite dans des poissons juvéniles ou adultes (âge compris entre 4 et 52 semaines) en fonction de la vitesse d’apparition des tumeurs.
Maintien de lignées de poisson zèbres sans phénotype dommageable, pour l’étude de mécanismes impliqués dans un type de mémoire appelé l’habituation
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
16 000 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie tuée et les hétérozygotes gardés vivants pour la reproduction jusqu'à dix-huit mois. À deux mois, chaque poisson est anesthésié le temps qu'un morceau de nageoire caudale soit coupé au scalpel pour le génotypage, les poissons au génotype non recherché ou présentant un phénotype visible étant ensuite tués. Le porteur affirme que l'ablation d'un fragment de moins de 0,25 mm² reste sans conséquence et que la nageoire repousse en quinze jours. Il justifie l'usage du poisson zèbre par un cerveau de vertébré parmi les plus simples et affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut le remplacer pour l'étude de la mémoire.
Objectifs
Comprendre comment les animaux apprennent et forment des souvenirs est une question fondamentale en neurosciences. Pour répondre à cette question des poissons zèbres sont utilisées car leur cerveau est relativement simple (~100 000 neurones), petit (0,25 mm3) et l'activité de tous les neurones peut être mesurée de façon indépendante. Lorsqu'il est stimulé par un flash de lumière ou un bruit, le poisson zèbre réagit par un sursaut. En cas d'éclairs ou de bruits répétés, cette réponse diminue, formant un type de mémoire connu sous le nom d’habituation. Ce projet consiste à génotyper des poissons zèbre âgès de 2 mois, issus de lignées à phénotype non dommageable afin de maintenir les individus avec un génotype voulu. Le génotypage se fera sur une biopsie de nageoire caudale
Bénéfices attendus
L'étude de l'habituation chez le poisson zèbre nous permettra de mieux comprendre les effets positifs de certaines voies de signalisation sur l''habituation et les mécanismes cellulaires mis en place lors de celle-ci. Les défauts d'habituation observés dans les cas de pathologies psychiatriques comme la schizophrénie ou l’autisme chez l'homme nous montrent l'importance de cette étude avec différentes mutations dans des protéines impliquées dans l'habituation.
Procédures
Les poissons âgès de 2 mois, seront génotypés par prélèvement d 'une partie infime de leur nageoire caudale afin de ne garder que les individus voulus. Le génotypage sera fait par balnéation et anesthésie du poisson; un unique bout de la nageoire caudale sera découpée à l'aide d'un scalpel et transférée dans un tube. Le temps total de l'anesthésie sera inférieur à 2 min. Les poissons seront placés rapidement dans un bac de réveil rempli d'eau, surveillé jusqu'à leur réveil, avant d'être transférés dans leur aquarium. Les poissons sont maintenus deux par deux dans un aquarium avec un séparateur. Après génotypage, les poissons hétérozygotes sont maintenus dans les aquariums en nombre suffisant pour leur permettre de se déplacer en banc. Cette intervention concerne les 16 000 poissons de cette demande et n'aura lieu d'une seule fois à 2 mois.
Impact sur les animaux
Le génotypage des poissons se fera par découpe d'une extrémité de la nageoire caudale d'une surface inférieure à 0.25 mm2 sous anesthésie dans un délai très court. Les nuisances ou effets indésirables se situent au moment de l'endormissement , du réveil ou de la non repousse de la nageoire (qui doit être totale au bout de 15 jours). Tout phénotype visible entrainera la mise à mort immédiate du poisson.
Devenir
Les poissons une fois génotypés seront divisés en deux catégories. Les poissons +/+ seront mis à mort car nous souhaitons maintenir les lignées sont forme hétérozygote. Les poissons hétérozygotes +/- seront maintenus en vie pour être mis en croisement afin de faire des expériences d'habituation sur leurs descendants âgés de moins de 5 jours et pour être mis en croisement pour obtenir la génération suivante 6 mois plus tard. Ces poissons +/- seront maintenus en vie jusqu'à 18 mois si aucun point limite n'apparait avant.
Remplacement
L'étude de la mémoire et du comportement ne peut se faire que sur un cerveau entier, dans des animaux vivants. Le poisson zèbre présente le modèle vertébré ayant un cerveau le plus simple nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre la plasticité neuronale dans le cerveau des vertébrés. En tant que vertébrés, le cerveau et le génome du poisson zèbre partagent des homologies majeures avec les mammifères et les humains. Travailler sur un modèle vertébré est essentiel pour nos projets visant à découvrir les mécanismes conservés de plasticité et leur pertinence potentielle pour la fonction psychiatrique humaine et le dysfonctionnement du cerveau dans les maladies neurologiques. Aucun modèle cellulaire in vitro ne peut se substituer à cette étude. Nous utilisons des lignées transgéniques connues pour être impliquées dans l'habituation afin de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu et mieux caractériser l'action de certaines molécules impliquées dans les défauts de mémoire.
Réduction
Les lignées à génotyper sont sans phénotype dommageable même à l'état homozygote mais sont en plus maintenues sous forme hétérozygotes pour trois raisons. Nous devons les croiser avec les individus sauvages afin d'éliminer les mutations indésirables spontannées et la consanguinité. Les expériences de comportement, faites sur leur descendance âgés de moins de 5 jours, nécessite des poissons ayant tous les génotypes, génotypes possibles qu'en croisant des hétérozygotes par des hétérozygotes. Pour les poissons portant une simple mutation (lot1), nous devons garder à la naissance 50 embryons que nous laisserons se développer jusqu'à 2 mois avant de procéder au génotypage. Nous devons également maintenir les poissons doubles mutants sous forme double hétérozygote (lot2). Nous en garderons 100 au moment de leur naissance afin d'avpoir, après génotyapge 25 double mutants hétérozygotes (+/-;+/-).
Raffinement
Le génotypage sera fait par balnéation et anesthésie du poisson puis la nageoire caudale sera découpée . Le temps de cette étape durera moins de 2 min. Les poissons seront placés immédiatement dans un bac rempli d'un litre d'eau, surveillé obligatoirement jusqu'à leur réveil, avant d'être transféré dans leur aquarium. Une fois par jour des artémias vivants leur sont donnés en plus de deux nourritures sèches. Après le génotypage par PCR, qui durera moins de 48h, les poissons hétérozygotes sont regroupés et maintenus dans les aquariums en nombre suffisant (>8) pour leur permettre de se déplacer en banc. En plus de la nourriture sèche, une fois par jour des artémias vivants leur sont donnés afin de maintenir leur activité de prédation. A tout moment, tout poisson présentant un comportement anormal, ou un des points limites tels que fréquence operculaire/branchique, problème de flottabilité, immobilité, mouvements natatoires, mouvements anormaux suite à la coupure de la nageoire, non repousse de la nageoire, sera euthanasié immédiatement. Les poissons seront observés deux fois par jour au moment de leurs nourrissages.
Choix des espèces
Le poisson zèbre présente le modèle vertébré ayant un cerveau le plus simple nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre la plasticité neuronale dans le cerveau des vertébrés. En tant que vertébrés, le cerveau et le génome du poisson zèbre partagent des homologies majeures avec les mammifères et les humains. Travailler sur un modèle vertébré est essentiel pour nos projets visant à découvrir les mécanismes conservés de plasticité et leur pertinence potentielle pour la fonction psychiatrique humaine et le dysfonctionnement du cerveau dans les maladies neurologiques. le génotypage se fait à 2 mois car à ce stade la nageoire caudale est assez développée pour qu'un petit bout soit prélevé sans conséquences et que celle-ci repousse en l'espace de 15 jours.
Caractérisation du processus de calcification cardiovasculaire chez le zebrafish
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
168 760 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent des imageries répétées, des régimes riches en graisses, des injections, des chocs thermiques, des clips de nageoire pour génotypage et le criblage de nombreuses molécules, pour caractériser la calcification cardiovasculaire, une partie étant issue de lignées à "phénotype nocif". Le porteur indique n'attendre aucune souffrance modérée ou grave mais avoir déclaré ce niveau par précaution, et précise qu'aucune analgésie ne peut être mise en place. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro et ex vivo restent biaisés et que l'animal demeure "crucial".
Objectifs
La calcification cardiovasculaire (CCV) est une anomalie pouvant toucher différents tissus tels que les valves cardiaques, le myocarde ou les vaisseaux sanguins. La calcification vasculaire, qui inclut les pathologies de calcification de l’artère coronaire, touche 90% des hommes et 67% des femmes de plus de 70 ans. Malgré l’incidence mondiale de ces maladies, les traitements sont très limités, ce qui conduit à des taux de morbidité et mortalité élevés pour ces pathologies. De plus, les mécanismes exacts conduisant à la CCV restent mal définis, limitant la découverte de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous utiliserons le modèle poisson zèbre pour clarifier les mécanismes de la CCV et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques en nous appuyant (i) sur la facilité d’imagerie in vivo (ii) les possibilités de criblage haut débit (test de centaines de molécules sur les poissons présentant une CCV) et (iii) la conservation entre mammifères et poissons zèbres de la plupart des voies impliquées dans les systèmes cardiovasculaires et osseux (facilitant ainsi la translation des données générées chez les poissons zèbres vers les patients). Pour cela, nous caractériserons la dynamique cellulaire et les interactions au niveau moléculaire à travers différentes voies et signalisations, ainsi que l'impact fonctionnel de la calcification in vivo chez des mutants de poisson zèbre présentant des phénotypes de calcification cardiovasculaire. Cette caractérisation permettra l'établissement de nouveaux modèles génétiques de calcification cardiovasculaire, qui pourraient être utilisés dans la recherche de nouvelles thérapies pour bloquer ou inverser la calcification cardiovasculaire, ayant un impact considérable sur la population européenne, gravement touchée par ces maladies.
Bénéfices attendus
Notre projet a pour objectifs d’identifier les voies de signalisation impliquées dans la calcification cardiovasculaire puis de tester différentes thérapeutiques pour réduire les taux de morbidité et mortalité associés à cette pathologie.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes: 1. Microscopie d'imagerie en direct avec coloration in vivo pour les tissus calcifiés : -45 minutes de coloration et de lavage de l'excès de teinture - 10 minutes d'imagerie par point de temps - Expérience de 30 jours (maximum) - Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Dans ce cas, nous soumettrons l'animal à cette procédure au maximum 7 fois (5, 8, 12, 15, 20, 25 et 30 dpf) dans les 30 jours. 2. Échocardiographie : - 10 minutes d'imagerie par point de temps - Expérience de 60 jours (maximum) - Lorsque cela est possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. Dans ce cas, nous soumettrons l'animal à cette procédure au maximum 4 fois (60, 90 et >90 dpf) à partir de 60 dpf. 3. Alimentation avec des régimes riches en graisses et occidentaux - 5 minutes par tétée (2 à 3 tétées par jour) - Expérience de 90 jours - les animaux seront nourris ces jours-ci pendant une partie ou la totalité de cette période 3. Traitements médicamenteux, y compris pour l'ablation de populations cellulaires spécifiques Les médicaments seront administrés par l'eau ou par injection intrapéritonéale. - Injection intrapéritonéale avec un temps d'anesthésie inférieur à 5 minutes. - Les poissons seront maintenus en traitement médicamenteux pendant une durée maximale de 15 jours et seront analysés à différentes étapes. L'administration du médicament se fera en doses uniques ou répétées en fonction de la durée de vie du médicament et des périodes d'absorption. 4. Choc thermique local - Moins de 1 minute pour le choc thermique - 10 minutes d'imagerie par point de temps - Expérience de 90 jours (maximum) - Dans la mesure du possible, nous suivrons le même animal pour réduire la variabilité et appliquer les principes des 3R. 5. Clip d'aileron pour le génotypage - Moins de 1 minute par clip d'aileron - Les poissons seront maintenus isolés pendant 3 jours (7 jours max., en cas de problème avec le génotypage/PCR) 6. Maintien de colonies d'animaux génétiquement modifiés établis avec un phénotype nocif Les animaux seront maintenus jusqu'à l'âge adulte et croisés pour une nouvelle progéniture jusqu'à 2 ans après la fécondation.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant impacter le bien être animale sont les risques de malformation squelettique et les dysfonctionnements du système cardiovasculaire. Certaines des lignées génétiques peuvent également présenter une croissance réduite (par rapport aux lignées de type sauvage) sans aucun effet sur les comportements de nage ou d'alimentation. À ce stade, nous ne prévoyons aucune souffrance modérée ou grave. Cependant, nous ne pouvous exclure des effets inattendus sur quelques animaux, c'est pourquoi nous avons déclaré les procédures en modéré et que nous maintiendrons cependant une surveillance constante, en particulier chez les animaux subissant des expériences d'ablation cellulaire et des traitements médicamenteux.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour prélèvements d'organe et analyse (histologique, moléculaire)
Remplacement
Notre projet se déroule dans la continuité de tests in vitro. Cependant, ces modèles ne permettent pas de prendre en considération les caractéristiques multifactorielles du scénario in vivo. Des travaux récents ont proposé comme alternative l’utilisation ex vivo d’aorte de souris ou de rat. Là encore, les résultats peuvent être biaisés par les conditions de culture, la rigidité de la matrice extracellulaire, régulant artificiellement les capacités des cellules cardiovasculaires à se différencier en lignée ostéoblastique. L'utilisation de modèles animaux reste donc cruciale.
Réduction
La variabilité interindividuelle, particulièrement importante chez les jeunes poissons zèbres (stades larvaires), justifie l'exigence d'un plus grand nombre d'animaux pour atteindre la puissance statistique minimale pour valider les résultats. De plus, la calcification cardiovasculaire est un phénotype progressif et très variable, nécessitant donc un plus grand nombre d'animaux pour un résultat robuste. Néanmoins, comme chaque fond génétique peut être plus ou moins variable, nous réaliserons nos expériences en plusieurs tours pour augmenter notre n de manière progressive et éviter d'utiliser des animaux en excès si la puissance statistique est atteinte avec un n inférieur. Par conséquent, le nombre d'animaux demandé est le plus grand nombre d'animaux que nous pouvons utiliser. La calcification cardiovasculaire étant un processus très dynamique et hétérogène, nous proposons d'utiliser et de générer un grand nombre de lignées génétiques pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires contribuant à établir et aggraver le phénotype de calcification. En utilisant des approches d'imagerie en direct, nous pourrons suivre les mêmes animaux et voir la progression individuelle de la calcification, réduisant ainsi le nombre d'animaux généralement utilisés pour caractériser et quantifier les échantillons post-mortem et les coupes histologiques de tissus.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des aquariums de différentes tailles avec les densités d’hébergement suivantes : - Pour les bacs de 3,5l : 1 à 20 animaux - Pour les bacs de 8l : 20 à 40 animaux Le système contrôle la température (27-29°C), la conductivité (500-600 uS)et le pH (7-8)de l’eau. Le cycle lumineux est de 14h jour pour 10h nuit. L’enrichissement est assuré par les courants d’eau dans les aquariums ainsi que par l’ajout de nourriture vivante (artémias). Les aquariums sont bleus et permettant ainsi de maintenir un éclairage adapté. Les accouplements sont réalisés dans des aquariums dédiés mimant les conditions naturelles d’accouplement. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel hautement qualifié dans la détection d’anomalie du poisson zèbre. Des points limites seront fixés de manière à détecter précocement tout signe de souffrance et à prendre toutes les mesures nécessaires à la réduire. Lorsqu’une immobilisation des poissons sera nécessaire, une anesthésie générale sera réalisée. Au vu des procédures et des phénotypes attendus, aucune analgésie ne peut être mise en place.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un organisme modèle avec des caractéristiques de développement dès son stade embryonnaire (la transparence des embryons et des larves jusqu'à plusieurs semaines après la fécondation) qui permettent des techniques d'imagerie qui ne sont pas possibles avec d'autres modèles de vertébrés. Sa petite taille qui facilite son hébergement et sa manipulation, et son nombre élevé de descendants, idéal pour les études à haut débit, sont d'autres atouts de ce modèle. De plus, les techniques et outils de transgenèse et de mutation dans cet organisme modèle sont très développés, donnant la possibilité de différentes méthodes pour des études spécifiques des gènes et voies de signalisations. De plus, la forte homologie constatée entre le poisson zèbre et les mammifères est également un point fort de cet organisme. L’extraordinaire capacité de régénération tissulaire que possède le poisson zèbre tout au long de sa vie en fait un organisme ayant un grand intérêt d’un point de vue translationnel. Pour notre projet, la possibilité d'acquérir des images en temps réel à différents stades de développement, ainsi que celle de cibler des cellules spécifiques avec des techniques d'ablation génétique, font du poisson zèbre l'organisme idéal pour l'expérimentation nécessaire au bon déroulé de ce projet. Nous étudierons l'établissement de la calcification cardiovasculaire au cours du développement et à l'âge adulte pour comparer l'apparition précoce et tardive de la maladie. Pour cela, nous nous intéresserons aux stades larvaire et juvénile (5, 8, 12, 15, 20, 25, 30 et 60 dpf) montrant les différents stades clés du développement cardiovasculaire ainsi qu'aux stades adultes (90 et >90 dpf ) où l'on peut observer un tissu adulte sain et malade chez les jeunes adultes (90 dpf) et chez les animaux âgés (>90 dpf).
Impact de la neuroinflammation et des encéphalites virales sur le développement précoce du système nerveux
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
10 345 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à sévère, une partie gardée vivante comme géniteurs et les autres tués à l'issue. Aux stades larvaires surtout, ils sont infectés par des virus neuroinvasifs ou reçoivent des injections de cytokines et une activation optogénétique, pour étudier l'impact d'une inflammation précoce sur le système nerveux. Le porteur indique que l'infection peut provoquer perte d'équilibre, hémorragies, arythmies et nécrose cérébrale, les larves atteignant un point limite étant alors anesthésiées. Il affirme que ces interactions complexes ne peuvent être "totalement remplacées" in vitro, tout en signalant un modèle mathématique réduisant le nombre d'animaux.
Objectifs
L’objectif général de ce projet est de comprendre les mécanismes par lesquels une neuroinflammation précoce peut conduire à des déficits neurologiques ou des maladies psychiatriques, en utilisant le poisson-zèbre comme modèle animal. D’une part, nous étudierons les conséquences de cette inflammation dans le contexte d’une infection virale neuroinvasive, comme modèle d’encéphalite virale du nouveau-né. Nous utiliserons pour cela le modèle d’infection par le virus de Sindbis (SINV), bien établi, et nous développerons un autre modèle par le virus de herpès simplex (HSV-1). Nous chercherons à distinguer les impacts du virus lui-même sur ceux de l’inflammation dans les déficits neurologiques observés. D’autre part, nous analyserons les impacts d’une inflammation stérile sur le système nerveux en cours de développement ou de réparation. L’inflammation peut se manifester de diverses façons avec l’induction du plusieurs cytokines (molécules permettant la communication entre cellules) aux effets parfois antagonistes. Pour clarifier notre analyse, nous aurons essentiellement recours à l’injection de cytokines recombinantes. Nous développerons par ailleurs des systèmes optogénétiques pour induire l’expression de cytokine in vivo sans avoir recours à une injection. Afin de disséquer les mécanismes impliqués, nous aurons recours à différents mutants dans les voies de signalisation des cytokines ou dépourvus de certains types cellulaires importants. Nous vérifierons d’éventuelles modifications neurologiques chez ces mutants adultes. Nous étudierons le comportement de nos animaux ainsi que la morphologie et la composition cellulaire du système nerveux, avec un intérêt plus particulier pour le système dopaminergique (système particulier de transmission nerveuse) impliqué dans plusieurs maladies psychiatriques qui ont été liées à des infections précoces.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre de mieux appréhender le rôle de la neuroinflammation dans les déficits neurologiques constatés après une encéphalite d’origine infectieuse ou stérile. Ceci devrait aider à décider du bien-fondé des traitements anti-inflammatoires dans ces situations. L’identification de gènes protecteurs contre l’infection sans effet indésirables lors d’une surexpression par des neurones ouvrira de nouvelles pistes vers le traitement ou la prévention des encéphalites virales par thérapie génique.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigile. Pour du génotypage de routine, des prélèvements d'un fragement de nageoire seront réalisés sous anesthésie. Microscopie intravitale effectuée sous anesthésie (durée maximale une heure, avec des sessions quotidennes pendant 10 jours au plus). Tests de comportement: enregistrement de la locomotion spontanée ou après stimuli lumieux ou sonore (durée maximale 1 heure, avec deux sessions par semaine au plus). Suivi d'une infection virale établie par microinjection sous anesthésie (pendant 7 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par microinjection de protéines sous anesthésie (pendant 14 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par activation optogétique (pendant 3 jours au plus). Suivi des conséquences d'une inflammation précoce obtenue par transgénèse (pendant 7 jours au plus). Suivi de le régénération du cerveau après arrêt d'une infection virale (pendant 17 jours au plus).
Impact sur les animaux
Les infections virales des larves sont susceptibles d’entraîner les effets suivants : perte d’équilibre, hyperactivité, apathie, hémorragies localisées, arythmies cardiaques, oedèmes, et ceci tant que l’infection persiste. Dans les cas d’infection létale (attendue chez certains mutants notamment) un assombrissement du cerveau sera préalablement observé, traduisant un début de nécrose, qui entraînera une anesthésie profonde évitant tout décès non traité. Les injections de cytokines inflammatoires (ou leur équivalent optogénétique) devraient causer hyperactivité ou apathie, comportements anxieux, arythmies cardiaques. Ces effets devraient être transitoires (moins de 24 heures) pour la plupart. Lors des tests de surexpression des ISGs (gènes induits par les interférons, qui sont des cytokines antivirales) par des neurones, ces effets sont attendus pour les ISGs qui seraient neurotoxiques. Dans les cas les plus extrême une nécrose localisée pourrait être observée, entraînant là aussi une anesthésie définitive. Dans les expériences de régénération du cerveau chez les juvéniles, une perte d’appétit et une apathie globale est attendue. Chez les adultes mutants pour les gènes immunitaires d’intérêt, une susceptibilité aux infections opportunistes peut se traduire par l’apparition plus précoce de signes classiques tels que cachexie, lordose, pétéchies, ou nage anormale.
Devenir
Les animaux utilisés à des fins d'élevage et entrant dans les procédures de génération de lignées transgéniques, de génotypage de routine, ou de caractérisation de lignées potentiellement délétères, seront conservées pour servir de géniteurs. Tous les autres animaux seront mis à mort à l'issue de la procédure.
Remplacement
Nous travaillons sur des interactions complexes entre les nombreux types cellulaires du système nerveux, du système immuntiaire, et un pathogène, qui ne peuvent être totalement remplacées par des modèles in vitro ou in silico. Nous avons toutefois développé un modèle mathématique de la progression virale et de la réponse interféron de type I dans le système nerveux et la périphérie, à partir de nos données d'imagerie et de mesure d'expression des gènes par biologie moléculaire. Ce modèle permet de déduire certains paramètres expérimentaux, comme l'évolution du titre viral, réduisant le nombre d'animaux nécessaires à certaines de nos expériences.
Réduction
Les nombres d'animaux employés dans les expériences sont basés sur notre expérience passée pour des tests comparables, nous permettant de prédire la variance attendue et donc de réaliser des tests de puissance statistique. Lorsqu'il n'y a pas d'nterférence attendue entre deux tests, les animaux sont réutilisés pour plusieurs mesures.
Raffinement
Grâce à la transparence de la larve de poisson-zèbre, il nous est possible de mesurer la localisation de l'infection et la charge virale par des approches d'imagerie intravitale non-invasives. Pour limiter la douleur liée à l'infection de la larve sans interférer avec le déroulement de l'expérience, nous suivons les larves infectées en mesurant un score clinique quotidien; si l'infection est avancée avec atteinte de point limite, les larves sont anesthésiées pour éviter toute souffrance, tout en nous permettant de continuer à suivre l'évolution de l'infection.
Choix des espèces
Le poisson-zèbre est un modèle animal bien établi. En tant que vertébré, les principes de fonctionnement de ses systèmes nerveux et immunitaire sont semblables aux nôtres. Sa manipulation génétique est aisée et la petite taille, la transparence, et l’anesthésie facile de ses larves en fait un excellent système pour la microscopie intravitale. De nombreuses lignées transgéniques fluorescentes permettent d’observer la localisation et/ou l’activité de diverse populations neurales ou immunes. Combinées avec des pathogènes eux-mêmes porteurs de gènes fluorescents, on peut suivre en temps réel la propagation d’une infection et la réponse immune et neurale. La très grande majorité de nos expériences seront réalisées au stade larvaire, qui se prête le mieux à la microscopie et requiert le moins d’espace. Toutes les infections, notamment, seront réalisées à ce stade, avec des animaux maintenus en plaques multi-puits en incubateur dans un laboratoire de sécurité de niveau 2, facilitant le confinement des pathogènes. L’élevage de poissons adultes aura pour finalité principale la production des larves destinées à nos expériences. Si le(s) transgène(s) et/ou la mutation portés par ces adultes sont potentiellement dommageables, nous mesurerons cela aux stades juvénile et adulte. Les conséquences à long terme de certaines manipulations au cours du stade embryonnaires seront évaluées chez des poissons juvéniles.
Etude de la physiopathologie du syndrome de Marfan dans un modèle de poisson-zèbre
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
2 814 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Porteurs de mutations reproduisant le syndrome de Marfan, ils subissent des prélèvements de nageoire, des exercices de nage forcée pour mesurer vitesse et endurance et un protocole d'entraînement de plusieurs semaines, pour étudier les atteintes musculo-squelettiques de la maladie. Le porteur décrit une possible émaciation et des comportements d'anxiété ou de résignation, avec arrêt du protocole au-delà de 20 % de perte de poids. Il affirme que le poisson zèbre est le modèle vertébré "le plus simple" pour cette étude, plus rapide et moins coûteux que le rongeur.
Objectifs
Le syndrome de Marfan (SM) est une maladie génétique rare (1/5000), touchant aussi bien les hommes que les femmes. Les patients présentent des atteintes cardiovasculaires, oculaires et musculo squelettiques. Les anomalies cardiaques sont responsables d’une mortalité précoce, qui est maintenant contrôlable grâce aux progrès dans la prise en charge de la maladie. Par contre, la fatigue chronique et la moindre endurance physique sont des affections fréquentes des patients atteints de SM avec un impact important sur la qualité de vie, aussi l’intérêt de recherche s’est tourné vers une meilleure compréhension des atteintes musculosquelettiques. Une fragilité des tissus de soutien et un déficit musculaire, à l’origine d’un stress accru sur le système musculosquelettique, pourraient participer à ces symptômes. Une étude clinique a rapporté un déficit en masse maigre dès l'enfance et s'aggravant avec l'âge, et la pertinence d'un programme d'entraînement est actuellement évaluée. Comprendre les mécanismes à l’origine de ce déficit musculo-squelettique pourrait permettre l’identification de cibles thérapeutiques spécifiques et le développement de traitements. Nous proposons donc de développer un modèle animal original de la maladie et d’explorer les paramètres osseux et musculaires. Le poisson zèbre représente le système vertébré le plus simple disponible à ce jour pour évaluer l’impact d’une mutation d'un gène associé à une maladie génétique sur le système musculo squelettique à l’échelle tissulaire, cellulaire et moléculaire et de pouvoir évaluer les bénéfices éventuels d’un entrainement. Nous souhaitons donc développer et caractériser des lignées de poisson zèbre portant des mutations équivalentes aux mutations responsables du SM chez l'Homme. Leur comparaison permettra de mieux comprendre la physiopathologie du SM, afin d’identifier de possibles cibles thérapeutiques et d’optimiser les protocoles d’entrainement personnalisé.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux documenter la physiopathologie du SM, qui est à l’heure actuelle mal comprise, et d’identifier des stratégies thérapeutiques allant de programme d’entrainement à des approches pharmacologiques qui pourront toutes deux être testées dans ce modèle poisson -zèbre de la maladie.
Procédures
-Prélèvement unique à la nageoire caudale pour génotypage sous anesthésie -Mesure mensuelle de la taille et du poids sous anesthésie -Analyse locomotion et comportement; durée 3h avec acclimatation; isolement -Exercice de nage forcée pour détermination de la vitesse maximale; durée
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus concernent essentiellement le phénotype associé à la perte de fonction du gène muté chez les patients atteints du syndrome de Marfan, qui devrait reproduire le syndrome de Marfan humain, et associe des malformations cardiovasculaires, oculaires et musculo-squelettiques. D’après les quelques données de la littérature, le développement du phénotype chez le poisson zèbre ne s’observe qu’à l’état homozygote (c'est-à-dire quand les 2 exemplaires du gène sont mutés) ou sur des doubles mutants. Cependant, le SM étant une maladie dominante (c'est-à-dire que la mutation sur un seul exemplaire du gène suffit à déclencher la maladie) chez l’Homme, une attention sera portée sur les hétérozygotes (un seul exemplaire du gène muté). En lien avec ces atteintes, les individus peuvent présenter une perte de poids, ou émaciation, accompagnée de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qui sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Pour les procédures expérimentales, le prélèvement caudal pour le génotypage est réalisé sous anesthésie et les animaux recouvrent leur capacité à nager normalement dès le réveil. L’analyse du comportement de nage nécessite l’isolement du poisson dans le bac où le film est réalisé, isolement qui est maintenu pendant une durée maximale de 3 heures. Pour la nage forcée, la durée de nage à la vitesse maximale est une source de stress, mais ne pourra excéder 3 minutes. L'ensemble des points limites est détaillé dans chaque procédure.
Devenir
A l'issue des différentes procédures les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus pour des analyses histologiques et de l'expression génique (taille des fibres musculaires, structure des tissus de soutien, analyse du squelette, inflammation).
Remplacement
Comprendre la physiopathologie du SM nécessite l’utilisation d’un organisme intégré dans lequel l’étude des différents systèmes (cardiovasculaire, musculosquelettique) altérés dans cette maladie soit possible de même qu’une évaluation comportementale transposable à l’Homme. A ce jour, ces informations ne peuvent être obtenues à partir de modèles non animaux (cultures cellulaires ou organoïdes). Le poisson -zèbre représente pour cela le modèle vertébré le plus simple à ce jour, avec de nombreux systèmes moléculaires et cellulaires conservés avec les mammifères, et présente l’avantage de pouvoir facilement réaliser de la mutagenèse in vivo et produire des lignées transgéniques d’intérêt.
Réduction
A notre connaissance, 3 équipes ont développé des modèles de SM (perte de fonction) mais qui ne sont pas rendus disponibles à ce jour. De plus, dans l’idée de réaliser des corrélations phénotype/génotype entre ces mutations perte de fonction et des mutations ponctuelles générées de façon originale par notre équipe, il est essentiel de comparer des animaux de même fond génétique afin de s’affranchir de l’effet de gènes influenceurs pouvant différer d’un fond génétique à un autre. Nous effectuerons cependant une veille régulière des différents dépositaires afin de stopper la production de modèles redondants avec ceux disponibles. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observés au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 8 animaux par condition seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour le suivi longitudinal des cohortes, des sous-groupes de 4 animaux seront nécessaires pour documenter les différents phénotypes au cours du temps. Les différents tissus seront biobanqués (congélation et inclusion paraffine) afin d’optimiser l’utilisation des animaux. Si un phénotype est présent sur les lignées simple mutation, les autres lignées ne seront pas produites. De même, si un phénotype est présent dès le stade hétérozygote, les élevages seront réalisés de façon à ne pas produire d’homozygotes. Afin de réduire le nombre d’animaux, les expérimentations n’ayant pas d’impact les unes sur les autres seront réalisées sur les mêmes animaux.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres pourra induire une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% du poids de référence de l'animal (poids maximal atteint) conduira à l'arrêt du protocole expérimental. Lors des expérimentations, des phases d’isolement ou des mises en reproduction, les bacs seront posés sur des photos représentant des fond aquatiques. Pour les suivis longitudinaux nécessitant une séparation des différents animaux d’une même ponte, les animaux d’intérêt seront maintenus avec des animaux d’un autre fond génétique afin de ne pas rester isolés. Pour les tests fonctionnels (tunnel de nage), une phase d’habituation au nouvel environnement sera systématiquement réalisée. Tous les poissons sont nourris deux fois par jour, avec notamment des artémies (crevettes fraiches) vivantes, cultivées sur place, qui représentent une source de nutriments frais et une forme d'enrichissement, puisque les poissons les chassent dans le bac.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est génétiquement modifiable, rendant aisé la génération de mutant d’un gène d’intérêt reproduisant une maladie génétique humaine comme le SM, et permet des études de grande envergure tout en étant plus rapides et beaucoup moins couteuses que celles menées chez le rongeur. Le poisson zèbre est aussi un modèle pertinent pour étudier les dysfonctions musculo- squelettiques et cardiovasculaires, et récapitule les processus physiopathologiques observés chez l'Homme. De plus, beaucoup d’événements biologiques sont analysables par des approches non invasives et quantitatives. Actuellement, un très grand nombre de lignées rapportrices ont été générées et sont facilement disponibles dans la communauté scientifique, permettant de répondre à de vraies questions biomédicales. Pour toutes ces raisons, le poisson zèbre est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans de nombreux laboratoires académiques pour modéliser un large spectre de pathologies avec la possibilité d'aller très en profondeur pour l'exploration mécanistique. Un suivi du développement des signes de la maladie sera réalisé depuis le stade larvaire jusqu’au stade adulte, le SM étant une maladie se développant dès l’embryogenèse mais évoluant tout au long de la vie. De plus, une finalité du projet étant d’identifier des leviers thérapeutiques potentiels, l’évaluation du potentiel curatif d’approches thérapeutiques sur des traits cliniques installés est nécessaire.
La larve de poisson-zèbre comme modèle d’étude in vivo pour évaluer les effets « cocktails » de perturbateurs endocriniens sur la progression pathologique des NAFLD et le rôle des vésicules extracellulaires hépatiques
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
4 200 larves de poissons zèbres vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime gras puis exposées à des cocktails de perturbateurs endocriniens entre le cinquième et le onzième jour après la fécondation, elles servent à étudier la progression des maladies du foie gras, avec une atteinte hépatique et une nage altérée attendues. Le porteur présente la larve comme un modèle "alternatif" au rongeur qui limite l'usage de mammifères, tout en qualifiant l'expérimentation animale d'"indispensable". Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne reproduit les interactions entre organes nécessaires à l'étude.
Objectifs
Les maladies du foie gras sont devenues une priorité de santé publique car elles touchent plus de 20 % de la population générale et surtout les personnes obèses (>70% de personnes atteintes). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite, propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. L’exposition aux perturbateurs endocriniens, seuls ou en mélange, notamment via l’alimentation, est reconnue comme un facteur pouvant participer au développement de ces maladies. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact de ces molécules sur la santé et en particulier sur les maladies du foie gras. Etant donné la nature complexe de ces maladies qui dépendent des interactions étroites entre différents organes et types cellulaires, il est nécessaire d’avoir une approche utilisant des organismes entiers et donc uniquement retrouvée dans les modèles in vivo. Le premier objectif de ce projet est donc de poursuivre l’évaluation de la larve de poisson-zèbre comme modèle alternatif aux modèles rongeurs pour l’étude des effets cocktail des perturbateurs endocriniens sur les maladies du foie gras. En outre, l’un des mécanismes suspectés fait intervenir les vésicules extracellulaires comme un moyen de communication important entre les organes participant à la progression de ces maladies du foie. Ces vésicules représentent également de potentiels biomarqueurs d’exposition et/ou de progression de la maladie dans la mesure où elles sont facilement accessibles par prélèvement sanguin. Ainsi, un second objectif de ce projet est de caractériser la production des vésicules extracellulaires issues du foie suite à l’exposition à un cocktail de perturbateurs endocriniens.
Bénéfices attendus
Cette phase d'expérimentation in vivo devrait permettre de confirmer le potentiel de ce modèle de larve de poisson-zèbre en alternative au modèle murin classiquement utilisé. En parallèle, des travaux seront d’ailleurs conduits sur un modèle murin pour compléter ce projet (ces travaux sont intégrés à une autre saisine). En outre, ce projet permettra de vérifier nos hypothèses sur les vésicules extracellulaires et, en cas de confirmation, ouvriront la voie à des études plus avancées sur le rôle de ces vésicules dans les maladies du foie gras ou à leurs utilisations en tant que potentiels biomarqueurs.
Procédures
Alimentation avec un régime enrichi en graisse de 4 à 10 jours post-fertilisation des oeufs. Exposition à des cocktails de perturbateurs endocriniens (de 7 à 11 jours post-fertilisation des oeufs)
Impact sur les animaux
L'objectif de ce projet est d'étudier l'apparition et la progression de pathologies hépatiques. On s'attend donc à un impact sur la santé des poissons, cependant celui-ci devrait rester modéré et se traduire éventuellement par des modifications légères du comportement (nage altérée).
Devenir
A l'issue de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés afin d'obtenir suffisamment d'échantillons biologiques pour réaliser les expériences envisagées et garantir au maximum l'obtention de résultats significatifs.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à l’atteinte des objectifs du projet (3R : Remplacement), l’utilisation du modèle poisson-zèbre reste toutefois une alternative au modèle rongeur dans le contexte de l’étude du rôle des vésicules extracellulaires dans les effets délétères des NAFLD.Plus précisément, l’un des objectifs de ce projet est de déterminer si les vésicules extracellulaires produites par le foie peuvent servir de biomarqueurs d’exposition et/ou d’atteintes hépatiques dans le contexte d’exposition à des polluants environnementaux. Pour cela, il est nécessaire de reconnaitre spécifiquement les vésicules issues du foie au sein de toutes les vésicules produites par l’organisme et d’identifier les changements qualitatifs ou quantitatifs de cette population de vésicules qui pourraient corréler avec les niveaux d’exposition aux polluants ou avec les atteintes du foie. Ainsi, seule l’expérimentation sur un modèle in vivo peut permettre d’évaluer de manière intégrative la production de vésicules et le développement de ces maladies du foie (maladies qui dépendent en partie de la communication entre différents organes). A l’heure actuelle, il n’existe pas d’alternatives (in vitro, in silico ou ex vivo) permettant de reproduire l’ensemble des interactions entre organes liées à ces maladies du foie ni la grande variété de vésicules retrouvées dans un organisme entier.
Réduction
Les plans d’expérimentations ont été réalisés de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en vue de l’obtention de résultats significatifs et d’éviter les réplicats inutiles. Ainsi, nous avons prévu de réaliser des tests de comparaison de moyennes ANOVA avec un seuil de significativité à 5% (p
Raffinement
Les études seront conduites dans le respect des normes les plus strictes en matière de soins des animaux et d’évaluation de la souffrance animale. Les animaux seront maintenus dans des installations modernes et agréées pour assurer un confort maximal aux animaux. Tout le personnel impliqué dans le travail des animaux a suivi une formation conformément aux réglementations institutionnelles et aux lois nationales relatives à la protection des droits des animaux. En outre, les animaux seront attentivement suivis et l’atteinte éventuelle des points limites évalués selon des critères adaptés, gradés et précis entrainera l’arrêt des expérimentations.
Choix des espèces
Ce projet vise à évaluer l’impact des perturbateurs endocriniens en mélange sur l’apparition et la progression des maladies du foie gras. Le modèle de poisson- zèbre se positionne comme un modèle d’étude intermédiaire entre les modèles in vitro et les modèles murins et limite ainsi l’utilisation de ces modèles mammifères. L’objectif de ce projet est en partie de renforcer cette notion en particulier pour l’étude des perturbateurs endocriniens et des vésicules extracellulaires. Le modèle zebrafish possède, en effet, de nombreux atouts : une grande similitude avec l’Homme notamment concernant le foie et les maladies du foie gras (types cellulaires et métabolisme); une grande sensibilité dans la réponse aux agents hépatotoxiques et aux perturbateurs endocriniens ainsi que des avantages méthodologiques (transparence des larves permettant l’observation directe d’organes internes). Les animaux seront utilisés, après éclosion, au stade larvaire entre 5 et 11 jours post-fertilisation. En effet, à partir du 4ème jour, les larves présentent un foie fonctionnel et sont capables de se nourrir de l’alimentation apportée : 2 éléments essentiels à ce projet. D’autre part, de nombreuses études ont montré qu’à cet âge, les larves de poisson-zèbre pouvaient être utilisées comme modèle pour tester la toxicité d’agents chimiques au niveau du foie ou étudier le développement des maladies du foie gras (induite par l’alimentation notamment).
Impact du lopéramide sur la composition du microbiote chez le poisson-zèbre
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
1 566 poissons zèbres au stade larvaire vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ils sont exposés vingt-quatre heures au lopéramide, un antidiarrhéique, puis tués par homogénéisation pour analyser leur microbiote et mesurer taille et poids hors de l'eau. Le porteur n'attend aucun effet délétère, la dose étant décrite comme non toxique dans la littérature, et prévoit de ne pas conserver les larves au-delà de onze jours. Il indique que l'effet sur la dynamique du microbiote ne peut être étudié qu'in vivo, le stade larvaire présentant selon lui un système digestif comparable à celui des mammifères.
Objectifs
La flore microbienne joue de nombreux rôles en santé humaine mais peut être affectée par diverses perturbations extérieures telles que les antibiotiques ou stress chimique. L’étude de l’impact de ces perturbations dont les médicaments sur le microbiote connait un intérêt grandissant afin de développer à l’avenir des approches complémentaires pour réduite leurs effets indésirables. Ces effets bien que décrits restent peu caractérisés du fait de la diversité et complexité de la flore intestinale chez les mammifères et des limites pratiques intrinsèques aux modèles in vivo correspondants (coûts d’hébergement, manipulation...). Dans ce contexte, la larve du poisson zèbre constitue un modèle de choix puisque la flore y est moins complexe, l’observation microscopique non invasive plus aisée, tout en arborant un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables aux mammifères, en faisant ainsi un modèle pertinent pour étudier les interactions hôte-microbiote. Notre objectif est ici d’analyser l’impact du lopéramide, un médicament anti-diarrhéique couramment prescrit en clinique et utilisé pour mimer les dysfonctionnements intestinaux sur modèles animaux, sur la composition et la stabilité du microbiote naturel du poisson zèbre et d’identifier les éventuelles conséquences sur l’hôte.
Bénéfices attendus
La flore joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-microbiote et les perturbations pouvant l’affecter sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques et/ou préventives rationnelles. En effet, ceci s’intègre dans l’intérêt grandissant pour l’étude de l’impact de médicament couramment utilisés chez l’Homme sur le microbiote et le développement futur d’approches complémentaires pour contrer ou réduire les effets indésirables ainsi identifiés.
Procédures
Les poissons-zèbres au stade larvaire seront exposés pendant 24 heures au lopéramide, une molécule qui réduit le mouvement péristaltique intestinal. Cette procédure est considérée comme légère puisque cette molécule n’est pas létale à la dose utilisée ni même n’a jamais montré d’effets indésirables dans la littérature.
Impact sur les animaux
Aucun effet délétère du lopéramide n’est attendu car c’est une dose décrite précédemment comme non toxique. Néanmoins, une observation quotidienne des poissons sera réalisée et les poissons ne seront pas conservés plus de onze jours post-fertilisation pour limiter leur inconfort au vu de notre procédure d’élevage, à savoir des plaques 24-puits avec un poisson par puits contenant deux millilitres d’eau.
Devenir
L’ensemble des poissons utilisés dans cette étude sera mis à mort pour pouvoir analyser l’impact du traitement sur la composition du microbiote et ses éventuelles conséquences sur la croissance et/ou le développement des larves. La mise à mort des poissons est nécessaire car d’une part l’analyse du microbiote se fait par extraction après homogénéisation des poissons et d’autre part, l’impact sur la croissance (détermination du poids et mesure de la taille) ne peut se faire qu’hors eau, c’est-à-dire une fois les poissons mis à mort.
Remplacement
Tandis que l’impact du lopéramide sur les bactéries commensales fait l’objet d’une caractérisation in vitro, l’impact sur la composition et la dynamique de réponse du microbiote et ses éventuelles conséquences ne peut être étudié que dans un contexte in vivo. Le poisson zèbre est un modèle in vivo bien caractérisé et cette procédure implique de n’exposer au lopéramide que des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’être minimum tout en permettant l’application des approches statistiques choisies et est ainsi basé essentiellement sur des données précédemment publiées. Dans le cas des analyses de la composition du microbiote par séquençage 16S, le nombre de larves par groupe a été calculé à partir de donnés précédemment publiée, et a donc été fixé au nombre de 5 à chaque temps d’exposition pour chaque condition. Ce nombre permettra d’aborder la variabilité liée à ce type d’échantillon sans affecter la puissance statistique des tests choisis. L’analyse statistique pour la comparaison du microbiote par séquençage des larves au cours du temps s’appuiera ainsi sur l’utilisation d’un modèle comparatif du type modèle de Kruskal-Wallis. Les p-valeurs seront ajustées par une méthode type Benjamini-Hochberg afin de prendre en compte la multiplicité des tests. Pour l’analyse morphométrique des larves au cours du temps, le test statistique de Kruskal-Wallis non-paramétrique suivie de Wilcoxon sera appliqué, avec 10 larves par temps d’échantillonnage et par condition pour comparer les larves traitées au lopéramide contre celles contrôles exposées au DMSO.
Raffinement
La procédure consiste à exposer des larves de poissons-zèbres ayant une flore naturelle ou contrôlée à une dose non toxique de lopéramide puis à suivre l’impact sur la composition du microbiote au cours du temps et les conséquences éventuelles. Aucun effet délétère du lopéramide n’est attendu car c’est une dose décrite précédemment comme non toxique (Shi, 2014). Néanmoins, une observation quotidienne des poissons sera réalisée et les poissons ne seront pas conservés plus de onze jours post-fertilisation pour limiter leur inconfort au vu de notre procédure d’élevage, à savoir des plaques 24-puits avec un poisson par puits contenant deux millilitres d’eau. Nous nous appuierons également sur certains des critères présentés pour l’évaluation quantitative de points limites qui sont applicables dans ce modèle comme comme la prostration ou la nage anormale et certains aspects physiques. Les anomalies de développement et/ou morphologie seront ainsi recherchées. La détection d’un de ces points limites conduira à la mise à mort du poisson.
Choix des espèces
La flore intestinale joue un rôle important sur notre santé. La compréhension des interactions hôte-microbiote et leur réponse aux stress sont indispensables au développement d’approches thérapeutiques rationnelles complémentaires aux existantes pour le traitement de la diarrhée, et cela ne peut se faire sans le recours à l’expérimentation animale. Le Danio zébré est un modèle in vivo bien caractérisé (notamment du fait de son utilisation en biologie du développement), avec un génome connu et de nombreuses lignées transgéniques déjà disponibles. De plus, nos procédures impliquent de n’exposer au lopéramide que des poissons au stade larvaire de développement dont les systèmes digestif et immunitaire (réponse innée) sont organisés comme ceux des mammifères, un point déterminant dans le cadre de notre étude. Outre l’obtention de pontes, réalisée dans l’animalerie Zorgl’Hub, qui nécessite des poissons-zèbre adultes, mâles et femelles, mais non inclus dans ce projet car simplement géniteurs, nos procédures impliquent de n’exposer au lopéramide que des poissons au stade larvaire de développement. L’utilisation de poissons au stade larvaire de développement se justifie au niveau scientifique et éthique puisque ces derniers possèdent déjà un système digestif et une réponse immunitaire innée comparables à ceux des mammifères.