Rongeurs

174 souris vont être utilisées, chacune recevant une injection sous la peau cinq jours par semaine pendant quatre à six semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La bléomycine ou l'acide hypochloreux injectés leur font développer une fibrose de la peau et des poumons, et quarante d'entre elles subissent en plus une biopsie cutanée au punch dans le bas du dos. Toutes sont tuées pour prélever sang, poumons, rate et peau. Le bénéfice avancé reste conditionnel, valider un jour une thérapie cellulaire chez les personnes atteintes de sclérodermie systémique, quand la fibrose infligée aux souris est immédiate et le porteur affirme qu'observer l'"animal entier" est "indispensable".

Objectifs

L’objectif du projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser des cellules stromales mésenchymateuses d'origine adipocytaire (ASCs) en clinique (traiter des patients atteints de sclérodermie systémique). Ainsi, nous évaluerons leurs effets thérapeutiques (réduction de l’inflammation et de la fibrose cutanée et /ou pulmonaire), leurs interactions avec différents types de cellules immunitaires et le(s) mécanisme(s) impliqué(s) dans leurs effets thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le bénéfice du projet sera de valider si la thérapie cellulaire de cellules stromales et en particulier d'origine adipocytaire (ASCs) est efficace pour contrer les troubles majeurs de la sclérodermie systémique que sont la fibrose cutanée et pulmonaire et, dans une moindre mesure, la production d’anticorps et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets thérapeutiques.

Procédures

Toutes les souris seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 4 semaines ou pendant 6 semaines et à une seule injection intraveineuse dans la veine caudale de cellules souches stromales d'origine adipocytaire (ASCs). 40 souris auront en plus une biopsie cutanée qui sera réalisé en bas du dos à l'aide d'un punch.

Impact sur les animaux

L'injection intra-dermique de Bléomycine ou d'acide hypochloreux peut entrainer une gène (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois des petites plaies ou des irritations cutanées au point d'injection. Ces souris développent une fibrose cutanée au point d'injection et une fibrose pulmonaire modérée, limitée à la région sous-pleurale qui n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires. Il n'est pas attendu d'effets négatifs pour les souris suite à la réalisation de la biopsie cutanée ; en effet, comme le diamètre du punch est réduit au minimum (4 mm) et que nous faisons un pont de suture, la cicatrisation est rapide.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tissus et d'organes (sang, poumons, rate et peau)

Remplacement

Il est important de voir les effets thérapeutiques des cellules mésenchymateuses stromales au niveau de l’animal entier portant une maladie surtout quand celle-ci touche plusieurs tissus ou organes et qu’elle est caractérisée par une autoimmunité (présence d’auto-anticorps dans la circulation sanguine), impossible à reproduire in vitro. La souris possède de nombreuses caractéristiques physiopathologiques communes avec l’homme, indispensables à l’extrapolation des résultats.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux pour ce projet, nous testerons la tolérance des souris à l'injection des cellules souches stromales adipocytaires (ASCs) uniquement dans la procédure N°1 et sur un nombre réduit de souris c'est à dire 5 souris/groupe au lieu de 10 pour les groupes de souris malades. Afin de réduire le nombre d'animaux pour ce projet, les effets thérapeutiques précoces (préventifs) et tardifs (curatifs) des d'ASCs dans le modèle de souris sclérodermiques induit par injection d'HOCl seront évaluées dans la même procédure (N°4).

Raffinement

Les procédures ont été travaillées pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront au maximum 5 dans des cages enrichies. Une observation quotidienne des souris sera réalisée (apparence physique, comportement), une pesée sera réalisée une fois par semaine et, si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, des sédatifs ou anti-douleurs adaptés (après avis du vétérinaire) pourront être leur être administré.

Choix des espèces

Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Les souris seront adultes car la sclérodermie systémique est une pathologie qui affecte les adultes

Choisies parce que le modèle reproduit "de façon rapide et reproductible" la colite à Clostridioides difficile, 300 souris de six à sept semaines vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la bactérie par gavage, deux injections d'antibiotique, puis sont isolées chaque jour jusqu'à émission d'une selle, avec un massage abdominal quand rien ne vient. Le porteur indique que l'infection provoque des diarrhées, des déshydratations de 24 à 48 heures et des pertes de poids. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leurs organes et mesurer la réponse inflammatoire déclenchée par dix souches mutantes de la bactérie.

Objectifs

Clostridioides difficile (C. difficile) est une bactérie anaérobie stricte (nécessitant une atmosphère sans oxygène pour survivre et se développer), première cause de diarrhées et de colites associées aux antibiotiques, notamment dans les établissements de santé (plus de 24 000 cas par an, dont 14 % de formes compliquées, en France). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l’ordre de 3 %. La contamination se fait à partir de formes de résistance hautement contagieuses de la bactérie, appelées spores, largement présentes dans l’environnement des services de soins hospitaliers. Les ICD représentent un coût sanitaire important en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours hospitaliers et des surcoûts des soins associés. Malgré des traitements antibiotiques généralement efficaces, les réapparitions des infections à C. difficile sont fréquentes (environ 20 %) et des résistances aux antibiotiques surviennent. Il est donc primordial de mieux comprendre les mécanismes contrôlant les principales étapes de l’infection, dans le but de pouvoir développer des traitements alternatifs pour éviter que la bactérie ne colonise l’intestin. Un de ces mécanismes régulateurs chez les bactéries fait intervenir des petites molécules d’acides ribonucléiques (ARN) qui, au lieu de coder des protéines, régulent l’expression d’autres gènes ; ils sont ainsi appelés ARN non codants (ARNnc). Dans ce projet, notre objectif est d’évaluer le rôle des ARNnc de C. difficile dans le processus pathologique des infections (succession d’évènements conduisant à cette infection) afin d’identifier de nouveaux mécanismes de régulation basés sur ces ARNnc et de développer de nouvelles stratégies diagnostiques et thérapeutiques dans la lutte contre les ICD.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but d’évaluer à court terme le rôle des ARN non codant de C. difficile dans le processus pathologique des infections à C. difficile et permettra à moyen terme de développer de nouvelles stratégies de lutte contre ce pathogène.

Procédures

Le modèle nécessite deux types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale de la souche de C. difficile (un gavage unique durant la procédure, d’une durée maximale d’une dizaine de secondes) et 2 injections d’antibiotique (d’une durée maximale d’une dizaine de secondes). De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé quotidiennement (au maximum), sur la durée de l'essai. Chaque animal sera isolé jusqu’à émission d’une selle. Dans la plupart des cas, l’émission de selle est spontanée et intervient dans les 2 à 3 minutes. Dans le cas contraire, une stimulation par un massage abdominal léger d’une dizaine de secondes sera effectué. Si aucune selle n’est émise dans les 2 à 3 minutes suivant cette stimulation, l’animal sera libéré et remis dans sa cage d’origine. Aucune procédure chirurgicale n'est nécessaire dans le cadre du projet.

Impact sur les animaux

Le gavage nécessite une contention de courte durée (une dizaine de secondes) qui peut entrainer un stress léger. La piqûre d’aiguille pour l’injection intrapéritonéale entraine une douleur et un stress légers et de courte durée. Le prélèvement de selles nécessite une manipulation et peut donc engendrer un stress léger. Pendant l’infection, le modèle induit des diarrhées résolutives en quelques jours qui peuvent occasionner des troubles intestinaux désagréables pour les animaux et être associées à des déshydratations transitoires (24 à 48 heures maximum) et des pertes de poids légères.

Devenir

Le prélèvement d'organes à la fin des procédures expérimentales, nécessaire à l’analyse de la réponse inflammatoire induite par les différentes souches de la bactérie C. difficile, et donc du rôle des ARNnc dans la pathologie, nécessite l'euthanasie des animaux.

Remplacement

Plusieurs tests réalisés précédemment in vitro ont permis de sélectionner les 10 molécules (ARNnc) présentant un rôle potentiel dans le processus pathologique et la virulence les plus prometteuses, et donc les 10 souches mutantes de la bactérie (C. difficile), qui ne produisent plus ces molécules, qui seront utilisées dans ce projet. Bien que des études in vitro se poursuivent en parallèle (tests sur modèles cellulaires), le recours à l'animal est indispensable pour étudier les processus de colonisation et la virulence. La reconstitution des interactions entre le microbiote, l’hôte et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.

Réduction

Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 300, tout en préservant la validité statistique de l'étude.

Raffinement

Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace et enrichissement (tunnel de carton et papier pour construction de nids). Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Une procédure d’euthanasie anticipée sera ainsi mise en place si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation et de virulence par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation et de virulence par C. difficile.

40 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués à la fin sous une anesthésie sans réveil pour analyse histologique du trajet fistuleux. Chacun subit une chirurgie d'une heure et quart combinant une opération anti-obésité et la création d'une fistule entre l'estomac et la peau, puis une seconde intervention où un patch d'un centimètre carré est suturé sur l'ouverture, puis une IRM. Le porteur annonce des douleurs temporaires, une perte de poids et un risque d'infection au point de suture, tout en écrivant que les animaux ne souffrent généralement pas de douleurs persistantes après la chirurgie. Il affirme qu'il n'existe aucun modèle alternatif satisfaisant et que ces tests sur des animaux non-humains sont "indispensables" à une éventuelle application chez l'humain, l'étape suivante annoncée restant une étude pilote conditionnée aux résultats.

Objectifs

Les fistules digestives sont des complications graves qui surviennent lorsqu’un passage anormal se forme entre deux organes internes ou entre un organe et la peau. Ces problèmes peuvent être causés par des maladies comme la maladie de Crohn ou des interventions chirurgicales, notamment les opérations pour traiter l’obésité. Par exemple, en France, 35 000 sleeves (chirurgie de l’obésité) sont réalisées chaque année, et dans 1 à 3 % des cas, des fistules peuvent se développer. Dans 20 % de ces cas, les fistules deviennent chroniques et difficiles à soigner. Le traitement des fistules est complexe : il peut inclure des soins locaux, un drainage, et parfois une nouvelle opération, souvent risquée et associée à un taux de mortalité élevé. Des recherches récentes explorent une solution prometteuse : la gelée de Wharton. Ce matériau, issu de cordons ombilicaux humains, possède des propriétés uniques qui favorisent la régénération des tissus et réduisent l’inflammation. Notre équipe travaille à développer un nouveau traitement combinant la gelée de Wharton et une matrice spéciale dérivée d’œsophage de porc, afin de favoriser la cicatrisation des fistules. La matrice, un support biologique préparé à partir de tissus animaux, est enrichie avec la gelée de Wharton pour être appliquée directement sur la fistule. Ce processus est soigneusement testé dans des conditions de laboratoire avant de pouvoir être utilisé chez l’humain. Les tests actuels utilisent un modèle animal (chez le rat), car il est essentiel d’observer l’évolution de la cicatrisation sur une période prolongée, ce que les études sur des cellules isolées ne permettent pas. Objectifs : 1. Évaluer l’efficacité du traitement pour refermer les fistules chroniques. 2. Étudier comment la gelée de Wharton agit sur l’inflammation, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins et la réparation des tissus. 3. Optimiser l’adhésion et la rétention de la gelée de Wharton sur la matrice utilisée. Nous espérons que ce traitement novateur permettra de soigner plus efficacement les fistules digestives post-opératoires. Si les résultats des tests sont concluants, une étude pilote chez l’humain pourra être envisagée. Grâce à ces avancées, notre objectif est d’offrir une alternative moins invasive et plus efficace pour traiter une complication souvent dramatique.

Bénéfices attendus

Nous voulons démontrer qu’il est possible d’utiliser un nouveau matériau, composé d’une matrice biologique enrichie en gelée de Wharton, pour traiter des fistules digestives chez le rat. Ce matériau devra être à la fois sûr (sans causer d’infections ou d’inflammations) et efficace pour favoriser la cicatrisation. Pour cela, nous vérifierons l’absence de complications grâce à des observations cliniques et radiologiques. L’efficacité sera mesurée en comparant le nombre de fistules guéries entre différents groupes de traitement. Ces tests chez l’animal sont indispensables pour une éventuelle application chez l’humain. Afin de rendre cette transition possible, toutes les étapes de fabrication respectent déjà les normes médicales en vigueur. Les fistules digestives sont des complications fréquentes, graves, et difficiles à soigner. Elles ont un impact majeur sur la qualité de vie, surtout lorsqu’elles deviennent chroniques. Les traitements actuels sont invasifs, nécessitent de longues hospitalisations et ne réussissent pas toujours à guérir les patients. Grâce à ce projet, nous espérons offrir une solution innovante, plus efficace et moins lourde, pour améliorer la prise en charge des personnes touchées par cette maladie.

Procédures

1. Une première opération d’une heure et quart sera réalisée sous anesthésie générale. Elle consistera à effectuer une chirurgie anti-obésité et à créer une fistule entre l’estomac et la peau. 2. Une deuxième intervention durant 15-30 minutes sera réalisée sous anesthésie générale. Un patch de 1 cm², issu du traitement innovant, sera suturé sur l’ouverture de la fistule au niveau de la peau. 3. Une phase concernant 3 rats comprendra une IRM supplémentaire visant à optimiser et valider le protocole d’IRM prévu en phase 4. 4. Enfin, une dernière phase sous anesthésie sans réveil permettra d’évaluer visuellement et avec une IRM si la fistule s’est refermée.

Impact sur les animaux

Les principales gênes attendues incluent des douleurs temporaires après l’opération pour créer la fistule, ainsi qu’une possible perte de poids liée à la chirurgie et à la fistule. Le traitement appliqué au jour 15 pourrait entraîner des infections locales ou des démangeaisons dues aux points de suture, mais les expériences précédentes montrent qu’après la chirurgie, les animaux ne souffrent généralement pas de douleurs persistantes.

Devenir

A la fin de la procédure, les rats seront euthanasiés dans une procédure d’anesthésie sans réveil pour analyse histologique du tractus fistuleux et des tissus environnants afin d’étudier les phénomènes de cicatrisation à l’échelle microscopique.

Remplacement

Les fistules mettent plusieurs semaines à se former, et leur cicatrisation ne peut être observée qu’après un mois de traitement. Cela ne peut pas être étudié en dehors d’un organisme vivant. Actuellement, il n’existe pas de modèle alternatif satisfaisant pour remplacer les expériences sur les animaux. Cette recherche vise à développer un traitement qui pourra, à terme, être utilisé chez l’humain, car les options actuelles sont insuffisantes. Le rat est un modèle pertinent pour ce type d’étude : sa biologie tissulaire et ses réactions immunitaires et inflammatoires sont proches de celles de l’homme, comme le confirment des études scientifiques. Cela permet de prédire les résultats humains de manière fiable et d’étudier la biocompatibilité des matériaux utilisés.

Réduction

Pour analyser les résultats : Nous utiliserons un test statistique pour comparer les groupes d’animaux selon la fermeture ou non des fistules et un autre pour mesurer les différences sur les données continues. L’étude inclura 4 groupes de 9 rats chacun, avec un rat supplémentaire par groupe pour compenser d’éventuels décès ou problèmes techniques. Ce nombre est le minimum nécessaire pour obtenir des résultats fiables. Nos calculs sont basés sur une étude précédente, qui a utilisé un modèle similaire. Le taux de fermeture des fistules y était de 82,5 % avec traitement, contre 12,5 % sans traitement. Les calculs statistiques ont été réalisés avec un logiciel dédié (G*POWER), en fixant une puissance de 80 % et un risque d’erreur de 5 %. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés (principe des 3R), la procédure sera réalisée par des experts en microchirurgie. Un membre de notre équipe, spécialiste des chirurgies digestives chez le rat, supervisera ces opérations.

Raffinement

- Du personnel qualifié, dont un chirurgien expérimenté, sera mobilisé avant, pendant et après les interventions. - Les rats s’habitueront à leur environnement pendant 7 jours avant l’opération. - Les animaux seront logés en cages ventilées et stérilisées, avec un accès normal à l’eau, à la nourriture et à des enrichissements (nidification, maison en cas d’isolement). - L’environnement est conçu pour préserver leur bien-être : aucun stress visuel, sonore ou olfactif entre les rats opérés et ceux à opérer. - Les animaux recevront des analgésiques avant et après la chirurgie (tramadol, carprofène). - Des protocoles précis encadrent l’anesthésie, les soins post-opératoires et, si nécessaire, l’euthanasie pour minimiser toute souffrance. - Des limites éthiques strictes seront suivies tout au long du projet pour garantir le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Nous avons choisi le rat Wistar car : -Son anatomie digestive est proche de celle de l’Homme, ce qui permet de reproduire la pathologie humaine. -Les modèles de rats avec fistules post-chirurgie gastro-œsophagienne sont validés et reconnus comme fiables pour les études précliniques. -L’équipe impliquée est experte dans la gestion et les soins des rats. -Ces rats sont facilement disponibles auprès d’éleveurs agréés. Caractéristiques des rats Wistar pour l’étude -Les rats seront tous âgés de 12 semaines, pour garantir des résultats comparables et des plaies proportionnelles à leur taille. Le choix de rats adultes réduit les risques liés à l’anesthésie et facilite les opérations chirurgicales. -À cet âge, la qualité des tissus permet une cicatrisation optimale.

Anesthésiées, incisées au coin de la troisième côte, puis atteintes par une seringue enfoncée jusqu'au retour de sang pour un prélèvement dans le cœur, 112 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit une injection dans l'abdomen, l'autre une injection derrière l'œil sous anesthésie, pour recevoir des vésicules issues du sang de personnes atteintes d'un purpura thrombotique thrombocytopénique. Le porteur résume les perturbations anticipées à la douleur d'une injection intrapéritonéale et à la gêne de la contention, et écrit par ailleurs que les animaux ne subiront que très peu de contraintes. Toutes sont tuées pour que leurs organes soient coupés et colorés.

Objectifs

Si nous comparons notre sang à une rivière qui coule dans notre corps et pour que cette rivière coule bien, il faut que les cellules du sang circulent librement. Mais chez certaines personnes atteintes d'une maladie rare appelée purpura thrombotique thrombocytopénique, c'est comme si des petits caillots se formaient et bouchaient les ruisseaux de cette rivière, ruisseaux qui représentent les petits vaisseaux des malades. Récemment, les chercheurs ont découvert que dans le sang de ces personnes malades, il y a des petites bulles appelées vésicules qui contiennent une substance qui provoque de l'inflammation et ils veulent savoir si ces petites bulles mettent du feu aux environs. Ces bulles sont un peu comme des petites usines à inflammation qui aggravent la situation. Les chercheurs veulent comprendre dans ce projet ce qui se passe exactement quand ces petites bulles inflammatoires arrivent dans le sang des souris. Ils veulent savoir si ces bulles vont provoquer la maladie ou l’aggraver et si elles jouent un rôle important dans la formation des caillots et dans le feu mis dans les environs. Ils vont aussi tester un médicament qui existe sur le marché et qui est déjà utilisé dans d’autres maladies. En comprenant mieux ce mécanisme, les chercheurs espèrent trouver de nouveaux traitements pour aider les personnes atteintes de cette maladie.

Bénéfices attendus

Si nous constatons que l'effet délétère de nos petites bulles est supprimé par l'utilisation de notre médicament, alors nous pourrons envisager d'utiliser ce médicament dans les services médicaux qui accueillent des patients atteints de la pathologie qui nous intéresse. Nous savons en plus, que l'utilisation de ce médicament est possible, étant donné qu'il est déjà utilisé pour d'autres pathologies.

Procédures

Les animaux sont mis en cage d'inhalation pour induire une anesthésie. Pour la moitié des animaux, ils seront soumis à de la contention et à des injections intrapéritonéales, c'est à dire dans le ventre des souris, pouvant leur occasionner un stress (une injection) et une douleur minime. Cela concerne donc 56 animaux sur une durée de 2 à 5 minutes maximum une fois. Pour une autre partie des animaux (56 autres), l'anesthésie se déroule de la même manière et des injections rétro-orbitaires sous anesthésie sont réalisées. A la fin du protocole, les animaux sont à nouveau anesthésiés, l'anesthésie vérifiée en pinçant la queue de l'animal et un prélèvement intracardiaque est réalisé afin de récupérer le sang des souris. Pour cela, une incision est réalisée au coin de la troisième côte et une seringue est enfoncée jusqu'à retour de sang. Ces gestes durent 10 minutes.

Impact sur les animaux

Les perturbations anticipées pour les animaux se résument à la possibilité de ressentir de la douleur, associée à une injection intrapéritonéale et de la gêne par la contention.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure, quelle qu'elle soit, afin de récupérer les organes des animaux et réalisés de l'immuno-histochimie sur ces organes, c'est à dire une coupe des organes et des colorations de ces coupes d'organes.

Remplacement

La réalisation de ce projet est justifiée par l’impossibilité de les remplacer par un modèle in vitro. A ce jour, il est impossible de reproduire in vitro un vaisseau avec ce qui recouvre les vaisseaux, la totalité des cellules qui circulent dans le sang et les molécules solubles du plasma participant à l’activation des vaisseaux. L’utilisation de l’animal a pour but de reproduire des conditions physiopathologiques intégratives impossible à reproduire in vitro.

Réduction

Le calcul d’effectif est déterminé avant l'étude afin d'être sûrs que nous n'utiliserons pas un trop grand nombre d'animaux mais seulement le nombre nécessaire à démontrer scientifiquement un intérêt à utiliser notre médicament dans notre modèle de maladie. Nous nous appuyons sur des logiciels spécifiques qui nous permettent de calculer ce nombre d'animaux et sur des critères de jugement qui sont bien mesurables et bien quantifiables chez la souris.

Raffinement

Les animaux ne subiront que très peu de contraintes et la douleur sera minimisée par l'utilisation d'analgésique. Les cages seront enrichies avec du coton, un dôme et/ou un tunnel. De plus, la douleur et la souffrance seront évaluées lors des protocoles toutes les heures et la souffrance évaluée par une grille permettant d'établir un score. Les animaux ne sont pas seuls dans les cages. Ils seront hébergés dans des cages comprenant au maximum 5 animaux du même sexe, afin d'éviter tout conflit entre eux. Ils sont hébergés avec de la nourriture et de l'eau à volonter. Les salles sont spécialement concues dans une animalerie agrée avec une température vérifiée quotidiennement et stable, une ventilation continue, et une visite des animaux est organisée quotidiennement avant que l'expérience ne soit réalisée. Une personne est responsable du bien-être de ces animaux.

Choix des espèces

Les souris constituent un modèle simple à étudier compte tenu de la taille et de sa disponibilité. Des études ont montré que ce modèle d'étude, la souris, est adapté pour étudier notre pathologie. En effet, la souris présente des similitudes génétiques avec l'homme puisque la souris partage une grande partie de ses gènes avec celui de l'homme. Cette similitude génétique permet d'étudier des processus biologiques fondamentaux et des maladies humaines chez la souris. En outre, les souris sont des animaux de laboratoire relativement petits, faciles à manipuler et à élever en grand nombre. Elle ont un cycle de vie court et l'âge de 12 semaines correspond à une souris jeune. Nous choisissons cet âge étant donné que chez l'homme notre pathologie se développe plutôt chez les jeunes adultes. Nous devons donc choisir chez la souris un jeune âge également. D'autre part, le choix de la souris est associé aussi à un coût relativement faible, puisque comparé à d'autres modèles animaux tels que les primates, le coût des souris est moindre. Enfin, les précédentes études de la bibliographie justifient pleinement l'utilisation de souris pour notre pathologie, puisque c'est le modèle qui est le plus similaire à la pathologie développée chez l'homme.

Pour tester cinq molécules immunostimulantes, seules ou associées à des anticorps d'immunothérapie, 480 souris greffées de cellules de cancer colorectal, de lymphome ou de cancer du sein triple négatif vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après l'injection des cellules cancéreuses sous la peau, leurs tumeurs sont mesurées au pied à coulisse jusqu'à trois fois par semaine pendant 100 jours, et elles reçoivent les traitements dans la veine ou le péritoine une fois par semaine pendant trois semaines, après un regroupement qui peut les changer de cage et de groupe social. La peau peut s'ulcérer, voire se nécroser, au niveau de la tumeur. Toutes sont tuées au centième jour pour prélever leurs organes, ou plus tôt si elles atteignent un point limite. Le porteur mentionne des essais en impression 3D dont il dit qu'ils n'en sont "encore qu'à un stade très précoce", et conclut que l'étude des molécules ne peut se faire "que sur organisme entier".

Objectifs

Le projet présenté vise à étudier l’efficacité de molécules immunostimulantes, lorsqu’elles sont administrées seules ou en combinaison avec des traitements de référence en immunothérapie, dans différents types de cancers. L’immunothérapie consiste à activer le système immunitaire lorsque celui-ci est désactivé par la tumeur. Plusieurs anticorps ont ainsi été approuvés pour le traitement de diverses tumeurs, permettant au système immunitaire d’être à nouveau activé et fonctionnel pour détruire les cellules tumorales et constituant une avancée majeure dans la prise en charge des patients. Cependant, un nombre croissant d’observations réalisées chez les patients mettent en évidence un phénomène de résistance aux anticorps, la recherche se concentre donc maintenant à contourner ou reverser cette résistance grâce à de nouveaux traitements. Les molécules que l’on souhaite tester sont dites immunostimulantes car elles ont été créées de façon à stimuler directement la réponse immunitaire afin d’engendrer une mort des cellules tumorales. Au sein de notre laboratoire nous possédons des modèles de cancer chez la souris, étant peu ou non répondeurs à l'immunothérapie : cancer colorectal, lymphome et cancer du sein triple négatif, c'est donc sur ces modèles que nous souhaitons travailler. Nous cherchons à voir si les molécules que l'on souhaite tester, seules sont capables de rétablir un mécanisme antitumorale et à quel point, et si en combinaison avec les anticorps de référence, ceux-ci sont plus efficaces.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine. Ce projet permettra d’obtenir des informations sur l’efficacité d’un potentiel nouveau traitement anticancéreux plus efficace chez des patients atteints de cancer, étant peu ou non répondeurs aux traitements de référence.

Procédures

Injection de cellules cancéreuses en sous-cutané (réalisée une fois au début de l'expérimentation, quelques secondes). Mesures tumorales au pied à coulisse et pesées 3x/semaine maxmimum pendant 100 jours (quelques secondes). Une homogénéisation des groupes de traitements sera réalisée lorsque le volume tumoral moyen de début de traitement sera atteint, celle-ci pouvant entrainer un changement de cage et de groupe social pour les individus, ceux-ci ne changeant plus jusqu'à la fin d'étude. Injection des traitements en intraveineux (quelques secondes, 1 fois par semaine pendant 3 semaines) et/ou injection de traitement en intrapéritonéal (quelques secondes, 1 fois par semaine pendant 3 semaines).

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir une injection de cellules en sous cutané qui entraine un stress à la contention, une douleur à l’injection, la tumeur peut à un certain volume gêner à la locomotion. L'homogénéisation nécessite un réallotement des souris qui induit un changement d’environnement et de groupe social, ce qui peut provoquer un stress et une réacclimation durant la première semaine. Les pesées et mesures de tumeurs génèrent un stress pendant plusieurs semaines lors de la contention et éventuellement une gêne, sensibilité au niveau de la tumeur pendant la mesure avec le pied à coulisse. La peau au niveau de la tumeur peut potentiellement ulcérer voire nécroser. L’administration des traitements une fois par semaine par voie intraveineuse et/ou par voie intrapéritonéale va entrainer du stress à la contention, au contact de l'eau et de la douleur peut être ressentie à l’injection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai. Les animaux seront mis à mort afin de réaliser des prélèvements d'organes, organes qui seront utilisés par la suite pour différentes analyses.

Remplacement

Les interactions entre le métabolisme, les cellules du système immunitaire et le microenvironnement tumoral sont complexes et impactées par différents organes, ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Même si nous cherchons à développer nos modèles en impression 3D, tout ceci n’étant encore qu’à un stade très précoce et ne représentant pas le microenvironnement tumoral et sa complexité, l’étude de l’efficacité de potentielles molécules anticancéreuses sur cette tumeur ne peut, pour le moment, se faire que sur organisme entier.

Réduction

Les procédures seront faites sur le nombre minimal d’animaux nécessaires afin de conclure de façon statistiquement fiable à une meilleure efficacité de nos molécules administrées seules ou en combinaison avec les traitements de référence. Grâce à un outil statistique et connaissant nos modèles (ayant une réussite de prise tumorale de 75%), ceci nous a permis de savoir que nous avons besoin pour chaque modèle, pour étudier nos 12 groupes de traitement, de 10 souris par groupe, d'une marge de 40 souris en plus, ce qui nous amène à 480 animaux au total.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet en les pesant plusieurs fois afin de limiter leur stress. Les souris seront observées quotidiennement (week-ends et jours fériés inclus) par le personnel de l’animalerie qui remplit une fiche de surveillance de l’état général des souris afin de détecter rapidement une souffrance, et par les expérimentateurs qui remplissent un scoring plus détaillé trois fois par semaine et si nécessaire, afin d’identifier l’atteinte d’un point limite. Les expérimentateurs sont formés et expérimentés, ils sont donc à même de détecter très rapidement le moindre signe clinique afin d’appliquer les meilleures mesures. Un analgésique sera administré aux souris si signes de douleur et lors du prélèvement sanguin terminal. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 souris par cage et chaque cage présentera des enrichissements appropriés à la souche de souris (coton de nidation, tunnels pour jeux, maisonnette).

Choix des espèces

Nous souhaitons travailler avec la souris car c’est une espèce sur laquelle de nombreux modèles de cancer ont été développé dont ceux que l’on souhaite étudier. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.

Frottis vaginaux quotidiens, micro-incisions de la queue pour quatre prises de sang étalées sur huit heures, cathétérisation artérielle permanente, pose d'un capteur de glycémie sous la peau, ablation des ovaires avec implant hormonal : 328 Arvicanthis ansorgei, un rongeur diurne, subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et sont toutes tuées pour analyse des gènes, des hormones et des organes. Le porteur retient cette espèce parce que son système circadien ressemble à celui des humains, contrairement aux rats et aux souris nocturnes, et n'utilise que des femelles. Il annonce une perte de poids possible de 15 %, une inflammation des plaies, un risque d'hémorragie lié à la cathétérisation et un hébergement individuel pendant toute l'expérimentation pour une partie des animaux. Le régime de lumière nocturne qui donne son objet au projet n'est décrit nulle part, et l'effectif de 328 animaux repose sur des moyennes d'études antérieures sans calcul exposé.

Objectifs

Ce projet de recherche vise à déterminer les mécanismes biologiques, à ce jour très mal connus, impliqués dans les effets néfastes de la pollution lumineuse et de la désynchronisation circadienne (= désynchronisation des rythmes biologiques proche de 24 heures). Les résultats permettront de répondre aux enjeux de santé publique visant à améliorer la santé du personnel exposé aux conditions de travail posté et des populations exposées à la lumière nocturne (professionnels navigants sur plusieurs fuseaux-horaires, travaillant très tôt ou très tard, enfants et adolescents s’exposant à la lumière d’écrans la nuit). Les mécanismes impliqués dans les effets sanitaires néfastes de la pollution lumineuse et des horaires décalés sont difficiles à établir chez les sujets humains, et nécessitent l'utilisation d’un modèle animal proche de l’homme. Les modèles classiques (rats, souris) ont un phénotype nocturne (vivent la nuit) qui est inadapté aux applications biomédicales. Nombre de leurs rythmes journaliers (cycles veille-sommeil, prise alimentaire-jeune) sont inversés par rapport à l’Homme (phénotype diurne, de jour). La majorité des études expérimentales sont réalisées chez des individus mâles, ignorant l’effet sexe de ces analyses. Les études ne distinguent pas l’impact direct de la pollution lumineuse nocturne de l’effet indirect de la désynchronisation circadienne sur la physiologie. Nous proposons une approche originale pour mieux comprendre les effets de la pollution lumineuse et des décalages horaires sur le métabolisme et la fertilité féminine. L’objectif de ce projet est de fournir de nouvelles connaissances pour mieux comprendre les effets délétères de la pollution lumineuse sur l'homéostasie métabolique et la fertilité. Le choix d’un modèle diurne, le rongeur Arvicanthis Ansorgei, permettra la production de résultats rapidement exploitables dans le domaine de la santé humaine. La majorité des études dans cette thématique étant menées chez les individus masculins, notre choix de sujets féminins permettra d’évaluer les points critiques et, de gérer les risques sanitaires de la pollution lumineuse sur l'ensemble de la population générale. La réalisation de ce projet aidera à développer des approches préventives. Le projet initial nécessite l'ajout de 16 animaux pour modification de la voie de cathétérisation.

Bénéfices attendus

Ce projet va aider à mieux comprendre les mécanismes néfastes de la pollution lumineuse nocturne sur la santé métabolique et la fertilité. Les résultats obtenus chez un modèle animal diurne ( = vivant de jour) féminin permettront de mieux appréhender les risques sanitaires de la pollution lumineuse pour le personnel exposé aux conditions de travail en horaires décalés ainsi que pour toutes les autres catégories populationnelles exposées à de la lumière nocturne (par exemple, personnel navigant sur plusieurs fuseaux-horaires, personnes de toutes classes d’âge s’exposant à la lumière d’écrans pendant la nuit). La réalisation de ce projet conduira ensuite à développer des approches préventives sous forme de mesures interventionnelles ou de recommandations de bonnes pratiques et de gestion des risques professionnels.

Procédures

Pour analyser l'effet de la pollution lumineuse sur le métabolisme: un groupe de 108 animaux vigiles seront soumis à une injection d’une solution sucrée puis à 5 microprélèvements sanguins sur une période de 3H. Ce test sera effectué avant le début de l'expérience, puis à la fin de chaque mois, l’expérimentation durant entre 1 et 3 mois selon les résultats obtenus.16 animaux maximum seront soumis à une chirurgie permettant la pause d’un capteur donnant la glycémie 24/24h (durée 2H). Cette opération s’effectuera sous anesthésie générale. 16 animaux seront soumis à une cathétérisation permanente (durée de la chirurgie 1H) pour réaliser des prélèvements sanguins séquentiels un ou plusieurs jours. Cette chirurgie s’effectuera sous anesthésie générale. Pour analyser le cylce sexuel, 108 autres individus seront soumis à des frottis vaginaux quotidiens (décrit précédemment) et des micro-prélèvements sanguins réguliers (jour déterminé par frottis). Les micro-volumes de sang seront prélevés à 4 reprises sur une durée totale de 8h par une micro-incision de la queue. Un groupe de 48 animaux sera soumis à une ablation des ovaires et à la pose d'un implant sous cutané d'hormone sous anesthésie générale. Ces animaux seront soumis à un unique frottis vaginal. Les frottis seront réalisés sur animaux vigiles maintenus à l’aide d’un tissu englobant le corps (pour réduire le stress) pendant une durée d’environ une minute.

Impact sur les animaux

L’intervention chirurgicale est jugée douloureuse (douleur modérée) et inflammatoire. Les procédures chirurgicales peuvent entraîner une perte de poids de 15%, une inflammation des plaies et l'hémorragie comme complication de la canulation cathétérisation artérielle ne peut être totalement exclue. Bien que les rongeurs soient des espèces « dit » social, il faudra garder certains individus en cage individuelle après intervention chirurgicale pour éviter que ses congénères ouvrent la plaie et empêchent la cicatrisation. De plus, certaines analyses s’effectueront dans des cages particulières n’étant pas prévu pour l’analyse de 2 individus simultanément. Une partie des animaux sera donc placés en cages individuelles pendant toute l’expérimentation. La contention douce nécessaire aux injections peut entrainer un stress léger de courte durée.

Devenir

L’euthanasie des animaux est nécessaire puisqu'elle permettra d’étudier les gènes, hormones et organes afin de comprendre le mécansime biologique d’action de la lumière sur le métabolisme et la reproduction.

Remplacement

En termes de remplacement, la régulation du métabolisme et des cycles reproducteurs impliquant plusieurs organes (notamment, cerveau, foie, pancréas, muscles, hypophyse, ovaires), l’investigation des interactions nécessite l’utilisation d’organismes entiers, et non pas d’organes ou de cellules isolées.

Réduction

En termes de Réduction, le nombre d’animaux propose est basé sur un nombre minimal qui prend en compte les moyennes des données comportementales recueillies dans des études précédentes. Ici nous privilégions l’utilisation des mêmes animaux pour les expérimentations calorimétrie, tolérance au glucose, actimétrie.

Raffinement

En termes de Raffinement, les cages seront systématiquement enrichies d’un morceau de bois à ronger. L’ajout de matériel de nidification n’est pas utile chez les Arvicanthis en stabulation car ni les mâles, ni les femelles hors reproduction ne construisent de nid avec ce matériau. Par ailleurs, bien que ce projet nécessite des procédures invasives, le maximum sera fait pour réduire la douleur et le stress des animaux tout au long de l’expérience (environnement enrichi, anesthésie et analgésie profondes, suivi du score de douleur). De plus, l’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement. Des points limites prédictifs ont été établis permettant d’interrompre les procédures et soustraire ainsi l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le rongeur diurne Arvicanthis ansorgei a été choisi car son système circadien fonctionne d’une manière similaire à celui des Hommes, contrairement aux rongeurs classiques de laboratoire (rats et souris qui ont une activité nocturne). Le modèle Arvicanthis présente donc des atouts novateurs indéniables pour les applications biomédicales visant à étudier les effets de la pollution lumineuse sur la santé humaine. Nous avons choisi d’étudier l’effet de la pollution lumineuse sur un modèle de rongeur de sexe féminin pour trois raisons majeures : 1) le genre féminin est rarement étudié dans les investigations scientifiques à ce jour, 2) il existe des différences spécifiques liées a la reproduction féminine qui implique les rythmes biologique de 24 h dans la création des cycles reproducteurs ; 3) un nombre croissant de femmes travaille en horaires décalés alors que leurs systèmes reproducteur et métabolique sont particulièrement sensibles à la pollution lumineuse. La tranche d'âge choisi est jeunes adultes entre 3 et 6 mois pour étudier des fonctions matures dont la fonction de reproduction étudiable qu'en période mature. La tranche d'âge choisi est jeunes adultes entre 3 et 6 mois pour étudier les fonctions physiologiques matures dont la fonction de reproduction étudiable qu'en période mature et non-sénescentes.