Rongeurs

Identifier des signatures électroencéphalographiques utilisables pour tester de futurs candidats médicaments : c'est l'objet du projet, et 128 souris porteuses de deux mutations humaines de la maladie d'Alzheimer y subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune passe par une neurochirurgie d'une heure, des enregistrements de douze à quarante-huit heures une fois par semaine, jusqu'à vingt prélèvements sanguins et trois mois d'hébergement individuel. Elles sont toutes tuées à l'issue, les dispositifs implantés n'étant pas amovibles. Le porteur écrit que le modèle ne présente pas d'effets indésirables et que les souris ne développent aucun symptôme dommageable jusqu'à douze mois, tout en décrivant une douleur modérée dans les heures suivant l'intervention et un stress lié à l'isolement.

Objectifs

L’objectif aujourd’hui est d’identifier des signatures électroencéphalographiques précliniques permettant d’évaluer à terme l’efficacité de futurs candidats médicaments. Cela signifie d’appréhender cette problématique par une approche consistant à utiliser les données existantes de la recherche clinique pour construire de nouvelles solutions de recherche préclinique et se baser sur des signes de la maladie dans le cerveau et des tests médicaux utilisables à la fois chez l’animal et chez l’homme. L'électroencéphalographie représente un outil de choix en raison de son caractère transposable entre différentes espèces. En effet, les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères montrant le fort potentiel de transposition de cette méthode du rongeur à l’Homme, et donc l’application chez le rongeur d’observations faites chez le patient et inversement. Les patients atteints d’une pathologie neurodégénérative telle que la maladie d’Alzheimer, souffrent, en plus des symptômes caractéristiques, de troubles du sommeil et du cycle veille - sommeil. Ces dernières années, les altérations du comportement veille-sommeil ont été proposées comme étant non seulement un symptôme comportemental de la pathologie de la maladie d’Alzheimer, mais également un facteur de progression de la maladie, indiquant une relation réciproque entre le sommeil et les biomarqueurs précoces de la maladie d’Alzheimer. Des études sur des modèles animaux ont montré que des perturbations du sommeil peuvent déjà être présentes au stade précoce (présence de symptômes avant-coureurs) de la pathologie. Dans ce projet, nous étudierons les phases de veille-sommeil et les oscillations cérébrales dans un modèle murin modélisant la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

L’optimisation de nouveaux médicaments nécessite d’identifier des signes de la maladie dans le cerveau et des tests transposables entre les études cliniques et précliniques. Ils doivent permettre d’évaluer de façon fiable et robuste l’efficacité des molécules testées. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des souris modélisant la maladie d’Alzheimer et chercherons à mettre en évidence des marqueurs de la maladie qui pourront par la suite être applicables à l’Homme et permettre de tester de nouvelles molécules thérapeutiques. L’identification d’un potentiel nouveau traitement de la maladie d’Alzheimer permettrait d’améliorer les conditions de vie de nombreux patients.

Procédures

L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux seront tous soumis à des enregistrements longs (12 à 48 heures) qui seront réalisés sur l’animal éveillé une fois par semaine. Des prélèvements sanguins sur animal éveillé pourront également être réalisés (20 maximum au total, durée inférieure à 1 minute), tous les animaux du projet sont susceptibles d'être soumis à ces prélèvements. Ces prélèvements seront espacés d’au moins une semaine. Les animaux sont hébergés de façon individuelle à partir de la chirurgie pendant 3 mois maximum.

Impact sur les animaux

Le modèle ne présente pas d’effets indésirables, selon nos informations. Jusqu’à 12 mois, les souris ne développent aucun symptôme dommageable de la pathologie Suite à la chirurgie, une diminution de l’activité locomotrice et une déshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaître dans les heures suivant l’intervention chirurgicale. Les animaux sont hébergés de façon individuelle ce qui peut engendrer un certain niveau de stress. Les prélèvements de sang réalisé au cours de l’étude peuvent également représenter une source de nuisance pour les animaux (stress, douleur à la piqûre et possible plaie).

Devenir

Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électriques du cerveau qui ne sont pas amovibles, les animaux doivent donc être mis à mort à la fin du projet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle étudie des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou informatique).

Réduction

Les études sur le long terme présentent un avantage significatif en permettant à chaque animal de servir de contrôle pour lui-même, réduisant considérablement le nombre d'animaux nécessaires par groupe. Cette approche méthodologique nous a permis de déterminer le nombre d'animaux de manière à minimiser celui-ci, tout en veillant à préserver la validité scientifique et la fiabilité des résultats des expériences menées. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à nos études, les protocoles combineront un ensemble de procédures permettant de faire un suivi et d’obtenir plusieurs informations chez la même souris.

Raffinement

Le raffinement a été appréhendé à travers les conditions d'expérimentation et d'hébergement qui sont optimisées afin de s'assurer du bien-être des animaux tout au long des procédures expérimentales. Les souris qui entrent dans ce projet ont au minimum une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement. Le projet prévoit des procédures engendrant des douleurs post-opératoires modérées. Toutefois, les animaux recevront un protocole de soins post-opératoires comprenant une évaluation clinique quotidienne, des antidouleurs et des anti-inflammatoires. Des critères d’arrêt anticipé de l’expérimentation en cas de survenue d’une complication ont été identifiés. De plus, nous appliquerons des actes expérimentaux les moins invasifs possibles aux souris testées comme le choix d’une anesthésie gazeuse (par rapport à une injection). L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. La prise en compte de ces points permettra de juger du bien-être et d'éviter l'inconfort des animaux au cours de l'expérimentation de manière à garantir la qualité des résultats.

Choix des espèces

Dans ce projet nous utiliserons des souris. Ces animaux présentent des similarités anatomiques et fonctionnelles avec le cerveau humain et notamment au niveau des activités électriques du cerveau. De plus, la plupart des modèles de la maladie d’Alzheimer ont été développés sur cette espèce. Ce modèle exprime deux mutations humaines impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie. Cette lignée permet l’utilisation d’individus contrôles issus de la même portée. Ce modèle a donc un intérêt particulier pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point de traitements thérapeutiques. Par conséquent, l’utilisation de souris dans notre étude permettra une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine. La sélection de la souris est aussi basée sur des études précédemment réalisées. Les animaux sont âgés de 3,5 mois ou 9 mois puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes à différents stades de la pathologie. A ce stade, les circuits électriques du cerveau sont matures. Les animaux seront gardés jusqu’à l’âge de 14 mois maximum car le sujet d’étude concerne la maladie d’Alzheimer qui se développe avec le vieillissement.

Nourries huit à dix semaines avec un régime qui déclenche myotonie et faiblesse musculaire, injectées seize fois en huit semaines, soumises à une myotoxine qui abîme le muscle et à trente séances de course sur tapis roulant de quarante-cinq minutes, 720 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie passe aussi par une chirurgie de mesure de la force musculaire. Le porteur écrit que les modèles murins existants de la dystrophie myotonique de type 1 ne reproduisent que partiellement les anomalies observées chez les patients, et qualifie dans la même phrase le développement de nouveaux modèles murins d'"étape incontournable". Toutes les souris sont tuées pour prélever deux muscles, parfois trois, ce que le porteur juge "indispensable" pour mener ces recherches.

Objectifs

La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est une maladie neuromusculaire fréquente chez l’adulte, qui provoque des troubles musculaires, cardiaques et neurologiques particulièrement invalidants. Elle est causée par une anomalie génétique qui résulte de la répétition excessive d’une courte séquence d’ADN (répétitions CTG -variant de 50 à plus de 1500 répétitions chez les patients) ce qui provoque diverses dysfonctions cellulaires en perturbant le fonctionnement de certaines protéines essentielles. Ces perturbations affectent de nombreux processus cellulaires, dont certains sont directement liés aux symptômes observés chez les patients. Cependant, d’autres mécanismes moléculaires et cellulaires contribuent probablement à cette pathologie complexe. À ce jour, il n’existe pas de traitement permettant de guérir la DM1.

Bénéfices attendus

La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) est la dystrophie musculaire la plus fréquente chez l’adulte, touchant environ 1 personne sur 8 000. Elle se manifeste par une faiblesse musculaire progressive, une raideur des muscles (myotonie), ainsi que des atteintes cardiaques, respiratoires et neurologiques. Ces symptômes affectent le quotidien des patients et peuvent progressivement réduire leur autonomie. A ce jour, aucune thérapie n’est disponible pour soigner cette maladie génétique. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l’origine de la pathologie en disséquant les processus physiopathologiques musculaires des patients DM1. Ces études sont pré-requises pour le développement de thérapies ciblées.

Procédures

Certains lots d'animaux seront soumis à un régime alimentaire spécial pendant 8 à 10 semaines (animal vigil, prise alimentaire spontanée), d'autres subiront une injection à raison de 2 fois par semaines pendant 8 semaines (animal vigil, 16 injections maximum, 30 secondes). Certains lots d'animaux auront une injection (animal sous anesthésie et analgésie, 1 injection, 3 minutes) et d'autres effectueront un exercice sur tapis de course (animal vigil, 30 fois, 45 minutes). Enfin, certains animaux seront soumis à une intervention chirurgicale pour la mesure de la force musculaire (animal sous anesthésie et analgésie, 1 fois, 30 minutes).

Impact sur les animaux

Le régime alimentaire spécial donné aux souris génétiquement modifiées induira un phénotype tel que la myotonie (défaut momentané de relaxation musculaire après une contraction) et de la faiblesse musculaire provoquant une baisse générale d'activité. Les injections en intrapéritonéales étalées sur 8 semaines pourraient induire une légère douleur au point d’injection et un stress léger lors des manipulations, tout comme la contention nécessaire à l’injection ou les manipulations lors des mesures du poids effectuées deux fois par semaines à partir du début des injections. Les différents traitements sont connus, mais pourraient avoir des effets indésirables dans de rare cas tels que des diarrhées ou une perte de poids. D’autres effets indésirables de notre expérimentation concernent les dommages musculaires dues à l’injection de myotoxine. Ils peuvent être une infection de la peau au site d’injection et une douleur post-dommage du muscle. Les courses sur tapis roulant pourront engendrer un stress et une fatigue transitoire. Les anesthésies, effectuées dans le cadre de certains actes invasifs, peuvent induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardio-respiratoire.

Devenir

À la fin du projet, tous les animaux seront euthanasiés, car nous devons prélever leurs muscles pour les analyser. Ces analyses permettent d’étudier les effets de la maladie sur le muscle et sa capacité à se régénérer. Nous examinons généralement deux muscles par souris (parfois un troisième selon les besoins), ce qui rend l’euthanasie indispensable pour mener ces recherches.

Remplacement

Les modèles in vitro de cellules musculaires restent imparfaits puisqu’ils ne reproduisent pas le contexte tissulaire adulte de la fibre musculaire qui est une cellule hautement spécialisée et différenciée. La compréhension des mécanismes à l’origine de la DM1 nécessitent d’avoir recours à des modèles animaux de cette pathologie qui expriment la mutation DM1 et reproduisent la pathologie au niveau moléculaire et physiologique. A ce jour, les modèles murins de la DM1 existants ne reproduisent que partiellement les anomalies moléculaires et physiologiques observées chez les patients. Le développement de nouveaux modèles murins de la DM1 présentent davantage de similitudes avec la pathologie chez l'homme est un enjeu majeur et une étape incontournable dans la compréhension de la pathologie humaine.

Réduction

Pour ce projet, un maximum de 720 animaux sera utilisé. Le nombre d’animaux à utiliser par groupe est de 15, soit 720 au total dans le cadre de ce projet. La taille des effectifs a été établie grâce à nos études précédentes et à un calcul de puissance. Des tests statistiques seront réalisés pour permettre l'interprétation fiable des résultats. Afin d'optimiser et de réduire le nombre d'animaux, tous les animaux avec le génotype d'intérêt seront analysés, sans distinction de sexe. Les souris seront analysées in vivo et in situ et les tissus seront prélevés post-mortem et conservés pour des expériences ultérieures éventuelles.

Raffinement

Dans le but de raffiner le protocole et, en conformité avec la réglementation, toutes les précautions seront prises afin de réduire à son maximum le stress et la souffrance animale. L’entretien des souris ainsi que les différents protocoles expérimentaux seront assurés par du personnel qualifié et le bien-être des animaux est amélioré par la mise en place d’un enrichissement de milieu (carré de lanière kraft et bâtonnet en bois). Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture. Les conditions de température et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères et l'hébergement individuel est évité au maximum. Dans le but de réduire la souffrance et le stress des animaux, une habituation aux gestes de contention et d’injection sera faite avant le début des injections. Une attention particulière sera apportée sur la manipulation douce des cages et des animaux lors des contentions et injections successives. Une phase d’acclimatation sera réalisée avant le début des séances d’exercice sur tapis roulant. La durée et la vitesse sont adaptées à chaque souris de façon à ce qu’elle ne soit pas épuisée et puisse réaliser la totalité de la séance. Les injections ainsi que les mesures de force in situ seront réalisées sous anesthésie générale, et l'administration d'un analgésique sera effectuée 30 minutes avant l'anesthésie. Enfin, un suivi du bien-être des animaux et des points limites seront réalisés quotidiennement. En cas d’effet indésirables observés tel que des diarrhées, l’apport d’aliment et une source de nutrition hydratée sera proposé.

Choix des espèces

Dans cette étude, nous générons et ré-utilisons des modèles murins développés par d'autres chercheurs. Le choix de cette espèce est pertinent car la structure et la fonction du muscle est très proche entre l'humain et la souris. Le projet vise à étudier les défauts liés à la dystrophie myotonique de type 1, pathologie qui se développe chez l’adulte. Chez la souris, la maturation du muscle continue jusqu'à 8 semaines après la naissance. Les souris portant le génotype d'intérêt seront donc utilisées sevrées et adultes âgées de 8 semaines au minimum au début des procédures.

Toutes tuées en fin de protocole pour que soient prélevés leurs intestins et leurs cerveaux, 192 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant vingt et un jours, elles subissent des facteurs de stress imprévisibles, cage inclinée, litière humidifiée ou retirée, privation de nourriture pendant douze heures, cycle lumineux perturbé, et pour la seconde procédure une heure de contention, deux heures d'exposition à une odeur de prédateur et douze heures de litière fortement humide. S'y ajoutent un antibiotique dans l'eau de boisson, un gavage bactérien, une injection de pilocarpine et trois tests comportementaux nommés, open field, labyrinthe en croix surélevé et appétence au sucrose. Le porteur écrit qu'aucun prélèvement douloureux ne sera effectué sur les animaux vivants, puis affirme que remplacer l'expérimentation animale n'est pas possible ici parce que les effets du stress dépendent d'interactions propres à l'organisme.

Objectifs

Le microbiote intestinal est un ensemble de micro-organismes (bactéries, virus) qui vivent dans nos intestins et qui jouent un rôle crucial pour notre santé. Son équilibre est influencé par des facteurs liés à notre corps, comme notre génétique, ainsi que par des éléments extérieurs, comme notre alimentation et les médicaments que nous prenons. Des recherches récentes montrent que le stress, qu'il soit temporaire ou prolongé, peut modifier la composition de ce microbiote. En période de stress, les bactéries de notre intestin peuvent être exposées à des substances qui changent leur croissance et leur comportement. De plus, le stress pourrait faciliter le transfert de gènes entre les bactéries, y compris les gènes qui rendent certaines bactéries résistantes aux antibiotiques. L’ensemble de ces observations suggère que le stress pourrait augmenter la fréquence des transferts de gènes dans l’intestin et participer à la dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques. Or, d’une part, le stress est un problème courant dans notre société, et, d’autre part, la résistance aux antibiotiques, en forte augmentation ces dernières années, devient une menace majeure pour la santé humaine. A l’heure actuelle, l’influence du stress sur la dissémination des gènes de résistances aux antibiotiques n’a jamais été évaluée dans un organisme vivant. Etant donné la complexité des interactions dans le microbiote intestinal entre les bactéries et les cellules humaines, il n’est pas possible d’explorer cette hypothèse en dehors d’un modèle animal. Ce projet a pour but d’étudier l’impact du stress sur la propagation des gènes de résistance aux antibiotiques dans le microbiote intestinal de souris. Nous comparerons les effets de deux modèles de stress imitant chez l’humain les contrariétés de la vie quotidienne, le premier étant léger (protocole 1) et le second modéré (protocole 2), en examinant si le sexe des animaux (mâles ou femelles) influence leur réponse au stress.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus ici permettront de mieux comprendre les effets du stress sur la propagation de gènes de résistance aux antibiotiques dans le microbiote intestinal, en tenant compte de son intensité et des différences entre les sexes. Ces résultats seront innovants. Ils permettront de déterminer si le stress influence le microbiote intestinal, en particulier la transmission des gènes de résistance aux antibiotiques dans les intestins. Si on observe un effet du stress sur cette transmission, nous chercherons à identifier les mécanismes en jeu, ce qui pourrait ouvrir de nouvelles voies pour lutter contre la propagation de la résistance aux antibiotiques. Ces avancées bénéficieront à la fois aux humains et aux animaux, car la résistance aux antibiotiques affecte les deux.

Procédures

Les protocoles entraînant un stress léger (protocole 1) ou modéré (protocole 2) consistent à appliquer des facteurs de stress de manière imprévisible. Le stress durera 21 jours, avec 1 heure le matin, 2 heures l’après-midi et une période de stress pendant la nuit. Les facteurs de stress sont légers à modérés (par exemple, incliner la cage, humidifier ou enlever la litière) et il y aura des périodes d’au moins 2 heures où l’animal ne subira aucun stress. Aucun prélèvement douloureux ne sera effectué sur les animaux vivants. À la fin du protocole, un échantillon de salive sera prélevé. Par ailleurs, l’ensemble des animaux recevra un antibiotique à raison de 0.5 mg/L dans son eau de boisson à partir de J-3 du début du stress et durant les 21 jours de la durée du stress. A J0 du stress, la moitié des animaux se verra administrer en une fois par gavage la bactérie donneuse du plasmide de résistance aux antibiotiques. Des tests comportementaux (Open Field, Labyrinthe en croix surélevé, test d’appétence au sucrose) seront réalisés en fin de protocole de stress. Une injection intrapéritonéale de pilocarpine sera réalisée à la fin du protocole, afin de permettre le prélèvement d’une quantité suffisante de salive.

Impact sur les animaux

L’inclinaison de la cage va perturber la souris ; la privation de nourriture (12h) va induire un besoin non comblé ; dans la première procédure, la réduction de l’espace va induire un stress situationnel, la cohabitation et l’inversion de cage vont générer un stress social ; la litière humide ainsi que le placement dans une cage sans litière vont déranger l’animal ; le non-respect du cycle lumineux va induire un épuisement. L’ensemble de ces différents stress légers justifie un classement de la première procédure de stress imprévisibles en léger. Dans la seconde procédure, trois stress d’intensité plus importante seront utilisés : contention (1h), stress d’exposition à une odeur de prédateur (2h) et litière fortement humidifiée (12h), justifiant un classement de la deuxième procédure de stress imprévisibles en modéré. Le gavage nécessaire à l’administration des bactéries peut induire un stress léger (moins de 1 minute). L’injection de la pilocarpine peut induire une courte douleur d'intensité identique à celle de l'introduction d'une aiguille (moins de 1 minute). La pilocarpine induit des effets non douloureux chez l’animal, à savoir une hypersécrétion salivaire, lacrymale et gastrique, ainsi qu’une bradycardie.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de réaliser des prélèvements intestinaux (pour mettre en évidence les transferts de gènes entre bactéries) et des prélèvements cérébraux (pour mettre en évidence le niveau de stress).

Remplacement

Les recherches en laboratoire montrent que des molécules libérées dans l’intestin en cas de stress pourraient influencer le transfert de gènes entre certaines bactéries. Cependant, ces études ne prennent pas en compte la complexité du microbiote intestinal. Les protocoles de stress chronique léger et modéré utilisés ici sont plus proches de la réalité que les modèles en laboratoire. Ainsi, il n'est pas possible de remplacer les expérimentations animales par des méthodes alternatives dans ce cas. En effet, les effets du stress dépendent de nombreuses interactions et processus biologiques spécifiques à l’organisme, ce qui ne peut être étudié que par des modèles in vivo (sur des animaux vivants).

Réduction

Le nombre minimal d’animaux utilisés pour ce projet a été calculé en utilisant des tests statistiques. Ces tests ont montré que nous aurons besoin de 12 animaux par groupe testé pour pouvoir obtenir des résultats analysables, soit un total de 192 animaux pour l’ensemble de l’étude.

Raffinement

Les cages seront munies d’éléments permettant d’offrir aux animaux la possibilité d’évoluer en espaces clos, type de milieu préférentiel chez des rongeurs. L’état des animaux sera vérifié quotidiennement à la recherche de symptômes légers, modérés ou sévères référencés dans la grille de scoring interne à la structure. En cas de symptômes légers, les soigneurs et zootechniciens surveilleront particulièrement ces animaux. En cas de symptômes modérés, la structure bien-être animal sera sollicitée avec ou sans le vétérinaire référent. En cas de symptômes sévères, l’animal sera sorti du protocole.

Choix des espèces

Des études récentes ont validé les effets du protocole de stress léger que nous allons utiliser durant 3 semaines sur des souris. En effet, celui-ci entraîne une augmentation des marqueurs du stress dans le sang des animaux ainsi qu’un comportement anxieux tels qu’attendus dans notre étude. Notre étude portera sur des animaux mâles et femelles jeunes adultes.

Pour former ou remettre à niveau le personnel technique d'un laboratoire aux gestes de prélèvement et d'administration, 450 souris et 300 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir jusqu'à six gestes techniques au cours de sa vie, à raison d'une séance par semaine au maximum, prélèvements sanguins et gavages compris. Le porteur indique qu'un hématome peut se former au point de ponction et que certains animaux peuvent faire un choc hypovolémique ou souffrir d'anémie après un prélèvement de sang, les nuisances augmentant avec des expérimentateurs non aguerris. Tous sont tués une fois la technique validée, parce que les prélèvements répétés modifient leurs paramètres sanguins et rendraient leurs données inutilisables dans un autre projet.

Objectifs

L’administration de médicaments et/ou le prélèvement sanguin, dans le cadre d’études utilisant des animaux à des fins scientifiques, est une étape couramment utilisée en recherche et développement pharmaceutique. Selon les besoins, les voies ou les volumes d’administration ou de prélèvement peuvent varier grandement. À l’intérieur de ce cadre expérimental, il est primordial de viser en tout temps le maintien du bien-être de l’animal via la bonne formation des expérimentateurs. Ce projet concerne la formation interne de gestes techniques en expérimentation animale utilisés dans nos projets. Il s’agira de former ou de remettre à niveau le personnel technique intervenant dans le cadre de projets validés afin de garantir la qualité technique et la standardisation des procédures, et in fine augmenter la reproductibilité des études.

Bénéfices attendus

La maitrise des gestes techniques du personnel intervenant lors les études en expérimentation animale est essentielle pour plusieurs points : -essentielle au bien-être animal (la maitrise d’une technique permet de minimiser la gène/douleur pour les animaux). La contrainte subie par l'animal lors d’un geste technique ne dépend pas seulement de la technique en elle-meme ou de l’animal mais aussi de l'habileté de la personne. qui l'exécute. Une bonne maitrise technique limite le stress de l’experimentateur lors des études limitant ainsi son stress transmis aux animaux. -essentielle pour la reproductibilité des études : une bonne maitrise des gestes techniques maximise la reproductibité intra et inter expérimenteurs des études.

Procédures

Les animaux de cette procédure pourront être soumis à des prélèvements de sang anesthésiés ou non selon la technique utilisée, 1 fois par semaine maximum. La durée de l’intervention dépendra de la voie de prélèvement, en général de 20 à 30 secondes. De même, pour les administrations (1 séance par semaine maximum), animaux si possible anesthésiés dans les premières séances, puis vigiles, selon la technique utilisée. La durée de l’administration dépendra de la technique utilisée. Par exemple, 15 à 20 secondes pour un gavage, jusqu’à 1 minute de contention pour une injection intraveineuse.

Impact sur les animaux

Les animaux seront réutilisés pour différentes techniques si besoin. La formation sera optimisée, dans le respect du bien-être des animaux, pour le nombre et les voies de prélèvements/administrations. Néanmoins, la multiplication des actes de même type ou différents, peut entrainer un stress cumulé. Les nuisances peuvent être induites par chaque geste technique : administration d’une solution saline, prélèvements sanguins, anesthésies prolongées (prélèvements) par exemples. Les nuisances / effets indésirables peuvent être augmentés dans le cadre de l’apprentissage de nouveaux gestes techniques par les expérimentateurs non aguerris. La douleur ressentie par les animaux peut se manifester, entres autres, par une hypo- ou une hyperactivité, des difficultés à se déplacer, une prostration, une modification des expressions faciales. Un hématome (épanchement sanguin généralement sous-cutané avec ecchymose et douleur) peut se former au site de ponction, certains animaux peuvent faire un choc hypovolémique ou souffrir d’anémie suite à un prélèvement sanguin.

Devenir

Une fois la technique validée par le formateur, les animaux ne pourront entrer dans un projet. En effet, les injections ou prélèvements répetés peuvent induire des modifications hématologiques et/ou biochimiques. Ces dernières, même légères, peuvent être délétères pour les analyses demandées dans le nouveau projet. Ils seront alors tous mis à mort.

Remplacement

La personne en formation aura accès, via des sites internet spécifiques, à des vidéos/articles/photos adaptées. Les premières séances de formation consisteront à la lecture de notre procédure technique, validée par notre vétérinaire référent. Elle contient les informations concernant chaque geste technique potentiel : volumes adaptés, nombre de réalisations tolérées, périodes de récupération, conditions de validation de la formation, etc L’apprentissage d’une nouvelle technique, qui ne nécessite pas obligatoirement des animaux vigiles (per os par exemple), suivra toujours le même process : 1-Expérimentation sur animal mort et/ou un mannequin 2-Expérimentation sur animal anesthésié sans réveil 3-Expérimentation sur animal avec réveil

Réduction

Après entrainement sur un mannequin et/ou un animal mort, les animaux seront réutilisés pour différentes techniques si besoin. La formation sera optimisée, dans le respect du bien-être des animaux, pour le nombre et les voies de prélèvements/administrations, afin de limiter l’impact de ces actes techniques que se soit sur l’homéostasie ou le stress cumulé. A la fin de la formation, le responsable de ce projet devra s’assurer que les animaux seront utilisés dans la mesure du possible pour des prélèvements finaux (souvent organes) pour la mise en place de techniques ex vivo (histologie par exemple) ou pour servir d’échantillons contrôles.

Raffinement

Les animaux hébergés en groupe bénéficierons d’une acclimatation de 5 jours minimum. Ils auront à leur disposition des carrés de ouate notamment pour la constitution du nid ainsi qu’un dôme en plastique rouge (souris) ou un tunnel en carton (rats) pour pouvoir se cacher. Leur comportement de rongeur sera encouragé par la présence de bâtons en bois dans la cage. Ils auront également libre accès à l’eau et la nourriture tout au long du projet. Les points limites associés à chaque technique en apprentissage seront recherchés après chaque séance. En cas d’atteinte, une décision sera prise avec le formateur et/ou le vétérinaire référent.

Choix des espèces

Les séances de formation se dérouleront avec des souris et/ou des rats, espèces utilisées dans notre animalerie pour les projets scientifiques validés par le Ministère. Les animaux seront au minimum du même âge que ceux couramment utilisés dans nos projets, c’est-à-dire entre 7 à 9 semaines en général. Ils pourront néanmoins être gardés plus longtemps si le technicien a besoin de beaucoup de séances de formation ou dans le cas d’une technique plus difficile à maitriser, tant que les animaux sont en bonne santé et peuvent rester dans ce projet, dans la limite de 6 gestes techniques reçus tout au long de leur vie.

Saisis et immobilisés dix minutes chacun, puis piqués quatre fois pour des injections de sérum physiologique par des stagiaires qui apprennent le geste, 150 souris et 75 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués à l'issue, le porteur indiquant qu'ils ne peuvent pas être réutilisés pour éviter un effet cumulatif. Ces séances forment la partie pratique d'une formation encadrée par l'arrêté du 1er février 2013, et le porteur les présente comme un moyen d'enseigner les gestes qui réduisent le stress animal. Il ajoute que diminuer le nombre d'animaux ne ferait qu'augmenter les nuisances subies par chacun, et la liste des effets indésirables mentionne le gavage par la bouche et le prélèvement sous la mâchoire, deux gestes absents de la description des procédures.

Objectifs

Les formations spécifiques pour les personnes appliquant/concevant des procédures expérimentales sont encadrées par l’arrêté du 1er février 2013 relatif à l’acquisition et à la validation des compétences des personnels des établissements utilisateurs, éleveurs et fournisseurs d’animaux utilisés à des fins scientifiques. Cet arrêté défini le programme de base et ce dernier doit comporter une partie : Procédure faiblement invasive : théorie et pratique. Ce projet décrit cette partie pratique.

Bénéfices attendus

Cette formation a pour objectif de former les personnes qui seront autorisées à utiliser des animaux à des fins scientifiques. Ces sessions de travaux pratiques ont pour but de leur enseigner les bonnes pratiques c'est à dire les gestes techniques qui permettent de réduire le stress animal. Il s'agit donc de raffiner les procédures de ces futurs utilisateurs et utilisatrices d'animaux à des fins scientifiques.

Procédures

Préhension, contention (dix minutes par animal) et injections sur animaux vigiles (quatre injections de sérum physiologique (deux minutes par injection), un prélèvement d'une goutte de sang (deux minutes) et une administration d'eau (cinq minutes) par souris, quatre injections de sérum physiologique (2 minutes) par rat).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les rongeurs peuvent être un stress généré par l’inexpérience des stagiaires. Cette hésitation peut être source de stress pour l’animal. Le stress généré n’est cependant que transitoire et de courte durée. Par ailleurs les injections et les prélèvements peuvent entrainer une douleur notamment lors de l’effraction cutanée. Les injections dans la cavité abdominale peut entrainer éventuellement dans de très rare cas une injection dans le début du gros intestin. Le gavage par la bouche peut également entrainer un inconfort pour l’animal et un risque de fausse route s’il n’est pas réalisé correctement. Le prélèvement sous la machoire peut entrainer éventuellement un risque d’hémorragie s’il n’est pas réalisé correctement.

Devenir

Les animaux ne pouvant pas être réutilisés afin d'éviter un effet cumulatif, ils seront mis à mort.

Remplacement

L’objectif de cette séance est d’une part de montrer aux stagiaires les bonnes pratiques en terme de contention et de prélèvements, puis de vérifier qu’ils mettent correctement en oeuvre ces pratiques. Il est important pour cela, qu’ils soient confrontés à des animaux vivants, tout comme dans les futures procédures expérimentales qu’ils et elles appliqueront.

Réduction

Le nombre d’animaux est choisi pour être réduit au minimum tout en gardant la possibilité à chaque apprenant de pouvoir effectuer les différents gestes techniques. Diminuer ce nombre ne ferait qu’augmenter les nuisances pour chaque animal, ainsi que le stress rendant les contentions plus difficiles et les apprentissages plus complexes. Des animaux de réforme pourront être utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, ils bénéficient d'enrichissement du milieu et d'une période d'acclimatation. Les manipulations se font sous le contrôle des intervenantes et intervenants qui veillent à l’exécution des gestes dans le respect du bien-être animal. Des points limites et critères d'arrêt sont définis. La préhension des souris en évitant la prise par la queue sera également enseignée (utilisation de tunnels et main en coupe).

Choix des espèces

La souris reste le modèle le plus utilisé en recherche (60% des utilisations d’animaux), le rat, bien que moins utilisé (environ 10%) reste néanmoins très utilisé notamment dans le cadre des neurosciences, discipline très représentée au CNRS. Les rats d’un poids de 250g et les souris de 7 semaines sont utilisés à cet âge de manière à ne pas rendre trop compliquée la préhension et la contention pour les apprenants.

155 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit deux interventions chirurgicales de quarante-cinq à cent vingt minutes, la pose d'une prothèse sur la tête sous sédation, cinq semaines d'hébergement individuel, un entraînement progressif au port d'un appareil d'imagerie crânien, puis une tâche comportementale que le porteur qualifie de légèrement désagréable sans la nommer. Le modèle est une lignée transgénique présentée comme représentant l'autisme, et les retombées annoncées, une contribution possible à l'orientation d'essais cliniques, restent au conditionnel. Sur le remplacement, le porteur écrit que les études cliniques ne conviennent pas en raison de la fragilité de la population concernée et de la "nécessité" d'approches invasives.

Objectifs

Les difficultés d'attention sont fréquentes dans divers troubles neurodéveloppementaux tels que l'autisme, les troubles du déficit de l'attention et certaines maladies génétiques caractérisées par un retard de développement. Ces problèmes posent un défi important à l'intégration sociale, éducative et professionnelle des personnes concernées. Pour mieux comprendre les raisons biologiques de ces difficultés, nous proposons d'analyser l'activité des cellules nerveuses dans une région du cerveau impliquée dans ces troubles. Nous utilisons un modèle génétiquement modifié représentant l'autisme, qui manifeste des problèmes d'attention dans des conditions expérimentales. Notre projet comprend des tests de comportement et l'imagerie, ainsi qu'un traitement pharmacologique pour mettre en évidence ces déficits.

Bénéfices attendus

L'autisme est une condition complexe pour laquelle il n'existe actuellement aucun traitement médicamenteux spécifique. En raison de la diversité des origines et des manifestations de cette condition, il est peu probable qu'une seule molécule puisse traiter tous les symptômes. Face à cette complexité, une approche consiste à comprendre les modifications dans les circuits cérébraux liés à des symptômes spécifiques. Notre étude se concentre sur les problèmes d'attention, qui touchent environ 40% des personnes autistes et sont étroitement liés à d'autres symptômes comme les problèmes sensoriels. En s'appuyant sur des recherches antérieures, nos propres données préliminaires et notre programme de recherche, nous cherchons à identifier les changements dans l'activité de certaines populations de cellules nerveuses. Ces modifications pourraient servir de biomarqueurs tant sur le plan physiologique que comportemental, permettant d'évaluer l'impact de nouveaux traitements médicamenteux pour les problèmes d'attention liés à l'autisme. Nous pensons que notre travail pourrait éventuellement contribuer à orienter des essais cliniques chez l'homme. En outre, les avancées techniques réalisées dans le cadre de ce projet bénéficieront à d'autres projets de recherche de notre laboratoire, nous permettant d'améliorer nos méthodes techniques et scientifiques pour nos futurs travaux. Dans une perspective plus large, les connaissances que nous espérons tirer de notre étude pourraient également enrichir notre compréhension d'autres troubles neurodéveloppementaux impliquant des problèmes d'attention.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes. En outre, ils subiront une intervention sous sédation (sans acte invasif) d'une durée d'environ 60 minutes pour la pose d'une prothèse sur la tête. Pour des raisons techniques liées à la présence d'une prothèse, il est nécessaire d'adapter les conditions d'hébergement. Les animaux seront hébergés individuellement pendant une période de 5 semaines, avec des périodes d'échange entre congénères. Les animaux seront progressivement habitués à accepter la pose d'un appareil d'imagerie sur leur tête au cours de séances d'entraînement, dont la durée augmentera progressivement de 2 à 30 minutes. Par la suite, les animaux effectueront une tâche comportementale légèrement désagréable d'environ 30 minutes en présence de l'appareil d'imagerie, qui sera positionné sur leur tête. Le lendemain, ils seront de nouveau exposés à la tâche comportementale, cette fois pendant environ 20 minutes. Certains animaux reçoivent un traitement pharmacologique d'un produit autorisé pour l'administration chez l'enfant (3 injections intra péritonéale ; durée : chacune 2s max).

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : le risque d'inconfort, de douleur, d'infection et/ou de perte de poids est inhérent à ces procédures. Ils seront à nouveau endormis, exposant ainsi un risque d'hypothermie ou de problèmes respiratoires temporaires. Ils seront soumis à une tâche comportementale légèrement désagréable et stressante pour l'animal. Ils seront entraînés à porter un appareil d'imagerie sur leur tête, ce qui représente une contrainte pour la posture de l'animal. La pose d'une prothèse implique également une contrainte pour l'animal, ce qui nous obligera à adapter les conditions d'hébergement. Les injections sont légèrement desagréable. Le produit injecté peut avoir un effect neuropharmacologique.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées et leurs cerveaux seront prélevés pour des analyses post-hoc.

Remplacement

Le projet se concentre sur l'exploration des changements comportementaux et neurobiologiques chez un modèle de maladies neurodéveloppementale. Les expériences proposées nécessitent l’utilisation d’un modèle animal vivant et il ne peut pas être remplacé par les études in vitro ou in silico. Les études cliniques ne sont pas appropriées pour notre objectif expérimental, en raison de la fragilité de la population clinique concernée et de la nécessité d'approches invasives pour répondre à nos questions scientifiques. Les structures cérébrales sont généralement bien préservées chez différentes espèces de mammifères, ce qui suggère une similitude fonctionnelle entre les rongeurs et les humains. L'utilisation de modèles animaux avec une sensibilité neuronale plus faible (tels que les invertébrés ou les poissons) ne convient pas à notre projet, car ces organismes ne possèdent pas la structure cérébrale spécifique ciblée par notre étude.

Réduction

Nous avons réfléchi à notre projet de recherche de façon à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. La conception expérimentale soigneuse de notre projet permettra une stratégie de réduction à minima de nombre des animaux nécessaires à l’exploitation statistique des résultats. Afin d’estimer correctement le nombre d’animaux nécessaires, nous avons consulté deux experts dans le domaine. Nous avons également prévu une étude pilote, permettant l’étude de la faisabilité technique de certains aspects de notre projet. De plus, nous avons intégré une stratégie permettant une évaluation précoce de nos résultats au fur et à mesure et, si nécessaire, une réduction de nombre d’effectifs nécessaire à la réalisation de nos objectifs scientifiques.

Raffinement

i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal avant et après chaque expérience ou manipulation. iii) Perfectionnement des procédures chirurgicales pour réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques pour chaque intervention chirurgicale. Ajout d'un analgésique local à longue durée d'action et d'un anti-inflammatoire lors de la deuxième intervention chirurgicale. iv) Application de soins préventifs après la chirurgie v) Animaux manipulés quotidiennement avant les séances de comportement afin de réduire le niveau de stress. vi) Entraînement à la porte de l'appareil d'imagerie, vii) Utilisation des techniques de manipulation prévu pour réduire le stress de la manipulation viii) Habituation à la salle de comportement, ix) Définition de points limites spécifiques et de mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure. x) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de perfectionnement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs en bien être animal, consultation d'experts dans le domaine.

Choix des espèces

Choix de l'espèce : Les expériences proposées pour cette étude nécessitent des mesures comportementales et neurophysiologiques (impliquent des interventions invasives). Nous avons donc besoin d’un modèle animale complexe et intacte, adapté à la réalisation des tests cognitifs, possèdant la structure cérébrale ciblée par notre étude, pour lequel il existe déjà des tests comportementaux validés dans la littérature scientifique. De plus, il est essentiel que l'espèce soit susceptible d'accepter des modifications génétiques pour reproduire les conditions génétiques humaines. Idéalement, le modèle devrait être bien validé par des études antérieures en tant que représentation fiable et éprouvée pour l'étude de l'autisme. La souris répond à tous ces critères et offre la cohérence avec les recherches précédemment menées au sein de notre équipe. Les modèles animaux avec une sensibilité neurophysiologique moindre, tels que les invertébrés ou les poissons, ne sont pas appropriés pour notre projet, car les approches techniques que nous envisageons ne peuvent pas être appliquées à ces organismes. De plus, les tests comportementaux chez ces animaux sont souvent trop limités pour modéliser de manière adéquate des maladies complexes comme l'autisme. Stade de développement : 4 à 6 semaines au début des procédures (c.a.d. l'acte chirurgical) et 10 à 12 semaines (jeunes adultes) au moment du test comportemental. Justification : Ce stade de développement a été choisi pour être en cohérence avec les études antérieures effectuées au sein de notre équipe, utilisant le même modèle transgénique et la même tâche comportementale. En effet, cette étude s'inscrit dans la continuité de notre programme de recherche, et il est très important de maintenir les mêmes conditions expérimentales afin de garantir la reproductibilité et la fiabilité de nos expériences, tout en facilitant la comparabilité de nos données avec celles obtenues précédemment. L'âge de 10 à 12 semaines a été choisi car il correspond au moment de maturité des circuits neuronaux ciblés. Bien que la condition étudiée se manifeste à tous les stades de la vie, une intervention thérapeutique sera plus efficace si elle est effectuée de manière la plus précoce possible. C'est pour ces raisons que nous utilisons des jeunes adultes.