Rongeurs

Jusqu'à vingt et une injections par animal et une opération de quinze minutes : 880 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour des analyses post-mortem. L'objet est d'ouvrir temporairement la barrière hémato-encéphalique pour faire entrer davantage de médicaments dans les glioblastomes, décrits comme les tumeurs cérébrales les plus agressives. Sur ce que subissent les souris, le porteur s'en tient à des "douleurs légères et de courte durée" liées aux injections et à des "nuisances et douleurs liées à la présence de tumeurs cérébrales". Ni le mode d'implantation des tumeurs ni la répartition des 880 souris entre les procédures ne sont précisés.

Objectifs

Les glioblastomes sont les tumeurs cérébrales les plus agressives. La faible diffusion des médicaments au travers de la barrière hémato-encéphalique limite fortement leurs efficacités. Ainsi, le développement de stratégies thérapeutiques sur-mesure conçues pour augmenter la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique constitue un besoin clinique majeur. Des travaux ont mis en évidence le rôle de protéines impliquées dans l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. Une molécule ciblant ces protéines a été développée et induit une ouverture transitoire de la barrière hémato-encéphalique. Cette molécule peut être utilisée pour augmenter la diffusion et l’efficacité des médicaments contre les tumeurs cérébrales.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus au cours de ce projet permettront de mieux comprendre les processus d’administration et de diffusion des molécules thérapeutiques dans les tumeurs cérébrales, ainsi que d’augmenter leurs efficacités

Procédures

Maximum de 21 injections (< 1 minute par injection) par souris, avec un intervalle entre deux injections allant de 24h à 72h en fonction des traitements. Maximum de 1 procédure chirurgicale par souris (15minutes).

Impact sur les animaux

Douleurs légères et de courte durées liées aux injections intrapéritonéales ou intraveineuses. Nuisances et douleurs liées à la présence de tumeurs cérébrales

Devenir

Les souris seront mises à mort à la fin des procédures pour analyses post-mortem.

Remplacement

Des études préliminaires in vitro de perméabilité sur cellules endothéliales cérébrales ont été réalisées. Cependant, la complexité de la barrière hémato-encéphalique ne peut pas être entièrement répliquée in vitro. Cette complexité se retrouve conservée entre humains et souris, faisant de la souris un modèle nécessaire pour cette étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum. La taille des échantillons permettant une analyse statistique efficace des résultats a été déterminée à partir de données collectées au cours d’expériences précédentes, ainsi que par utilisation de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Pour éviter le stress et la douleur, les injections seront réalisées sous anesthésie générale associée en amont à une analgésie. Nous avons mis en place des points limites adaptés à chaque procédure.

Choix des espèces

La souris est un modèle nécessaire pour cette étude de part : 1- La complexité de la barrière hémato-encéphalique qui ne peut pas être entièrement répliquée in vitro, mais qui est conservé entre humain et souris 2- L’existence de modèles de souris génétiquement modifiées avec une barrière hémato-encéphalique perméable ou imperméable. Des souris adultes entre 2 et 8 mois seront utilisées pour l’étude des effets de la barrière hémato-encéphalique sur la diffusion et l’efficacité́ des molécules thérapeutiques visant les tumeurs cérébrales.

Parce que ce modèle "garantit que 100 % des animaux développent un cancer du foie", 90 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dès les premiers jours de vie, chaque souriceau est séparé de sa mère et reçoit une injection d'antibiotique sous la peau, puis, à partir de la quatrième semaine, un régime riche en graisses plus ou moins chargé en vitamine B9. Toutes sont tuées après six ou quatorze semaines pour prélever leur foie. Le porteur écrit que ce régime, qui fait passer les souris d'un foie gras à un cancer du foie, se déroule "sans douleur".

Objectifs

La maladie dite du « foie gras » peut évoluer en cancer du foie, une des principales causes de décès par cancer dans le monde. Un manque en vitamine B9 pourrait favoriser le développement de cette maladie et le cancer du foie. Cependant, son rôle exact n’est pas encore clair et les mécanismes impliqués ne sont pas bien compris. Le but du projet est donc de voir si la vitamine B9 peut influencer cette maladie et le cancer, et par quels mécanismes. Pour répondre à ces questions et étudier l’évolution de la maladie du « foie gras » en cancer, il n’est pas possible d’utiliser de cellules en culture. Par contre, des souris nourries avec un régime gras et traitées avec un antibiotique spécifique développent la maladie comme chez l’humain : d’abord une accumulation de graisse, puis une inflammation et des cicatrices, et enfin un cancer du foie. Pour déterminer si la vitamine B9 joue un rôle dans cette évolution, ces souris recevront soit une quantité insuffisante, soit une quantité excessive de cette vitamine. On pourra ainsi étudier quels sont les mécanismes mis en jeu et qui sont influencés par la présence ou l’absence de vitamine B9.

Bénéfices attendus

Ce projet cherche à comprendre comment le cancer du foie se développe lorsque l’alimentation est riche en gras, et comment un manque ou trop de vitamine B9 peut y contribuer. Nous espérons pouvoir identifier de nouveaux mécanismes de régulation de l’expression des gènes liés au cancer et donc mieux comprendre comment l’expression de certains gènes est mal régulée lors du développement du cancer du foie. Nous pourrons aussi savoir si cette vitamine peut protéger ou aggraver la maladie, ce qui aidera à proposer des conseils alimentaires pour les personnes à risque (comme celles atteintes de la maladie du « foie gras »). A plus long terme, les résultats pourraient contribuer à la découverte de nouveaux outils pour diagnostiquer ou traiter ce cancer.

Procédures

Les interventions seront effectuées sur les 90 souris : • Injection d'un antibiotique rapidement après la naissance, durant quelques minutes • Isolement de la mère pendant quelques minutes • Alimentation avec un régime riche en graisses avec une quantité normale, faible ou forte en vitamine B9 à partir de la 4 ème semaine jusqu'à la mise à mort de l'animal (après 6 semaines ou 14 semaines selon le groupe).

Impact sur les animaux

- Douleur liée à l’injection sous-cutanée de l'antibiotique. - Stress lié à la séparation du souriceau de la mère. - Une alimentation enrichie en graisses favorise la progression de la maladie du foie gras vers un cancer du foie dès la semaine 16, un processus potentiellement influencé par un manque de vitamine B9 ou par son enrichissement dans le régime alimentaire.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront mis à mort à différentes semaines selon les groupes d’étude. Le foie sera récupéré, afin d’étudier les mécanismes qui régulent l’expression des gènes.

Remplacement

Nous avons mené des études préliminaires sur des cellules de cancer du foie, cultivées avec ou sans vitamine B9. Nous avons trouvé que l’expression de certains gènes était modifiée quand il n’y avait pas de vitamine B9. Par contre, nous ne pouvons pas étudier avec ces cellules le développement de la maladie, tel qu’il se produit chez l’humain, avec la progression d'un foie gras vers le cancer. Seul le modèle animal permet de l'étudier.

Réduction

Pour cette étude, nous allons travailler avec 9 groupes de souris, en testant 3 types d’apport en vitamine B9 (normal, avec peu de B9, avec beaucoup de B9) à différents moments (3). Pour garantir des résultats fiables, nous avons calculé à l’aide de tests statistiques qu’il nous faut 10 souris par groupe, soit 90 au total.

Raffinement

À leur arrivée, les souris auront une semaine pour s’habituer à leur nouvel environnement avant de commencer les accouplements. Elles seront hébergées dans une animalerie répondant à tous leurs besoins (température, humidité, air filtré) et installées dans des cages ventilées avec des matériaux pour construire des nids. Les nouveau-nés recevront une injection unique d’antibiotique, réalisée par un expert, sans anesthésie car elle est rapide et peu invasive. Pour tout signe d'abandon ou d'isolement de plus d'une journée, l'animal sera placé avec une autre mère pour adoption. Si l'isolement persiste avec la nouvelle mère, l'animal sera mis à mort. Tout au long de l’étude, les animaux seront surveillés quotidiennement pour vérifier leur bien-être, avec un suivi précis de leur état de santé et des pesées régulières. Après le sevrage, les souris seront nourries avec un régime riche en graisses qui provoque une progression de la maladie vers le cancer du foie, sans douleur. Elles seront regroupées par cinq dans des cages enrichies avec des objets pour jouer, se cacher, ronger et explorer, comme des tunnels, des dômes, et des bûchettes non toxiques. Tout est pensé pour leur assurer le meilleur confort possible. Si des signes de souffrance sont détectés et persistants, ou qu'une perte de poids trop importante est notée, les animaux souffrants seront mis à mort.

Choix des espèces

Les principaux modèles de maladie du foie gras ont été validés à l’échelle internationale sur des souris ou des rats. Nous avons choisi de travailler avec des souris car ce modèle, utilisé par nos collègues, garantit que 100 % des animaux développent un cancer du foie. Les souris utilisées proviendront de femelles gestantes, et les souriceaux débuteront le protocole avec l’injection d’un antibiotique rapidement après la naissance, qui permet d’instaurer un pré-diabète, une condition typique de la maladie du « foie gras ». Selon leur groupe, les souris seront suivies jusqu’à 4, 10 ou 18 semaines, correspondant respectivement aux étapes d’un foie normal, d’un « foie gras », et d’un cancer du foie. Ce protocole nous permet d’étudier les différentes étapes de l’évolution de la maladie du « foie gras » vers le cancer.

Opérées au crâne pour quarante-quatre d'entre elles afin d'y retirer localement une protéine, puis placées seules quatre fois vingt-quatre heures dans une cage instrumentée, 176 souris porteuses de mutations liées à l'autisme voient ensuite leur sommeil enregistré pendant quarante-huit heures. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur n'annonce aucun effet indésirable attendu hormis d'éventuels signes de stress ou de grattage, et prévoit de demander une dérogation aux conditions d'hébergement si l'isolement de quarante-huit heures est jugé trop long. Toutes sont tuées à la fin, le porteur écrivant n'avoir "rien d'autre à étudier avec eux" et ne pas souhaiter garder ces lignées dans son animalerie.

Objectifs

Les troubles du spectre autistique sont fréquemment accompagnés de perturbations du sommeil, comme des insomnies, une fragmentation des cycles veille-sommeil ou des difficultés à maintenir un sommeil réparateur. Ces problèmes ont un impact significatif sur la qualité de vie et peuvent aggraver les symptômes comportementaux associés à l’autisme. Dans ce projet, nous utilisons des souris porteuses de mutations génétiques similaires à celles retrouvées chez les individus autistes, ce qui permet de modéliser ces troubles de manière précise. Nous allons analyser leurs comportements de sommeil en mesurant des paramètres tels que la durée totale du sommeil, la fréquence des réveils et les transitions entre les différentes phases du cycle veille-sommeil. L’objectif est d’identifier, parmi ces souris, celles dont les troubles de sommeil sont les plus marqués. Une attention particulière sera portée au rôle du cervelet, une structure clé dans la coordination des fonctions motrices et cognitives, mais également impliquée dans la régulation des rythmes veille-sommeil. Cette identification est cruciale pour mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents et guider nos recherches futures vers des stratégies thérapeutiques ciblées.

Bénéfices attendus

L’ensemble de ce travail permettra de mieux comprendre les troubles du sommeil dans des modèles de souris porteurs de mutations liées à l’autisme, apportant des informations précieuses sur les mécanismes biologiques impliqués. Ces connaissances pourront éclairer comment les anomalies génétiques affectent les circuits cérébraux qui régulent le sommeil, et comment ces perturbations contribuent aux symptômes comportementaux associés à l’autisme. En identifiant les liens spécifiques entre mutations, troubles du sommeil et fonctionnement neuronal, cette recherche ouvre la voie à une compréhension plus intégrée des interactions complexes entre sommeil et développement neurocognitif.

Procédures

Nous utiliserons quatre lignées de souris différentes, toutes modèles du spectre autistique, les 44 souris Shank3 fl/fl recevront une injection stéréotaxique (de 20 minutes) comprenant également trois injections sous-cutanées de xylovet (20 s) 3 min avant l’incision pour l’injection stéréotaxique et en fin de chirurgie (20 s) et 24h après la chirurgie (20 s). Cette intervention permettra de retirer localement une protéine. Tous les animaux de l’étude (10 jours après leur chirurgie pour les Shank3 fl/fl) seront placés individuellement dans une cage spécialement conçue pour enregistrer les mouvements de la souris, grâce à un tapis de sol. Ce dispositif permet d’enregistrer leur sommeil, tout en préservant un cadre de vie confortable et le plus proche possible de leurs conditions naturelles. Ainsi les souris seront placées 4 fois 24h pour habituation dans ces cages, puis 1 fois pendant 48 h pour l’enregistrement de sommeil.

Impact sur les animaux

Si des signes de stress ou de grattage survenaient, une attention particulière sera apportée à ces animaux pour limiter leur souffrance et leur douleur.

Devenir

À la fin de ces expérimentations, les animaux seront euthanasiés, car ils n’entrent dans aucune autre procédure, nous n’avons rien d’autre à étudier avec eux et nous ne souhaitons pas garder ces lignées dans notre animalerie.

Remplacement

L’habituation plusieurs fois 24h avant l’enregistrement est un raffinement qui vise à diminuer le stress des animaux du au changement d’environnement. Cette étape permet de réduire l’impact des facteurs émotionnels sur les paramètres physiologiques étudiés et vise à améliorer la fiabilité et la reproductibilité des données. Par ailleurs, les objectifs scientifiques de cette étude nécessitent des enregistrements des comportements de sommeil, qui ne peuvent être réalisé sur des modèles alternatifs (in silico, in vitro, ou sur tissu isolé). Le recours à l’animal vivant est donc indispensable à la compréhension des mécanismes sous-tendant la régulation du sommeil.

Réduction

Nous avons choisi un nombre d’animaux suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables, tout en évitant d’utiliser plus d’animaux que nécessaire. Ce nombre d’animaux choisi correspond également à ce que l’on retrouve dans d’autres études similaires, où la variabilité liée au sommeil est déjà bien documentée.

Raffinement

Tout au long de la procédure, les souris seront régulièrement surveillées afin de détecter Pour les souris subissant une chirurgie, une anesthésie sera réalisée. Tout au long des procédures, les souris seront régulièrement surveillées afin de détecter précocement tout signe de souffrance ou de détresse. Des points limites strictes et spécifiques à ce protocole ont été définis (perte de poids, prostration, automutilation, anomalies comportementales persistantes, etc.). L’expérimentation sera immédiatement interrompue si ces critères sont atteints, avec administration de soins appropriés et d’une analgésie, et le cas échéant, euthanasie sans délai, afin de prévenir toute souffrance inutile. Une demande de dérogation aux conditions standards d’hébergement prévues à l’article R. 214-95 du Code rural et de la pêche maritime sera formulée si l’isolement en cage individuelles pendant 48h est perçu comme trop long.

Choix des espèces

Les animaux génétiquement modifiées n’existent dans aucune autre espèce de vertébrés homéothermes que les souris, tout du moins concernant les mutations que nous souhaitons étudier. Elles nous permettent par conséquent d’entreprendre l’étude des mécanismes physiologiques complexes du système nerveux central tels que l'alternance veille /sommeil avec une approche causale du rôle d’un gène pour une fonction étudiée. Le rythme de sommeil, initialement très irrégulier avant le sevrage, mature progressivement. Le rythme de sommeil est considéré comme de type adulte 5 à 6 semaines après la naissance. De même, la thermorégulation, absente chez les souriceaux nouveau-nés, se met en place progressivement. Nous enregistrerons donc le sommeil lorsqu’il est stable, sur des souris adultes entre 2 et 4 mois.

3 648 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections abdominales sur animal vigile pour déclencher la modification génétique, puis des glucocorticoïdes ou des régimes obésogènes pendant quatre jours à vingt semaines, avec des jeûnes de cinq à quinze heures suivis de six prélèvements sanguins en deux heures. Elles passent aussi deux minutes immobilisées dans un tube pour la mesure de leur masse grasse et dix minutes dans un test d'anxiété dont le protocole n'est pas nommé. L'objet est de décrire les effets d'un excès de glucocorticoïdes sur la graisse, le foie et le comportement, le porteur affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit "la complexité d'un organisme entier".

Objectifs

Les glucocorticoïdes sont des outils thérapeutiques amplement utilisés dans un large panel de maladies chroniques inflammatoires. Néanmoins chez certains patients, l’utilisation à long terme et à fortes doses peut entrainer des maladies telles que le diabète, des maladies du foie et des anomalies de répartition des dépôts adipeux, présentant des altérations fonctionnelles. Ces altérations peuvent également impacter le comportement des animaux et favoriser des troubles de l’anxiété à différents âges. Ce projet de recherche vise à décrire l’impact d’un excès de glucocorticoïdes sur la physiologie des tissus adipeux et les conséquences métaboliques sur d’autres tissus sensibles à l’action de l’insuline tels que le foie et le muscle squelettique ainsi que les conséquences sur l’activité cognitive. De plus, les expériences décrites dans ce projet permettront d’étudier le rôle des glucocorticoïdes dans un contexte d’obésité induite par des régimes obésogènes, sur les maladies hépatiques, la fonctionnalité des organes sensibles à l’insuline et dans l’équilibre glycémique.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à mieux comprendre comment les glucocorticoïdes impactent et modifient le comportement des animaux ainsi que le fonctionnement et la morphologie des tissus graisseux, notamment lors de traitements de longue durée. Plus largement, nous examinerons aussi les conséquences de leur action des glucocorticoïdes sur les maladies du foie (par exemple, l'accumulation de graisse dans le foie, l'inflammation, la fibrose ou la cirrhose), induites par des régimes riches en graisses. À terme, ces recherches pourraient montrer que bloquer l'action de ces hormones au niveau des tissus graisseux pourrait devenir une solution pour réduire les effets négatifs de ces traitements ou de ces régimes sur le métabolisme.

Procédures

Une partie des animaux seront soumis à un traitement par injections intrapéritonéales afin d’induire la modification génétique, à raison d’une injection par jour pendant 5 jours soit un total de 5 injections par souris. Les injections seront effectuées sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. Les animaux seront ensuite soumis à différents traitements via des régimes alimentaires spécifiques et/ou l’eau de boisson durant 4 jours à 20 semaines selon les groupes. Les animaux seront impliqués dans une mesure de composition corporelle (masse grasse, masse maigre, eau) à l’aide d’un équipement d’imagerie en plaçant l’animal dans un tube et en l’immobilisant durant moins de 2 minutes. Les souris seront soumises à des tests pour évaluer soit la tolérance au glucose et à l’insuline. Pour cela, après une mise à jeun (entre 5h et 15h selon les actes), les souris seront injectées au niveau de l’abdomen ou par voie orale et 6 prélèvements sanguins de faible volume sur une période de 2h seront réalisés pour mesurer l’évolution de la glycémie au cours du temps (2h pour chaque test effectué, 1 test par souris). Des souris adultes et âgées seront également soumises à des tests de comportement pour mesurer l’anxiété des souris traitées ou non (1 fois, 10 minutes par animal). Enfin, une partie des animaux subiront une injection unique au niveau de l’abdomen quelques minutes avant l’euthanasie. L’injection sera effectuée sur animal vigile à raison de quelques secondes par animal. L’ensemble des animaux seront ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements nécessaires pour les analyses. Une seconde partie des animaux seront anesthésiés et analgésiés pour réaliser un prélèvement sanguin (2-3 minutes) ou une chirurgie (8-10 minutes) immédiatement suivie de l’euthanasie en vue des prélèvements, sans réveil des animaux.

Impact sur les animaux

Les modèles transgéniques inductibles subiront des injections pour induire l’invalidation du gène d’intérêt. Les administrations entrainent une contrainte/stress liée à la contention, à la piqure qui sont légers et de courte durée. Une partie des animaux subiront des traitements aux glucocorticoïdes ou seront exposés pendant plusieurs semaines à des régimes obésogènes pouvant induire une obésité associée à une insulino-résistance et le développement des pathologies hépatiques qui restent néanmoins asymptomatiques d’un point de vue phénotypique. Les animaux soumis à une mesure de la composition corporelle subiront un stress de courte durée lié à leur placement en boites de contention durant la mesure (1 fois, environ 2 minutes). Les souris seront inclues dans plusieurs tests de phénotypages métaboliques. Ces phénotypages seront réalisés sur des souris à jeun, pour lesquels l’alimentation aura été supprimée auparavant (entre 5h et 15h en fonction des tests mis en œuvre). Cela pourrait induire une sensation de faim au cours de ces périodes. Elles seront également amenées à suivre des challenges métaboliques. Ces manipulations pourront entrainer un stress et une douleur de courte durée (contention, administration par orale et/ou injection, prélèvement sanguin de faible volume) ou des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie. Les tests de comportement seront potentiellement générateurs de stress et ou d’angoisse en raison de la néophobie du modèle rongeur. Enfin, avant l’euthanasie en vue des différentes analyses, une partie des animaux subira une unique injection au niveau de l’abdomen pouvant induire un léger stress lié à la contention et une douleur de courte durée au point d’introduction de l’aiguille. Les animaux seront ensuite euthanasiés après quelques minutes par une méthode réglementaire. Une autre partie des animaux seront anesthésiés et analgésiés afin d’effectuer un prélèvement sanguin terminal qui sera suivi d’une euthanasie sans réveil des animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour l’étude histologique ou biochimique des tissus sensibles à l’insuline des animaux.

Remplacement

Cette étude vise à mieux comprendre comment les glucocorticoïdes impactent et modifient le comportement des animaux ainsi que le fonctionnement des tissus graisseux, ainsi que d’autres organes sensibles à l’insuline tels que le foie. D’un point de vue évolutif le GR apparait chez les vertébrés terrestres et plus particulièrement chez les mammifères, justifiant l’utilisation d’un modèle mammifère dans ce projet. Ce travail de physiologie intégrée permettra de comprendre d’une part, l’activité sensori-motrice et le degré d’anxiété des animaux et d’autre part, les communications inter-organes et les régulations métaboliques entre les différents tissus. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire le comportement des animaux et les interactions inter-organes et la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. L’utilisation d’un modèle petit rongeur, comme la souris, se justifie par l’espérance de vie relativement courte de ces animaux, permettant la réalisation du projet dans le temps imparti (5 ans).

Réduction

Le projet impliquera un total de 3648 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue) et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. En effet, les procédures expérimentales et les tests statistiques ont été validées dans des études précédentes. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

L’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie). La principale contrainte concerne les injections intrapéritonéales pour induire le modèle génétiquement modifié. Les administrations de traitement via l’eau de boisson seront surveillées et les biberons changés 3 fois par semaine afin de garantir une bonne qualité de l’eau de boisson. Les régimes seront placés en faible quantité afin de garantir une qualité optimale de l’aliment et son appétence. Les différentes explorations métaboliques et comportementales mises en œuvre seront effectuées par du personnel formé au geste et selon des protocoles maitrisés et les mises à jeun seront réduites au maximum pour réduire la contrainte sans compromettre l’obtention des résultats scientifiques De plus, afin de limiter les effets indésirables, les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel formé et compétent afin de détecter toute anomalie. Un suivi du poids sera mis en œuvre tout au long du projet. Des points limites ont été établis sur la base de précédentes études sur ce type de modèles expérimentaux. Les mesures appropriées seront mises en œuvre selon les observations réalisées (soins, etc.) et la structure en charge du bien-être animal ainsi que le vétérinaire pourront être sollicités, le cas échéant.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : Le récepteur aux glucocorticoïdes, tel que présent chez l’homme, est spécifique des mammifères et ne permet pas l’utilisation d’autres organismes modèles plus simples. Plusieurs modèles murins transgéniques seront utilisés au cours de notre projet afin de répondre aux différentes questions scientifiques. Justification des stades de développement : Les souris transgéniques seront utilisées à l’âge adulte et/ou âgées car nous étudions l’impact des glucocorticoïdes sur des tissus et organes matures, totalement différenciés.

Des cellules tumorales sont greffées dans le cerveau de 410 souris immunodéprimées, qui subissent ensuite jusqu'à trente-cinq gavages sur animal vigile, cinq séances d'ultrasons ou de radiothérapie sous sédation, quatre prélèvements de sang et jusqu'à douze séances d'imagerie. Toutes sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et tuées à l'issue. Le porteur affirme que les doses de radiothérapie et d'ultrasons "ne déclenchent pas de nuisance", tout en décrivant des symptômes neurologiques et de l'apathie en fin de procédure. Leur cerveau et leur liquide céphalorachidien sont prélevés après la mise à mort, pour mesurer ce que l'ouverture de la barrière hémato-encéphalique laisse passer dans le sang.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales malignes représentent la principale cause de décès liés au cancer chez les enfants, les adolescents et les jeunes adultes. Le succès du traitement actuel comprenant la chimiothérapie, la radiothérapie et la chirurgie reste très limitée avec une survie qui s’est très peu améliorée au cours des 20 dernières années. Il est actuellement très difficile pour les cliniciens d'évaluer la réponse au traitement et d'anticiper la résistance de la tumeur ou la rechute, ce qui limite le développement de nouvelles thérapies. Lorsque les cellules tumorales meurent, elles se désintègrent et répandent leur contenu dans les fluides biologiques comme le sang ou le liquide céphalo-rachidien. Ce matériel génétique flottant, détectable dans les liquides biologiques, contient des informations différentes mais complémentaires sur la tumeur. Dans le contexte spécifique des tumeurs cérébrales, une barrière de vaisseaux sanguins visant à protéger le cerveau, limite aussi le passage des biopsies liquides dans le sang ainsi que la pénétration d'agents chimio thérapeutiques dans le cerveau. Cependant, de récent progrès technologiques ont permis d’ouvrir cette barrière de manière temporaire à l'aide d'ultrasons. Des études ont également montre que lors d’un traitement avec radiothérapie, la barrière hémato-encéphalique devenait plus perméable. Dans le projet proposé, nous allons donc utiliser ces approches pour tester la pénétration dans le cerveau de nouveaux médicaments mais aussi collecter une plus forte concentration de biopsies liquides et en extraire des données génétiques grâce à des technologies de pointe.

Bénéfices attendus

L’étude des tumeurs cérébrales pédiatriques représente un défi majeur en oncologie pédiatrique. Une approche de biopsie liquide non invasive pourrait présenter plusieurs avantages. À court terme, l'ouverture de la barrière hémato-encéphalique est temporaire, se rétablissant lentement en quelques heures ou jours. L'optimisation du moment des prises de sang permettra d'établir un modèle plus précis pour les futures expériences. Les échantillons de sang sont prélevés dans l'heure suivant l'impulsion ultrasonore. Si nos résultats montrent qu'un autre moment de prélèvement est plus efficace, cela pourrait entraîner une révision du protocole clinique. Par ailleurs, nous prévoyons de recueillir des échantillons sanguins dans le cadre d'un essai clinique pendant que les patients reçoivent leur radiothérapie. Les résultats de cette étude pourraient aider à déterminer le moment optimal pour les prélèvements sanguins. À terme, la biopsie liquide pourrait permettre de surmonter les limites des biopsies standards, qui nécessitent des procédures chirurgicales invasives souvent contre-indiquées en fonction de la localisation de la tumeur. Ces interventions peuvent également entraîner des complications neurologiques. L’identification d’altérations moléculaires spécifiques est cruciale dans le diagnostic et le traitement des tumeurs du système nerveux central, car elle permet de concevoir des thérapies ciblées et personnalisées. De plus, les biopsies standard peuvent ne pas refléter l’intégralité du génome tumoral, notamment dans le cas de tumeurs hétérogènes. Quant à elle, la biopsie liquide offre une vue d’ensemble du génome tumoral, même dans les tumeurs multifocales. Un autre avantage majeur est la possibilité de réaliser des prélèvements répétés, ce qui permet de suivre l’évolution de la tumeur à long terme, d’évaluer la réponse au traitement et de détecter précocement une rechute moléculaire.

Procédures

Le animaux subiront une seule fois une greffe de cellules tumorale dans le cerveau sous anesthesie générale. Il s'agit d'une chirurgie qui dure une dizaine de minutes au maximum. L'application des ultrasons externe est une procédure qui nécessite la sédation des souris pendant environ 5 minutes (dépendant du temps d'exposition aux ultrasons). Le traitement de radiothérapie nécessite la sédation des souris pendant environ 5 minutes (dépendamment de la dose de traitement). Il y aura 5 séances d'ultrasons ou 5 séances de radiothérapie selon les animaux. Certains animaux auront 4 prélèvements de sang sous anesthésie générale (durée : moins d'une minute). Des animaux pourront avoir entre 14 et 35 gavages, vigiles, durée 1 minute. Des animaux auront des séance d'imagerie une fois par semaine (maximum 12 séances, sous anesthésie générale, durée 10 minutes).

Impact sur les animaux

Les animaux seront greffés avec des tumeurs par injection intracérébrale. De ce fait, en fin de procédure, des animaux pourront présenter des symptômes neurologiques modérés, principalement de l'apathie. Les doses de radiothérapie et d'ultrasons utilisées sont bien tolérées par les animaux et ne déclenchent pas de nuisance. Les prélèvements de sang, et les injections sous anesthésie locale ou générale entraîneront une contrainte légère (stress avant anesthésie).

Devenir

Les animaux seront euthanasiés afin de faire des études et analyses sur les cerveaux et les liquides céphalorachidiens.

Remplacement

À l'heure actuelle, il n'existe pas de modèle alternatif qui récapitule correctement la barrière hémato-encéphalique, il est donc essentiel d'utiliser des animaux vivants pour valider cette perméabilisation. De plus, il n'existe pas de modèle in vitro pour tester les fluides corporels tels que le sang et le liquide céphalo-rachidien, ainsi que l'impact de l'administration de médicaments anti-cancéreux dans les conditions testées d'ouverture de la barrière hémato-encéphalique. Ces études chez l’animal nous aideront à passer à la pratique clinique. (essais chez l'Homme).

Réduction

La croissance tumorale est mesurée par la détection d un marqueur sur animal vivant. Ce suivi longitudinal permet de déterminer le volume tumoral au cours du temps, ce qui rend les statistiques beaucoup plus puissantes et permet de réduire le nombre d'animaux dans le projet. Par conséquent, le nombre d'animaux par procédure est réduit et la souffrance des animaux peut être prédite le plus tôt possible.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur comportement sera évalué. Ils recevront également un analgésique dès l'apparition de signes cliniques. Les interventions sont réalisées sous anesthésie générale . Une anesthésie locale sera appliquée avant les injections. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix en oncologie, en raison de sa proximité immunologique avec l'homme. L'utilisation de modèles de souris immunodéprimées permet également de créer des modèles pertinents en greffant des tumeurs humaines. Les animaux utilisés auront 7 à 8 semaines correspondant à l’âge de l'adolescent/ jeune adulte ce qui représente la tranche d'âge au diagnostic des tumeurs cérébrales sur lesquelles nous travaillons.

Tuées à l'issue parce que leur obésité, selon le porteur, leur interdit d'être maintenues en vie, 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est rendue obèse par un régime à 60 % de lipides, les autres le sont par une mutation du gène de la leptine qui les rend morbidement obèses dès la cinquième semaine de vie. Elles reçoivent une ou deux injections d'un nanocatalyseur dans les coussinets graisseux de l'abdomen, dix minutes d'exposition à une lampe infrarouge, des prélèvements sanguins, un passage en cage à métabolisme et deux heures à 4 °C. Le porteur qualifie ce composé de "traitement révolutionnaire" qui "ouvre sans conteste des perspectives thérapeutiques prometteuses", alors que l'étude décrite est son premier test sur un animal vivant.

Objectifs

L'obésité est une pandémie mondiale. En 2019, un indice de masse corporelle supérieur à la norme a causé 5 millions de décès. Ceci suggère un besoin urgent de nouveaux traitements. Le brunissement du tissu adipeux blanc est une nouvelle cible thérapeutique prometteuse pour lutter contre l’obésité. En effet, pour mieux combattre le froid, les cellules adipeuses brunes produisent des protéines transformant l’énergie graisseuse en chaleur et brûle ainsi les calories stockées. Chez l’homme, le tissu adipeux est constitué à 95% de graisse blanche et 5 % de graisse brune. Il a été montré que l’activation spécifique de certaines protéines du tissu adipeux blanc permet sa transformation en tissu adipeux brun et ainsi l’élimination des calories excédentaires sous forme de chaleur. Plusieurs molécules agissant sur la voie de signalisation intracellulaire des récepteurs régulant la fonction des adipocytes pour augmenter le métabolisme oxydatif, ont déjà été développées mais elles ont toutes montré des effets secondaires délétères Dans ce projet, nous avons développé un nanocatalyseur induisant la transformation des cellules adipeuses blanches en tissu adipeux brun. Les études préalables que nous avons faites in vitro ont montré qu’il induit un renouvellement important des adipocytes, et reste non toxique pour ces cellules. Pour tester son effet in vivo, nous voulons cibler le tissu adipeux blanc de souris obèses par injection du nanocatalyseur dans les coussinets adipeux abdominaux. La présence d’acides gras sera contrôlée dans le sang, l’urine et les féces avant l’injection puis 15 et 30 jours après l’injection. La pesée des souris sera réalisée quotidiennement ainsi que le contrôle de la prise de nourriture et d’eau. L’étude sera réalisée sur 2 modèles de souris obèses : des souris nourries avec un régime riche en lipides et des souris génétiquement obèses. La 1ère étape est un test unique fait sur un petit nombre d’animaux afin de vérifier l’innocuité du catalyseur et de déterminer la dose optimale à utiliser. La 2ème étape permettra de tester 4 structures de nanocatalyseur différant de quelques acides aminés et de déterminer celle qui est la plus efficace et la plus fonctionnelle. Un replicat unique du protocole utilisant la structure du nanocatalyseur la plus efficace sera ensuite réalisé pour asseoir la robustesse statistique des résultats en vue de les publier.

Bénéfices attendus

Ce projet s'inscrit dans le cadre du développement d'un composé anti-obésité visant l'humain. Ce nanocatalyseur multifonctionnel qui comprend de l'hème et des acides aminés, ouvre sans conteste des perspectives thérapeutiques prometteuses pour le traitement de l’obésité et plus largement pour traiter les maladies cardiovasculaires. C’est un traitement révolutionnaire ayant une application à visée humaine personnalisée là où les traitements médicaux traditionnels ont leurs limites. L’étude décrite dans ce projet constitue la première étape testant la fonctionnalité in vivo chez la souris de ce nanocatalyseur transformant les cellules adipeuses blanches en tissu adipeux brun après tout un travail de mise au point préalable in silico et sur culture cellulaire in vitro. C’est une étape clé dans la réalisation de ce nouveau traitement contre l’obésité. Le nombre d’animaux utilisé pour chaque étude est minimisé, l’étude exploratoire déterminera la concentration de nanocatalyseur optimale et l’étude confirmatoire, la structure la plus fonctionnelle et efficace.

Procédures

Au cours du projet, les animaux recevront une injection unique de biocatalyseur lors de l’étape 1 et deux injections à un mois d’intervalle lors de l’étape 2. Liste des interventions faites sous anesthésie gazeuse : -l’injection du nanocatalyseur dans les coussinets graisseux de la souris d’une durée de 20 secondes. -l’exposition de l’abdomen des animaux à une source de lumière infrarouge commerciale (à usage médical) pendant un maximum de 10 minutes juste après l’injection du nanocatalyseur. -les prélèvements sanguins d’une durée de 1 min chacun. Liste des interventions faites sur animal vigile : -La récupération de selles et d’urine après avoir mis les animaux en cage à métabolisme pendant 30 min. En cage à métabolisme, les souris ont un accès libre à la nourriture et à la boisson. - Le test de tolérance au froid (4°C) d’une durée de 2h, nous utiliserons une caméra infrarouge avancée pour surveiller sans contact et en permanence la température cutanée des souris. Les souris dont la température cutanée aura baissé de plus de 1°C par rapport au début de l’expérimentation seront remises à température ambiante et réchauffée sous une lampe infra rouge médicale.

Impact sur les animaux

L’injection du nanocatalyseur dans les coussinets adipeux de la souris peut engendrer une légère douleur, ainsi que l’exposition consécutive de l’abdomen des animaux à une source de lumière IR (à usage médical) pendant 10 minutes. Le prélèvement sanguin peut également être douloureux. Bien que peu probable, la toxicité potentielle du nanocatalyseur est aussi à envisager dans les effets indésirables attendus sur les animaux particulièrement lors de la 1ère étape du projet. L’état d’obésité obtenu chez les groupes de souris ayant une alimentation enrichie en lipides ainsi que l’état d’obésité avéré des groupes de souris obèses génétiquement est à prendre en compte dans les nuisances potentielles attendues sur les animaux même si des mesures de suivi, de soins et de conditions d’hébergement seront prises en conséquence. Avec l’âge et la prise de poids, ces animaux seront en perte de mobilité. Ils seront susceptibles de développer des maladies métaboliques chroniques. L’exposition au froid est également à considérer.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car leur autopsie et les prélèvements de coeur, de foie et de rein de tissu adipeux blanc et brun sont nécessaires pour compléter notre étude. De plus, ce sont des animaux obèses qui ont des facteurs de comorbidité importants et ne peuvent être maintenus en vie.

Remplacement

Le recours à la pratique sur animal pour valider la fonctionnalité thérapeutique de ce nanocatalyseur est essentiel. Cette validation arrive au terme de plusieurs longues étapes de mise au point in silico et d’études de sa fonctionnalité in vitro. Il a d’abord été élaboré in silico en utilisant des logiciels de conception. Son efficacité et sa toxicité ont également été évaluées in silico au moyen de logiciels puis il a été testé in vitro sur culture de cellule. Toutes les expériences in vitro possibles ont été réalisées au préalable. Tous les critères étant validés, il doit être testé in vivo car les expériences sur la souris constituent l'étape ultime dans le développement de cette nouvelle thérapie et ne peuvent être remplacées par des méthodes alternatives. Nous avons fait tout notre possible pour remplacer l’expérimentation sur l’animal qui arrive en bout de chaine d’étude et seulement après la validation des tests in vitro et de l'étape 1 in vivo.

Réduction

Lors de la 1ère étape du projet déterminant la dose optimale de nanocatalyseur à utiliser, un total de 16 souris nourries avec un régime riche en lipides et 16 souris génétiquement obèses seront utilisées. La 2ème étape du projet permettra de tester 4 structures différentes de nanocatalyseur et de préciser celle qui est la plus efficace et la plus fonctionnelle. Un replicat unique du protocole utilisant la structure du nanocatalyseur la plus efficace sera ensuite réalisé pour valider statistiquement les résultats en vue de les publier. Pour la 2ème étape du projet, avec l’aide d’un biostatisticien, nous avons établi : -qu’un protocole type utilisera 16 souris nourries avec un régime riche en graisses et 16 souris génétiquement obèses -que 4 protocoles types seront réalisés pour tester les 4 structures de nanocatalyseur (1 structure de nanocatalyseur par protocole type). - que la structure du nanocatalyseur déterminée comme étant la plus fonctionnelle et la plus efficace pour le brunissement des adipocytes donnera lieu à un replicat unique du protocole type en vue d’asseoir la robustesse statistique des résultats et de les valider statistiquement. Sur 2 ans, nous utiliserons un total de 160 souris maximum et moins si les résultats escomptés sont obtenus avant. Pour le test au froid, nous n’utiliserons pas de groupes d’animaux supplémentaires. Le nombre de souris utilisées par lot est calculé au plus juste pour interpréter et valider statistiquement les résultats. Les groupes de souris témoins négatifs de la 1ère étape du projet seront réutilisés dans l’étape 2 et non pas en surnuméraire. La taille de l'échantillon a été estimée selon des hypothèses appropriées et les résultats seront analysés avec un test statistique approprié. Selon ces hypothèses, nous avons obtenu une taille de groupe de huit animaux. Les animaux seront assignés au hasard aux groupes expérimentaux. Les données seront traitées en aveugle. Tous les animaux en bonne santé avant et pendant l'expérience seront inclus dans l'étude. Si des signes de détresse, de douleur et de perte d'état corporel sont observés, les souris seront exclues du protocole et prise en charge par des antalgiques.

Raffinement

Dès leur entrée à l’animalerie et pour toutes les souris, la surveillance sera quotidienne, des croquettes seront mises dans une mangeoire dans la cage pour faciliter l’accès à l’alimentation des animaux obèses ainsi que l’utilisation de biberons à pipettes longues. La fréquence de change sera de 2 fois par semaine (les souris obèses sont diabétiques et urinent plus) et les souris seront hébergées par 4 dans une cage. Avant le début du protocole, les animaux seront pesés à l’occasion des changes pour éviter de les perturber avec mesure de la prise de nourriture et de boisson. Une grille d’évaluation clinique du bien-être (BEA) spécifique au protocole sera mise en place pour chaque animal dès son arrivée avec un scoring du comportement (attitude dans la cage), de l’aspect physique (aspect du poil), de la physiologie (hyperventilation, déshydratation) et de l’évolution du poids. Ce qui permettra d’adapter un traitement antalgique selon le score obtenu. Une surveillance renforcée des souris sera effectuée après l’injection du nanocatalyseur : toutes les 2h pendant 12h puis toutes les 12h pendant 72h et enfin quotidienne avec contrôle de la consommation de nourriture, de la boisson, pesée des souris et observation de leur état général. Des points limites adaptés seront mis en place pour les souris obèses de ce projet. Durant l’exposition au froid, nous utiliserons une caméra IR avancée pour surveiller sans contact et en permanence la température cutanée des souris mais si la température corporelle d’un animal baisse de 1°C, il sera immédiatement retiré et réchauffé sous une lampe infrarouge. Durant l’expérience, pour éviter toute douleur, la plupart des actes seront faits sur souris anesthésiées : l’injection du nanocatalyseur, l’exposition de l’abdomen à une source de lumière IR, ainsi que le prélèvement sanguin.

Choix des espèces

Chez l’homme, l’obésité résulte de facteurs alimentaires, génétiques/épigénétiques et environnementaux. Elle est due à : 1) une alimentation trop riche, une activité physique faible 2)une prédisposition génétique : 8 gènes responsables d’obésité monogénique et 22 gènes de prédisposition à l’obésité ont été identifiés. Par conséquent, nous utiliserons, ici, les 2 modèles de souris développés spécifiquement pour les études sur l’obésité : -l’un reproduit les conditions humaines d’obésité alimentaire avec insulino-résistance : souris nourries avec un régime enrichi en lipides 60% pendant 30 jours. -le modèle génétiquement obèse est proche de l’obésité génétique humaine (mutation du gène codant pour la leptine également identifiée chez l’homme). Elles présentent une obésité morbide apparaissant 4 à 5 semaines après la naissance, s'accompagnant de troubles métaboliques. La prise en charge des animaux obèses est décrite dans les procédures. Ces animaux sont de jeunes adultes mâles de 25 grammes soit 35 à 42 jours environ. C'est à ce stade de développement que la courbe de croissance des souris s'infléchit et que les fonctions physiologiques de l'animal ont atteint leur maturité. Notre étude à visée humaine doit être réalisée sur souris adultes comme le sont la plupart des études précliniques de ce type en recherche fondamentale.

Pour tester si le blocage du métabolisme des acides gras réduit le remodelage des bronches, 204 souris femelles vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent deux injections d'allergène dans l'abdomen puis jusqu'à quarante-quatre instillations dans le nez sous anesthésie gazeuse, jusqu'à développer un asthme. Les mesures respiratoires se font par trachéotomie sous anesthésie et sans réveil, alors que la déclaration de gravité ne compte aucune procédure sans réveil. Le porteur annonce des points limites portant sur la perte de poids, le comportement anormal et la difficulté respiratoire, et prévoit de corriger toute gêne respiratoire par quinze secondes de bronchodilatateur.

Objectifs

L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses. Un des besoins non couvert dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Le remodelage bronchique est un changement structurel qui comprend entre autres l’augmentation de la taille du muscle lisse bronchique. La taille du muscle lisse bronchique est une valeur très importante, car son augmentation est associée à une fonction respiratoire dégradée et à un taux d’exacerbation plus élevé. L’objectif de ce travail est d’étudier si le blocage du métabolisme des acides gras par un fragment d’anticorps contre une des molécules de cette chaine métabolique au moment d’installation des caractéristiques de l’asthme est capable de diminuer les symptômes de la maladie dans le modèle murin de l’asthme chronique allergique.

Bénéfices attendus

Ce projet montrera si le blocage d’une des molécules qui jouent le rôle important de régulation du métabolisme énergétique dans les muscles lisses bronchiques permet de diminuer les symptômes d’asthme et notamment de remodelage du muscle lisse bronchique chez les animaux de laboratoire. Les données ainsi obtenues ouvriront la voie pour la nouvelle thérapie de cette pathologie respiratoire.

Procédures

Les animaux seront soumis à quarante-quatre (maximum) instillations intranasales sous anesthésie gazeuse (durée jusqu’à 2 minutes) et les deux injections intra-péritonéales de l’allergène (2 injections). Les mesures de paramètres respiratoires d’une durée de 10 minutes seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés dans la procédure sans réveil.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir un léger stress suite aux contentions pour l’injection/l’instillation des allergènes et un bref placement dans une boîte en plexiglass. Les souris ressentiront une légère douleur des piqûres pendant l’injection. L’anesthésie sous isoflurane induit également un léger stress. La sensibilisation aux allergènes induit des symptômes asthmatiques chez l’animal : l’inflammation des voies respiratoires et éventuel remodelage bronchique. Ces symptômes peuvent survenir après l’instillation de l’allergène et éventuellement provoquer une dyspnée (un essoufflement). Après l’anesthésie, l’opérateur observera les animaux et toute dyspnée sera corrigée par l'utilisation d’un broncho-dilatateur d’action rapide.

Devenir

L’objectif de ce projet est d’estimer l’efficacité de traitement contre le remodelage bronchique dans l’asthme. Suite au développement des symptômes d’asthme, les animaux recevront le traitement et les paramètres respiratoires seront réalisés. Puis les animaux seront mis à mort et les organes seront prélevés et analysés au laboratoire.

Remplacement

En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. Grace au modèle animale, nous testerons les hypothèses apparues après nos résultats in-vitro sur les lignées cellulaires. L’utilisation du modèle murin d’asthme chronique allergique dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes et à terme de proposer des traitements plus efficaces pour la prise en charge des personnes asthmatiques.

Réduction

Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Nos expériences ne seront pas répétées. Nous allons comparer les organes des groupes de souris asthmatiques avec ceux des animaux témoins qui recevront ou non le traitement pouvant diminuer les symptômes d’asthme. Comme il a été déjà démontré par nos travaux précédents, les groupes de souris doivent être composés de 10 souris minimum afin de mettre en évidence une différence significative sur les différents paramètres analysés grâce aux pléthysmographie invasive notamment la résistance bronchique dont la variabilité est importante. Afin d’analyser l’inflammation broncho-alvéolaire nous utilisons les 6 animaux par groupe.

Raffinement

Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupe sociaux, frisottis et bâtonnets), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide.

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés sont des femelles. La majorité des études sur l’asthme est menée sur les souris femelles. L’utilisation des femelles permet de rapprocher le modèle murin de la maladie humaine car la sévérité de l’asthme est plus fréquente chez la femme que chez l’homme. Les animaux utilisés pour commencer le protocole sont des jeunes adultes âgés de 5 à 10 semaines. La plupart des études scientifiques dans le domaine pneumologique sont réalisées sur les animaux de cet âge.

Soumises pendant deux à cinq mois à un régime riche en cholestérol, puis à huit ou vingt injections pratiquées sur animal conscient, 760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique qu'elles développent en fin de régime un œdème du visage et des membres, et qu'elles perdent du poids. Leur queue est amputée d'un demi-millimètre pour le génotypage, sur animal vigile jusqu'au dixième jour de vie. L'objet immédiat est de tester des mimétiques d'une protéine régulant le cholestérol, la meilleure prise en charge des patients atteints d'athérosclérose étant renvoyée au long terme et à des résultats "concluants".

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires affectent beaucoup d’organes comme le cœur, le cerveau ou le foie. Une part importante de ces affections est due à l’accumulation de cholestérol dans la paroi des artères ou dans les organes. Ainsi, certaines maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer ou la maladie de Niemann-Pick sont liées directement ou indirectement à l’accumulation de cholestérol dans les cellules du cerveau. Cette accumulation de cholestérol dans la paroi vasculaire peut également être responsable des accidents vasculaires cérébraux (AVC) et infarctus du myocarde (IF). Comme pour l’IF et les AVC, le cholestérol peut également former des agrégats dans les parois des vaisseaux sanguins qui irriguent le cerveau, formant des lésions d’athérosclérose qui empêchent une bonne oxygénation des neurones et aboutissent à une altération du fonctionnement cognitif : la démence vasculaire. L’objectif de ce projet est l’identification de mimétiques chimiques d’une protéine spécifique qui permettra de réguler l’homéostasie du cholestérol dans les cellules. Nous étudierons comment ces mimétiques de la protéine en question permettent d’éviter l’apparition des complications neurodégénératives de l’accumulation du cholestérol dans les vaisseaux sanguins cérébraux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une connaissance fine de la survenue des atteintes cardiovasculaires liées aux dépôts de cholestérol dans la paroi des vaisseaux et des dépôts de cholestérol au niveau des cellules du système nerveuses central et de déterminer si l’injection d'un mimétique d'une protéine spécifique est en mesure de prévenir ou diminuer la gravité de ces atteintes cardiaques et cognitives. A long terme, si les résultats obtenus sont concluants, cette études permettra une meilleure prise en charge des patients atteints d'athérosclérose.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime riche en cholestérol pendant 2 ou 5 mois. Certains animaux (au maximum 760) seront soumis à 8 injections , soit 2 injections par semaine espacées de 2 à 3 jours (protocole de 2 mois de régime) ou 20 injections, soit 2 injections par semaine espacées de 2 à 3 jours (protocole de 5 mois de régime). Les animaux seront vigiles et le temps de la contention à la fin de l'injection sera d'environ 1 minute par animal. Les animaux subiront une biopsie de queue pour génotypage sous anesthésie (environ 1 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances pour les souris lors des expérimentations sous régime pro-athérogène avec ou sans Intrapéritonéal, sont le développement d'oedème facial et des membres en toute fin de la période de régime pro athérogène. Un stress engendré par les injections lors des différents traitements et l'anesthésie finale en IP. Le traitement (en début de régime et après traitement avec les anticorps) peut potentiellement entraîner une perte de poids. Le génotype de ces souris est vérifié par PCR sur un prélèvement d’environ 0.5 mm de l’extrémité de la queue lors du processus d’identification par tatouage, ce qui est une source de stress, de nuisance et de douleur transitoire légère. Ce prélèvement est fait sur animal vigile jusqu'au 10ème jour après la naissance et sur animaux anesthésié du 10ème au 21ème jour après la naissance.

Devenir

Les animaux soumis à un régime riche en cholestérol et traités par les mimétiques seront mis à mort pour prélever les organes à des fins de caractérisation histologiques et biochimiques et ainsi répondre aux objectifs de l'étude.

Remplacement

L'accumulation de cholestérol de l'alimentation dans la paroi des artères aboutit à une maladie appelée athérosclérose qui peut entraîner des infarctus, des accidents vasculaires cérébraux et également une démence vasculaire et des maladies neurodégénératives. Il n'est pas encore possible de nos jours de modéliser in vitro ou in silico les processus liés à l'accumulation de cholestérol dans la paroi des vaisseaux, ni au niveau des cellules du système nerveux central. Etant donné qu'une partie des apports en cholestérol est alimentaire et que nous mettons en place un régime spécifique qui mime ces apports, nous ne pouvons pas utiliser un modèle cellulaire pour cette étude, mais un modèle animal qui reproduit toutes les conditions physiopathologiques des effets d'un tel régime. L'efficacité et la toxicité de ces molécules ont été testées sur un modèle de cellules avant l'utilisation sur la souris.

Réduction

Si nous arrivons à mettre rapidement en évidence un effet positif d'un des mimétique sur l'accumulation de cholestérol dans la paroi des vaisseaux ou dans les cellules du système nerveux central, nous n’utiliserons pas le nombre total d’animaux demandé (760 animaux sur 5 ans pour la procédure ). Si la significativité du paramètre étudié est atteinte avant l’utilisation du nombre d’animaux prévu pour le groupe considéré, nous arrêterons les expérimentations avant l’utilisation du nombre maximale d’animaux. La taille des groupes a été déterminée mathématiquement et est au minimum de 15 animaux en tenant compte de la mortalité due à la longueur de l'expérimentation pour obtenir des résultats statistiquement interprétables.

Raffinement

Nous mettrons en place différents points limites dans notre expérimentation pour atténuer autant que possible la gêne de nos animaux liée au régime riche en cholestérol que nous leur donnerons : ces points limites sont définis en tenant compte de l’aspect et du comportement des animaux au cours du régime. Le suivi de l’état des animaux sera quotidien et les animaux seront soumis à une inspection visuelle. Dès qu'un animal atteint un des points limites, il sera euthanasié et ces organes prélevés pour étude. Si la significativité du paramètre étudié est atteinte avant l’utilisation du nombre d’animaux prévu pour le groupe considéré, nous arrêterons les expérimentations avant l’utilisation du nombre maximale d’animaux. Le stress engendré par les différentes pratiques expérimentales sera limité au maximum. Les animaux seront entre 3 et 5 par cagée, leur environnement sera enrichi par des carrés de coton pour l’édification du nid (changement toutes les semaines). Des tunnels de change sont également ajoutés dans les cages pour diminuer le stress engendré par la préhension lors du change des cages et des buchettes de bois sont ajoutées pour que les animaux puissent user leurs dents.

Choix des espèces

La souris peut être génétiquement modifiée et permet ainsi d'étudier l'implication de gènes spécifiques dans la survenue des pathologies humaines. Nous utilisons un modèle de souris génétiquement modifiée qui permet une accumulation intracellulaire de cholestérol accélérée lorsqu'elles sont soumises à un régime riche en cholestérol, ce qui est difficile avec une autre espèce de rongeur. Pour ce projet, nous utilisons des souris de 3 mois qui ont atteint l'âge adulte. Après la période de régime riche en cholestérol, leur âge correspondra à l'âge d'apparition de la patholgie chez l'homme. De plus, chez la souris, la physiopathologie de la démence vasculaire est proche de celle que nous retrouvons chez l'homme.

80 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est irradiée neuf minutes aux rayons X puis reçoit en intraveineuse la moelle osseuse prélevée sur les autres, et la moitié subit un prélèvement de sang derrière l'orbite de l'œil. Une lignée porte la mutation humaine du syndrome de DAVID, une maladie rare associant immunodéficience sévère et auto-immunité, ce que le porteur nomme un "phénotype dommageable". Il écrit que les études in vitro ont "largement validé" l'effet de cette mutation sur les lymphocytes, puis conclut que le recours aux rats reste "indispensable".

Objectifs

Des mutations sur le gène étudié ont été identifiées chez des patients atteints du syndrome de DAVID, maladie autosomique rare associant des syndromes d'immunodéficience sévère et d'autoimmunité, ainsi que des déficits de certaines hormones hypophysaires. Nous disposons au laboratoire d'un modèle rat porteur d'une des mutations identifiées chez des patients atteints du syndrome de DAVID. L'objectif est d'utiliser ce modèle pour analyser l'impact de cette mutation dans la fonction et la différenciation des lymphocytes, dans les phénomènes auto-immuns sévères et dans les mécanismes de "tolérance centrale thymique", mécanismes qui permettent à ces lymphocytes de ne pas attaquer le corps lui-même.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'évaluer si la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (cellules spécialisées qui se trouvent dans la moelle osseuse, l'organe responsable de la production de toutes les cellules sanguines : globules rouges, globules blancs, et plaquettes) serait susceptible de réduire la sensibilité aux infections récurrentes et de réduire les symptômes d'autoimmunité chez les patients porteurs de cette mutation dans le gène étudié.

Procédures

- 1 irradiation de 9 min aux rayons X (la moitié des animaux du projet) - une injection en intraveineuse de cellules de la moelle osseuse d'animaux donneurs. Les animaux seront ensuite placés sous lampe chauffante et surveillés jusqu’à leur réveil (la moitié des animaux). - Un prélèvement de sang derrière l'orbite de l'œil sous anesthésie et analgésie locale (gel ophtalmique) (la moitié des animaux). En cas d’atteintes de points limites avant la fin de la procédure, les animaux seraient mis à mort pour abréger leur souffrance.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont principalement 1. légère douleur liée à l'injection de cellules de la moelle osseuse ; 2. douleur légère et de courte durée, ainsi qu’un stress lié au prélèvement sanguin réalisé derrière l'orbite de l’œil.

Devenir

Mise à mort de l'ensemble des animaux à la fin de l'expérimentation pour effectuer des prélèvements de tissus post-mortem.

Remplacement

Des études "in vitro" ont largement validé l'impact de la mutation du gène étudié dans la fonction et la différenciation des lymphocytes. Néanmoins, ces études in vitro ne sont pas suffisantes pour répondre au défaut de "tolérance centrale thymique" (mécanismes qui permettent aux lymphocytes de ne pas attaquer le corps lui-même) à l'origine des troubles auto-immuns sévères observés chez les patients atteints du syndrome de DAVID. Des études chez l'animal en utilisant ce modèle de rats génétiquement altéré sont donc indispensables.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est réduit au nombre nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Quatre-vingt rats maximum ont été estimés pour réaliser ce projet. Ce chiffre pourra être revu à la baisse, pour: - les donneurs de moelle osseuse si la quantité de cellules obtenues est bien au-delà de la quantité nécessaire. Le surplus de cellules sera congelé pour être utilisé dans une autre expérience. - le nombre d'expériences indépendante pourra être réduit à 3 si les résultats sont fiables et assez reproductibles pour en tirer des conclusions solides.

Raffinement

Les animaux seront surveillés à chaque étape critique de la procédure: - suite à l'irradiation des animaux aux rayons X, - suite à l'injection de cellules de la moelle osseuse - suite au prélèvement de sang. Si un signe clinique sévère est observé et/ou un point limite atteint, l’animal sera sacrifié pour des raisons éthiques. Afin de réduire le stress, différents types d'enrichissement (briquettes de bois, tunnel en carton) sont placés dans les cages et les rats seront à 2-3 par cage pour éviter leur isolement. Si un animal présente des signes de faiblesse mais sans atteintes de points limites, il pourra faire l'objet d'un isolement temporaire pour éviter tout comportement agressif de ses congénères. Les animaux à phénotype dommageable seront suivis comme les autres : suivi de poids, surveillance de prostration éventuelle.

Choix des espèces

Les rats sont de bons modèles d'étude de par leur facilité d’entretien, de stabulation, de manipulation, et leurs similitudes physiologiques avec l’espèce humaine. L'utilisation préalable de ces animaux par des équipes scientifiques internationales permet à d’autres travaux de recherche de débuter avec une base solide (connaissances théoriques, modèles, équipement, …). De plus, le modèle rat a été choisi car nous disposons de 2 lignées de rats génétiquement modifiés pour ce projet: - une lignée de rats exprimant constitutivement une protéine fluorescente verte, utilisée comme donneurs de moelle osseuse - une lignée de rats porteurs de la mutation d'intérêt dans le gène étudié, utilisée comme receveurs de moelle osseuse. Nous utilisons cette lignée à phénotype dommageable parce que ces animaux sont porteurs d’une mutation dans le gène étudié, comme celle présente chez les patients atteints du syndrome de DAVID, et qui est à l'origine des troubles auto-immuns sévères observés chez ces patients. Les rats utilisés auront entre 6 et 7 semaines.