Rongeurs

Nourries d'un régime riche en graisses pour développer une fibrose du foie, 120 souris reçoivent ensuite un anticorps deux fois par semaine pendant huit semaines, par injection sur animal vigile. Des prélèvements sanguins sous anesthésie jalonnent le traitement, un prélèvement terminal clôt le protocole. Elles sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Toutes sont tuées pour collecter les foies, le porteur inscrivant parmi les effets attendus le développement d'un poil "gras" lié au régime, faute de toilettage suffisant.

Objectifs

L'objectif du projet est d'étudier l'efficacité d’un anticorps pour une meilleure prise en charge de la Maladie Hépatique Associée au Syndrome (MASH). Cette dernière, également connue sous le nom de maladie du foie gras, est la conséquence d’une alimentation trop riche en sucre et en graisse. Ce type d’alimentation va entrainer le stockage et l’accumulation de graisses dans le foie, ce qui va conduire à une inflammation locale au sein de l’organe. Cette inflammation chronique va entraîner avec le temps le développement d’une fibrose dans 20% des cas. Au stade précoce, la MASH est souvent asymptomatique et est généralement diagnostiquée lorsque la fibrose hépatique se développe, pouvant évoluer vers une cirrhose ou un cancer du foie dans les cas les plus graves. En mars 2024, un premier médicament a été approuvé par la FDA (Food and Drug Administration) pour le traitement de la MASH. Cependant, ce composé permet seulement de retarder l’échéance en réduisant la fibrose chez seulement 24% des patients. Il y a donc un besoin urgent d’optimiser le traitement de la MASH. Depuis une dizaine d’années nous avons développé un anticorps reconnaissant spécifiquement une protéine localisée sur la membrane des cellules et connue pour participer au développement de différents cancers, notamment celui du foie. Nous avons montré que notre anticorps conduisait à une inhibition partielle de la croissance du cancer du foie et du processus de fibrose hépatique. Cela suggère que l’utilisation de notre anticorps pourrait améliorer l’efficacité du traitement des fibroses hépatiques. L’objectif de notre projet est d’évaluer l’efficacité de notre anticorps sur une fibrose hépatique à un stade avancée dans la MASH.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à étudier l’efficacité d’un anticorps thérapeutique dans le traitement de la fibrose hépatique avancée dans le cas d’une MASH. Les résultats de ce projet permettront une meilleure optimisation thérapeutique chez les patients atteints de MASH et de fibrose hépatique avancée et contribuera à améliorer la prise en charge des patients à l’avenir.

Procédures

Afin d’induire une fibrose hépatique les animaux suivront un régime riche en graisses tout au long de l’expérimentation. Les animaux recevront un traitement par un anticorps 2 fois par semaine pendant 8 semaines par injection. Cette injection est réalisée sur animaux vigiles et prend moins d’une minute à être réalisée. Un prélèvement de sang sera réalisé avant et pendant le traitement afin d’évaluer l’évolution de la fibrose hépatique. Avant d’effectuer ces prélèvements de sang, les souris recevront un anesthésiant local puis ces dernières auront une anesthésie générale. Cette procédure est réalisée en 1 minute environ. Les animaux subiront également un prélèvement de sang terminal. Cette procédure est réalisée sur animaux anesthésiés et est réalisé en environ 1 minute.

Impact sur les animaux

Un stress lors de la manipulation des souris pour réaliser les traitements risque d’être observé. Une légère inflammation ainsi qu’une légère douleur de courte durée suite aux injections risque d’être observées. L’injection des traitements vont également améliorer l’état de santé des souris en diminuant la pathologie (fibrose hépatique par exemple). Développement d’un poil « gras » du au régime suivi (toilettage non suffisant).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissues (foies) qui seront utilisées pour des analyses ultérieures. Cela permettra d’étudier en détail l’effet de notre traitement sur la souris et de mieux comprendre le mécanisme d’action qui améliore la pathologie.

Remplacement

Afin de remplacer les études in vivo, nous avons procédé à des études in vitro sur lignées cellulaires et ex vivo sur des tissus de patients afin de démontrer la validité de l’approche. Celle-ci nécessite maintenant une validation dans un modèle physiologique complet sur animal entier avant transposition clinique chez l’humain. De plus, les modèles cellulaires ne peuvent récapituler que partiellement la pathogenèse complexe de la MASH et de la fibrose hépatique. Notamment concernant la fonction hépatique qui sera évaluée lors de cette étude, les réactions inflammatoires ou encore le métabolisme et qui peuvent être reproduit seulement lors de l’utilisation d’un organisme complet.

Réduction

Les tailles d’effectifs ont été déterminées grâce à de précédentes études et à l’aide d’un outil de calcul statistique afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables et robustes. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification, des briques de tremble à ronger, un tunnel pour se cacher, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre si nécessaire les procédures permettant de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance. Des méthodes anesthésiques, analgésiques et de confort seront appliquées lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement. Avant les procédures le nécessitant, au cours de la période d’acclimatations de 14 jours, les souris seront laissées 7 jours sans manipulation puis habituées à la contention afin de diminuer le stress lié aux injections.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères très proches de l’homme. Le modèle proposé dans cette étude a contribué dans le passé à établir le potentiel curatif des approches thérapeutiques actuellement prescrites chez l’homme. Notre modèle humanisé permet en outre de tester notre anticorps qui reconnait la molécule humaine. Les animaux seront utilisés à un âge adulte de 8 semaines minimum. Ce choix se rapproche de l’âge chez l’humain lors du développement de fibrose hépatique (âge adulte).

408 rats vont être utilisés, chacun soumis à des sessions de tâche comportementale de vingt minutes à une heure quinze par jour pendant quatre mois, sous un rationnement alimentaire qui maintient leur poids à 90 ou 95 % du poids initial pendant trois mois. Une partie d'entre eux subit une chirurgie cérébrale d'une heure et demie, avec injection de composés et implantation à demeure d'une fibre de verre. Tous seront tués pour vérification histologique, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur décrit la faim ainsi entretenue comme une "légère sensation" garantissant la motivation, et renvoie les retombées pour les pathologies mentales à une "perspective translationnelle".

Objectifs

La prise de décision est un processus essentiel du comportement humain. Ce processus complexe nécessite d’apprendre de son environnement afin d’emmagasiner des connaissances mais également de s’adapter aux changements. Une prise de décision adaptée nécessite ainsi un équilibre entre les comportements d’exploitation (utilisation des connaissances acquises) et d’exploration (recherche d’options plus favorables) qui peuvent être fidèlement modélisés chez le rat afin d’en établir les bases neurales. Le projet vise à étudier les circuits cérébraux qui permettent une prise de décision adaptée dans un environnement changeant chez le rat. Nous souhaitons dans ce projet étudier la connectivité de voies connues pour être impliquées dans la prise de décision mais dont le rôle précis n’est pas encore décrit. Dans un premier temps nous réaliserons une étude descriptive de la connectivité entre les différentes régions, puis nous testerons leur implication fonctionnelle en procédant à des déconnexions réversibles, afin de déterminer leur rôle précis.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de préciser la connectivité des voies impliquées dans la prise de décision ainsi que de préciser le rôle d’une population neurone de cette voie. Une hypothèse majeure actuelle est que la prise de décision mal adaptive qui caractérise un grand nombre de pathologies mentales (par exemple la schizophrénie) est associée à un syndrome de dysconnectivité de ces régions, ce projet fondamental a donc une claire perspective translationnelle.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une tâche comportementale dont les sessions durent entre 20mn et 1h15 par jour pour une durée maximale de 4 mois. Ils seront soumis également à un rationnement alimentaire léger (permettant de conserver 90-95% de leur poids initial) qui durera maximum 3 mois. Les animaux de la procédure 2 subiront une chirurgie d’injection intra cérébrale de composés et d’implantation à demeure d'une fibre de verre très fine d’une durée maximale d’une heure et demie.

Impact sur les animaux

Les chirurgies du cerveau présentent un risque de diminution du bien-être animal dans les moments/jours qui suivent la chirurgie (inconfort, fatigue et parfois douleur). Afin de garantir la motivation des animaux pour la tâche comportementale ils seront mis en régime alimentaire spécifique (90 à 95% de maintien du poids), ce qui impacte très peu leur bien-être (légère sensation de faim garantissant la motivation des animaux à obtenir une récompense alimentaire). Certains animaux recevront des injections d’un produit ne provoquant pas de douleur. L’animal subit ainsi une restriction de mouvements ainsi que l’introduction d’une aiguille, l'ensemble peut provoquer un léger stress ainsi qu'une légère douleur.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux vérifications histologiques et à l'étude de marqueurs neuronaux

Remplacement

Etudier le fonctionnement du cerveau, et dans notre cas la prise de décision ne peut, par définition, s’étudier que chez des organismes entiers. L’approche expérimentale chez l’homme n’autorise pas la manipulation fine des circuits neuronaux qui est nécessaire à la compréhension de leur fonctionnement. De même, les approches alternatives faisant appel à la modélisation sont utiles mais restent complémentaires des approches expérimentales sur les animaux qui permettent de valider ces modèles.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés par groupe a été calculé comme étant le nombre minimum nécessaire pour être en mesure de mettre en évidence une différence statistique significative sur les paramètres étudiés grâce à l’utilisation de tests robustes. Ainsi, 12 animaux par groupe seront nécessaires. Cependant le nombre de groupes pourra être réduit en cours de projet : si une des voies étudiées ne montre pas de résultats significatifs sur les premiers lots elle ne sera pas étudiée sur les lots suivants.

Raffinement

Le bien-être animal étant essentiel pour garantir des données comportementales exploitables, toute souffrance sera évitée. Les animaux bénéficieront d’un enrichissement adapté (matériel de nidification, tunnel et barre à ronger) et seront hébergés en cage collective, même après les chirurgies. Les protocoles de chirurgie ont été optimisés afin de garantir des conditions optimales (analgésie centrale, locale, gel oculaire, tapis chauffant, scoring post-opératoire). Des points limites généraux et spécifiques ont été identifiés et des mesures conservatoires mises en place afin de permettre une prise en charge optimale de la douleur et de l’inconfort.

Choix des espèces

D’une façon générale les rongeurs sont un bon modèle d’étude du système nerveux. Les principes fonctionnels à l’œuvre dans ces circuits sont transposables à l'homme. De plus, de nombreuses épreuves comportementales spécifiques permettent de modéliser chez le rat des aptitudes cognitives complexes. Les animaux utilisés pour ce projet seront des jeunes adultes âgés d’environ 3 mois au début des expériences afin de limiter la variabilité de taille entre individus.

Les souris utilisées ici sont immunodéprimées, choisies pour accepter des greffes de tumeurs humaines sans les rejeter. Elles sont 435, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de la tumeur et des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal peut subir onze séances d'imagerie sous anesthésie, neuf injections et une chirurgie d'implantation tumorale, au service de la mise au point d'un prototype d'imagerie 3D dans l'infrarouge. Le porteur range la croissance des tumeurs parmi les nuisances attendues, puis écrit quelques lignes plus loin qu'elle "n'entraîne pas de gêne".

Objectifs

L’imagerie en fluorescence dans l'infrarouge connaît un essor considérable en raison de ses avantages uniques pour l’imagerie biomédicale, la détection industrielle et l’analyse environnementale. Contrairement aux longueurs d’onde visibles, le SWIR (partie de la lumière invisible à l’œil humain, située juste après la lumière visible) permet une meilleure pénétration des tissus biologiques, réduit la diffusion de la lumière et minimise l’autofluorescence, améliorant ainsi le contraste et la précision des images obtenues. Notre projet vise à développer un nouveau système d’imagerie en fluorescence SWIR combinant des capteurs haute sensibilité et des substances fluorescentes adaptées. L’un des défis majeurs réside dans l’identification de marqueurs fluorescents efficaces émettant dans cette gamme spectrale, ainsi que dans l’optimisation des sources d’excitation et des optiques adaptées. En intégrant des technologies de traitement d’image avancées et des algorithmes de correction des interférences, nous ambitionnons d’améliorer significativement la détection de tumeurs in vivo. À terme, notre objectif est de proposer un intrument polyvalent et adaptable aux besoins spécifiques de la recherche biomédicale. Pour valider la performance et la fiabilité de notre instrument, nous prévoyons de le tester sur différents modèles de cancers chez la souris, afin d’évaluer la qualité de reconstruction des images et d’optimiser les paramètres d’acquisition.

Bénéfices attendus

Avoir un outil fiable dans l'optique de développer de nouveaux agents de contraste et de nouveaux traitements pour le cancer.

Procédures

Les souris vont être soumises aux interventions suivantes : imagerie sous anesthésie (entre 5 et 20 minutes, 11 fois maximum) ; chirurgie sous anesthésie (15 minutes, 1 fois) ; injections sous anesthésie (1 minute, 9 fois).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues dans ce projet sont les différentes injections (douleur + stress), la croissance des tumeurs (inconfore), les différentes anesthésies (stress), les contentions (stress) et la chirurgie pour l'implantation (douleur + gène) de certains modèles.

Devenir

Les animaux issus des procédures seront mis à mort afin de prélever la tumeur et des organes pour des analyses anatomopathologiques.

Remplacement

Les tests in vitro permettront de sélectionner plus efficacement les composés et particules à tester, réduisant ainsi leur nombre. Par ailleurs, une équipe collaborant avec nous sur ce projet a développé des modèles numériques reproduisant les propriétés optiques des tissus de la souris, ce qui, combiné aux données des expériences in vivo, nous aidera à optimiser les algorithmes de reconstruction 3D et à diminuer significativement le nombre de souris nécessaires. Néanmoins, certains aspects du projet, comme la validation des algorithmes en conditions physiologiques complexes, ne peuvent actuellement être réalisés qu’en utilisant un modèle in vivo complet. Les interactions dynamiques entre les tissus, la perfusion sanguine, et l’effet de la respiration sur la qualité des images sont des éléments que les modèles in vitro ou in silico ne permettent pas encore de reproduire avec une précision suffisante. L'utilisation d'animaux est donc indispensable pour atteindre les objectifs scientifiques du projet.

Réduction

Nous nous efforcerons de faire en sorte que l’effectif utilisé soit minimal. En effet, dans ce projet, les expériences seront réalisées par lot de 3 animaux. Si le niveau de fluorescence et la localisation du signal sont comparables aux autres modalités d'imagerie dès le premier batch d'animaux, les suivants ne seront pas utilisés. D'après notre expérience dans ce domaine, 3 animaux peuvent être suffisants pour obtenir des informations scientifiques avec une bonne validité statistique. Cela permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux employés autant que possible.

Raffinement

Nous utiliserons des souris immuno-déprimées nous permettant le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les circuits sales/propres sont séparés, le box est en surpression, les cages sont stériles et jetables, la litière, les croquettes et l'enrichissent sont également stérilisés. L’étude se déroulera sur une période qui, dans la vie des animaux immunodéprimés, se situe bien en amont des complications liées à l’âge chez ces animaux. Lors de la chirurgie d'implantation des tumeurs, les souris seront sous anesthésie volatile, la température de l’animal est monitorée et régulée par un tapis chauffant, la déshydratation oculaire est limitée par l’application d’un gel ophtalmique et nous assurons une prise en charge efficace de la douleur grâce à une approche antalgique adaptée. La croissance des tumeurs n’entraîne pas de gêne et sera suivie régulièrement au pied à coulisse, par imagerie de bioluminescence et par ultrasons. L’application de critères d’arrêt et le suivi quotidien des animaux garantiront leur bienêtre, et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance par un traitement antalgique, de la nourriture humide, une réhydratation avec du sérum physiologique, une solution glucosée ou l'ajout d’un enrichissement sucré, selon le problème détecté.

Choix des espèces

Le système d'imagerie in vivo que nous devellopons est conçu pour faire de l'imagerie de fluorescence 3D sur souris, c'est pourquoi cette espèce est la plus adaptée. Les souris que nous utiliserons permettent le développement de modèles tumoraux humains sans phénomène de rejet. Les méthodes utilisées pour induire une tumeur sont rapides et reproductibles et la bonne connaissance de ces modèles de pathologie chez la souris fait que les limites éthiques de ce type d’expérimentation sont bien connues. Souris immunodéprimées de 5 semaines. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes avec une prise tumorale optimale.

Carencées en vitamines B9 et B12 un mois avant l'accouplement et jusqu'au sevrage, quinze rates reproductrices donnent naissance à 50 femelles qui reçoivent des injections tous les deux jours, de 21 à 60 jours d'âge. Les 65 rats seront tous tués pour prélèvements de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. L'objectif déclaré est de vérifier si une supplémentation vitaminique corrige les comportements de type dépressif observés chez la descendance lors d'une thèse antérieure, avec l'imipramine comme comparateur. Le porteur annonce neuf tests comportementaux répartis sur six semaines et ne nomme que le test de la nage, dont il indique avoir ramené la durée de dix à cinq minutes.

Objectifs

Ce projet fait suite aux résultats obtenus lors des travaux d’une thèse récente où nous avons montré que la descendance de mères carencées en vitamines B9 et B12 pendant la gestation et la lactation, présentait des comportements de type dépressif, une augmentation de l’anxiété ainsi qu’une diminution des interactions sociales. Par ailleurs, les femelles semblent plus sensibles et nous avons montré une corrélation des mécanismes biologiques interstinaux et du cerveau. Les mâles eux, ne présentaient que très peu des paramètres biologiques modifiés. Fort de ces résultats, ce projet vise donc à évaluer l’intérêt d’une compensation vitaminique B9/B12. L’hypothèse est d’observer une compensation, puis un rééquilibrage des mécanismes intestinaux et cérébraux, en parallèle d'une diminution des symptômes liés aux troubles psychiques, et de proposer une alternative aux traitements pharmacologiques. Cette évaluation sera comparée notamment avec un traitement de référence « anti-dépresseur » pharmacologique (l’imipramine). Nous proposons de nous concentrer dans un premier temps sur les femelles, en raison de la présence chez elles (au contraire des mâles) de l’ensemble des marqueurs qui suggèrent ces mécanismes. Ce projet de courte durée est tout à fait pertinent pour une étude de niveau Master; mais nous prévoyons déjà d’investiguer les mâles dans un projet plus conséquent (Doctorat de trois ans) en parallèle de l’investigation d’autres mécanismes suggérés par nos travaux récents.

Bénéfices attendus

Du fait qu'il est établi un lien fort entre des troubles de l’humeur (stress, anxiété…) ou encore des maladies psychiques (dépression, autisme…) et la prévalence concomitante de troubles intestinaux chroniques inflammatoires, les bénéfices attendus sont (1) l’éventualité de traiter certains patients par une voie non-pharmacologique et (2) de proposer un nouvel axe mécanistique pour les patients non-répondeurs aux traitements classiques qui ne prennent pas en compte les aspects intestinaux dans les troubles psychiques.

Procédures

Des femelles adultes reproductrices seront soumis à une carence alimentaire en vitamines B9 et B12 un mois avant l'accouplement et jusqu'à la fin de l'allaitement, mais celle-ci n’engendre pas de nuisance physique notable d’après nos précédentes études de mêmes type au laboratoire. Les rats descendants des mères reproductrices seront soumis à des injections répétées tous les deux jours de 21 jours à 60 jours d'âge, mais de très courtes durée (quelques secondes). Ces descendants subiront aussi deux prélèvements sanguins à 21 jours et 60 jours d'âge, sous anesthésie pour un recueil d’un petit volume (quelques gouttes ce prélèvement dure moins d'une minute). Les descendants passeront neuf tests comportementaux observationnels dans des dispositifs simples standardisés et déjà connus et maîtrisés. Chaque test est court de 2 à 5 minutes maximum et ils sont répartis de 19 jours à 60 jours d'âge. Ces tests comportementaux ont pour objectif l'évaluation des capacités locomotrices, cognitives et psychiques (stress, anxiété et marqueurs de dépression).

Impact sur les animaux

Les injections sur les individus peuvent être considérées comme inconfortables, cependant elles sont de très courtes durée (quelques secondes). Les prélèvements sanguins peuvent être considérés comme inconfortables mais ces prélèvements seront effectués sous anesthésie et le recueil ne sera que d’un petit volume (quelques gouttes). Les animaux passeront des tests comportementaux standardisés en neurobiologie. Ils sont observationnels plutôt que interventionnistes sur l’animal et ne génèrent pas ou très peu de stress ou inconfort. Seul le test de la nage peut générer un stress ponctuel, mais il a été aménagé par rapport à la description originelle de ce test (réduction du temps total de 10 minutes vers 5 minutes et empêchement total de tout effet physique ou psychique négatif majeur).

Devenir

Les 15 mères reproductrices seront euthanasiées pour prélèvements tissulaires au sevrage de leurs descendants. Les 50 descendants femelles objet de l'étude seront euthanasiées pour prélèvements tissulaires à 61 jours d'âge.

Remplacement

Ce projet est centré sur les mécanismes biologiques de communication entre cerveau et intestin, aussi il n’est pas possible d’investiguer par un autre moyen que des animaux vivants. Une approche globale sur "animal entier" est nécessaire pour étudier la dynamique et l’intégralité du dialogue intestin-cerveau

Réduction

De précédents travaux sur le même sujet indiquent que les femelles sont particulièrement affectées par les mécanismes intestinaux perturbant le fonctionnement cérébral en lien avec l’anxiété et la dépression. Aussi, nous proposons de ne travailler dans un premier temps que sur des femelles (réduction du nombre de lots et donc d’individus). Les mâles présentent également quels marqueurs biologiques dérégulés, mais pas dans les mêmes proportions que les femelles. Les résultats issus du présent projet pourront orienter nos hypothèses pour les mâles et nous proposerons l’étude sur les mâles à l’issu du présent projet. Afin d’évaluer le nombre de rats nécessaires pour ce projet nous utilisons un logiciel spécifique, qui permet un calcul prédictif au plus juste scientifiquement. 5 groupes expérimentaux seront comparés entre eux, et nous obtenons par calcul un effectif total de 50 animaux; d’où 10 rats femelles par groupe. A ceci s'ajoutent 15 femelles adultes reproductrices qui génèreront les 50 animaux de l'étude.

Raffinement

Dès leur réception, les animaux auront une période d’acclimatation de deux semaines pour s’adapter à leur nouvel environnement. Ils seront hébergés dans une animalerie dotée de la régulation de tous les paramètres nécessaires (température, hygrométrie, filtration de l’air, …) à leur bien-être. Un enrichissement des conditions d'hébergement est prévu avec buchettes de bois et du papier absorbant pour faire un nid. Un suivi quotidien sera effectué pendant toute la procédure et jusqu’à la mise à mort. Les points limites considérés seront : Les points limites sont fixés selon une grille d'évaluation des signes de mal-être établie dans notre EU et validée par notre vétérinaire référent (isolement, yeux fermés, dos voûté, poils hérissés, immobilité, perte de poids de plus de 20% du poids corporel total ou de 15% entre deux pesée consécutives, déshydratation, yeux et abdomen creux). Les animaux seront anesthésiés sous isofluorane (3,5% induction, 5% maintien) préalablement à l’euthanasie.

Choix des espèces

Le projet de recherche nécessite le recours à des analyses physiologiques, cellulaires, biochimiques et moléculaires en lien avec des régimes nutritionnels spécifiques. Les rats sont classiquement utilisés pour la recherche sur la physiologie et le métabolisme. De plus, il a été montré dans la littérature que les rats constituent un bon modèle d’étude de l’axe intestin-cerveau notamment pour l’étude des troubles psychiques (stress, dépression et anxiété) et de l’hypersensibilité intestinale. Les femelles adultes génitrices seront reçues du fournisseur entre 6 et 8 semaines d'âge et gardées jusqu'au sevrage de leurs descendants, puis mises à mort pour prélèvements tissulaires. Les descendants objet principaux de l'étude seront suivis de leur naissance jusqu'à 61 jours d'âge, puis mis à mort pour prélèvements tissulaires.

Amputées de l'extrémité de la queue dans leur première semaine de vie et sans analgésie, génotypées, puis suivies par électrorétinogramme, fond d'œil et tomographie sous anesthésie, les souris de la lignée Loa sont transportées jusqu'à neuf fois entre deux établissements. D'autres subissent une laparotomie sur femelle gestante pour injecter l'œil des embryons dans l'utérus, avec un risque d'avortement, de saignements et d'infection de la plaie, ou une injection sous la rétine au stade nouveau-né. 1 359 souris vont être utilisées, dont 46 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et les autres en souffrance légère. Les souris Loa portent une mutation qui provoque une ataxie des pattes arrière et un poids inférieur de 10 à 20 % à celui des témoins, et toutes sont tuées en fin de projet pour prélever les tissus de la rétine, jamais étudiée jusqu'ici chez cette lignée.

Objectifs

La mutation d’un gène de protéine de transport dans l’œil de souris et du poisson-zèbre perturbe le fonctionnement de la rétine, notamment en entraînant la perte de cellules photosensibles appelées les photorécepteurs. Ces données suggèrent l’importance de ce gène dans l’intégrité de la rétine. Chez l'homme, des mutations de ce gène sont responsables d’une maladie appelée dynéinopathie qui se caractérise par un déficit dans le développement du système nerveux, soit au niveau des membres inférieurs (déficits locomoteurs), soit du cerveau. Environ 30% des patients présentent également des déficits visuels dont certains sont liés à des anomalies de la rétine. Une mutation spontanée de ce gène a été décrite chez la souris (nommée Loa). Cette mutation est similaire à celle retrouvée chez l'homme. Les souris Loa manifestent des déficits au niveau des membres (sans impacter sa capacité à se reproduire, s’alimenter…), qui sont similaires à ceux observés chez les patients. Chez ces souris, d'autres anomalies ont été également rapportées dans le cerveau. Cependant, l'œil, notamment la rétine, de ces souris n'a jamais été étudié. L'objectif du projet, qui se déroulera dans 2 établissements distincts, est divisé en 3 parties : 1/ amplifier et maintenir une lignée de souris Loa, 2/ étudier aux niveaux cellulaire et fonctionnel les rétines de souris Loa, et 3/étudier le rôle de ce gène à différents stades de développement de la rétine de souris sauvage à l’aide d’un traitement pharmacologique contre la protéine de transport. La comparaison des résultats entre les différentes souris fournira les premières données sur l’intégrité de la rétine des souris Loa et une meilleure compréhension du rôle de ce gène dans la régulation des fonctions rétiniennes.

Bénéfices attendus

L’implantation, sur site (EU1), d’une lignée de souris atteinte de déficits dans le développement du système nerveux, telle que la lignée Loa, permettra aux équipes de chercheurs de caractériser pour la première fois, les effets, spécifiquement in vivo, d’une mutation du gène de cette protéine de transport dans les processus du développement de la rétine. De la même manière, l’administration d’un traitement pharmacologique contre cette protéine directement dans la rétine de souris permettra d'étudier pour la première fois les effets, spécifiquement in vivo, de l'inhibition de cette protéine à différents stades de développement de la rétine. La comparaison des résultats entre les différentes souris et conditions de traitement devrait donc contribuer à une meilleure compréhension du rôle de cette protéine dans la régulation des fonctions rétiniennes, et à plus long terme au développement de nouvelles thérapies pour les patients souffrant d’anomalies de l'œil, notamment de la rétine.

Procédures

Pour les souris de la lignée Loa, la mutation du gène sera vérifiée en analysant l’ADN à partir d’un prélèvement de tissu effectué sur chaque animal vigil dans sa première semaine de vie. Un suivi ophtalmologique des souris Loa sera réalisé sur animaux anesthésiés à l'aide de trois méthodes non invasives: l'électrorétinogramme (ERG), l'observation du fond d'œil (FO ) et la tomographie par cohérence optique (OCT, durée ), les deux dernières étant réalisées dans l'EU2. Ces techniques sont identiques à celles utilisées chez l’homme lors d’une évaluation ophtalmologique. Elles n'impliquent aucune intervention chirurgicale et durent entre 15 et 60 minutes. Pour réaliser les injections dans l'œil des embryons en place dans l’utérus (technique appelée injection in utero), des femelles gestantes de souris sauvages sont placées sous anesthésie générale et locale (durée

Impact sur les animaux

Le prélèvement tissulaire nécessaire pour caractériser génétiqueme,nt les nouveaux-nés entraîne un inconfort/une douleur aigue légère. La laparotomie sur femelle gestante peut induire des douleurs abdominales et des complications post-opératoires (avortement, saignements vaginaux ou de la plaie, inflammation de la suture, infection de la plaie, plaie ouverte). L’injection in utero dans l’œil d’embryons n’engendre, en général, aucune lésion ni altération rétinienne. L’injection sous-rétinienne chez les souriceaux n’engendre aucune lésion ni altération de la rétine . Lors du transport vers l'EU2 (

Devenir

A la fin du projet tous les animaux auront été mis à mort afin de prélever les tissus qui seront utilisés pour réaliser les analyses cellulaires et moléculaires.

Remplacement

Pour cette étude, l’animal ne peut être substitué par aucun modèle in vitro existant à ce jour. En effet, les modèles actuels ne permettent pas de recréer la complexité du système visuel dans son intégralité, c’est-à-dire depuis la détection de la lumière jusqu’aux réponses fonctionnelles. Néanmoins, l'effet d’une inhibition pharmacologique de Dync1h1 (et de son solvant) a été étudié in vitro sur des cultures de cellules rétiniennes murines. Nos résultats montrent une altération du transport des lysosomes après 24h de traitement avec l'inhibiteur.

Réduction

Pour cette étude exploratoire, nous utiliserons au maximum 1359 animaux. Cet effectif a été estimé à l'aide d'analyses statistiques. Ce nombre pourra être réduit de deux manières : d’une part via une approche d’inclusion progressive dans le suivi ophtalmologique, et d’autre part via des études pilotes visant à mettre en évidence des déficits potentiels de la rétine. Par ailleurs, la période de gestation chez la souris est courte et le nombre d’embryons important, ce qui permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de peu de fondateurs. De plus, nous pouvons comparer les animaux mutants avec leurs conspécifiques (+/+) issus des mêmes portées. L'avantage de la technique d'injection dans un organe pair tel que l'œil permet de réduire de moitié le nombre d'animaux. De plus, le nombre d'animaux est considérablement réduit grâce à la réalisation d'examens ophtalmologiques non invasifs permettant un suivi longitudinal sur le même animal. Enfin, le nombre d'animaux pourra être réduit si les résultats des études pilotes ne montrent pas de déficits rétiniens.

Raffinement

Les animaux en accouplement sont en trio continu ou une nuit, puis séparés si un accouplement est avéré. Les femelles gestantes et leurs portées ont une alimentation enrichie de la lactation au sevrage. La caudectomie réalisée dans la 1ère semaine de vie ne nécessite pas d'analgésie. Le stress et l'hypothermie sont diminué par un retour rapide à la mère et une lampe chauffante, respectivement. Zootechniciens et expérimentateurs font un suivi hebdomadaire pour alerter des premiers signes de dégradation du bien-être en portant attention à l'état général et comportemental. En cas de changements, des aliments humides sont mis dans la cage. En cas de douleur manifeste, l’animal est mis à mort. L'intervention sur femelles gestantes se fait sur tapis chauffant pour limiter l'hypothermie et sous anesthésie gazeuse et locale associée à une analgésie per- et post-opératoire. L’injection sous-rétinienne se fait sur animal placé sous anesthésie gazeuse et locale et sur tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Pour le transport entre les 2 EU (

Choix des espèces

Les souris Loa sont atteintes d'une mutation identique à une mutation décrite chez l'homme et qui mime parfaitement le déficit locomoteur, symptôme caractéristique. Ce modèle animal est reconnu comme modèle idéal permettant d'étudier les effets de la mutation humaine. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons important, ce qui permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de fondateurs. Etant donné que la rétine n'a jamais été étudiée chez les souris Loa, nous analyserons plusieurs stades: embryonnaire (photorécepteurs immatures), postnatal (quand les photorécepteurs sont matures et fonctionnels), 1 mois (jeune), 2 mois (maturité sexuelle), 4 mois (jeune adulte), 6 mois (adulte) et 12 mois (âgé).