Rongeurs
Développement d’une nouvelle stratégie de thérapie ciblée
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit deux injections directement dans le cerveau au cours d'une intervention d'environ une heure sous anesthésie, puis trois prélèvements sanguins, avant une chirurgie terminale deux, six ou douze mois plus tard pour prélever le cerveau. Le porteur signale une douleur possible à la tête ou à la mâchoire pendant une douzaine d'heures après l'opération, un risque d'infection de la plaie et un risque faible que l'injection perturbe des connexions cérébrales. Le même RNT annonce une approche capable de "révolutionner" la prise en charge de l'autisme et des épilepsies, et affirme que la mise à mort en fin de protocole "garantit" que les animaux ne subissent aucune souffrance prolongée.
Objectifs
Ce projet a pour but de développer un nouveau type de traitement, capable de transporter des gènes réparateurs directement là où le corps en a besoin, notamment dans le cerveau. Ces traitements pourraient aider à soigner des maladies graves, actuellement sans solution efficace. Nous travaillerons en collaboration avec des experts de l’industrie pour garantir que ces traitements soient à la fois sûrs, efficaces et adaptés à une utilisation chez l’humain. Objectifs du projet : • Créer des traitements intelligents : concevoir un système capable de délivrer les gènes de manière précise. • Cibler des maladies du cerveau : utiliser ce système pour traiter certaines maladies neurologiques. • Améliorer la sécurité : éviter les effets secondaires, comme les réactions immunitaires. • Respecter les normes : s’assurer que tout respecte les règles de sécurité pour une future application chez l’homme. • Mieux comprendre leur action : étudier comment ces traitements fonctionnent dans le corps pour les améliorer. Ce projet allie science et technologie pour ouvrir la voie à de nouveaux traitements contre des maladies complexes, en toute sécurité.
Bénéfices attendus
1. De nouveaux outils pour traiter les troubles neurologiques et du développement. Ce projet vise à développer des traitements ciblant spécifiquement le cerveau pour corriger les altérations causées par le mauvais fonctionnement de certains gènes dans les troubles neurologiques, neurodégénératifs et neurodéveloppementaux. Son objectif principal est de rétablir le fonctionnement normal des neurones en s'attaquant directement à la cause génétique profonde de ces pathologies. 2. Un pas vers la thérapie. Les résultats prometteurs de ces recherches pourraient ouvrir la voie à des essais cliniques et, à l'avenir, au développement de thérapies géniques personnalisées adaptées aux besoins spécifiques de chaque patient. 3. Transformer le traitement des maladies neurologiques. Cette approche innovante pourrait révolutionner la prise en charge de pathologies telles que les troubles du spectre autistique, les épilepsies, les maladies neurodégénératives et d'autres troubles du développement liés à un dysfonctionnement génétique. Ce faisant, elle permettrait non seulement d'améliorer considérablement la qualité de vie des patients, mais aussi d'offrir un nouvel espoir à ceux qui sont confrontés à ces maladies actuellement incurables.
Procédures
Toutes les souris recevront deux injections intracérébrales (1 fois) sous anesthésie, une procédure d’environ une heure. À 2, 6 ou 12 mois après les injections, une chirurgie terminale sous anesthésie sera réalisée pour le prélèvement du cerveau, une procédure d’environ dix minutes. De plus, chaque souris fera l’objet de trois prélèvements sanguins répartis sur la durée du projet, une procédure d’environ 3 minutes.
Impact sur les animaux
Douleur et inconfort après l'opération. Les animaux peuvent ressentir une légère douleur au niveau de la tête ou de la mâchoire pendant environ 12 heures après l'opération. Stress associé à la manipulation, risque d'infection. Bien que tout soit fait dans des conditions stériles, il existe un petit risque d'infection au point d'injection. Réactions locales à la plaie. La petite plaie à la tête pourrait s'infecter ou s'enflammer. Risque pour les connexions neuronales. Il existe un très faible risque que l'injection perturbe d'importantes connexions cérébrales, ce qui pourrait affecter certains mouvements.
Devenir
Dans cette étude, tous les animaux seront euthanasiés avec un chirugie terminale sous anesthésie à la fin de la procédure. Cette étape est nécessaire pour permettre l’analyse approfondie de leurs organes, notamment du cerveau, afin de mieux comprendre les mécanismes biologiques étudiés. Ces analyses, réalisées selon des techniques histologiques précises, sont indispensables pour obtenir des résultats fiables et avancés, contribuant ainsi à la recherche scientifique et médicale. Cette approche garantit également que les animaux ne subissent aucune souffrance prolongée, en accord avec les principes de bien-être animal et les réglementations en place.
Remplacement
Malgré les efforts continus pour développer des modèles alternatifs, l'utilisation de souris reste indispensable dans les études sur les maladies neurologiques, en raison de la complexité des processus biologiques impliqués et de la nécessité d'examiner ces mécanismes au sein d'un organisme vivant. Bien que les cultures de cellules souches neurales et les organoïdes cérébraux fournissent des informations précieuses sur les réseaux neuronaux, ils ne reproduisent pas entièrement le microenvironnement cérébral complexe, en particulier les interactions cruciales entre les différents types de cellules. Ces interactions sont essentielles pour comprendre les altérations des réseaux neuronaux dans des conditions telles que l'épilepsie ou certains comportements associés aux troubles du spectre autistique. Les progrès de la modélisation informatique permettent des simulations utiles de certains aspects des réseaux neuronaux, mais ces modèles sont limités par des données restreintes et la complexité des mécanismes neuronaux. Les souris, bien qu'elles ne reproduisent que partiellement les comportements et les altérations des réseaux humains, sont particulièrement utiles dans leurs versions génétiquement modifiées pour des gènes spécifiques. Ces modèles constituent une base précieuse pour l'étude du rôle de certaines protéines, permettant aux chercheurs de tester comment moduler ou restaurer l'expression des gènes dans le cadre de pathologies telles que l'épilepsie ou l'autisme, et ainsi de mieux comprendre des mécanismes similaires chez l'homme et de développer des traitements potentiellement plus efficaces. Dans le cadre de ce projet, nous évaluerons d'abord chaque vecteur viral en culture cellulaire pour nous assurer qu'il exprime correctement les protéines. Seuls les vecteurs qui passent ce contrôle de qualité en culture seront ensuite utilisés sur des animaux vivants, ce qui réduira la nécessité d'utiliser des modèles animaux uniquement lors des étapes cruciales de validation.
Réduction
Nous avons utilisé des tests statistiques qui te permettent de réduire le nombre d'animaux à 8 par groupe pour garantir des résultats fiables et statistiquement valables. Étant donné que nous incluons des animaux mâles et femelles et que nous comparons des conditions différentes. Cette approche nous permet d'utiliser le moins d'animaux possible tout en maintenant la validité scientifique de nos résultats.
Raffinement
Tout au long du projet, toutes les mesures nécessaires seront mises en œuvre pour éviter tout impact négatif sur le bien-être des animaux. L'expérience respectera les impératifs éthiques, en intégrant des méthodes d'hébergement appropriées, l'enrichissement de l'environnement et la prévention de toute douleur, inconfort, stress ou détresse des animaux. Ils sont placés dans la cage avec une maison en carton, de la laine de coton et une roue d'exercice, afin de répondre à leurs besoins physiologiques et comportementaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur poids sera vérifié une fois par semaine. Des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés pendant les procédures pour réduire la douleur. Après les procédures, de la nourriture gélifiée et de l'eau seront placées sur le sol pour faciliter l'alimentation. Enfin, des points limites précis ont été établis pour suivre de près les effets des interventions. Les animaux présentant l'un des points limites ou un score supérieur à 15 dans ce tableau seront systématiquement euthanasiés.
Choix des espèces
L’objectif principal de ce projet est de développer un nouveau traitement. Avant d’y parvenir, nous devons d’abord tester la sécurité et l’efficacité de notre vecteur viral chez des souris. Nous utilisons de jeunes souris adultes âgées de 2 à 3 mois, car elles offrent plusieurs avantages. À cet âge, leur cerveau est complètement formé et elles sont en bonne santé, ce qui garantit des résultats fiables. Leur crâne est également suffisamment stable pour permettre des injections précises dans les régions spécifiques du cerveau. Cela nous aide à analyser où le vecteur se distribue et quels neurones il cible, ce qui est crucial pour améliorer la précision et la validité des résultats. Ce travail est une étape essentielle pour développer des solutions thérapeutiques innovantes pour des maladies complexes.
Caractérisation de modèles de souris de la maladie de Fanconi.
- Recherche appliquée
- Cancers
1 728 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacune suivie de la naissance jusqu'à l'âge de vingt-quatre mois, avec un prélèvement de sang à la joue chaque mois sur animal éveillé à partir de six semaines. Elles portent des mutations combinées de gènes de la voie Fanconi, et certaines développent des cancers ou une défaillance de la production des cellules sanguines par la moelle osseuse, que le porteur cite comme sources de douleur. Toutes sont tuées au plus tard à vingt-quatre mois pour l'analyse des organes. Le projet ne teste aucun traitement : il crée et caractérise les lignées, l'évaluation de thérapies étant renvoyée à un "second temps".
Objectifs
L’anémie de Fanconi est une maladie héréditaire rare, caractérisée par des malformations dès la naissance, et un défaut de la production de cellules sanguines par la moelle osseuse, menant à une quantité réduite de globules rouges, globules blancs et plaquettes dans le sang. Par ailleurs tous les patients ont une tendance très importante à développer des cancers du sang et des cancers solides tels que ceux de la tête et du cou. Cette maladie est causée par des mutations des gènes participant à la réparation de l’ADN en cas d’altération. À ce jour, 23 gènes participant à la voie de signalisation Fanconi sont connus dans cette pathologie. La mutation d’un de ces 23 gènes de la voie Fanconi provoque les symptômes de la maladie anémie de Fanconi. Il est important de travailler avec différentes mutations de la voie Fanconi afin de mieux comprendre la maladie et l’évolution vers des cancers du sang. Pour ce projet nous utiliserons des modèles de souris associant plusieurs gènes impliqués dans la maladie et retrouvés mutés chez les patients Fanconi, notamment dans les cas les plus graves. Ces modèles de souris nous permettront également de mimer des états précédant l’apparition des cancers du sang. L’objectif de ce projet est de créer et caractériser des lignées de souris transgéniques reproduisant les altérations retrouvées chez les patients Fanconi.
Bénéfices attendus
Les gènes associés à l’anémie de Fanconi sont similaires entre la souris et l’homme. Nous pouvons ainsi modéliser les mutations de ces gènes retrouvés chez les patients chez la souris. À court terme, ce projet nous permettra de créer des modèles de souris de l’anémie de Fanconi et d’étudier l’évolution naturelle de la maladie. Dans un second temps, nous utiliserons ces nouvelles lignées génétiquement modifiées pour tester des thérapies ciblant l’anémie de Fanconi.
Procédures
Pour mener à bien ce projet, nous générerons de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées par croisement. Les animaux ainsi obtenus seront suivis de la naissance jusqu'à l'âge de 24 mois afin de détecter tout effet sur l'apparition de cancer. Nous mesurerons également plusieurs paramètres sanguins à partir de prélèvements de sang obtenus au niveau de la joue (sur souris éveillée, d'une durée de 30 secondes environ). Ces prélèvements seront mensuels à partir de l’âge de 6 semaines et jusqu’à l’âge de 24 mois.
Impact sur les animaux
Une douleur liée au prélèvement de sang réalisé au niveau de la veine de la joue peut être constatée. Certaines souris peuvent développer des cancers ou un défaut de la production des cellules sanguines par la moelle osseuse ce qui peut être une source de douleur ressentie par l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés au plus tard à 24 mois pour l’analyse des organes post-mortem.
Remplacement
Notre projet a pour but de décrire les caractéristiques des souris avec des mutations de gènes associés à l’anémie de Fanconi, notamment les valeurs de référence pour les paramètres sanguins (hémoglobine, globules rouges, globules blancs, plaquettes) et leur évolution en fonction du vieillissement des souris, en cherchant une réduction progressive des paramètres sanguins avec le temps. Le modèle souris ne peut pas être remplacé par un modèle cellulaire car nous avons besoin de l’organisme entier et vivant pour évaluer l’impact de la perte d’un gène Fanconi sur la production des cellules du sang par la moelle osseuse.
Réduction
Afin de caractériser les nouveaux modèles de souris que nous allons créer, nous avons besoin d’un nombre minimal d’animaux de chaque groupe, défini à l’aide d’une analyse statistique. Nous prévoyons une analyse intermédiaire ce qui permettra de déterminer si les animaux créés présenteront une altération de leur bien-être. Si l’analyse intermédiaire permet de détecter une différence significative entre les groupes génétiquement altérés, l’expérience sera arrêtée.
Raffinement
Une surveillance quotidienne sera réalisée par l’expérimentateur ou l’animalier. Nous serons attentifs en veillant à ce que tous les animaux soient maintenus autant que possible en groupe et que l’enrichissement du milieu soit adapté, notamment pour les animaux qui se retrouveraient isolés en cours d’expérience. Toutes les cages auront un enrichissement (papier kraft, tunnel, buchette de bois). Une surveillance clinique hebdomadaire de l’apparence (poids, pelage, sécrétions, présence de masse tumorale) et du comportement (interactions sociales, posture, mobilité, respiration) sera effectuée dès la naissance et jusqu’à la fin de la procédure (24 mois). Le suivi se fera en suivant une grille de points limites définis, suffisamment précoces et prédictifs. Pour les nouveaux nés jusqu’au sevrage, nous surveillerons également la présence de malformations et de retard de développement éventuel. La surveillance biologique mensuelle par numération des comptes globulaires sanguins à partir de 6 semaines de vie nous permettra également de détecter des anomalies très précoces de la numération sanguine. Si des animaux présentent des signes d’inconfort, ils bénéficieront d'une analgésie. Toute souris présentant des signes de souffrance pendant la durée de l’expérience (poil hérissé, prostration, perte de poids, tumeur palpable) sera euthanasiée sans attendre et analysée.
Choix des espèces
Les gènes Fanconi sont similaires entre la souris et l’homme. Nous pouvons ainsi modéliser les mutations de ces gènes retrouvées chez les patients Fanconi chez la souris. L’utilisation du modèle souris permet à la fois de modéliser le défaut de réparation de l’ADN de l’anémie de Fanconi et d’analyser l’évolution naturelle de cette pathologie. Pour la caractérisation des modèles, les souris seront suivies dès la naissance afin de détecter l’apparition d’une tumeur. Le premier prélèvement sanguin aura lieu à l’âge de 6 semaines, afin de ne pas manquer des anomalies très précoces de la numération sanguine et jusqu’à l’âge de 24 mois, afin d’évaluer le vieillissement des souris et son retentissement sur les paramètres sanguins, ainsi que le développement de possibles cancers. Cette surveillance est basée sur la littérature scientifique existante.
Neurostimulation des voies dopaminergiques in vivo par des ultrasons de basse énergie chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Le crâne est ouvert pour y descendre une microélectrode en fibre de carbone et un émetteur d'ultrasons, au cours d'une chirurgie de trois à quatre heures menée sous uréthane. 50 rats vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, le porteur indiquant que le réveil après une chirurgie du crâne entraînerait des souffrances inutiles. L'objectif est de vérifier si des ultrasons de basse énergie déclenchent une libération de dopamine dans un cerveau intact, étape que le porteur juge nécessaire avant tout essai chez l'humain. Il écrit par ailleurs que l'uréthane est difficile à manipuler, avec un risque de variation de l'état de conscience des animaux, et retient précisément le réveil de l'animal comme point limite de la procédure.
Objectifs
La neurostimulation par ultrasons de basse énergie (low-energy ultrasound ou LEUS) est une méthode prometteuse pour stimuler des régions cérébrales de façon non-invasive et avec grande sélectivité spatiale limitée à quelques mm3 de tissu nerveux. La neurostimulation par les LEUS a déjà été testée chez l’animal, et a été capable d’évoquer des mouvements des membres, des vibrisses chez le rongeur, voire des yeux. Cependant, les effets cellulaires des LEUS et les mécanismes biologiques de cette stimulation demeurent largement inconnus. Un verrou important consiste à comprendre comment les LEUS affectent la neurotransmission, le mécanisme fondamental par lesquels les neurones libèrent des neurotransmetteurs et transmettent des signaux chimiques à leurs voisins. In vitro, les LEUS sont capables d’induire des libérations de calcium intracellulaire et d’évoquer une libération de dopamine par des neurones en culture. Cependant, la pertinence de ces effets in vivo au sein d’un cerveau intact reste inconnue. Ce projet se focalisera sur les neurones dopaminergiques du rat. La libération de dopamine peut être monitorée en routine par la technique de voltamétrie cyclique rapide à l’aide de microélectrodes en fibre de carbone. L’objectif de ce projet est de tester in vivo l’hypothèse selon laquelle la stimulation par LEUS des voies dopaminergiques induit une libération de dopamine dans le cerveau, démontrant ainsi que les LEUS ont bien la capacité d’exciter les neurones in vivo et de stimuler la libération de neurotransmetteurs.
Bénéfices attendus
L'ensemble de ce projet permettra d'évaluer le potentiel des LEUS pour stimuler le cerveau de façon non invasive et localisée chez l’homme à des fins curatives. Il s’agira de la première évaluation de ce type in vivo et cette approche apportera des informations cruciales sur les mécanismes biologiques mis en jeu par la stimulation par LEUS dans le cerveau. Il existe déjà des pathologies neurologiques humaines dont les traitements utilisent la neurostimulation. Par exemple, les patients atteints de maladie de Parkinson et ne répondant plus aux traitements pharmacologiques peuvent recevoir une électrode de stimulation pour compenser la perte de dopamine dans leur cerveau. D’autre pathologies humaines pourraient bénéficier d’une approche thérapeutique par neurostimulation mais les développements de ces thérapies sont limités par les risques liés à l’implantation d’électrodes invasives dans le cerveau. La technique de neurostimulation par LEUS pourrait offrir une alternative prometteuse pour remplacer les méthodes de neurostimulation invasive dans la maladie de Parkinson et peut-être ouvrir la voie vers de nouvelles thérapies à base de neurostimulation.
Procédures
Procédures chirurgicale sous anesthésie générale et analgésie sans réveil d'une durée de 3-4 h.
Impact sur les animaux
L’ensemble des procédures expérimentales seront effectuées sur l’animal anesthésié sans réveil. L’uréthane est difficile à manipuler , avec un risque de variation d’état de conscience des animaux. L'utilisation longue peut entrainer un risque de dégradation des fonctions physiologiques difficiles à maitriser.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux en fin de chirurgie car le réveil de l'animal après une chirurgie du crâne entrainerait des souffrances inutiles.
Remplacement
La technique de neurostimulation par les LEUS a déjà été testée in vitro sur des neurones en cultures ainsi que sur des explants de cerveau. L'étape in vivo chez l'animal est maintenant nécessaire avant de passer chez l'homme afin de vérifier l'efficacité de la stimulation et son innocuité.
Réduction
Les effectifs des groupes ont été réduits au maximum afin de permettre une mise au point sérieuse des procédures : 10 rats pour la mise au point de la détection de dopamine, 10 rats pour la mise au point des paramètres d'angulation des électrodes, 20 rats pour l'optimisation des paramètres de la stimulation LEUS. Nous pourrons procéder à des comparaisons statistiques de différents paramètres de stimulation par LEUS à partir d'un effectif de 6 animaux par groupe. Par exemple, la comparaison entre les paramètres LEUS optimaux et la stimulation électrique de référence pourra être menée à bien avec ces effectifs.
Raffinement
Concernant la douleur, un traitement analgésique est prévu avant la chirurgie. La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale en appliquant les points limites définis par (1) un réveil de l'animal et (2) l'apparition d'une hemorragie incontrôlée au niveau du scalp. Concernant l'angoisse infligée à l'animal, elle est réduite par un hébergement par groupes de deux à six dès l’arrivée au laboratoire et par l’insertion d’un enrichissement dans les cages d’hébergement (tuyau en PVC transparent, matériau de nidification).
Choix des espèces
Le rat est une espèce qui a été largement caractérisée pour la libération de dopamine dans le cerveau évoquée par une stimulation électrique. Les procédures permettant de réaliser cette mesure ont été décrite dans la littérature et serviront de base à notre approche expérimentale. Les données de la litérature semblent indiquer que le rat permet une détection de dopamine plus robuste que la souris. Rats adultes de 6-10 semaines pour bénéficier d'une taille maximale
MétabolIteS du microbioTe et ruptuRe de l’homéostasie épithéliale intestinALe dans le Syndrome de l’Intestin Irritable (MISTRAL-SII)
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Vingt-quatre gavages, deux séances de contention forcée de deux heures, un puçage, une prise de sang : chaque souris passe par cette série avant d'être tuée pour l'étude de ses tissus. 112 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole teste par voie orale des métabolites bactériens dans un modèle murin de syndrome de l'intestin irritable, en mesurant la perméabilité intestinale, l'inflammation et la sensibilité viscérale, avec une priorité donnée aux femelles. Le porteur annonce deux séries de tests anxiodépressifs de deux heures sans préciser lesquels, et écrit attendre de l'administration du métabolite qu'elle "exacerbe" les altérations intestinales du modèle.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de tester in vivo (par administration orale) la capacité de ces métabolites bactériens à moduler les fonctions de l’intestin dans un modèle murin de SII. Plus particulièrement, nous évaluerons leurs effets sur (i) la perméabilité intestinale, (ii) l’inflammation, (iii) le stress oxydant, (iv) la viscéro-sensibilité et (v) la motricité intestinale. L’impact de ces métabolites sur la composition du microbiote sera également étudié dans les deux sexes. Le SII étant à prédominance féminine, la priorisation de nos études se portera sur les souris femelles. Les souris mâles seront également utilisées pour nous permettre de comparer l’effet sexe dans ce modèle murin de SII.
Bénéfices attendus
Nous anticipons que l’administration de ce métabolite exacerbera les altérations de l’homéostasie intestinale rencontré dans ce modèle murin. Ces travaux pourront conduire à la mise en place d’études ultérieures utilisant des probiotiques spécifiques capables de métaboliser/utiliser ces métabolites délétère et in fine réduire l’abondance de ces métabolites
Procédures
Les souris seront sujets aux interventions suivantes : 1- Puçage, 1 fois, 5 min/souris. 2- Gavages oraux, 24 fois, 5 secondes/souris 3- Stress de contention, 2 fois, 2h/souris 4- Tests anxiodépressifs, 2 fois, 2h/souris 5- Prise de sang, 1 fois, 1min/souris 6- Mise à mort, 1 fois, 2 secondes/souris
Impact sur les animaux
Les procédures impliquent l’administration orale récurrente de plusieurs substances afin de déclencher des effets cliniques modérés (troubles fonctionnels intestinaux). Pour cette raison, ces procédures sont classées dans la catégorie modérée. Le stress étant une composante indéniable dans la physiopathologie du SII, 2 séries de stress seront réalisés avec un délai suffisant pour une récupération maximale. Les animaux seront acclimatés aux pièces d’hébergement et manipulés fréquemment. Les études utilisant ce modèle murin de SII ne mentionnent pas de mortalité particulière mais la souffrance animale sera évaluée quotidiennement.
Devenir
L’ensemble des animaux seront mis à mort pour l’étude de leurs tissus à la fin du protocole et des procédures. Une utilisation conjointe sur plusieurs projets peut être envisagée par la récupération de tissus non utilisés lors de ce projet.
Remplacement
Le syndrome de l’intestin irritable implique de nombreux acteurs cellulaires dont le fonctionnement ou le métabolisme est altéré. En exemple, les cellules épithéliales intestinales (colonocytes, cellules muqueuses caliciformes, cellules L enteroendocrines), les cellules immunitaires intestinales (mastocytes et lymphocytes), les cellules nerveuses intestinales (cholinergiques) et les bactéries du microbiote intestinal. Le recours à l'expérimentation animale est de fait nécessaire pour mieux comprendre la physiopathologie du SII et intégrer la dérégulation globale de tous ces acteurs. Au regard de la règle des 3R, pour limiter le nombre d'animaux, certaines approches très mécanistiques sont menées actuellement sur des modèles cellulaires comme par exemple l'étude des voies régulant la fonction de barrière intestinale, l’inflammation, le stress oxydant et les fonctions neuroendocrines. Nous possédons au laboratoire diverses lignées cellulaires intestinales pouvant modéliser ces nombreux acteurs. Ces lignées ont été spécifiquement achetées grâce à des financements antérieurs. Nous possédons aussi l’expertise de la technique de co-culture sur inserts transwell qui permet d’évaluer le passage des molécules à travers la monocouche cellulaire. Ces outils in vitro sont indispensables car ils nous permettent de sélectionner les métabolites bactériens les plus intéressants à tester chez l’animal parmi la quinzaine que nous avons pu identifier dans la littérature.
Réduction
Pour limiter le nombre d'animaux, l'effectif a été évalué par l'utilisation de tests statistiques. Lors de la réalisation de l’expérimentation nous prévoyons une perte en animaux de 0.00%. Le problème de dépendance statistique des individus appartenant à une même cage sera minimisé lors de l’analyse des données en ayant recours à des modèles statistiques à effets mixtes. Le protocole est optimisé de manière à réduire de manière significative l’utilisation importante d’animaux dans ce projet.
Raffinement
D'une façon générale, les animaux seront manipulés régulièrement par les mêmes expérimentateurs pour tendre à une habituation, et hébergées au nombre maximum de 4 animaux par cage avec de l’enrichissement (coton pour le nid, maisons en carton, balles, tunnels, différents types de litière, papier kraft). Afin de limiter le stress occasionné par le transport, une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera maintenue avant tout début de protocole. Les animaux seront maintenus dans un environnement contrôlé et stabilisé. Une évaluation du bien-être de l’animal sera réalisée quotidiennement à l’aide du score de la « Mouse Grimace Scale » et les animaux recevront une injection d'analgésique adaptée pour prendre en charge la douleur si besoin. L’animal sera surveillé et remis dans sa cage d’origine. En situation de douleur persistante, les animaux seront mis à mort.
Choix des espèces
Ce projet est un projet de recherche en physiologie intégrée permettant d’étudier le dialogue altéré entre le microbiote intestinal, l’intestin et le cerveau dans le contexte du SII. Le recours à des modèles animaux est de fait indispensable pour (i) mieux comprendre l’influence bénéfique ou délétère de métabolites fécaux sur les animaux, et (ii) Identifier les effets sexe-dépendants en présence de ces métabolites. Le modèle murin est communément utilisé dans notre unité pour étudier les troubles fonctionnels intestinaux associés à d’autres pathologies comme l’obésité (alimentation riche en lipide) ou encore l’anorexie mentale (anorexie basée sur l’activité). La souche choisie de nos souris a un taux de réponse élevé à ces troubles par rapport à d'autres espèces animales voire d'autres souches. Le choix de la souris par rapport au rat se justifie également par les quantités et le coût des métabolites administrés. Pour l’ensemble des procédures, les souris seront livrées à l’animalerie centrale à leur septième semaine de vie pour un début de protocole à 9 semaines. À ce stade, nos études antérieures montrent une bonne réponse des animaux aux différents protocoles qui induisent des troubles fonctionnels intestinaux sans mortalité particulière
Rôle du système sérotoninergique dans la physiopathologie des douleurs neuropathiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une grille de score quotidienne et un arbre décisionnel peuvent conduire à la mise à mort avant terme, cas que le porteur estime à moins de 2 % des animaux. 1 834 rats vont être utilisés, dont 1 738 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Après un diabète déclenché chimiquement, ils développent pendant toute la durée de l'étude une allodynie et une hyperalgésie déclarées sévères, une soif et des urines abondantes également sévères, une fonte musculaire modérée, et subissent entre neuf et onze injections ainsi que des tests de sensibilité répétés toutes les trente minutes pendant trois heures. La raison de la mise à mort tient en une ligne du RNT, l'état douloureux chronique de l'animal, état que le protocole a lui-même installé pour évaluer des antalgiques.
Objectifs
La neuropathie diabétique est une des complications les plus fréquentes du diabète de type 1 (DT1, insulino-dépendant) et de type 2 (DT2, insulino résistant) touchant jusqu’à 50% des patients diabétiques et responsable de neuropathie douloureuse pour 50% d’entre eux. Ses principaux symptômes associent des douleurs évoquées (hyperalgie, allodynie), spontanées (décharges électriques, sensation d’étau, …), une perte de la sensibilité thermique. Les neuropathies douloureuses sont difficiles à traiter et, en raison de leur chronicité, elles sont fréquemment associées à des comorbidités anxieuses, dépressives et cognitives. Ces co-morbidités peuvent interférer avec les actes de la vie courante et avoir un impact important sur la qualité de vie des patients. A l’heure actuelle, trois classes pharmacologiques sont recommandées en 1ère intention dans cette indication : les antidépresseurs tricycliques, les inhibiteurs de la recapture de la sérotonine et de la noradrénaline et les anti-épileptiques ligands des canaux calciques voltage-dépendants. Néanmoins, ils ont une efficacité limitée d'où un besoin urgent d’innovation thérapeutique. Sur la base de ce constat clinique, la modélisation de la neuropathie diabétique douloureuse est une nécessité. Le modèle de neuropathie diabétique chimiquement induite reproduit les mécanismes lésionnels métaboliques du DT1 associés aux symptômes de d'hypersensibilité et aux co-morbidités cognitives. Nous proposons d’étudier dans ce modèle animal à haute valeur translationnelle, l’implication de récepteurs de la sérotonine, dans les mécanismes physiopathologiques de la douleur neuropathique afin de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant d’améliorer la prise en charge des douleurs neuropathiques. Les données précédemment acquises indiquent que cet objectif, pourrait être atteint en modulant l’activité de récepteurs de la sérotonine. Ce projet, qui mettra en œuvre des approches comportementales, pharmacologiques et moléculaires a pour but d’identifier les mécanismes spinaux sous-tendant les effets bénéfiques des modulateurs testés sur la douleur neuropathique diabétique.
Bénéfices attendus
Si l’administration des agents pharmacologiques permet de soulager les symptômes douloureux et les co-morbidités associées, alors on peut espérer i) soit le repositionnement de certains de ces agents déjà introduits dans des essais cliniques pour une autre indication (troubles cognitifs associés à la maladie d’Alzheimer), ii) soit le développement de nouveaux agents. Au vu du nombre croissant de patients atteints de diabète dans le monde, de la sévérité des douleurs neuropathiques, de l'efficacité très limitée et des nombreux effets indésirables des traitements disponibles, le développement de thérapeutiques médicamenteuses efficaces dans le traitement des douleurs neuropathiques est fortement attendu.
Procédures
Les animaux vigiles sont soumis à des tests comportementaux de sensibilité 21 jours après l'induction du diabète puis, après l'administration de l'agent pharmacologique ou du véhicule, 1 fois toutes les 30 min pendant 3 h maximum (au total entre 5 et 7 mesures). Le test de cognition est réalisé une seule fois, 21 jours après l'induction du diabète, il dure 10 minutes. Les animaux rentrant dans deux procédures ne subissent qu'un seul test de sensibilité et le test cognitif. Entre leur arrivée et leur mise à mort, les animaux subissent: entre 9 et 11 injections. La durée totale de chaque injection (qui comprend l'immobilisation du rat dans la main de l'opérateur et l'injection) est de 10 secondes. Pour mesurer la glycémie, une goutte de sang est recueillie par piqûre de l'extremité de la queue du rat, une ou deux fois pendant toute la durée de l'étude (piqûres espacées de 7 jours). La piqûre et le recueil de la goutte de sang durent 5 secondes.
Impact sur les animaux
Chez les rats diabétiques, un arrêt de la croissance pondérale (sans perte de poids par rapport au poids initial), une polydypsie (sévère), une polyurie (sévère), une perte de la masse musculaire (modérée), une apparition d’une allodynie et/ou d'une hyperalgésie (sévère) persistant pendant toute la durée de l’étude sont attendus. Injections réalisées sur animal vigile : stress (modéré) lié à l’immobilisation du rat dans la main de l’opérateur et douleur (légère) liée à la piqure. Tests comportementaux réalisés sur animal vigile : stress (modéré) dû au changement de salle (salle de stabulation vers salle d’expérimentation). Stress (modéré) lors des tests de sensibilité dû à l’immobilisation du rat entre les mains de l’opérateur (durée 15 sec). Aucun effet indésirable majeur n’est attendu après administration des agents pharmacologiques.
Devenir
Mise à mort en raison de l'état douloureux chronique de l'animal.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole : ces études, menées chez l’animal vigile, sont nécessaires pour appréhender des mécanismes intégrés et pour évaluer la pertinence de traitements antalgiques potentiels sur la douleur et les co-morbidités associées. Le modèle de diabète induit chimiquement fait référence dans la communauté scientifique. Sa répétition est nécessaire afin d’évaluer l’effet de nouveaux composés pharmacologiques sur les symptômes douloureux de la neuropathie et les co-morbidités cognitives associées.
Réduction
n= 8 rats/condition (traitement); la taille de l’échantillon a été définie selon la variabilité (10%) des paramètres étudiés (hyperalgie, allodynie ; troubles cognitifs) grâce à une approche statistique. Les rats diabétiques ayant reçu le véhicule lors du test de stimulation thermique seront introduits dans le test de cognition. Ainsi, 160 rats (80 mâles et 80 femelles) seront concernés sans pour autant augmenter la durée de vie de l'animal. Les rats ne développant pas d'hyperglycémie sont systématiquement réinjectés 7 jours plus tard avec la même dose de l'agent inducteur. S'ils demeurent résistants alors ils seront écartés de l'étude pharmacologique. Ceci permet de limiter à 10% la proportion de rats non diabétiques.
Raffinement
Le protocole mettant en jeu un modèle de douleur chronique, une attention particulière est portée aux animaux, aux conditions de stabulation et aux soins post-induction du diabète. Les rats sont observés tous les jours et évalués à l’aide d'une grille de score spécifique au modèle; des points limites adaptés au modèle et un arbre décisionnel sont mis en place , pouvant conduire à la mise à mort de l'animal (très rare < 2%). En raison de polydipsie et de polyphagie développées après l'induction du diabète, les personnels veillent à ce qu’il y ait un apport en eau suffisant et permanent (2 biberons de capacité double/cage) ainsi qu’en granulés dans la mangeoire. Les rats diabétiques sont stabulés à raison de 3 rats/cage maximum, le milieu des cages est enrichi par des tunnels en matière plastique, des morceaux de bois à ronger, du coton pour construire un nid et les litières sont partiellement changées quotidiennement en enlevant une partie de la sciure souillée et en apportant de la sciure fraiche afin de conserver l'environnement olfactif du rat.
Choix des espèces
Le choix du rat est justifié par i) sa pertinence physiologique (nombreuses similarités structurelles et fonctionnelles de son système nerveux avec l’humain) pour permettre des extrapolations ; ii) la richesse de ses comportements facilement observables et mesurables, reproductibles, pour l’étude des fonctions cognitives et de la douleur ; iii) sa facilité de manipulation et sa docilité, iv) son cycle de vie court (permettant d’étudier en quelques semaines les effets d’une pathologie chronique qui évolue sur plusieurs mois chez l’homme) ; v) la possibilité de développer des modèles de maladies humaines, dont le diabète de type 1, permettant de tester de nouvelles thérapies potentielles avant de passer aux essais cliniques chez l’humain. Rats jeunes adultes (âgés de 7-8 semaines): des jeunes adultes sont préférés car le taux de létalité est plus bas (3 % chez les 6-11 semaines et 220-400 g) que chez des rats plus âgés (83 % chez les rats de 12-17 semaines).
Prélèvement de tissus pour la caractérisation d’animaux génétiquement altérés utilisé dans pathophysiologie de l’épilepsie, de la migraine et de l’autisme
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
Gardées vivantes après l'unique procédure, les souris de ce projet voient leur sort dépendre du résultat du génotypage et de leur sexe : utilisation dans un autre projet autorisé, maintien de la lignée, ou mise à mort avec ou sans prélèvement. 2 500 souris vont être utilisées dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Sur chacune, entre 13 et 28 jours de vie, deux millimètres de l'extrémité de la queue sont coupés sur animal vigile sous contention, geste que le porteur situe à un âge où la zone est peu ossifiée et peu vascularisée, avec un risque de saignement et, rarement, de rejet par la mère. Le bénéfice avancé se limite à la gestion de l'élevage, en sélectionnant les animaux porteurs du gène recherché, et le chiffre de 2 500 individus est annoncé sans être ventilé entre les lignées concernées.
Objectifs
Les animaux génétiquement modifiés constituent des modèles puissants pour étudier la fonction des gènes et comprendre leur rôle dans le cadre de projets scientifiques au bénéfice de la santé humaine et animale ou de l’environnement. Dans le cadre des projets scientifiques utilisant des animaux des modèles animaux génétiquement modifiés sont développés et élevés. Dans ce but, il est important d’avoir un élevage adapté et des animaux dont les caractéristiques génétiques sont bien déterminées pour constituer les lots expérimentaux et maintenir une production régulière et adaptée aux besoins. Pour ce faire, il est nécessaire de caractériser les animaux génétiquement modifiés afin de sélectionner les animaux d’intérêt pour les projets et pour le maintien des lignées. Il n’est cependant pas toujours possible de réaliser des prélèvements de tissus selon des méthodes non invasive. L’objectif de ce projet est de présenter la méthode de prélèvement utilisée pour le génotypage des lignées utilisées.
Bénéfices attendus
Ce projet permets de selectionner les animaux ayant un gène d'intéret afin d'optimiser la gestion de l'élevage.
Procédures
Prélèvement de 2mm de l’extrémité de la queue (durée maximale 5 secondes) réalisé une seule fois sur chaque animal vigile sous contention.
Impact sur les animaux
Les nuisances engendrées sont le stress léger inhérent à la préhension et à la contention des animaux, la douleur légère lors du prélèvement sur la queue. Un saignement peut aussi apparaître et dans de très rares cas un rejet par la mère.
Devenir
Tous les animaux sont gardés en vie à l'issue de cette unique procédure. Leur devenir dépendra du résultat du génotypage et/ou de leur sexe parmi les cas suivants : a) Utilisé dans une procédure expérimentale d’un projet autorisé, b) Utilisé pour le maintien de la lignée, c) Mis à mort avec ou sans prélèvements post mortem.
Remplacement
A ce jour, les techniques de prélèvements de tissus non invasives que nous avons testées n'ont pas données des résultats exploitables. Ce projet est nécessaire pour la production et la mise à disposition d’animaux modèles génétiquement modifiés pour les différents projets de l'équipe.
Réduction
L’enjeux et l’objectif majeur de la réduction consiste ici à optimiser les élevages pour limiter la production du nombre d’animaux au stricte nécessaire à leur utilisation dans les projets scientifiques ou pour le maintien des lignées. Dans cette perspective plusieurs stratégies sont mises en œuvre : - seules les lignées en cours d’utilisation dans des projets sont maintenues, les autres sont conservées congelées, - les lignées génétiquement modifiées sont maintenues sur des fonds génétiques homogènes de référence, - les schémas d’accouplement sont adaptés pour limiter au maximum la génération d’animaux au génotype non pertinent ou la nécessité d’avoir à génotyper et donc d’avoir à effectuer des prélèvements sur les animaux (utilisation de parents homozygotes, si phénotype non dommageable) - des réunions mensuelles avec les utilisateurs permettent d'anticiper les besoins à venir.
Raffinement
La méthodes utilisée est éprouvée, précise, rapide et standardisée permettant de minimiser les nuisances causées aux animaux par leur manipulation et par le prélèvement lui-même. Une liste de points limites et d'actions correctives est utilisée.
Choix des espèces
La souris est un mammifère qui présente de nombreuses similitudes biologiques, structurales et fonctionnelles avec l’être humain qui permettent d’adresser de nombreuses questions scientifiques dans tous les domaines de la recherche en biologie (fondamentale, environnementale, santé humaine et animale), avec un degré élevé d’extrapolation à d’autres espèce (dont l’être humain) ou systèmes biologiques. De nombreux outils moléculaires et génétiques ont été développés avec les rongeurs, et en particulier chez la souris, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes de nombreuses pathologies (tels que l'épilepsie, l'autisme, ...). Les prélèvements seront réalisés entre 13 et 28 jours après la naissance, à des âges auxquels la zone est peu ossifiée et peu vascularisée, ce qui rend le prélèvement réalisable sans anesthésie car peu douleureux avec des risques hémoragiques extrêmement réduits.
Evaluation de la toxicité chez la souris de nouvelles capsules lipidiques pour le développement de médicaments
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
88 souris vont être utilisées, dont 80 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour un prélèvement sanguin terminal et le prélèvement d'organes. Elles reçoivent sous anesthésie une injection de nouvelles capsules lipidiques destinées à transporter des acides nucléiques, et le porteur indique qu'une toxicité d'intensité sévère peut apparaître dans les minutes qui suivent, puis d'intensité modérée pendant les vingt-quatre premières heures, avec des effets sur le comportement, l'alimentation, la mobilité et l'apparence. L'intérêt annoncé tient à la fabrication de ces composés à partir de déchets de l'industrie, donc à leur faible coût et à leur disponibilité à grande échelle. Le porteur décrit une phase in vitro de sélection des composés, affirme ensuite que ces essais ne permettent pas d'appréhender la complexité physiologique d'un être vivant, et rattache l'effectif de 88 souris aux conditions de réalisation des tests réglementaires de toxicité.
Objectifs
La recherche et le développement de nouvelles capsules pour la délivrance de médicaments est devenu un axe de recherche majeur depuis l'apparition récente des vaccins à ARN messager contre la COVID19. L'utilisation de molécules de type lipide s'est mise en place afin de proposer de nouvelles approches. Le rôle de ces molécules est de servir de transporteurs dans le domaine de la cancérologie ou la vaccination. Si les molécules formées permettent d'encapsuler des petites protéines et les acides nucléiques (ADN, ARN), leur efficacité reste insuffisante pour plusieurs applications médicales. Le projet consiste à développer une nouvelle génération de transporteurs ayant une meilleure stabilité, rigidité et également la possibilité de cibler spécifiquement certains organes.
Bénéfices attendus
L'intérêt de ce projet est de pouvoir évaluer une potentielle toxicité de nouvelles molécules permettant le transport des acides nucléiques. Si ces nouvelles molécules ne présentent pas de toxicité, elles auraient un intérêt pour le développement de vaccins à ARN messager ou bien pour le transport de petites protéines. De plus, ces nouveaux composés synthétisés sont issus de déchets de l'industrie ce qui pourrait permettre une disponibilité à grande échelle avec un coût très faible.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés/analgésiés deux fois pour réaliser l'injection des molécules durant une dizaine de minutes et lors du prélèvement de sang terminal avant la mise à mort.
Impact sur les animaux
Un stress léger de quelques secondes pourra être induit lors du déplacement de l'animal de sa cage pour le mettre dans la cage sous la lumière chauffante puis dans la boite d'induction de l'anesthésie. Une douleur légère pourra être induite lors de l'injection pour l'administration du composé testé ainsi que pour l'administration de l'anesthésie/analgésie, cette douleur sera d'une durée maximale de 30 secondes. Une toxicité pourrait être induite suite à l'injection du composé avec une possibilité d'intensité sévère sur une période de plusieurs minutes. Si une toxicité apparait cela peut affecter l'animal de plusieurs manières que ce soit au niveau du comportement, de l'alimentation, la mobilité dans la cage et son apparence. Cette toxicité est d'une intensité modérée sur les premières 24h de la procédure.
Devenir
À l'issue de la procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir faire un prélèvement sanguin d'un volume important. Ce prélèvement de sang permettra de réaliser des analyses de sang. De plus, certains organes seront prélevés afin d'évaluer la toxicité au niveau de ces derniers.
Remplacement
Des études in vitro, sur des cellules en culture, seront menés en amont du projet. L'objectif de ces études est de déterminer le meilleur rapport entre l'agent de transfection et l'ARN et d'évaluer ensuite la toxicité et l'efficacité de transfection. Cette première série de tests va permettre de réduire le nombre de composés à tester. Le choix est fait selon le composé ayant obtenu le plus fort signal avec la plus faible toxicité. Cependant, ces études in vitro ne permettent d'appréhender toute la complexité physiologique d'un être vivant, c'est pourquoi il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal également.
Réduction
Le nombre d'animaux est réduit au minimum pour réaliser cette étude. Cela correspond à 88 animaux répartis en 11 lots de 8 souris. Ce nombre d'animaux est le minimum pour réaliser des tests statistiques. Chaque lot correspond à un type de composé ou au contrôle. Bien qu'il s'agit d'un projet justifié d'un point de vue scientifique, le nombre d'animaux a été déterminé sur la base d'une directive européenne qui définit les conditions de réalisation des tests de toxicités réglementaires.
Raffinement
Lors de la phase d'acclimatation, l'expérimentateur restera auprès des animaux afin que ces derniers puissent s'habituer à l'odeur et à leur pesée pour diminuer le stress lors de la procédure. L'injection des composés se fera sous anesthésie à 37°C. Les animaux seront surveillés tout le long de la procédure mais une vigilance accrue sera réalisée durant la première heure post-injection en suivant les critères définis dans notre grille de score. Si un ou des points limites apparaissent des mesures retenues comme la mise en place d'analgésie seront appliquées.
Choix des espèces
Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris. Il s'agit d'une espèce utilisée antérieurement au sein du laboratoire pour ce type de procédure. Les animaux seront utilisés à des stades entre 6 et 12 semaines. Cela correspond au stade jeune adulte pour ces animaux. Il s'agit de la tranche préconisée dans la directive 417 de l'OCDE.
Utilisation de l’imagerie à particules magnétiques pour l’imagerie moléculaire de l’inflammation digestive chez la souris
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
Perte de poids au-delà d'un seuil, score de douleur trop élevé, animal horripilé et recroquevillé, respiration abdominale : la liste des motifs de mise à mort anticipée occupe l'essentiel de la rubrique consacrée au raffinement. 346 souris vont être utilisées, dont 316 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue. Une injection unique sous anesthésie profonde déclenche une colite, avec diarrhée, saignements rectaux, perte de poids et un inconfort qui peut durer plusieurs jours, avant la pose d'un cathéter et une trentaine de minutes d'imagerie par particules magnétiques. Le porteur présente cette imagerie comme une alternative à l'endoscopie, qu'il décrit chez les patients comme longue, coûteuse et inconfortable, quand la mise au point de cette alternative passe par 316 souris en souffrance sévère.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de démontrer la faisabilité d'une imagerie de l'inflammation muqueuse digestive par une technique non invasive, quantitative et d'approche "corps entier". L'imagerie moléculaire de l'inflammation est un domaine de recherche prometteur, avec un potentiel certain de translation à l'homme. Le développement d'une stratégie d'imagerie non invasive de l'inflammation digestive en utilisant des particules magnétiques dirigées spécifiquement contre une molécule exprimée à la surface des vaisseaux sanguins digestifs (appelée MAdCAM-1), qui est surexprimée en cas d'inflammation digestive, apparaît particulièrement prometteur. La faisabilité d'une telle approche a déjà pu être démontrée par IRM. Cette approche permettait davantage de précision qu'une approche d'imagerie traditionnelle. Néanmoins, cette approche utilisait l'IRM qui est une technique ciblée sur une zone d'intérêt, au contraire de l'IPM (une nouvelle modalité d'imagerie) qui permet quant à elle l'obtention d'un signal "corps entier". L'utilisation de l'IPM apparaît donc pertinent. Il est souhaitable donc de valider cette approche d'imagerie moléculaire de l'inflammation en utilisant des particules couplées à un anticorps dirigé spécifiquement contre MAdCAM-1 dans des modèles précliniques d'inflammation muqueuse digestive en utilisant une imagerie "corps entier".
Bénéfices attendus
Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI) sont un problème de santé publique majeur puisqu'il s'agit actuellement des secondes pathologies inflammatoires les plus représentées au niveau mondial, avec un nombre de patients atteints en augmentation. Actuellement, la technique de référence pour le diagnostic et le suivi de ces pathologies est représentée par l'endoscopie avec prélèvement tissulaire pour analyse de la muqueuse digestive. Cette procédure diagnostique est relativement longue, coûteuse, inconfortable et invasive, pouvant engendrer des complications sévères comme des perforations digestives. De plus, l'analyse tissulaire comprend de nombreuses limites puisqu'elle ne permet pas une analyse complète du tractus digestif et n'offre donc qu'une vision partielle de l'organe étudié, avec un risque de faux négatif tant pour le diagnostic que pour le suivi thérapeutique. Il existe donc aujourd'hui un besoin de développer une technique non invasive, sensible et spécifique, permettant le diagnostic et le suivi des MICI. Cette étude permettra de démontrer la possibilité d'utiliser l'imagerie moléculaire couplée à une technique d'imagerie novatrice, quantitative, corps entier et non invasive.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : induction d'une colite inflammatoire par une injection unique d'un produit induisant l'inflammation sous anesthésie profonde (durée environ 10 minutes) ; pesées quotidiennes (durée inférieure à 5 minutes) ; pose d'un cathéter pour l'administration de l'agent de contraste sous anesthésie profonde (durée environ 15 minutes) ; réalisation d'examen d'imagerie avec injection d'agent de contraste (durée environ 30 minutes)
Impact sur les animaux
Les modèles de colite utilisés sont susceptibles d'occasionner des effets indésirables chez les animaux. Compte-tenu de notre expérience dans l'utilisation de ces modèles et des données de la littérature, le modèle de colite est susceptible de produire une diarrhée et des rectorragies. Il est susceptible d'entraîner une perte de poids chez les animaux, un inconfort physique et une souffrance de durée possiblement prolongée (quelques jours).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer.
Remplacement
Des tests in vitro ont été réalisés pour évaluer la capacité de l'agent de contraste à cibler efficacement MAdCAM-1 sur des cultures de cellules vasculaires mises en conditions inflammatoires. Néanmoins, il reste nécessaire d'étudier l'affinité de l'agent de contraste pour sa cible moléculaire à l'échelle de l'organisme, d'étudier le rapport signal/bruit à l'échelle de l'organisme, de comparer les données obtenues avec celles d'une imagerie sans produit de contraste spécifique. Les procédures expérimentales sont donc nécessaires afin de pouvoir valider la faisabilité de notre approche à l'échelle d'un organisme complexe, avant de pouvoir envisager une translation à l'homme. D'autres méthodologies expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux ne permettraient pas l'obtention du même niveau d'information.
Réduction
Le nombre d'animaux à utiliser dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures et d'un test statistique de nombre de sujets nécessaires.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d'un temps d'acclimation d'une semaine afin de permettre une réduction du stress. Les animaux seront hébergés par groupe de 5 afin de conserver les interactions sociales. Le milieu sera enrichi par l'utilisation de matériel type boîte à oeufs, tunnel PVC ou igloo PVC, et coton. Dès l'initiation de la procédure, le suivi des animaux sera assuré deux fois par jour afin de rechercher l'apparition de signes de souffrance et de les prendre en charge. La douleur sera évaluée par utilisation d'une échelle validée. Les animaux seront pesés quotidiennement. Les animaux des groupes interventionnels bénéficieront d'une coupelle de croquettes humidifiées pour permettre une hydratation et une alimentation facilitée. Tous les animaux bénéficieront d'eau et de nourriture sans limite. Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de ne pas laisser une éventuelle souffrance méconnue perdurer. Les animaux seront mis à mort en cas de : perte de poids supérieure au seuil défini ; score moyen de douleur supérieur au seuil défini ; l'animal est horripilé et recroquevillé ; l'animal est agité et/ou non alerte ; l'animal présente une respiration abdominale ; la provocation de l'applicateur n'entraîne pas ou peu de changement comportemental ; pendant la pose du cathéter, l'injection des particules ou la perfusion intracardiaque, un problème d'anesthésie survient, l'animal présente des saignement abondant, ou un arrêt respiratoire. Durant les différentes procédures expérimentales, les animaux bénéficieront d'antalgie adaptée, d'anesthésie générale, d'anesthésie locale avant les incisions. Les animaux montrant des signes de souffrance sans atteinte des points limites pourront bénéficier d'une antalgie supplémentaire.
Choix des espèces
La souris est l'espèce animale qui a le plus été étudiée dans le domaine des pathologies inflammatoires chronique de l'intestin. L'anatomie et la physiologie sont, dans ces pathologies, globalement transposables à l'homme. L'ensemble des connaissances acquises au laboratoire et dans la littérature rendent cette espèce particulièrement intéressante pour l'étude des maladies inflammatoires de l'intestin. Nous utiliserons des souris adultes (6-12 semaines) en rapport avec l'âge des animaux utilisés dans les études précédentes et en concordance avec le fait que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin représentent des maladies de l'adulte jeune chez l'espèce humaine. Le modèle de colite est de plus particulièrement pertinent et bien décrit chez des souris entre 6 et 12 semaines.
Mise au point de virus adéno-associés ciblant les cellules souches du muscle squelettique à des fins de thérapie génique
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
Chaque rat reçoit une injection dans le muscle sous anesthésie, puis deux jours d'analgésie, avant d'être tué pour des prélèvements histologiques et moléculaires. 480 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. L'objectif est de tester des séquences d'ADN censées limiter l'expression d'un gène thérapeutique aux seules cellules souches du muscle, en vue de thérapies géniques contre les myopathies. Le porteur indique utiliser à la fois des rats sauvages et des rats porteurs d'une mutation du gène Dmd, qui reproduit la dystrophie de Duchenne, sans dire combien d'individus relèvent de chaque groupe, et précise que ces rats seront tués vers l'âge de deux mois, avant l'apparition des atteintes les plus marquées.
Objectifs
Les cellules souches du muscle squelettique (aussi appelées cellules satellites) sont essentielles dans le processus de la régénération musculaire, et pourraient être la population cellulaire clé pour les thérapies géniques pour lutter contre des myopathies. Par contre, ces cellules sont entourées par plusieurs autres types de cellules. Les thérapies géniques pour certaines maladies musculaires pourraient être améliorées en utilisant des vecteurs de gènes ciblant spécifiquement ces cellules souches, et en évitant ainsi l’expression des gènes apportés (transgènes) dans d’autres populations cellulaires, qui pourraient déclencher des réponses immunitaires. Nous allons utiliser des virus adéno-associé (AAV) pour tester des séquences régulatrices de gènes seulement exprimés dans les cellules satellites, afin de créer des vecteurs qui peuvent cibler les cellules souches du muscle squelettique. Des rats sauvages ou avec une dystrophie musculaire provoquée par mutation du gène Dmd, responsable de la production de la dystrophine, seront injectés par voie intramusculaire avec les AAVs. Le ciblage des cellules souches sera examiné par analyse en immunofluorescence sur coupe histologique et cytométrie en flux.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier des séquences d’ADN qui permettent une expression spécifique des transgènes dans les cellules souches du muscle squelettique. De telles séquences ne sont pas connues à ce jour, donc cette identification représentera une avancée importante dans notre connaissance du ciblage et de la régulation génique dans les cellules souches. Du point de vue clinique, ces séquences seraient essentielles pour des thérapies géniques ciblées pour les cellules souches, pour éviter des effets non-ciblés et des réponses immunitaires.
Procédures
Dans ce projet, les animaux recevront une injection intramusculaire sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Nous attendons une douleur légère liée avec l’injection intramusculaire, qui sera traitée avec des analgésiques pendant deux jours suivant l’injection. Les rats DMD ne présentent pas des effets délétères majeurs du phénotype avant l’âge de 10 mois, et dans ce projet, ils seraient mises à mort à l’âge de 1,5-2 mois.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les prélèvements nécessaires aux analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
Nous réalisons des cultures de myoblastes en première intention pour tester nos séquences d’intérêt. Malheureusement, ces cultures restent loin de la situation in vivo puisque les vraies cellules souches du muscle sont quiescentes chez l’adulte, se divisant rarement, ce qui rend impossible la mise au point d'un système d'étude représentatif in vitro. De plus, nos expériences antérieures ont montré que certaines séquences prometteuses en culture n’avaient pas toujours une activité spécifique in vivo. Compte tenu de ces contraintes, il reste nécessaire de valider les séquences selectionnées dans un modèle animal.
Réduction
Le calcul de puissance statistique nous recommande d’utiliser 8 rats par AAV et point de temps. Ce nombre a été validé avec d’autres projets similaires terminés pour lesquels nous avons pu conclure de façon significative.
Raffinement
Les animaux sont stabulés en portoirs à cages ventilées, dans des pièces dont la température et l’hygrométrie sont contrôlées, monitorées et fidèles à la règlementation. Pour le bien-être des rats, nous avons fait le choix des plus grandes cages disponibles sur le marché, de sorte qu’ils peuvent marcher, courir et se dresser sur leurs pattes arrière. Cet exercice spontané quotidien est pleinement justifié pour des rats dont nous évaluons les capacités locomotrices. Les animaux ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères, à l’âge d’un mois. L’isolement n’existe jamais et le milieu est enrichi avec des lanières de papier Kraft, des bâtons de bois à ronger, des balles rondes, des tunnels ou des carrés de coton compacté. Pour éviter une réponse de stress induite par les divers tests, les animaux seront habitués dès leur plus jeune âge à être manipulés régulièrement, le plus en douceur possible. Le suivi des animaux sera conduit par un personnel par ailleurs compétent pour reconnaître, quantifier, atténuer ou supprimer les signes de douleur ressentie chez les animaux. Une grille d’évaluation critériée de la douleur et des points limites pour cette lignée a été établie. Les rats seront constamment évalués en observant individuellement les animaux, week-ends et jours fériés inclus. Toute atteinte des points limites sera suivi d’une action correctrice précisée sur la grille. En cas d’absence de bénéfice (trouble irréversible), nous procéderons à la mise à mort compassionnelle de l’animal avant qu’il ne souffre.
Choix des espèces
Nous avons choisi le rat pour des raisons multiples. D’abord, nous utilisons un modèle de la dystrophie musculaire de Duchenne dans le rat, qui récapitule le phénotype humain. Le rat est aussi un mammifère, et beaucoup des séquences d’ADN que nous allons mettre dans les AAVs sont conservées chez l’humain. Donc si une séquence a une activité forte dans des cellules de rat, il est probable que cette activité sera maintenue dans les cellules humaines. Pour les rats utilisés en procédure 1, les AAVs seront injectés à 4 semaines d’âge, quand le muscle se forme toujours, parce que les cellules souches du muscle sont plus accessibles au virus à ce stade.
Etudier les mécanismes de résistance à la chimiothérapie dans les leucémies aiguës myéloïdes
- Recherche appliquée
- Cancers
5 212 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules leucémiques après un pré-conditionnement, elles reçoivent trois injections de chimiothérapie puis des composés pharmacologiques, et subissent des prélèvements de sang et de moelle osseuse sous anesthésie générale. Le porteur indique que l'injection de lignées cellulaires provoque un développement rapide de la maladie conduisant à la mort de l'animal, avec amaigrissement, paralysie et prostration, alors que la gravité déclarée pour l'ensemble du projet reste modérée. Il conclut que les modèles in vivo sont "indispensables" pour étudier la résistance aux chimiothérapies, tout en annonçant des modèles de moelle osseuse in vitro censés réduire "à terme" le recours aux souris.
Objectifs
Les leucémies sont les cancers du sang et de la moelle osseuse les plus courants chez l’adulte, mais leur pronostic reste défavorable malgré des taux initiaux élevés de rémission. Cela s’explique par la rechute fréquente due à la survie de cellules résistantes au traitement. Ce projet vise à élucider et exploiter les mécanismes sous-jacents à la résistance des cellules leucémiques pour surmonter les limitations des traitements actuels. Les expériences sont menées sur des modèles murins greffés avec des cellules leucémiques et soumis à des protocoles de chimiothérapie. Notre objectif est d’identifier les mécanismes de résistance des cellules leucémiques et de proposer à terme de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter plus efficacement ces pathologies.
Bénéfices attendus
Le projet pourrait offrir des bénéfices significatifs en termes de compréhension et de traitement des leucémies. Sur le plan scientifique, il permettra de décrypter les mécanismes moléculaires régissant la résistance aux traitements. D’un point de vue clinique, ces découvertes pourraient conduire au développement de stratégies thérapeutiques visant à améliorer les réponses aux chimiothérapies intensives, réduisant ainsi les risques de rechute. Enfin, sur le plan sociétal, ces avancées pourraient améliorer à terme les taux de survie et la qualité de vie des patients atteints de leucémie.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Injections : - Pré-conditionnement des animaux : une injection par animal, 24h avant injection des cellules. Durée : quelques secondes. Sur animaux vigiles. - Traitements par chimiothérapie : 3 injections Jours 1/3/5, durée : environ 1 minute. Sur animaux vigiles. - Composés pharmacologiques testés : leur fréquence d’administration sera déterminée selon la littérature , en respectant scrupuleusement les recommandations des volumes limites. Ce sont des procédures qui durent de quelques secondes à 1 minute. - Injection des cellules leucémiques : injection des cellules. Cette manipulation dure de quelques secondes à une minute. Sur animaux vigiles. Prélèvements : - Prélèvements sanguins. Cette procédure est réalisée alors que les souris sont anesthésiées. Durée : environ 1 minute. Le premier prélèvement sera effectué 8 semaines après injection des cellules, et ensuite toutes les 4 semaines si besoin. - Prélèvements de moelle osseuse (les prélèvements sont réalisés après anesthésie générale de la souris).
Impact sur les animaux
Les expériences utilisant des cellules de patients (ou dérivés) n’engendrent pas d’effets secondaires visibles sur les animaux. Les traitements par chimiothérapie ont été optimisés dans notre laboratoire, de manière à ne pas avoir d’effets toxiques visibles sur les animaux (pas de perte de poids, ni de modification du comportement, ni de mortalité). Par contre, l’utilisation de lignées cellulaires de leucémie injectées à des souris entraîne un développement rapide de la maladie qui conduit à la mort de l’animal. Les effets indésirables prévus sur les animaux incluent une détérioration rapide de l'état général des souris, en particulier lors de l'injection de lignées cellulaires, qui peuvent entraîner des effets notables sur le comportement et la santé des animaux. Aussi, dans le cadre des expériences utilisant ces cellules, les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de la zootechnie et les expérimentateurs. Ces observations quotidiennes porteront sur des indicateurs précis : amaigrissement, paralysie, perte d’activité, prostration, deshydratation). Si un animal atteint un certain score de détérioration, l’expérience sera stoppée pour cet animal.
Devenir
Tous les animaux des procédures sont euthanasiés à la fin des expériences.
Remplacement
Pour respecter la règle des 3R, il est important de chercher à remplacer l’expérimentation animale. Cependant, afin d’étudier la résistance aux traitements dans les leucémies, des études sur des modèles animaux sont indispensables. Les modèles in vitro, bien qu’utiles pour une première compréhension des mécanismes, ne reproduisent pas fidèlement les interactions complexes entre la tumeur et son microenvironnement ni son évolution dans un organisme vivant. Par exemple, nous avons observé une absence de corrélation entre les réponses in vitro et in vivo à la chimiothérapie utilisée dans les leucémies, ce qui souligne l’importance des études in vivo. Ces dernières sont essentielles pour valider nos résultats et envisager leur application clinique chez l’homme. Néanmoins, afin de réduire l’utilisation d’anmiaux dans le futur, notre laboratoire est engagé dans le développement de modèles de moelle osseuse in vitro. Nous espérons que ceci nous permettra à terme de réduire à terme notre utilisation d’animaux en vue de les remplacer au moins partiellement par ces modèles in vitro.
Réduction
Les effectifs des cohortes seront définis à l'aide d'un logiciel de simulation, en s'appuyant sur des études précédentes et en utilisant des tests statistiques visant à optimiser et réduire le nombre d'animaux et d'échantillons nécessaires.
Raffinement
L'expérimentation inclut un suivi adapté du bien-être des animaux, tenant compte du modèle et des éventuels effets indésirables. Les animaux seront observés quotidiennement, et leur environnement enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer leur confort. Les protocoles viseront à minimiser le stress et la douleur en optimisant les injections et la durée des traitements. Les études précédentes ont aidé à mieux définir les points limites, et la majorité des procédures ont déjà été approuvées par un comité d'éthique pour l'expérimentation animale. Les souris utilisées dans ce projet (NSG) étant des animaux hautement immunodéprimés, ils sont maintenus dans un hébergement au statut sanitaire strict. Les cages sont disposées sur des portoirs ventilés et toute personne pénétrant dans les hégerment doit porter des équipements de protection individuelle (masque chirurgical, charlotte, surchaussures, combinaison, gants).
Choix des espèces
Le modèle souris est essentiel pour comprendre la biologie des cancers. Dans cette étude, nous utilisons des souris immunodéficientes, qui sont les modèles murins les plus utilisés à ce jour pour réaliser des greffes de cellules humaines leucémiques. Le développement de la maladie est relativement fidèle à celui retrouvé chez les patients atteints de leucémie. Les animaux utilisés sont des animaux adultes, les leucémies aiguës myéloïdes étant des cancers affectant préférentiellement les sujets adultes.
Modèle expérimental de DMLA chez le rongeur
- Formation professionnelle
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 4600
Des tirs de laser sur la rétine sous anesthésie, ou une injection sous la rétine, provoquent une dégénérescence maculaire chez des souris et des rats, qui reçoivent ensuite jusqu'à huit gouttes oculaires par jour et des injections dans l'œil une à deux fois par semaine. 9 200 souris et rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le porteur affirme que le développement de cette maladie n'est pas douloureux, tout en annonçant une altération permanente de la vision de l'œil traité. 8 390 animaux sont tués pour les évaluations histologiques, et 810 réutilisés dans d'autres procédures, ceux-là étant les individus écartés du protocole après la détection d'une anomalie de l'œil avant le début de l'étude.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de mettre en place dans l’établissement utilisateur, un modèle expérimental de DMLA (dégénérescence maculaire liée à l’âge) chez les rongeurs, dans le but de tester des traitements potentiels. La DMLA est la première cause de mal voyance chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays industrialisés. Cette pathologie touche l'œil dans une zone particulière de la rétine : la macula, impliquée dans la vision fine et la vision centrale. La maladie est silencieuse pendant plusieurs années, puis la vision et la perception des détails baissent, des tâches sombres apparaissent au centre du champ de la vision. Elle existe sous plusieurs formes : la forme « humide » ou exsudative et la forme sèche (ou atrophie géographique). Dans la forme humide de la DMLA, plus grave qui évolue rapidement vers une perte importante de la vision centrale, de nouveaux vaisseaux sanguins poussent de façon anormale et endommagent la rétine. Les nouveaux vaisseaux sanguins poussent anormalement à partir de la choroïde (tissu situé sous la rétine), on utilise les termes de néovascularisation choroïdienne. La stratégie des traitements est de stopper la progression anarchique de ces vaisseaux délétères. La forme dite «sèche», ou atrophie géographique de la DMLA est la plus fréquente, elle évolue plus lentement que la forme humide mais il n’existe pas de traitement. Nous estimons pouvoir réaliser 7 études par an de test d’efficacité de molécules luttant contre la DMLA, comportant au maximum 6 groupes de 15 animaux (90 animaux maximum) en fonction des produits à tester, par an pendant 5 ans, chez le rat et la souris, il s’agit d’une prévision maximumselon nos capacités. Le nombre de groupe varie en fonction des produits à tester : soit 1 ou plusieurs doses d’une même molécule à comparer à l’effet d’un placébo, soit plusieurs traitements différents à comparer entre eux.
Bénéfices attendus
Ce projet contribuera au développement de médicaments luttant contre la DMLA et améliorant la vue des patients. La DMLA est la première cause de mal voyance chez les personnes de plus de 50 ans dans les pays industrialisés et la troisième cause dans le monde (1,5 millions de personnes en France, 196 millions dans le monde). Sa fréquence augmente avec l’âge et le nombre de patient augmentera compte tenu de l’allongement de l’espérance de vie.
Procédures
L’induction de la DMLA chez les rats et les souris se fait par des tirs de laser ophtalmiques sur la rétine sous anesthésie, ou par une injection sous la rétine. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives. Ces examens sont d’ailleurs réalisés chez l’homme en cabinet médical en ambulatoire sans anesthésie. Ces examens sont également régulièrement pratiqués sur l’animal en clinique vétérinaire dans le cadre des consultations. Pour notre projet, ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles (examens en lampe à fente) mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère. Ces examens sont rapides et ne dureront pas plus de quelques minutes. Les administrations de produits se feront soit par instillations (gouttes oculaires), soit par injection au niveau de l'œil (injection intravitréenne, sous conjonctivale), soit par voie sous cutanée, soit par voie intramusculaire ou intrapéritonéale. Ces instillations ou injections nécessitent le maintien de l’animal afin de l’immobiliser. Ces procédures sont extrêmement rapides et ne prendront pas plus d’1 ou 2 minutes. Les gouttes oculaires peuvent être administrées plusieurs fois avec généralement une moyenne de 3 administrations et un maximum de 6 à 8 administrations par jour. Les administrations de produit par injection au niveau de l'œil se feront sous anesthésie locale et générale si besoin, leurs fréquences sont plus limitées, une à deux fois par semaine. Ces procédures sont aussi un peu plus longues et nécessitent de placer l’animal sous un microscope chirurgical. Il faudra compter quelques minutes (en général 5 minutes par animal) pour réaliser de telles administrations. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif du traitement administré ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements se feront sur animal vigile et le temps nécessaire aux prélèvements ne dépassera pas les 5 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Le développement de la DMLA chez l’homme, et par transposition chez l’animal, n’est pas douloureux. Outre les nuisances dues aux manipulations de l'animal pour les observations, le stress dû aux contentions manuelles de l'animal pour les administrations de produits, les instillations ou la douleur éventuelle de la piqûre lors des injections de produits ou d'anesthésiant, la pathologie devrait entrainer une altération permanente de la vision sur l'œil ayant reçu l'injection. L'administration des produits devrait engendrer tout au plus une douleur légère et de courte durée notamment lors de l’anesthésie. Au cours de l’anesthésie jusqu’au réveil, une baisse de la température corporelle pouvant induire un stress est attendue, ce stress sera minimisé par l'utilisation de tapis, de lampe ou d'enceinte de réveil chauffants.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux qui auront suivi la totalité de la procédure expérimentale seront mis à mort pour permettre de réaliser les évaluations ex vivo (évaluations histologiques, dosage de produit...). Pour les études d’efficacité de traitement, les animaux n’ayant pas suivi la totalité de la procédure (estimé à environ 10%, hormis ceux exclus pour cause de points limites) pourront être réutilisés dans d’autres procédures expérimentales compatibles avec l’avis du vétérinaire. Ces animaux sont des animaux qui sont exclus de l'étude en raison d'un défaut anatomique ou physiologique détecté aux examens de baseline au niveau de l'œil avant le début de l’étude. Ces animaux n'auront pas reçu d'induction de la pathologie, ni d'administration de traitement, seulement des examens qui ne sont pas invalidants mais qui potentiellement nécessitent une anesthésie.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode alternative ne permet de mimer l’œil dans son environnement et dans sa globalité fonctionnelle. Les lignées cellulaires ou les systèmes alternatifs comme les organoïdes ne permettent d’étudier qu’une partie des mécanismes. En effet, l’œil est composé de différents tissus (vasculaires, rétinien neuronal, vitréen, cornéen, humeur aqueuse ...) de physiologie différente et soumis aux variations environnementales, aux interactions des tissus et organes voisins. Les études in vivo permettent d’observer les réponses physiologiques d’un traitement dans un organisme vivant en tenant compte des pharmaco cinétiques, des métabolites générés. Compte tenu de la complexité de l’organe nous aurons donc recourt à des animaux.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à l'aide des tests statistiques paramétriques ou non paramétriques suivant la distribution des données, avec possibilité d'effectuer des comparaisons multiples, chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif grâce à un test, sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. Des évaluations non invasives de la pathologie sont utilisées tout au long de l'étude pour éviter la mise à mort de l'animal.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les animaux seront hébergés en groupe, avec différents enrichissements adaptés à l'espèce. Les examens choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont non invasifs et semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet d'ophtalmologie ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Afin de réduire le stress de l'animal lors d'examens nécessitant l'immobilisation de l'animal, une administration d'anesthésique sera réalisée. Lors des anesthésies des substituts de larmes sont régulièrement instillés sur les cornées pour éviter le dessèchement, un dispositif est prévu pour éviter l’hypothermie (enceinte chauffante, coussin, ou lampe). Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris et des rats ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Le choix de l’espèce se fera en fonction des caractéristiques des produits à administrer. Les animaux seront de jeunes adultes à leur arrivée dans notre animalerie, âgés de minimum 5 semaines, conformément aux publications de référence qui servent de base à ce modèle. Ils entrent en étude après une période d’acclimatation d'un minimum de 5 jours.
Effets de probiotiques et de prébiotiques sur l’obésité à travers les modifications du microbiote intestinal chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Gavées chaque jour pendant 75 jours, soumises à quatorze prélèvements de fèces de vingt minutes chacun, puis à un test de tolérance au glucose de trois heures, 160 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le régime riche en graisses et en sucres qui leur est imposé doit provoquer l'obésité, avec une mobilité réduite et un risque de dermatites et d'ulcérations cutanées. Le porteur signale aussi un risque de lésion de l'œsophage lié au gavage quotidien, et annonce deux tests d'évaluation de l'anxiété de vingt minutes sans préciser lesquels. Toutes sont tuées à la fin du protocole pour prélever l'intestin, le foie et le cerveau, afin de mesurer l'effet de probiotiques et de prébiotiques sur le microbiote intestinal.
Objectifs
L'épidémie d'obésité qui sévit à travers le monde (15,7 % des Français sont considérés obèses) est liée à une augmentation de la prévalence des maladies métaboliques, telles que le diabète de type 2 et les maladies cardiovasculaires. Au cours des dernières décennies, la recherche s’est tournée vers l’analyse du microbiote intestinal et de nombreuses publications ont démontré un rôle important de la dysbiose microbienne dans le développement des maladies métaboliques et inflammatoires. 38 000 milliards de bactéries vivent dans le microbiote et interagissent avec l'hôte, ce qui équivaut à plus de 100 fois le nombre de cellules de l'organisme humain. D'après l'ISAPP, l'International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics : " Les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui, lorsqu'ils sont administrés en quantités adéquates, confèrent un bénéfice pour la santé de l'hôte". "Les prébiotiques sont des substrats qui sont utilisés sélectivement par les microorganismes de l'hôte, conférant un bénéfice pour la santé." Les prébiotiques et les probiotiques jouent des rôles complémentaires importants pour la santé intestinale. Il a été prouvé par plusieurs études que les probiotiques et les prébiotiques ont un rôle essentiel dans la gestion de l'obésité. Les probiotiques et les prébiotiques ont amélioré les niveaux de leptine et d'enzymes hépatiques liés à l'obésité. Les probiotiques et prébiotiques agissent en supprimant l'inflammation, en renforçant la barrière intestinale, en régulant l'activité des enzymes intestinales et la fonction neuroendocrine, affectant ainsi le stockage et la dépense énergétique. L'impact des modifications au niveau du microbiote peut agir directement sur l'axe intestin-cerveau. L'objectif de notre projet est de mettre en lumière l'importance de nouveaux probiotiques et des prébiotiques en tant que stratégie complémentaire pour traiter l'obésité, en agissant sur le microbiote intestinal, l'homéostasie intestinale ainsi que l'axe intestin-cerveau.
Bénéfices attendus
Pour évaluer l'efficacité des probiotiques ou des prébiotiques contre l'obésité en analysant les modulations du microbiote intestinal, il est impératif d'utiliser un modèle in vivo. Aucun modèle in vitro ne peut remplacer la richesse du microbiote intestinal. A travers ce modèle, on peut tirer plusieurs bénéfices tels que : 1-Trouver des prébiotiques et probiotiques capables de réduire l'obésité chez la souris. 2-Observer une diminution des biomarqueurs liés à l'obésité. 3-Mettre en évidence des changements bénéfiques dans la composition du microbiote intestinal, avec une augmentation de l'abondance relative des bactéries bénéfiques. 4- Etudier l'impact des traitements sur l'axe intestin-cerveau. Nous espérons ainsi démontrer l'efficacité des prébiotiques et ainsi que des probiotiques pour la perte de poids et la normalisation de certains paramètres métaboliques tout en décryptant les mécanismes potentiels par lesquels les probiotiques et prébiotiques peuvent influencer la composition corporelle et le métabolisme.
Procédures
Gavages quotidien pendant 75 jours, qui dure moins de 30 seconde par souris. Prises de feces 14 fois pendant le protocole qui dure 20 min par prise. Test de tolérance au glucose, réalisé une seule fois et qui dure 3h avec une seule injection d'insuline. Test de tolérance à réalisé une seule fois pendant le protocole, avec une seule injection d'insuline. Deux tests d'évalution de l'anxiété chaque test dure 20 minutes par souris.
Impact sur les animaux
1 Le stress causé par le gavage quotidien, ainsi que le risque d'endommager l'œsophage. 2 Lors des tests de tolérance au glucose et à l'insuline , les injections peuvent entraîner de la douleur et de l'inconfort. Il est possible que ces procédures provoquent de l'irritation péritonéale. 3 L'obésité est le résultat d'une prise de poids excessive causée par un régime riche en graisses et en sucres. Cela va provoquer : • Une diminution de la mobilité due à un excès de poids. L'excès de sébum accroît le risque de lésions cutanées telles que les dermatites et les ulcérations.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour réaliser les différentes analyses sur les organes tels que l'intestin, foie et cerveaux.
Remplacement
On a effectué une phase in vitro. L'impact des prébiotiques ainsi que de nouvelles souches potentiellement probiotiques a été testé in vitro. En analysant le spectre antimicrobien, la résistance aux enzymes, le pH et l'impact sur des cellules in vitro, on peut évaluer leurs effets anti-inflammatoires. En effectuant cette étape, on peut réduire le nombre de prébiotiques et de probiotiques utilisés pour la partie in vivo. Seuls les candidats ayant un impact sur la flore, une diminution de l'inflammation et une réduction de l'oxydation seront utilisés pour la partie in vivo. D’autre part, l'étude du microbiote intestinal nécessite obligatoirement l'utilisation d'un modèle animal puisqu'il est impossible de reproduire, in vivo , la structure écologique, constituée par des milliards de bactéries représentant 1000 espèces bactériennes majoritairement incultivables.
Réduction
Pour optimiser le nombre d'animaux nécessaires, on utilise les analyses statistiques standards. Il y aura que 8 animaux dans chaque groupe expérimental. Le nombre d’animaux a été optimisé via des méthodes statistiques standards. Dans le contexte de l'expérimentation animale, l'utilisation de tests statistiques appropriés peut contribuer à réduire le nombre d'animaux requis, tout en maintenant la validité scientifique de l'étude.
Raffinement
Amelioration de l'enrichissement par:. 1. Cylindres en plastiques : Ces cylindres offriront aux souris des possibilités supplémentaires d'exploration et de cachette, stimulant ainsi leur comportement naturel. 2. Bâtonnets à ronger : Ces bâtonnets permettront aux souris de satisfaire leur besoin naturel de ronger, contribuant à leur bien-être dentaire et comportemental. 3. Matériel de nidification supplémentaire : Nous fournirons des morceaux de coton supplémentaires pour permettre aux souris de construire des nids plus élaborés. Pour réduire le stress des animaux lors des manipulations, nous mettrons en place un protocole de pré-entraînement qui comprendra les étapes suivantes : 1. Habituation à la manipulation : Nous manipulerons doucement les souris pendant de courtes périodes (30 secondes à 1 minute) pendant la semaine précédant le début des procédures expérimentales. Cela permettra aux animaux de s'habituer au contact humain. 2. Simulation de procédures : Nous simulerons certaines procédures non invasives, comme le pesage ou le placement dans la cage de gavage, sans effectuer réellement ces procédures. Cela aidera les souris à se familiariser avec ces situations. 3. Exposition progressive aux équipements : Nous introduirons progressivement les équipements utilisés lors des procédures (comme les sondes de gavage) dans l'environnement des souris, sans les utiliser, pour réduire leur caractère anxiogène. Pour améliorer les conditions de vie des animaux en captivité et réduire les sources de stress, nous mettrons en place les mesures suivantes : 1. Surveillance documentée pendant les procédures expérimentales : • Mise en place de fiches de suivi individuelles pour chaque animal • Observation et enregistrement des signes spécifiques : • Poids • Présence de lésions cutanées • Comportement (isolement, posture inhabituelle, piloérection) • Consommation d'eau et de nourriture • Qualité du pelage • Mobilité 2. Protocole d'action en cas de détection de signes de détresse ou de malaise : • Consultation immédiate du vétérinaire responsable • Administration d'analgésiques si nécessaire • Ajustement des conditions d'hébergement (ex : isolation temporaire, enrichissement supplémentaire)
Choix des espèces
Les études sont réalisées sur des souris car il s’agit du modèle expérimental chez l’animal le plus utilisé et le mieux caractérisé pour l’étude des effets induits par l'obésité en modèle riche en gras et sucres. La souris est un modèle remarquable pour étudier l'obésité, les animaux qui développent une inflammation et une résistance à l'insuline. En outre, nous avons mis au point tous les outils et techniques nécessaires pour mener à bien cette étude lors de nos travaux antérieurs sur ce modèle Le début des traitements à 6 semaines coincide avec le début de maturation de la flore intestinale.