Rongeurs
Conséquences de la carence en vitamine D paternelle sur la descendance de souris.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
144 souris vont être utilisées, chacune subissant deux recueils de fèces, un gavage de glucose, une injection d'insuline, seize prises de sang, dix pesées, quatre jeûnes et 48 heures seule en cage calorimétrique. Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, après dix semaines d'un régime qui les rend obèses. La question posée est de savoir si une carence en vitamine D chez le père modifie le métabolisme de sa descendance, l'application annoncée étant d'émettre des recommandations nutritionnelles aux hommes en âge de procréer. Le porteur décrit une grille de points limites et un arbre décisionnel, puis ajoute qu'aucune analgésie n'est prévue pendant le protocole.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’impact de la carence en vitamine D chez la souris génitrice mâle, sur les trajectoires métaboliques de sa descendance. 9 animaux mâles et 9 femelles issues des géniteurs carencés ou non en vitamine D durant 5 ou 10 semaines seront soumis à un régime contrôle ou un régime obésogène durant 10 semaines. L'évolution pondérale des animaux sera mesurée. Des prélèvements de sang et de fèces seront réalisés ainsi que des tests de tolérance au glucose et à l'insuline. Enfin une mesure de la dépense énergétique sera réalisée par calorimétrie indirecte. Les animaux seront mis à mort afin de mesurer les niveaux d'expression de différents gènes en lien avec la vitamine D. De plus les mécanismes permettant d'expliquer le passage des effets de la carence paternelle à la descendance seront étudiés.
Bénéfices attendus
Les données obtenues dans le cadre de ce projet permettront de connaitre l’impact d’une déficience paternelle en vitamine D sur la descendance. Cela servira de base pour émettre des recommandations nutritionnelles aux hommes en âge de procréer.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux prélèvements de fèces nécessitant de les héberger individuellement pendant un maximum d'une heure, suivi d'une prise de sang à la queue sur animal vigile. A 7 semaines les animaux passeront en cage calorimétriques durant 48 heures pour mesurer leur dépense énergétique. Ce procédé nécessite d'héberger individuellement les animaux pendant 48 heures dans une cage dotée de capteurs permettant de suivre la position de la souris dans la cage, mesurer la nourriture consommée ainsi que les échanges gazeux au sein de la cage. Une fois à 8 semaines de régime les animaux seront soumis à un unique test de tolérance à l'insuline, cette procédure nécessite un hébergement individuel d'environ 2 heures. Durant cette période les animaux recevront une injection d'insuline suivie de 7 prises de sang à l'extrémité de la queue à l'aide d'un glucomètre portatif (durée de la procédure de prise de sang: 1 minute). A 9 semaines à un unique test de tolérance au glucose, ces procédures nécessitent un hébergement individuel d'environ 2 heures, durant ces périodes les animaux recevront un gavage de glucose (durée de la procédure de gavage: 1 minute) suivi de 7 prises de sang à l'extrémité de la queue à l'aide d'un glucomètre portatif (durée de la procédure de prise de sang: 1 minute). Les animaux seront manipulés quelques minutes chaque semaine lors des mesures de masse. De plus ils seront soumis à une alimentation les rendant obèses durant toute la durée du protocole. En regroupant les interventions. Les animaux subiront chacun : deux recueils de fèces, un gavage de glucose, une injection d'insuline, quatre hébergements individuels (dont trois de moins de deux heures et un de 48h), 16 prises de sang (dont 14 sont des très faibles quantités réalisées pour mesure de glycémie à l'aide d'un glucomètre), 10 pesées (réalisées hebdomadairement) et un régime obésogène.
Impact sur les animaux
Les animaux seront maintenus en hébergement individuel lors des recueils de fèces ce qui peut constituer une source de stress légère (nuisance de gravité légère, courte durée). Des prélèvements de sang seront réalisés à la veine caudale (une seule incision mais 7 ponctions, ce qui peut constituer une source de douleur légère et une source de stress modérée, nuisance de gravité modérée, courte durée). L'injection d'insuline intrapéritonéale peut constituer une source de stress et de douleur légère (nuisance de gravité légère, courte durée). Le gavage de glucose peut constituer une source de stress et éventuellement être une source de douleur légère (nuisance de gravité légère, courte durée). L'induction de l'anesthésie peut constituer une source de stress légère (nuisance de gravité légère, courte durée). Les animaux seront mis à jeûn à quatre reprises, pour à chaque fois une durée de moins de douze heures, ce qui peut constituer une source de stress légère (nuisance de gravité légère, durée modérée). Des animaux seront soumis à un régime obésogène répondant à tous leurs besoins nutritionnels susceptible d'entraîner des anomalies cliniques légères (nuisance de gravité légère, durée longue). Enfin, les animaux seront maintenus en hébergement individuel pendant 48 heures lors des mesures en cage calorimétrique, ce qui peut constituer une source de stress de longue durée (nuisance de gravité modérée, durée longue)
Devenir
Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d’intérêt qui seront ensuite analysés.
Remplacement
Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode de substitution in vitro pour étudier l’impact de la nutrition périnatale. La souris est un modèle de choix car elle présente des mécanismes physiologiques proches de ceux qui sont observables chez l’homme. Le but de ce projet est de rechercher les conséquences métaboliques chez la descendance, d'une carence en vitamine D chez le mâle géniteur. Ce processus est complexe et met en jeu de nombreux organes et systèmes métaboliques, qu'il n’est pas possible de reproduire in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux est le minimum nécessaire pour étudier la variabilité biologique de la descendance (descendance issue de 10 géniteurs différents). Ce nombre minimal est également nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test de student, notamment en ce qui concerne la prise de masse des animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l’environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle pour une durée inférieure à 24h, avant d'etre replacé avec ses congénères jusqu’à la fin du protocole. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en fonction des observations faites permettra l’application des points limites et la mise en application de critères d'arrêt. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.
Choix des espèces
La souris est un modèle classiquement utilisé dans les études concernant les désordres métaboliques causés par l’alimentation en raison des similitudes avec l’homme. Le regime débutera à 6 semaines de vie et sera administré durant 10 semaines. Les différentes procédures seront réalisées durant cette période de 10 semaines de régime. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondant tels que le vieillissement.
Associations de chimiothérapies et inhibiteurs des dommages à l’ADN dans le traitement du cancer du pancréas.
- Recherche appliquée
- Cancers
Une greffe de cellules tumorales directement dans le pancréas ou dans la rate, opération de dix minutes, ouvre le protocole pour chacune des 880 souris utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Suivent quatre semaines de traitement, à raison de deux injections intrapéritonéales par semaine, pour mesurer l'effet d'une chimiothérapie associée à un inhibiteur de la réparation de l'ADN sur des métastases hépatiques. L'efficacité de cette association a déjà été montrée in vitro et sur deux modèles murins de tumeurs sous-cutanées, ce qui n'empêche pas de recommencer en greffe orthotopique. Le porteur justifie l'effectif par une variabilité de prise de greffe qui impose des groupes de dix animaux, sans expliquer comment on passe de dix à 880.
Objectifs
Le cancer du pancréas est un cancer digestif diagnostiqué à un stade avancé avec un des plus mauvais pronostics, moins de 8% des patients survivent au-delà de 5 ans. Au moment du diagnostic, 80% des patients ont déjà des métastases, rendant la chirurgie impossible. Actuellement, très peu de thérapies sont proposées. De plus, ce cancer résiste à la chimiothérapie. Ces échecs peuvent être expliqués par les caractéristiques de la maladie ainsi que par le manque de biomarqueur permettant la sélection des patients traités. Pour augmenter les chances de survie des patients, de nouvelles thérapies plus ciblées sont en développement. C’est dans ce contexte que nous avons montré un très fort effet anti-cancéreux de l’association de médicaments existants avec ces nouvelles molécules ciblées. Il s’agit maintenant d’évaluer la thérapie in vivo.
Bénéfices attendus
Il a déjà été démontré in vitro l’efficacité de l’association d'un chimiothérapeutique avec un inhibiteur spécifique de la réparation des lésions de l'ADN, dans différents modèles de cancer du pancréas et ceci à de faible dose de drogue. Cette synergie a aussi été démontré dans 1 modèle de souris immuno-déprimé et 1 modèle de souris compétentes sur des tumeurs sous-cutanées. Il s'agit maintenant d'étudier à la fois l'efficacité du traitement sur le même modèle immunocompétent mais en greffe orthotopique, ainsi que sur les métastases hépatiques obtenus lors de greffe intrasplénique, et de mettre en évidence les mécanismes immunitaires impliqués dans la réponse.
Procédures
Tous les animaux subiront une procédure chirurgicale d'environ 10 minutes par animal. Les traitements se déroulent sur 4 semaines à raison de deux injections intrapéritonéales par semaine (d'une durée d'une trentaine de secondes environ).
Impact sur les animaux
Effets indésirables directs : - douleur associée à une injection intra péritonéale lors des traitements ou lors de l'implantation de cellules en intra-pancréatique. Effets indésirables indirects, conséquence des produits injectés : - croissance tumorale - perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance animale. Concernant les traitements, de nombreuses études ayant déjà été élaborées, les doses administrées aux animaux sont maîtrisées et de ce fait aucun effet indésirable dû au traitement est attendu.
Devenir
A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux.
Remplacement
Il n’existe pas encore de vrai modèle in vitro reproduisant la complexité de la tumeur et permettant de déterminer l'efficacité thérapeutique d'un traitement. En revanche on assiste à une transition des modèles cellulaires en 2 dimensions vers des modèles cellulaires en 3 dimensions, les organoïdes, qui reproduisent un peu plus fidèlement l’environnement humain in vivo. L’utilisation d’organoïdes est encore très complexe et ne permet pas encore de se passer d'expérimentation in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au maximum tout en conservant une puissance statistique suffisante pour le traitement du résultat. L’analyse statistique sera réalisée en collaboration avec une unité de biométrie. Les différentes analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un logiciel. D’après nos expériences précédentes et la littérature, la variabilité de prise de greffe nécessite des groupes de 10 animaux
Raffinement
La première mesure prise afin de limiter le stress chez nos animaux est une semaine de stabulation à leur arrivée sur la plateforme, ceci afin de les habituer à leurs nouvelles conditions d'hébergement. Le milieu est enrichi à l’aide de litière mélangée à des copeaux, ainsi que de briques de peuplier et dôme en plastique opaque. Les animaux sont surveillés quotidiennement. Une grille de scoring ayant été établie, tous les soins nécessaires pour apaiser le stress ou la douleur seront mis en place, jusqu’à l’euthanasie si besoin.
Choix des espèces
L’étude de l’effet des thérapies des modèles possédant un système immunitaire demande l’utilisation de souris immunocompétentes greffées avec une tumeur murine. Age 6-7 semaines, âge ou l’on observe une forte incidence de prise de greffe et une forte homogénéité.
Impact d’une manipulation des contrôles inhibiteurs des neurones dopaminergiques en modèles de maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Biopsiées sans anesthésie vers six jours après la naissance pour leur génotypage, ou sous anesthésie plus tard, des souris génétiquement modifiées subissent une chirurgie qui peut durer jusqu'à quatre heures et jusqu'à 36 tests comportementaux répartis sur 20 semaines. 596 souris vont être utilisées, toutes tuées pour des prélèvements de tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger ou sévère, certaines menées sous anesthésie jusqu'à la mise à mort, sans réveil. Après des lésions des neurones à dopamine censées reproduire la maladie de Parkinson, le projet teste si l'inhibition d'une structure du cerveau soulage douleur, troubles moteurs, cognitifs et anxiodépressifs, et le porteur précise que les altérations des seuils de douleur "ne peuvent être soulagées car c'est l'objet de l'étude". Le résumé ne dit ni comment ces lésions sont provoquées, ni quels sont les 36 tests, ni ce que subissent les souris en procédure sans réveil.
Objectifs
La perte des neurones dopaminergiques dans la maladie de Parkinson s’accompagne d’un dysfonctionnement de certains circuits cérébraux et de symptômes moteurs et non-moteurs qui restent difficiles à prendre en charge. La lésion d’une région cérébrale incluant une structure qui est un contrôle de ces neurones dopaminergiques peut améliorer certains symptômes. L’identification récente d’un marqueur moléculaire sélectif de cette structure permet désormais d’étudier les conséquences d’une modulation de l’activité de cette structure dans un modèle de la maladie de Parkinson. L’objectif du projet est ainsi de tester si l’inhibition sélective de cette structure peut soulager les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs.
Bénéfices attendus
La structure cérébrale ciblée par ce projet exerce un contrôle inhibiteur sur les systèmes dopaminergiques, qui dégénèrent dans la maladie de Parkinson. Ce projet doit permettre de tester si une inhibition de cette structure peut améliorer les symptômes nociceptifs, moteurs, cognitifs et anxiodépressifs, apportant ainsi une preuve de concept sur le potentiel thérapeutique de cette cible anatomique. La maladie de Parkinson est la seconde maladie neurodégénérative la plus fréquente. Connue pour ses symptômes moteurs, cette maladie a aussi des conséquences délétères non-motrices, incluant douleur, troubles de l’humeur et déficits cognitifs. Les patients présentent en moyenne 14 symptômes dans les phases précoces de la maladie et plus de 20 dans des phases plus tardives, mettant en évidence le besoin de prendre cette complexité en considération dans la recherche préclinique.
Procédures
Les animaux sont soumis à une biopsie de tissu pour réaliser leur génotypage, cette biopsie est effectuée sur animal vigile autour de 6 jours postnatal, ou à défaut sur animal sous anesthésie à partir de 12 jours postnatal. Les animaux sont soumis à une biopsie de tissu pour réaliser leur génotypage, cette biopsie est effectuée sur animal vigile autour de 6 jours postnatal, ou à défaut sur animal sous anesthésie à partir de 12 jours postnatal. Des animaux sont soumis à 1 chirurgie d’au maximum 1h30 ou 4h, et un maximum de 36 tests comportementaux de 10 à 45 minutes chaque, répartis sur 20 semaines avec au moins un jour de repos entre chaque test.
Impact sur les animaux
Une douleur légère et de courte durée peut être provoquée par la biopsie de tissus. La chirurgie peut entraîner une perte de poids transitoire, une douleur postopératoire modérée, une inflammation locale transitoire autour du dispositif des points de suture (peau du crâne). Les tests comportementaux peuvent s’accompagner d’un stress léger. Les lésions dopaminergiques modélisant la maladie de Parkinson peuvent entrainer une perte de poids sur les 10 premiers jours après la lésion. Des déficits moteurs liés à la modélisation de la maladie de Parkinson sont également attendus, ainsi que des altérations sensorielles des seuils de douleur qui ne peuvent être soulagées car c’est l’objet de l’étude.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements de tissus.
Remplacement
Compte tenu du sujet du projet, il est impossible de remplacer le modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. En effet, les comportements étudiés nécessitent un système nerveux complet et un animal entier, vivant et vigile. L’existence et la localisation de la structure cérébrale étudiée n’ont pour l’instant été établies que chez les mammifères, ne permettant donc pas en l’état actuel des connaissances d’utiliser un autre modèle animal.
Réduction
Les expériences sont menées en cherchant à limiter le nombre d'animaux, tout en obtenant l’information scientifique recherchée. Pour les diverses expériences, ce nombre d'animaux nécessaire pour tirer des conclusions scientifiques statistiquement fiables est défini sur la base de notre expertise, de l'analyse de la littérature et de calculs de power analyse.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe sociaux dans des cages enrichies (bâton, tunnel, coton et frisure) favorisant leur comportement naturel (ronger et faire des nids). Ils sont acclimatés aux conditions d’hébergement et habitués aux expérimentateurs. Ils sont habitués à la manipulation avant la chirurgie, ainsi qu’aux environnements des tests comportementaux avant leur réalisation. Les animaux seront suivis pour déceler tout signe de mal-être. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont utilisées, la température maintenue (tapis chauffant) et les yeux protégés par du gel oculaire. Après la chirurgie, une grille d’évaluation est utilisée pour le suivi des animaux. Des soins, une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire et/ou une séparation des animaux seront réalisés si besoin après concertation avec le vétérinaire ou la cellule chargés du bien-être animal. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures pour limiter ou soustraire l’animal à la souffrance.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris modifiées génétiquement pour cibler sélectivement les neurones de la structure cérébrale étudiée. Ceci implique l'utilisation de souris spécifiques et ne permet pas l'utilisation d'autres espèces. Étant donné que les études nécessitent des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés. Le génotypage est prioritairement effectué entre 6 et 8 jours, et la chirurgie à partir de 8 semaines d’âge.
Influence de l’absence des cellules non-β des îlots pancréatiques sur l’activité des cellules β chez la souris mâle
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
400 souris vont être utilisées, toutes tuées pour prélever leur pancréas, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour supprimer les cellules non-β de leurs îlots pancréatiques, elles reçoivent trois injections espacées de 48 heures, avant deux tests de tolérance au glucose de deux à six heures chacun : incision de la queue sous anesthésie, injection de glucose, sept à dix microprélèvements de sang, quatre prises de sang plus importantes, et pour certains lots un gavage lipidique. L'objectif est de mesurer ce que ces cellules apportent à la régulation de la glycémie, une question dont le porteur reconnaît qu'elle a été peu explorée. Il écrit travailler par ailleurs sur un simulateur de l'homéostasie glucidique que les données tirées de ces 400 souris viendront enrichir, "afin de réduire encore le recours à l'expérimentation animale".
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont de comprendre l’influence d'un type particulier de cellules des îlots pancréatiques sur l’homéostasie nutritionnelle à la fois dans les conditions physiologiques (régime normal) et dans les conditions physiopathologiques (régime gras classiquement utilisé pour mimer des conditions diabétogènes).
Bénéfices attendus
Le diabète est une maladie grave qui s’étend. Il est lié à une augmentation anormale et prolongée de la concentration de sucre dans le sang : c’est l’hyperglycémie. Les petits organes qui libèrent les hormones régulant la concentration de sucre dans le sang (la glycémie) s’appellent les îlots du pancréas. Ils sont constitués de plusieurs types des cellules. Les principales cellules des îlots sécrétant l’insuline, la seule l’hormone qui diminue la glycémie. Dans le diabète de type 1, ces cellules sont absentes. Dans le diabète de type 2, elles fonctionnent mal. En ce sens, ces cellules ont toujours été au centre des études sur la régulation glycémique en conditions normales et pathologiques. On connait donc très peu le rôle des autres cellules du pancréas dans ces mécanismes et surtout la manière dont elles influencent les cellules produisant l’insuline. Une autre limite de la plupart des études est d’avoir été centrées uniquement sur les effets du sucre (le glucose). En effet, l’alimentation contient d’autres nutriments : protéines, lipides…. Dans le présent projet, les chercheurs disposent de souris dont la particularité est de pouvoir inactiver les cellules ne produisant pas l’insuline. La manière dont ces souris régulent leur glycémie suite à une administration de glucose combiné ou non avec d’autres nutriments pourra donc être étudiée et surtout comparée avec celle des souris « normales » qui ont dans leurs îlots tous les types de cellules. Ceci apportera des informations cruciales sur le rôle de ces cellules dans ces processus. Pour mieux comprendre les interactions entre les différents types de cellules pancréatiques dans le diabète, certaines souris seront soumises à un régime gras qui mime certaines conditions favorisant le diabète de type 2. Les informations fournies par ce projet seront aussi cruciales par rapport au diabète de type 1. En effet, dans la perspective des futures thérapies cellulaires, nous saurons s’il suffit de greffer seulement les cellules produisant l’insuline ou un mélange équilibré des différentes cellules pancréatiques.
Procédures
Pour induire le phénotype recherché, les animaux recevrons 3 injections (10 secondes par injection) espacées de 48h. Pour les tests de tolérance au glucose, 2 expériences effectuées à 2 semaines d’écart (durée du test de 2 à 6h) : une incision (2 secondes) de la queue sera faite après anesthésie, s’en suivra une injection (10 secondes) de glucose avec ou sans autres nutriments, 7 à 10 prélèvements très légers de sang (10 à 30 secondes) pour détermination glycémie (espacés de 15min à 1h) seront effectués et 4 prélèvements (30 à 60 secondes) un peu plus importants de sang pour la détermination d’hormones (espacés de 30min à 1h). Pour les animaux de certains lots, 1 gavage (20 secondes) avec une solution lipidique sera effectué (après l’injection de glucose).
Impact sur les animaux
Des souris de ce type sont actuellement en élevage dans un autre laboratoire. En dehors d’une diminution de poids légère et transitoire (1-2 semaines maximum) après la suppression des cellules des îlots qui ne sécrètent pas l’insuline, aucun effet délétère n’a été recensé chez ces animaux. Dans de très rares cas, il peut arriver, malgré les soins post-expérimentaux que la queue cicatrise mal après les prélèvements de sang. Il peut aussi arriver extrêmement rarement, lors de l’injection de toucher un organe entrainant la mort de l’animal.
Devenir
A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées et leur pancréas sera prélevé pour diverses expérimentations ex-vivo.
Remplacement
Même si des modèles in vitro à 2 organes se développent, les systèmes d’organes sur puce sont pour l’instant incapables de reproduire la complexité de l’homéostasie nutritionnelle des mammifères impliquant des interactions entre de nombreux organes (tractus digestif, îlots pancréatiques, foie, tissu adipeux, muscle, cerveau, rein…). Ces expériences ne peuvent donc se faire que sur un modèle de mammifère. Le modèle souris est le plus adapté car c’est le seul à ce jour permettant une ablation sélective des cellules non-β des îlots pancréatiques au travers du modèle que nous proposons d’étudier dans ce projet. Il n’existe actuellement aucun simulateur modélisant l’homéostasie nutritionnelle qui est au cœur de cette étude. Toutefois, nous travaillons justement sur un simulateur de l’homéostasie glucidique. Les données acquises dans ce projet sur ces animaux seront entre autres destinées à enrichir ce simulateur renforçant ainsi la puissance de cette approche de simulation afin de réduire encore le recours à l’expérimentation animale.
Réduction
Une réflexion approfondie a été effectuée pour réduire le nombre d’animaux tout en préservant une puissance statistique nécessaire sans laquelle il faudrait refaire l’étude. Une pré-étude a été réalisée antérieurement dans un autre laboratoire sur ces animaux montrant sans réserve la faisabilité du projet. Les tests in vivo décrits dans cette étude sont réalisés de manière courante depuis des années par notre équipe dans d’autres projets, mais sont aussi des tests courant largement utilisés dans les laboratoires qui travaillent sur le diabète au travers le monde, ils sont donc très standardisés. Il n’y a donc plus de mise au point technique et aucune perte d’animaux n’est à prévoir à ce niveau, ce qui contribue à limiter également le nombre d’animaux. Pour réduire encore le nombre de souris produites en élevage, le choix des animaux contrôles (témoins) produits permettra de diviser par 2 le nombre total d’animaux à produire. Nous réutiliserons les animaux d’un même lot pour 2 séries d’expériences ce qui permet de diminuer encore de 90 notre besoin total d’animaux, et enfin, après les tests in-vivo, les animaux produits seront utilisés pour récupérer leurs îlots pancréatiques pour des investigations sur ces tissus au sein de la même étude. Ceci permet encore une réduction de moitié des animaux utilisés. Ainsi, 400 animaux maximum (au lieu de 900 si les mesures précédentes n’étaient pas appliquées) seront utilisés. Chaque lot sera optimisé pour que le nombre d’animaux utilisé assure une significativité statistique. Les règles statistiques communément admises seront appliquées (à savoir : si la répartition des résultats suit une loi normale, des tests statistiques paramétriques seront employés. Si la distribution des données ne suivait pas une loi normale, les tests non paramétriques appropriés seront appliqués).
Raffinement
Les animaux seront regroupés entre 5 et 10 animaux par cage pour éviter les effets délétères de l’isolement de ces animaux. Leur habitat sera enrichi des dômes et carrés de ouate pour la nidification. Un suivi quotidien des animaux sera effectué par le personnel de l'animalerie. Une habituation des animaux aux manipulations, contentions sera effectué la semaine précédant les tests. Les animaux seront pesés 2-3 fois par semaine et tous les jours durant la semaine suivant les expérimentations pour les lots concernés. Une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue des animaux avant les incisions et une crème cicatrisante sera appliquée en fin d'expérience avec un suivi et nursing si besoin des animaux. Dans les 24h suivant les expérimentations, si une perte de poids >10% est constatée, une alimentation enrichie sera mis à disposition des animaux concernés. Cette alimentation enrichie sera maintenue jusqu’à ce que ces animaux aient recouvré leur poids d’avant injection, expérimentation. Si ce n’était pas le cas après 48h, ce qui n’est encore jamais arrivé lors des précédentes études avec le même type d’induction de phénotype, les mesures graduées et points limites habituels associées de l’animalerie seront appliqués.
Choix des espèces
Le modèle souris adulte est le plus adapté car c’est un mammifère dont le fonctionnement de l’organisme est transposable à celui de l’Homme adulte, notamment pour la régulation du glucose sanguin. C’est aussi le seul animal à ce jour permettant une ablation sélective des cellules non sécrétrices d’insuline dans les îlots pancréatiques dans le modèle transgénique que nous proposons d’étudier. Les études in vivo sur ces animaux seront faites au stade jeune adulte mâle, de 12 à 22 semaines. Même si des modèles in vitro à 2 organes se développent, les systèmes de micro-organes in-vitro sont pour l’instant incapables de reproduire la complexité de l’équilibre nutritionnel des mammifères impliquant de nombreux organes (tractus digestif, îlots pancréatiques, foie, tissu adipeux, muscle, cerveau, reins…). Ces expériences ne peuvent donc se faire que sur un modèle de mammifère adulte vivant.
Formation de concepteurs de projet et d’expérimentateurs utilisant des souris
- Formation professionnelle
Valider une formation réglementaire obligatoire pour qui veut expérimenter sur des animaux non-humains : c'est à cela que servent ces séances, où 36 stagiaires et 6 formateurs par an manipulent des souris éveillées. 420 souris vont être utilisées sur cinq ans, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin des travaux pratiques. Chaque animal subit jusqu'à six préhensions et six contentions de moins de trente secondes par des personnes débutantes, plus une injection de sérum physiologique, sur une séance de deux heures. Le porteur précise que ces souris sont des reproductrices âgées ou des individus dont les caractéristiques génétiques empêchent l'adoption, et présente le fait de les faire manipuler par des novices comme un bénéfice à moyen terme pour les animaux non-humains utilisés en recherche.
Objectifs
Pour tout concepteur de projet et tout expérimentateur utilisant des animaux à des fins scientifiques, l'utilisation d'animaux est conditionnée, par la réglementation européenne en vigueur, à la validation d'une formation spécifique. Dans cette formation plusieurs items sont imposés dont un item portant sur les éléments théoriques et pratiques des interventions dites faiblement invasives, comme par exemple une injection d'un médicament ou une prise de sang. Nous prévoyons d'aborder la partie pratique de cet item à travers le visionnage de vidéos, l'utilisation de mannequins et l'observation et la manipulation (préhension, contention) de souris vigiles. La formation s'adresse à un public qui n'est pas familiarisé avec la manipulation d'animaux et qui sera amené à en manipuler dans le cadre de stages d'études et/ou de programmes de recherche biomédicale. Notre objectif est de donner l'opportunité aux stagiaires d'approcher l'animal vigile, d'observer les réactions de l'animal au contact de personnes non familières, d'appréhender ses propres réactions lors de la manipulation d'animaux vigiles, et d'acquérir les bonnes pratiques de manipulation dans le cadre des 2 gestes, préhension et contention, qui sont réalisés au préalable de toute intervention sur l'animal.
Bénéfices attendus
Les stagiaires seront les bénéficiaires de cette formation à court terme ; il s'agit de doctorants et de personnels (chercheurs et personnels techniques) de laboratoires de recherche oeuvrant dans le domaine biomédical et d'étudiants en master 2 qui se préparent à faire un stage de fin d'études ou à travailler dans la recherche fondamentale en biologie animale ou appliquée à la santé humaine ou animale. Le contact de l'animal vigile dans un cadre sécurisant pour les stagiaires et l'apprentissage des bonnes pratiques de préhension et de contention contribuent à la bientraitance animale lors de l'utilisation des animaux en science. Ainsi, à moyen terme, il y a également un bénéfice attendu pour les animaux utilisés dans les programmes de recherche.
Procédures
Tous les gestes se feront sur des animaux vigiles : au maximum chaque animal sera soumis à 6 préhensions, d'une durée de moins de 30 secondes chaque, à 6 contentions, d'une duréee de moins de 30 secondes chaque, et à 1 injection de sérum physiologique d'une durée de moins de 15 secondes.
Impact sur les animaux
Douleur légère et temporaire (10 secondes) lors de l'injection. Stress léger à modéré sur la durée (2 heures) de la séance de travaux pratiques du fait de la présence des stagiaires et de la manipulation (préhension et contention) par des personnes débutantes.
Devenir
Les souris utilisées sont des animaux de réforme (reproducteurs âgés) ou sont issues d'élevage d'animaux génétiquement modifiés avec des caractéristiques génétiques qui limitent leur réutilisation dans des projets de recherche ou empêchent leur adoption pour éviter tout croisement avec des animaux de la faune sauvage. Tous les animaux seront donc mis à mort à la fin des travaux pratiques.
Remplacement
Les travaux pratiques seront précédés d'une séance de présentation théorique des interventions, de visionnage de vidéos récupérées sur des sites internet dédiés à l'utilisation des animaux en science et d'utilisation de mannequins. L'objectif de ce projet est de permettre aux stagiaires d'appréhender le concret de la manipulation des animaux, de se rendre compte des réactions de l'animal vigile manipulé et des sensations de la personne qui manipule, ce qui ne peut pas être actuellement simulé en réalité virtuelle.
Réduction
Nous prévoyons d'utiliser 1 à 2 animaux par stagiaire et par formateur ; le deuxième animal sera utilisé si le premier montre des signes de stress d'intensité modérée. Une seule session de formation sera réalisée par an et accueillera au maximum 36 stagiaires encadrés par 6 formateurs. La formation sera proposée 5 ans d'affilée. Il y aura donc besoin au maximum de 2 souris pour 42 personnes par an soit 84 souris par an et 420 sur la durée de la formation. Les animaux utilisés seront des animauxde réforme ou destinés à être mis à mort à court terme du fait de caractéristiques génétiques non adaptées aux programmes de recherche.
Raffinement
En amont des travaux pratiques, les stagiaires auront acquis des connaissances sur la biologie des souris, leur comportement et les signes de stress ou de souffrance. Le calme sera exigé sur toute la durée de la séance de travaux pratiques. La séance de travaux pratiques se fera par une approche progressive : mettre sa main dans la cage pour permettre aux souris de s'habituer aux stagiaires puis des gestes de plus en plus complexes seront proposés allant de la préhension à la contention de l'animal. Les formateurs montreront les gestes et proposeront aux stagiaires de les faire sous la surveillance du formateur ; les gestes seront validés par le formateur avant de passer au geste plus complexe si le formateur juge que le stagiaire est en état (stress limité) de le faire. Ainsi, pour limiter le stress de l'animal, la progression de l'apprentissage sera adaptée à chaque stagiaire. Des points limites gradés ont été définis ; leur atteinte conduira à une réaction sans délai des formateurs.
Choix des espèces
La souris est l'animal le plus utilisé actuellement en recherche fondamentale en biologie animale et en recherche appliquée à la santé, 2 des domaines majeurs auxquels se destinent les stagiaires en master 2 ou dans lesquels les doctorants et les personnels de laboratoire travaillent. Les animaux seront utilisés après sevrage, après avoir dépassé un poids de 20 g, de façon à avoir une taille bien adaptée à la préhension et à la contention par des personnes débutantes.
Entretien et génotypage invasif de lignées de souris avec cardiomyopathie dilatée et atteinte musculaire
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système musculosquelettique
Porteuses d'une mutation qui provoque une cardiomyopathie dilatée, ces souris développent une atteinte cardiaque vers neuf mois, avec une mobilité réduite, une douleur et une mort prématurée autour d'un an. 534 d'entre elles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, l'acte déclaré se limitant à une biopsie de queue prélevée en quelques secondes sur des souriceaux de 7 à 14 jours. Le porteur indique limiter volontairement leur utilisation à six mois, soit avant l'apparition du phénotype pour lequel la lignée est entretenue. La grande majorité des hétérozygotes partira vers d'autres projets d'expérimentation, certains encore en cours d'écriture, et les animaux sans le génotype recherché comme les anciens reproducteurs seront tués.
Objectifs
Nous cherchons à mieux comprendre les mécanismes conduisant au développement d'une famille de maladies rares présentant une atteinte cardiaque (cardiomyopathie dilatée) associée ou non à des atteintes musculaires (prévalence estimée à environ 9 sur 100.000). Des souris à phénotype dommageable sont nécessaires pour réaliser des projets de recherche. Chez ces souris, à l'état hétérozygote, la mutation du gène impliqué dans la pathologie entraine une cardiomyopathie dilatée ; tandis qu'à l'état homozygote, les souris développent une cardiomyopathie dilatée précoce associée à une atteinte musculaire. Une biopsie sera nécessaire afin de génotyper les animaux. L’objectif est donc l'entretien de la lignée afin de générer les lots de souris du bon génotype indispensables pour mener à bien les projets de recherche. Cette lignée est essentielle pour comprendre les mécanismes pathologiques conduisant au développement de la maladie (cardiomyopathie associée ou non à une atteinte musculaire) et pour pouvoir mettre au point des stratégies thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Les souris générées dans ce projet permettront de réaliser des projets d’étude centrés sur les mécanismes physiopathologiques dans les dystrophies musculaires et cardiomyopathies liées aux mutations d'un gène impliqué dans une famille de maladies rares affectant le coeur et les muscles, et permettront ainsi de proposer des nouvelles stratégies thérapeutiques. La cardiomyopathie liée à ce gène est la plus agressive des cardiomyopathies pour laquelle il n'existe aucune alternative thérapeutique à l'heure actuelle en dehors de la transplantation cardiaque.
Procédures
Un génotypage est nécessaire. Celui-ci sera effectué à partir d’une petite biopsie caudale réalisée sur un animal juvénile et vigil. Ce prélèvement aura lieu une seule fois au cours de la vie de l'animal et dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les prélèvements pour le génotypage (biopsie) pourront induire une douleur légère et de courte durée chez l'animal. Il peut également avoir un risque minime d'infection au site de prélèvement. La manipulation des animaux pourra engendrer un stress. Les souris hétérozygotes développent un phénotype cardique vers l'âge de 9 mois, pouvant induire une mobilité réduite et une douleur conduisant à une mort prématurée autour de l'âge de 1 an. Dans ce cadre, notre utilisation de ces souris est limitée à 6 mois afin de se placer avant la survenue du phénotype dommageable.
Devenir
La grande majorité des animaux hétérozygotes sera transférée pour expérimentation et affectée à d’autres demandes d’expérimentation animale (utilisation continue). Plusieurs projets sont en cours d’écriture pour soumission au comité d’éthique et d’autres encore le seront dans l’avenir. Les animaux qui n'ont pas le génotype d'intérêt pour les projets de recherche et les anciens reproducteurs seront euthanasiés.
Remplacement
Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et moléculaires participant au développement d'une atteinte cardiaque, musculaire et adipeux, organes qui communiquent entre eux. Un modèle animal est donc nécessaire pour étudier tous ces aspects.
Réduction
534 animaux seront utilisés dans ce projet. Les protocoles expérimentaux des projets seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que les expériences soient interprétables et pour éviter de les répéter. Afin de réduire le nombre d'animaux générés dans cet élevage, nous contrôlons le nombre de couples afin de ne pas générer d'excédent de stock en fonction des projets en cours autorisés (si nos besoins sont en baisse, nous pourrions être amené à réduire le nombre d'accouplements, à procéder à de la cryopréservation). Dans le cadre de ce projet d'élevage, il n'y a pas de tests statistiques ou de calcul de puissance mais cela sera systématiquement appliqué dans le cadre de l'utilisation continue des animaux au sein des projets de recherche qui découlent de ces élevages.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique : les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière kraft, carré de coton, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. La technique utilisée pour la réalisation des biopsies est la biopsie caudale, technique recommandée par les différents comités nationaux. Les biopsies sont réalisées avec du matériel propre et désinfecté, une compression avec de l'essuie tout propre est effectué pour stopper le micro-saignement. Les souriceaux sont sur surveillance jusqu'à ce que leur mère les reprenne en charge dans le nid. Un soin particulier sera apporté aux animaux commençant à développer la maladie pour leur faciliter l’accès à la nourriture et à l’eau. Ainsi des croquettes ou de la bouillie pourront être placés directement dans la cage, ainsi que de l’hydrogel en cas de besoin. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés.
Choix des espèces
Le modèle le plus commun utilisé dans les études précliniques dans le domaine musculaire et cardiaque est la souris. Des animaux modèles de la maladie sont indispensables pour étudier le muscle/coeur in vivo dans un système pathologique. Les animaux sont utilisés à partir de 7 jours pour les biopsies et jusqu'à 6 mois de vie pour les reproducteurs. Afin de limiter au maximum la manipulation des animaux, le prélèvement pour génotypage est réalisée en même temps que l'identification individuelle, soit sur des souriceaux âgés de 7 à 14 jours de vie. Nous limitons volontairement l'utilisation des animaux jusqu'à 6 mois de vie, nous plaçant ainsi plusieurs mois avant le développement du phénotype dommageable survenant vers 9 mois de vie.
Evaluation de la capacité de l’hespéridine à moduler les fonctions biologiques des vésicules extracellulaires après un repas
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Cinq prises de sang de six gouttes, une par heure, puis six autres prélèvements et une injection intraveineuse tous les quatre jours pendant deux semaines : 368 rats sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, et tous tués pour prélever leur sang, leur aorte et leur cœur. La question posée porte sur les vésicules extracellulaires libérées après un repas et sur la capacité d'un polyphénol, l'hespéridine, à en modifier la quantité et le contenu. Le porteur reconnaît que les ponctions répétées de la queue peuvent laisser des bleus et une irritation, et qu'une manipulation excessive de cette queue perturbe la régulation de la température de l'animal. Le choix de rats de 8 à 12 semaines est présenté comme un geste éthique, l'argument étant que des individus physiologiquement stables réduisent la variabilité et donc le nombre d'animaux non-humains à utiliser.
Objectifs
Le stress nutritionnel après le repas est connu pour être à l’origine d’altérations transitoires dans le fonctionnement normal du métabolisme, mais que répétées dans le temps, sont associées au développement des maladies métaboliques et cardiovasculaires. D’autre part, il est connu que des petites vésicules libérées par toutes les cellules de l’organisme peuvent se retrouver dans le sang et sont impliquées dans le bon fonctionnement du corps. De plus, une augmentation du taux circulant de ces vésicules est associée avec l’apparition de maladies métaboliques et cardiovasculaires. Cependant, l’effet des vésicules produites après un repas sur les fonctions cardiovasculaires est peu connu. Des approches nutritionnelles à base d’aliments végétaux riches en composés naturels appelés polyphénols, connus pour leurs bienfaits sur la santé, se sont avérées capables de réduire l’élévation du taux de ces vésicules extracellulaires lors de désordres cardio-métaboliques. Toutefois, l’impact quotidien de notre alimentation et de ces constituants végétaux sur la libération des vésicules extracellulaires après un repas et leurs activités biologiques n’est pas connu. Ce projet fait l’hypothèse selon laquelle les polyphénols apportés par la composante végétale de notre alimentation peuvent impacter favorablement la biologie des vésicules extracellulaires après un repas notamment en réponse à un stress nutritionnel. Pour répondre à cela, le premier objectif est de caractériser de façon fine les vésicules extracellulaires libérées (origine cellulaire et contenu) à la suite d’un stress après un repas et de déterminer les constituants permettant d’identifier spécifiquement les vésicules extracellulaires post-repas. Le projet a également pour but de déterminer le rôle biologique des vésicules extracellulaires post-repas, notamment sur certaines fonctions cardio-métaboliques. À partir des connaissances ainsi générées, nous pourrons évaluer la capacité de certains polyphénols à moduler la libération, le contenu et les fonctions biologiques des vésicules extracellulaires produites après un repas.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet est un prérequis à la compréhension du rôle des vésicules extracellulaires post-repas dans les effets de notre alimentation, et tout particulièrement de la composante en polyphénols des produits végétaux, sur notre physiologie et notre santé. Dans son ensemble, le projet permettra d’apporter un éclairage nouveau sur la réponse post-repas et son rôle primordial dans la mise en place des désordres cardiométaboliques.
Procédures
- Gavage (1 fois/animal, < 1 minute), - Prélèvement de sang pour doser les vésicules extracellulaires (5 prélèvements de 6 gouttes de sang par animal, 1 prélèvement/heure, durée de chaque prélèvement < 1 minute). - Supplémentation de la nourriture avec de l’hespéridine (durée acte : 4 semaines), - Injection intraveineuse (1 injection tous les 4 jours pendant 2 semaines, durée de chaque injection < 5 minutes), - Prélèvement de sang pour étude métabolique (6 prélèvements d’une goutte de sang par animal, durée de chaque prélèvement < 1 minute).
Impact sur les animaux
1. Gavage : Les animaux peuvent ressentir une gêne passagère lorsqu’un petit tube est introduit dans leur gorge pour administrer une substance. Cette procédure peut être un peu stressante, car elle nécessite de tenir l’animal immobile pendant un court moment. Si elle n’est pas faite correctement, elle pourrait provoquer de petites irritations internes. 2. Injections dans la queue : Les injections dans une veine de la queue peuvent provoquer une légère douleur au moment de la piqûre. Si plusieurs tentatives sont nécessaires, cela peut être un peu plus désagréable pour l’animal et entraîner une légère irritation ou un petit bleu. Dans certains cas, l’animal peut lécher ou mordiller la zone concernée. 3. Prises de sang dans la queue : Comme pour les injections, cette procédure nécessite de maintenir l’animal immobile, ce qui peut être stressant. La piqûre peut provoquer un léger inconfort, et des bleus ou une irritation peuvent apparaître si les prélèvements sont répétés trop souvent. Une manipulation excessive de la queue peut aussi perturber la régulation naturelle de la température chez l’animal.
Devenir
A la fin du protocole, des prélèvements de tissus (sang, aorte, cœur) seront effectués sur les animaux euthanasiés afin d’analyser les effets cardiovasculaires et métaboliques de l’étude.
Remplacement
Il n’existe pas actuellement d’autres méthodes permettant d’obtenir les mêmes informations sans utiliser d’animaux vivants. Pour comprendre comment le stress après un repas agit sur l’organisme, et comment certains composés comme les polyphénols peuvent influencer la circulation de petites particules appelées vésicules extracellulaires, il est nécessaire d’observer ces réactions directement dans un organisme vivant. Cela permet d’étudier des phénomènes complexes qui ne peuvent pas être reproduits en laboratoire autrement.
Réduction
Nous avons réduit le nombre d’animaux à celui requis pour obtenir une validation statistique des résultats en utilisant des données préliminaires de notre laboratoire pour une procédure similaire de gavage chez le rat. Le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental a été déterminé à l’aide d’un logiciel statistique pour déterminer le minimum numéro d’animaux nécessaire pour assurer la validité des résultats obtenues.
Raffinement
Pour favoriser la socialisation des animaux, nous placerons au maximum trois animaux par cage. Nous avons raffiné nos approches afin de minimiser la détresse imposée aux animaux, qui seront hébergés dans un environnement enrichi répondant à leurs besoins physiques et comportementaux. Dans la cage, les animaux auront à leur disposition des tubes en plastique opaque pour se cacher, grimper et faciliter leur accès à la nourriture. L’état de santé des animaux sera évalué régulièrement par l’expérimentateur (au moins une fois par semaine) pendant toute la durée du protocole, en observant leur comportement. Si une douleur est anticipée ou si les animaux présentent des signes pouvant suggérer du stress ou de la douleur après une manipulation, une grille de scoring spécifique avec des seuils prédéfinis sera appliquée. Le cas échéant, des médicaments appropriés (anesthésiques ou analgésiques) seront administrés, conformément aux recommandations vétérinaires et aux bonnes pratiques en expérimentation animale. Le suivi de ces animaux sera alors effectué quotidiennement dès l’apparition de ces signes. Si l’animal se rétablit, le suivi régulier sera repris jusqu’à la fin de la procédure. En revanche, si son état se détériore, le seuil limite sera appliqué et une euthanasie sera réalisée.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce est basé sur notre connaissance de ce modèle, ainsi que sur la disponibilité de données dans la littérature associées à un stress après un repas de courte durée. Les rats âgés de 8 à 12 semaines sont dans une phase de développement adulte jeune, ce qui les rend physiologiquement plus stables et donc plus fiables pour les expériences. À cet âge, ils ont dépassé les changements hormonaux liés à la puberté et ne sont pas encore affectés par les effets du vieillissement, ce qui permet d'obtenir des résultats plus cohérents et précis. D'un point de vue éthique, cette tranche d'âge respecte les principes de la science responsable. En effet, les rats à ce stade sont plus stables physiologiquement, ce qui permet de réduire les variations entre les individus et de mieux contrôler les expériences. Cela permet aussi de réduire le nombre d'animaux nécessaires tout en obtenant des résultats fiables. Choisir des rats à ce stade évite l'utilisation d'animaux trop jeunes, plus vulnérables, ou trop âgés, susceptibles de présenter davantage de risques. En résumé, l'utilisation de rats adultes jeunes garantit des résultats plus fiables tout en assurant leur bien-être et en réduisant le nombre d'animaux utilisés pour l'expérience.
Prélèvement invasif de tissus pour génotypage de lignées de souris pour l’étude du rôle endothélial de CD146 dans les maladies cardiovasculaires
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Maintenues en vie et versées au fil de l'eau à d'autres projets d'expérimentation de l'établissement, 1 000 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. L'acte déclaré tient en quelques secondes : au sevrage, à quatre semaines, deux millimètres de l'extrémité de la queue sont coupés sur l'animal éveillé, ce qui peut saigner, le saignement étant arrêté par compression au coton. Le porteur écarte toute analgésie, jugeant qu'elle ajouterait un geste invasif et que les animaux biopsiés ne présentent pas une douleur qui la justifie. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit les plaques d'athérosclérose et conclut qu'il est "nécessaire" d'utiliser des animaux génétiquement altérés.
Objectifs
Ce projet consiste à effectuer des biopses de queues sur les souris génétiquement modifiées qui ont intégrées dans tous nos projets scientifiques en cours et à venir (ayant déjà des autorisations de projet ou en cours) dans le but de génotyper nos lignées. La nouvelle réglementation exige désormais une autorisation pour ces prélèvements invasifs en vue de génotypage. Nos projets en cours concernant la compréhension du rôle d'une molécule d'adhésion dans les maladies cardiovasculaires. Cette molécule est exprimée par différents types cellulaires et nous souhaitons préciser son rôle lorsqu'elle n'est exprimé que par les cellules endothéliales. Nous utilisersons donc des modèles expérimentaux délétés pour cette molécule uniquement au niveau de l'endothélium.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de fournir des animaux aux génotypes d’intérêt pour nos projets scientifiques ainsi que leur génotypage et le contrôle qualité de nos lignées murines.Les animaux utilisés dans ce projet permettront d'apporter de nouvelles données dans la compréhension du rôle d'une molécule d'adhéson dans les maladies cardiovasculaires.
Procédures
Au moment du sevrage des souris, un seul prélèvement de tissu sera réalisé (2 mm) au niveau de l'extrémité de la queue pour le génotypage. Cette intervention se fera sur animal vigile et ne durera quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont liées à la biopsie pour le génotypage qui nécessite de couper l'extrémité de la queue au moment du sevrage à 4 semaines, donc éventuellement un saignement. Le fait de manipuler l'animal par contention engendre également un stress chez ce dernier.
Devenir
Animaux maintenus en vie, utilisation continue dans des DAP d'expérimentation.
Remplacement
Les animaux de ce projet ne peuvent pas être remplacés. Il n'existe pas de modèles in vitro mimant les plaques d'athérosclérose et suceptibles d'apporter le même niveau d'information sur le rôle d'une molécule d'adhésion dans la progression des maladies cardiovasculaires. Il est donc nécessaire d'utiliser des animaux génétiquement altérès afin d'envisager des approches thérapeutiques transposables à l'homme. Ici, il s'agit de produire des animaux avec un phénotype d'intérêt pour nos projets en cours.
Réduction
Nous appliquerons la stratégie de réduction, à savoir 1/ l'utilisation dès que possible de schémas d'accouplements ne nécessitant pas ou peu de génotypage, 2/ des schémas d’accouplement optimisés pour produire un maximum d’animaux « utiles » (lignées avec plusieurs modifications génétiques), 4/ le développement en parallèle des méthodes de génotypage sous le seuil telles que la biopsie de poils . Au total, dans ce projet, nous génotyperons tous les animaux nécessaires aux expérimentations, à savoir un nombre de 1000 souris qui résulte du nombre de souris nécessaire en lien avec nos besoins expérimentaux pour atteindre la puisance statistique nécessaire minimale.
Raffinement
Concernant le prélèvement invasif, il s'agit d'une méthode éprouvée, précise, rapide et standarisée, ce qui limite les effets indésirables liés au stress et à la douleur,cela peut éventuellement entraîner un saignement et une douleur, saignement qui sera arrêté par compression à l'aide d'un coton. Egalement, l'analgésie systématique n'est pas pertinente (elle se ferait par injection, ce qui ajoute un geste invasif alors que les animaux biopsiés ne presentent pas une douleur justifiant cette dernière).
Choix des espèces
Les études faites au sein de notre animalerie nécessitent l’utilisation de souris génétiquement modifiées. Ici, il s'agit de produire des animaux avec un phénotype d'intérêt pour nos projets en cours. Afin de pouvoir définir le phénotype des souris, un génotypage est nécessaire. Les animaux seront prélevés à l’âges de 20 jours, cet âge permet de pouvoir génotyper les animaux avant la date de sevrage et donc de pouvoir répartir les animaux dans les cages d’hébergement par génotype au moment du sevrage.
Développement de nouveaux vaccins muqueux contre les infections à pneumocoque
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
9 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1 728 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 3 072 en souffrance modérée. Elles sont vaccinées deux fois par voie nasale sous anesthésie gazeuse, puis reçoivent le pneumocoque dans les narines, ce qui provoque chez une partie d'entre elles une colonisation du nez ou une pneumonie avec perte de poids et altération de l'état général. L'objet est de mettre au point un vaccin nasal couvrant davantage de sérotypes que les vaccins actuels, qui n'en protègent qu'environ 20 %. Les souris qui survivent à l'infection sont tuées comme les autres, aucun animal infecté ne pouvant être adopté ni réutilisé, et un score clinique quotidien déclenche la mise à mort avant les signes les plus sévères.
Objectifs
La bactérie Streptococcus pneumoniae (pneumocoque), pour laquelle plus de 100 sérotypes ont été décrits, est la cause principale d’infection du tractus respiratoire supérieur et inférieur, et constitue un problème de santé publique majeur dans le monde. Les enfants de moins de 5 ans, les personnes âgées de plus de 65 ans et les individus avec un système immunitaire affaibli sont principalement affectés, et la sévérité de la maladie est exarcerbée chez les patients co-infectés par le virus de la grippe. Le pneumocoque colonise naturellement le nasopharynx, le plus souvent de manière asymptomatique (portage asymptomatique) ; les bactéries peuvent atteindre les poumons par aspiration des sécrétions nasopharyngées et induire une pneumonie (infection pulmonaire) qui peut évoluer vers une maladie invasive lorsque les bactéries pénètrent dans les vaisseaux sanguins des poumons et atteignent la circulation générale. Les vaccins commercialisés à l’heure actuelle protègent contre environ 20% des sérotypes du pneumocoque. Le développement de nouveaux vaccins capables d’induire une réponse immunitaire spécifique d’un motif bactérien conservé, partagé par les différents sérotypes, permettrait donc d’élargir la protection vis-à-vis d’autres sérotypes. D’autre part, les vaccins actuels, administrés par injection intramusculaire, préviennent l'apparition ou réduisent les symptômes d'une infection invasive mais présentent une capacité limitée à stimuler une immunité des muqueuses et à protéger contre la colonisation nasale ou la pneumonie. Afin de prévenir l'infection bactérienne pulmonaire et la transmission de la bactérie, l’utilisation de vaccins muqueux administrés par voie nasale, capables d’induire une réponse immunitaire au niveau du nasopharynx et des poumons, représente donc une approche d’intérêt. Le projet comporte les objectifs suivants : (1) Identifier des éléments conservés de S. pneumoniae nécessaires à la colonisation nasale (portage asymptomatique) et/ou à l’invasion pulmonaire et capables de stimuler une réponse immunitaire protectrice, (2) Développer des formulations innovantes pour les vaccins muqueux (à administration nasale), (3) Réaliser l’évaluation préclinique de l’efficacité et du mécanisme d’action de vaccins muqueux
Bénéfices attendus
Le résultat majeur du projet sera d'identifier de nouveaux vaccins candidats capables d’inhiber un stade de portage asymptomatique ou l’invasion pulmonaire, indépendamment du sérotype du pneumocoque. Il permettra d’autre part une caractérisation approfondie des mécanismes de l’immunité induite par la vaccination et l’infection au niveau du nasopharynx et au niveau pulmonaire. Ceci contribuera au développement d’outils applicables à long terme au développement d’autres vaccins à administration nasale, y compris dans d’autres contextes infectieux. Le développement de vaccins avec une efficacité accrue contre l’infection et la transmission présente un bénéfice pour la santé des populations au niveau mondial (impact sociétal) et un bénéfice économique lié à la prévention des infections à S. pneumoniae.
Procédures
Les souris seront vaccinées deux fois à 2 ou 3 semaines d’intervalle par administration nasale sous anesthésie gazeuse. Dans ce but, le vaccin anti-pneumocoque sous une forme liquide est déposé dans narines. Une solution saline est utilisée comme contôle négatif de vaccination. Pour comprendre le mécanisme d’action du vaccin et consolider l’innocuité du vaccin, les réponses en anticorps et cellulaire sont analysées. Dans certaines expériences, afin de caractériser le mécanisme d’action des vaccins, les souris recevront par injection des molécules qui modulent la réponse du système immunitaire. Pour étudier l’efficacité des vaccins, les animaux vaccinés recevront le pneumocoque 2 à 3 semaines après l’administration de rappel. La capacité des vaccins à diminuer la colonisation asymptomatique du nez, et ainsi la transmission entre individus, sera évaluée. L’efficacité des vaccins sera également testée contre une infection pulmonaire à pneumocoque. La colonisation et l’infection pulmonaire se font par administration nasale sous anesthésie par injection.
Impact sur les animaux
De façon similaire à une injection chez l’homme, les injections chez l’animal peuvent causer une douleur minime liée à la piqûre. Une aiguille la plus fine possible appropriée pour le type d’injection sera utilisée, et un nombre minimum d’administrations sera réalisé afin d’atteindre les objectifs scientifiques. Dans le cas des expériences comprenant une étape d’infection pulmonaire avec le pneumocoque, la majorité des analyses seront effectuées à des temps précoces, avant la survenue d’effets indésirables dûs à l’infection. Néanmoins, à des temps plus tardifs, les bactéries peuvent provoquer une infection respiratoire chez la souris qui peut se traduire par une perte de poids et/ou une altération de l’état général. Notre projet consiste à vacciner les animaux pour prévenir la survenue d’une infection pulmonaire et on s'attend donc à une amélioration de l’état général des animaux vaccinés en comparaison à des animaux non traités. Des critères d’arrêts de l’étude, évalués grâce à un score clinique, ont été définis afin de contrôler le bien-être des animaux. Ainsi, la mesure du poids de l’animal et l’inspection des signes physiques (pelage, respiration) et du comportement (mobilité) seront effectués de façon quotidienne, afin de détecter le plus précocément possible l’apparition de signes de souffrance. Les expérimentateurs sont formés à ces observations et procèdent à l’euthanasie des animaux si ces paramètres sont significativement détériorés, quel que soit le groupe expérimental.
Devenir
L’ensemble des animaux seront euthanasiés. Ainsi, les animaux seront euthanasiés afin d’analyser la réponse immunitaire dans différents tissus et/ou de déterminer le nombre de bactéries dans le nez, les poumons et la rate. Dans le cadre des expériences incluant une étape d’infection avec le pneumocoque, les animaux développant des signes sévères d’infections seront euthanasiés et ceux qui survivent à l’infection seront euthanasiés car ils ne peuvent être replacés ou adoptés (animaux infectés). La réutilisation de ces animaux n’est pas envisageable car la procédure réalisée peut altérer les résultats d’une étude ultérieure.
Remplacement
Des études in vitro seront développées pour mimer la colonisation nasale par S. pneumoniae et l’interaction des vaccins avec les muqueuses. Néanmoins, à ce jour, la complexité des processus infectieux et immunitaires ne peut pas être intégralement reproduite dans des tests in vitro et l’utilisation de souris sera donc nécessaire pour atteindre les objectifs du projet, dans le respect des stratégies de réduction et de raffinement ci-dessous.
Réduction
(1) Modélisation in vitro : des études sur des cellules isolées d’animaux seront développées afin de mimer la réponse aux vaccins. Une veille bibliographique sera réalisée afin d’identifier d’éventuels nouveaux modèles permettant de mimer la complexité des interactions entre les cellules du système immunitaire, les cellules épithéliales et la bactérie ou les vaccins. (2) L’utilisation de souris génétiquement identiques dans nos expériences permet d’obtenir des résultats expérimentaux plus reproductibles et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés pour avoir des résultats robustes. (3) La taille des groupes d'animaux dans les expériences réalisées est déterminée par des méthodes statistiques afin d’utiliser le strict nécessaire pour répondre à la question scientifique.
Raffinement
Lors de l’euthanasie, de multiples tissus (nasopharynx, poumons, ganglions drainants, rate, sang) seront prélevés sur chaque animal afin de rassembler un maximum de données exploitables pour chaque animal. L’utilisation de techniques de mesures à moyen et haut débit (qui mesurent plusieurs paramètres par échantillon) permettra également d’obtenir des données multiples sur chaque échantillon et de raffiner les analyses.
Choix des espèces
L’activation du système immunitaire et l’inflammation induites lors d’une infection respiratoire reposent sur le recrutement et l’activation de nombreux types cellulaires et sur la production d’une multitude de facteurs solubles. L’induction d’une réponse immunitaire protectrice par les vaccins implique aussi l’activation de multiples types cellulaires et leur interaction dans différents tissus. A ce jour, la complexité de ces processus infectieux et immunitaires ne peut pas être reproduite in vitro. Le modèle murin est le plus pertinent pour analyser l’efficacité et le mécanisme d’action de vaccins à un stade précoce de développement. De nombreux modèles de souris invalidées dans la réponse immunitaire sont disponibles et permettent de comprendre le mode d’action des vaccins. Les outils d’analyse nécesaires à l’évaluation des vaccins sont par ailleurs très développés pour la souris. Pour les souris obtenues auprès de fournisseurs agréés, des animaux adultes âgés de 6 à 10 semaines en début d’expérience seront utilisés. Pour les animaux provenant de l’élevage local, les animaux pourront être âgés de 6 à 20 semaines. A ces âges, le système immunitaire des souris est considéré comme compétent. Enfin, la détermination des doses de bactéries nécessaire à la colonisation nasale ou l’infection pulmonaire a déjà été établi par l’ensemble de la communauté scientifique. Ponctuellement, des tests pourront être réalisés sur des animaux jeunes (3 semaines) ou très âgés (>52 semaines) pour évaluer l'efficacité vaccinale aux âges extrêmes.
Etude des effets cocktail de perturbateurs endocriniens sur la production de Vésicules Extracellulaires (VEs) adipeuses chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées pour que leur tissu adipeux soit prélevé et mis en commun, une seule souris n'en fournissant pas assez, 720 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent neuf gavages hebdomadaires d'une huile contenant un mélange de quatre perturbateurs endocriniens, à faible ou forte dose, une partie d'entre elles suivant en plus un régime riche en graisses pendant toute l'étude. Une partie des souris est obèse par mutation génétique, ce que le porteur relie à des troubles de mobilité, une résistance à l'insuline et une inflammation chronique, en précisant que ces effets "ne provoquent pas de douleur directe". Les vésicules extraites de leur graisse seront ensuite testées sur des cellules en culture et injectées à des larves de poissons zèbres, toute application humaine restant hors du projet.
Objectifs
Les maladies du foie liées à l’accumulation de graisse (appelées MASLD, anciennement NAFLD) sont de plus en plus fréquentes et représentent un véritable problème de santé. Elles commencent par une infiltration excessive de graisse dans les cellules du foie (stéatose), ce qui peut entraîner des complications plus graves comme l’inflammation du foie (MASH), puis évoluer vers de la fibrose, une atteinte sévère du foie (cirrhose) et, dans certains cas, un cancer du foie. Parmi les facteurs qui pourraient aggraver ces maladies, l’exposition prolongée à certaines substances chimiques appelées perturbateurs endocriniens (PEs) est particulièrement inquiétante. Ces substances, présentes dans l’environnement et certains produits du quotidien, pourraient perturber le fonctionnement normal du foie et favoriser la progression de ces maladies. Dans ce projet, nous cherchons à comprendre comment certaines substances chimiques de l’environnement, appelées perturbateurs endocriniens (PEs), pourraient influencer les maladies du foie liées à l’accumulation de graisse. Pour cela, nous allons produire en laboratoire des particules appelées vésicules extracellulaires adipeuses (AdVEs), issues de la graisse de souris ayant été exposées à différents niveaux de PEs. Ces particules pourraient jouer un rôle clé dans l’évolution de ces maladies. Pour cela, nous exposerons des souris de différentes souches (normales, obèses et nourries avec un régime riche en graisses) à des perturbateurs endocriniens. Après leur mise à mort, nous collecterons le tissu adipeux pour produire in vitro les AdVEs. Grâce à ces différents modèles expérimentaux, nous pourrons étudier comment le sexe et l’état métabolique des souris (obésité d’origine génétique ou liée à l’alimentation) influencent la production et la composition des vésicules extracellulaires adipeuses (AdVEs), ouvrant ainsi la voie à une meilleure compréhensions des interactions entre exposition environnementale, adiposité et dysfonctionnements métaboliques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer les effets d’une exposition prolongée à un mélange de substances chimiques appelées perturbateurs endocriniens (PEs), à deux niveaux d’exposition différents, dans des situations métaboliques variées. L’objectif est de mieux comprendre l’impact combiné de ces substances, en particulier lorsqu’elles sont associées à de l’obésité. Des études précédentes ont montré que certains de ces polluants, pris individuellement, ont peu d’effet, mais qu’en cocktail, ils peuvent perturber davantage le métabolisme en agissant ensemble. Cette approche aidera à mieux comprendre comment l’environnement influence notre organisme. Enfin, les vésicules extracellulaires issues de la graisse des souris seront utilisées pour étudier leurs effets soit sur des cellules en laboratoire, soit après injection dans des larves de poissons-zèbres. Ces modèles complémentaires permettront d’avoir une vision plus large des conséquences de ces substances dans un contexte pathologique particulier.
Procédures
Une partie des souris sera soumise à un régime riche en graisses HFD pendant toute la durée de l’étude. Et toutes les souris recevront, par gavage oral (5 secondes) et à neuf reprises, soit une huile servant de contrôle, soit une huile contenant un mélange de 4 perturbateurs endocriniens, à faible ou forte dose.
Impact sur les animaux
Le gavage hebdomadaire est la principale source de nuisance dans cette étude. Bien qu’indispensable pour une administration contrôlée des substances, cette méthode peut entraîner du stress pour les animaux. Pour réduire cet impact, les manipulations seront effectuées par du personnel qualifié, en utilisant une contention appropriée et en limitant la durée des manipulations. L’exposition aux substances étudiées vise à simuler une exposition environnementale chronique, comparable à celle à laquelle les humains peuvent être confrontés. Toutefois, l’administration répétée peut provoquer un stress physique, notamment à cause des manipulations fréquentes. L'obésité, qu'elle soit causée par un régime alimentaire spécifique ou une mutation génétique, peut entraîner des problèmes de mobilité, des troubles métaboliques tels que la résistance à l'insuline et une inflammation chronique. Toutefois, ces effets ne provoquent pas de douleur directe chez l'animal, bien qu'ils nuisent à son bien-être en réduisant sa capacité à se déplacer et en générant un stress physiologique.
Devenir
À la fin de la procédure toutes les souris seront mises à mort, afin de permettre le prélèvement du tissu adipeux nécessaire à l’isolement des vésicules extracellulaires.
Remplacement
Le développement des maladies hépatiques liées à l’accumulation de graisse est souvent associé à l’obésité et résulte d’interactions complexes entre plusieurs organes, notamment le foie, le tissu adipeux et le pancréas. Ces échanges impliquent également divers types cellulaires au sein du foie. Les perturbateurs endocriniens (PEs) agissent en perturbant les hormones, ce qui peut influencer ces mécanismes. En l’absence de modèle alternatif fiable pour reproduire l’obésité à l’échelle de l’organisme, nous utiliserons un modèle murin de souris déjà bien caractérisé. De plus, ces interactions complexes entre les organes, qui jouent un rôle clé dans les troubles métaboliques, ne peuvent être correctement reproduites qu’avec un modèle vivant.
Réduction
L’expérimentation sera réalisée avec un nombre d'animaux suffisant pour garantir des résultats fiables et statistiquement interprétables. Le nombre total d'animaux est déterminé en fonction du nombre de groupes nécessaires et du nombre d'animaux par groupe pour obtenir des données fiables. Pour extraire les vésicules extracellulaires provenant du tissu graisseux, une certaine quantité de matière est indispensable. Comme une seule souris ne fournit pas assez de tissu, il est nécessaire de regrouper celui de plusieurs animaux. Le nombre varie selon le type de souris utilisé : il en faut davantage pour les souris de poids normal, et un peu moins pour les souris obèses. Des tests statistiques ont montré qu’il fallait au minimum huit échantillons indépendants pour chaque condition afin de pouvoir comparer les résultats de façon fiable. Ces échantillons seront préparés séparément pour les mâles et les femelles, car les effets étudiés peuvent différer selon le sexe. Au total, ces besoins justifient l’utilisation de 720 souris pour l’ensemble de l’étude.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce, avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tubes en carton, morceaux de bois). Le protocole expérimental prévoit un suivi quotidien des animaux, basé sur l’observation de signes physiques et comportementaux prédéfinis, qui permettront de repérer tout signe de mal-être. Leur poids sera contrôlé deux fois par semaine. En cas de douleur ou de souffrance, des antalgiques pourront être administrés. Si l’état de l’animal ne s’améliore pas, une euthanasie pourra être pratiquée pour éviter toute souffrance prolongée, selon une grille d’évaluation spécifique. Les souris obèses, mâles ou femelles, seront placées par groupes de 2 ou 3 par cage, en tenant compte de leur poids et de la taille des cages, et des tétines plus longues seront installées sur les biberons d’eau pour faciliter la prise. Étant moins mobiles, une attention particulière sera portée lors de leurs transferts.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie pour ces études est la souris, c’est un modèle bien établi d’étude préclinique et facilement accessible, permettant d’étudier les effets des perturbateurs endocriniens dans un contexte physiologique complexe. Leur exposition à un gavage hebdomadaire est facile à réaliser, ce qui simplifie l’administration contrôlée des substances. Des souris adultes âgées de 8 à 12 semaines seront utilisées, car les maladies liées à l'accumulation de graisses dans le foie touchent principalement les adultes.
Role des hormones thyroïdiennes dans les altérations de mémoire liées à la consommation de régime obésogène
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une canule est implantée dans l'hippocampe de 1 124 souris par chirurgie stéréotaxique, geste qui peut provoquer des crises d'épilepsie et que l'animal peut décoller en se frottant. 1 700 souris vont être utilisées au total, toutes tuées à l'issue, 1 124 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 384 dans des procédures d'un niveau sévère. Le porteur ramène les nuisances à leur durée, deux tests de cinq minutes pour les troubles émotionnels et trois minutes de contention pour la mesure de masse grasse, quand 384 souris relèvent tout de même du niveau de souffrance le plus élevé. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour analyse de l'expression des gènes, électrophysiologie ou immunohistochimie, afin de comprendre comment un régime gras et sucré consommé dès l'adolescence altère la mémoire.
Objectifs
Le thème général du projet porte sur l’effet délétère d’une alimentation déséquilibrée (obésogène) sur la mémoire. Une alimentation trop riche en gras et en sucre augmente le risque de problèmes cognitifs comme la mémoire. La période d’adolescence est particulièrement sensible à ce type d’alimentation car le cerveau est encore en maturation. Les conséquences de difficultés de mémoire chez les adolescents sont importantes car elles vont impacter la performance scolaire et influencer la mémoire pour toute la vie. Il est donc important de comprendre la vulnérabilité spécifique à l'adolescence et de trouver les moyens de prévenir ces déficits de mémoire. Nos études précédentes ont mis en lumière l'implication des hormones thyroïdiennes dans ces déficits de mémoire et ont montré que la chrononutrition permet de prévenir ces troubles. L'objectif du projet présenté ici est de comprendre comment les hormones thyroïdiennes altèrent la mémoire associée à la consommation de régime obésogène durant l'adolescence et comment la chrononutrition permet de prévenir ces troubles. Une recherche pré-clinique est indispensable pour cette compréhension des mécanismes neurobiologiques mises en jeu de par les conditions expérimentales contrôlées (mêle nourriture, même condition de vie) et la possibilité d'étudier le cerveau au-delà de l'imagerie cérébrale.
Bénéfices attendus
L’achèvement des expériences proposées, sur une durée de 4 ans, devrait fournir des preuves de concept pour de nouvelles approches thérapeutiques potentielles utilisant l’alimentation limitée dans le temps (chrononutrition) pour traiter les troubles de la mémoire induits par l’obésité. Le projet fournira également de nouvelles connaissances sur les actions des hormones thyroïdiennes sur le cerveau, ce qui pourrait aider à traiter les pathologies associées à l’hypothyroïdie légère.
Procédures
Nous effectuerons des chirurgies sur 562 males et 562 femelles. Nous ne ferons pas de prélèvements sur animaux vigiles. 1316 animaux feront des tests de comportement qui n'engendrent pas de souffrance. 384 animaux ferons 2 tests de comportement pour estimer les troubles émotionnels, qui peuvent engendrer de l'angoisse mais chaque test ne dure que 5 min par animal.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont celles associées à la chirurgie stéréotaxique bien que toutes les précautions soient prises pour réduire la douleur ou les infections. L'implantation de canule dans l'hippocampe de souris peut entrainer parfois des crises d'épilepsie. La souris opérée peut parfois décoller la canule implantée en la frottant. La prise de poids sous régime obésogène est modérée et n’entraine pas de nuisance observable. Certains tests de comportement sont stressants mais ils ne durent que 5 min chacun. Enfin la mesure de masse grasse par RMN oblige à faire une contention de l’animal qui entraine un stress mais ne dure également que 3 min et les animaux sont préalablement habitués à cette contention pour atténuer l'angoisse associée.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure car nous faisons des analyses post-mortem: analyse de l'expression de gènes, de protéines, électrophysiologie ou immunohistochimie pour préciser les mécanismes moléculaires expliquant les déficits de mémoire et leur prévention par la chrononutrition.
Remplacement
L’objectif général du projet vise à comprendre chez l’animal les conséquences comportementales et neurobiologiques de régime obésogène sur la mémoire et les effets de la chrononutrition. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l’étude de la cognition et des émotions reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre par ailleurs que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles ou applicables.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux, nous effectuons plusieurs mesures sur le même animal dans un ordre précis afin qu'une première mesure n'influence pas la seconde. Pour les chirurgies nous nous entrainons sur des animaux produits mais non utilisés (par exemple souris récupérées de croisements de souris transgéniques n'ayant pas le génotype désiré) afin dêtre au point et réduire les pertes pour la réalisation des expérimentations. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes n'obligeant pas à répéter l'expérience. Aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.
Raffinement
Dans ce projet nous avons 5 à 10 souris par cage (excepté après chirurgie où les souris implantées de guide-canules sont 2 par cage pour diminuer le risque d'arrachement des implantations par bagarre). Toutes les cages ont au moins un enrichissement (maison en carton, barre à ronger, frisoti et carré de coton pour fabrique de nid). Nous assurons une surveillance quotidienne afin d'apporter des soins rapidement si nécessaire. Nous privilégions les approches non invasives (imagerie in vivo) et pour celles qui ne le sont pas nous appliquons les soins pre et post opératoires, l'anesthésie et l'analgésie. Nous faisons des habituations aux souris qui doivent subir des brèves contentions afin que celles-ci ne soient pas associées à de l'angoisse. Nous avons mis en place des critères de points d’arrêt précoces où nous intervenons très rapidement pour réduire le stress et la douleur des animaux si cela apparait.
Choix des espèces
Nous utilisons uniquement des souris car les expériences de comportement sont validés dans cette espèce et les appareillages sont disponibles. Les traitements nutritionnels sont faciles à conduire et divers aliments/régimes alimentaires sont disponibles commercialement. Enfin, nous disposons pour ce projet de diverses souris transgéniques permettant de répondre aux questions scientifiques posées, par exemple des souris déficientes pour la signalisation des hormones thyroïdiennes. La plupart des expérimentations en neurosciences sont conduites sur des rongeurs (rat ou souris), nos expériences enrichissent le corpus de données en permettant des comparaisons directes avec ce qui est déjà publié. Nous étudions les souris entre 3 et 15 semaines d'âge. Ces âges couvrent la période d'adolescence jusqu'à l'état adulte. Cette période du développement est en accord avec nos objectifs d'étudier l'effet d'une alimentation obésogène consommée dès l'enfance et couvrant la période d'adolescence.
Mécanismes de développement et de régénération du système visuel chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Un pincement de dix secondes sur le nerf optique, des injections directement dans l'œil, une chirurgie de quarante minutes pratiquée sur des embryons à travers l'utérus de leur mère. 4 520 souris vont être utilisées, dont 4 490 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées entre un jour et plusieurs semaines après la fin de leur procédure. S'y ajoutent trois tests de comportement de trois heures, trois fois par semaine pendant quatre semaines, pour mesurer si la connexion entre l'œil et le cerveau se rétablit, dans la perspective lointaine de traiter le glaucome. Le porteur écarte le poisson zèbre précisément parce que son système nerveux central régénère spontanément, et retient la souris pour la disponibilité de ses lignées transgéniques.
Objectifs
Le glaucome concerne plus de 10 millions de patients dans le monde. Cette maladie entraine la dégénération du nerf optique, le seul lien entre l’œil et le cerveau. Dans ce contexte, il s’agit de faire repousser le nerf optique et de le connecter correctement aux zones du cerveau qui traitent l’information visuelle. Ce projet a pour but de comprendre les mécanismes impliqués dans la mise en place de la connexion entre l'œil et le cerveau au cours du développement embryonnaire. Une fois ces mécanismes identifiés, il s’agira de les manipuler chez l’adulte pour induire la connexion entre l'œil et le cerveau et permettre un retour visuel fonctionnel.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comprendre comment le système visuel se forme chez l’embryon. Les mécanismes identifiés peuvent ensuite être utilisés afin de générer des approches thérapeutiques pour des maladies comme le glaucome où il faut de nouveau connecter l’œil au cerveau.
Procédures
Les souris peuvent subir une ou plusieurs injections : -injection dans l’œil: les souris sont endormies environ 30 min. L’injection dans l’œil dure 20s. -injection dans le cerveau: les souris sont endormies environ 40 min. La chirurgie dure 15 min -lésion du nerf optique : les souris sont endormies environ 30 min. La procédure dure 5 min, la lésion correspondant à 1 pincement de 10 secondes. -chirurgie chez l’embryon : les souris sont endormies environ 50 min. La chirurgie dure 40min. Les souris participeront à 3 tests de comportement pour étudier le fonctionnement du système visuel du cerveau. Elles sont testées durant 4 semaines avec une fréquence de trois fois par semaine, chaque test a une durée de 3h, acclimatation comprise.
Impact sur les animaux
Lors de la procédure de chirurgie in utero, il y a deux types de nuisances. Premièrement pour la mère gestante : les sutures peuvent s’infecter (ceci represent un risque faible) ou alors les points pourraient être arrachées. Pour les embryons, la chirurgie peut entrainer la mort précoce des embryons. L’injection dans l'oeil chez les souris adultes peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil La lésion du nerf optique chez les souris adultes peut entrainer l’inflammation de l’œil et/ou endommager l’œil. Le traitement génétique peut éventuellement entrainer des phénotypes dommageables.
Devenir
Notre projet nécessite de récupérer les tissus dans les meilleures conditions afin d’étudier l’étendue de la repousse axonale suite au traitement par nos molécules. A la fin de chaque procédure les animaux seront mis à mort entre 1 jour et plusieurs semaines plus tard.
Remplacement
Pour atteindre nos objectifs, les expériences sur les souris sont essentielles et non remplaçables car les mécanismes de croissance nécessitent l’intervention de différents types de cellules qui ne peuvent être mimés efficacement dans un système unicellulaire ou modélisé. Il est à noter que tous les candidats identifiés testés in vivo seront étudiées d’abord sur des cultures de tissues. Seuls les candidats les plus pertinents (ceux qui montrent un effet significatif en culture) seront manipulés in vivo chez la souris.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d’animaux utilisés dans ce projet : - tester les candidats identifiés in vitro sur des cultures de tissus. -L’utilisation de tests statistiques optimaux pour avoir le nombre d’animaux le plus restreint tout en gardant une valeur biologique et statistique suffisante. Seuls les candidats les plus pertinents in vitro seront utilisées chez la souris. Les conditions de régénérations avec le meilleur résultat in vivo seront utilisés dans pour les tests de comportement.
Raffinement
L’état de santé des animaux sera suivi quotidiennement tout au long de l’expérience. Avant chaque injection réalisée sous anesthésie, les souris reçoivent un antalgique local en crème. Après chaque injection, les souris seront placées sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil... Les douleurs post-opératoires seront prévenues par l’addition d’un antalgique dans l’eau de boisson). Des grilles de points limites adaptées sont utilisées pour le suivi des animaux.
Choix des espèces
Le développement et la régénération du système nerveux sont des phénomènes multifactoriels qui permettent la formation d’un circuit neuronal. La modélisation de ces processus dans un système unicellulaire (telle que la culture cellulaire) ne permet ni d’identifier correctement les mécanismes moléculaires ni de tester efficacement les capacités de régénération. La souris représente le modèle in-vivo pertinent grâce à une grande similitude anatomique avec l’homme. Ceci n’est pas possible avec d’autres modèles telles que le poisson zèbre dont le système nerveux central régénère spontanément ou la drosophile dont le système nerveux est trop éloigné de celui des mammifères. La souris permet l’utilisation de toutes les chirurgies nécessaires pour les études scientifiques que nous réalisons. La souris permet aussi l’utilisation de tests de comportement pour analyser le retour fonctionnel. Enfin, tous les modèles transgéniques nécessaires à notre projet sont disponibles chez la souris ce qui n’est pas le cas pour d’autres modèles tels que le rat. Pour l’ensemble des expériences proposées nous utiliserons des souris dont le système nerveux est en cours de maturation et chez l’adulte. Nous voulons étudier les mécanismes de régénérescence et de plasticité dans le système nerveux central adulte pour être le plus proche possible des lésions chez l’homme.