Rongeurs
Effets des oestrogènes sur les vaisseaux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Trois cents d'entre elles subissent une ovariectomie, 240 la pose sous la peau d'une capsule ou d'une mini-pompe, 140 une opération de la carotide et 140 une agression mécanique de cette même artère, plusieurs de ces interventions étant enchaînées sur les mêmes animaux pour en réduire le nombre. L'objet est de mesurer l'effet du vieillissement, de l'obésité et de la carence en œstrogènes sur les cellules qui tapissent les vaisseaux. Le porteur étend les bénéfices attendus jusqu'à une société "plus solidaire et équitable pour les femmes", alors que le projet reste une thèse de biologie vasculaire.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de décès à l'échelle mondiale, touchant aussi bien les hommes que les femmes, avec un risque accru chez ces dernières après la ménopause. Les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins situées à l’interface entre le sang et les tissus sont en première ligne face aux altérations métaboliques associées aux facteurs de risque cardiovasculaire : le vieillissement, l'obésité et la carence en œstrogènes (ménopause) chez la femme. Le projet de thèse a pour objectifs de définir 1) les impacts des facteurs de risque cardiovasculaire sur l’endothélium, 2) le rôle des dysfonctions endothéliales dans l’étiologie des pathologies cardiovasculaires dans deux lits vasculaires : l’aorte et les vaisseaux du tissu adipeux. Ce projet pourrait permettre de proposer la cellule endothéliale comme une cible précoce pour limiter le développement des maladies cardiovasculaires, en particulier chez la femme au moment de la ménopause.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait permettre de proposer la cellule endothéliale comme une cible précoce pour limiter le développement des maladies cardiovasculaires, en particulier chez la femme au moment de la ménopause. En plus d'améliorer la santé des femmes, notamment en ce qui concerne les risques cardiovasculaires, l'optimisation du traitement de la ménopause aura un impact positif sur les problèmes sociaux liés à cette période de transition. Actuellement, de nombreuses femmes n'optent pas pour une hormonothérapie en raison des préoccupations liées aux effets secondaires. Le développement d'un traitement plus sûr (présentant moins de risques cardiovasculaires et thromboemboliques) contribuera à alléger les contraintes physiques et émotionnelles, ainsi que les problèmes sociaux associés à la ménopause, tels que la discrimination au travail et la stigmatisation. Améliorer la qualité de vie des femmes en période de ménopause contribuera à une société plus solidaire et équitable pour les femmes.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Injection intrapéritonéale (5 à 10sec) (420 souris) - Gavage (30sec) (420 souris) - Injection sous-cutanée (10 à 30sec) (420 souris) - Prélèvement sanguin sur animaux endormis (1 à 2min) (140 souris) - Ovariectomie (10 à 20min) (300 souris) - Pose de capsule ou mini pompes en sous cutanée (5 à 10min) (240 souris) - Injection en intraveineuse (30sec à 1min) (240 souris) - Operation de la carotide (20 à 30min) (140 souris) - Operation mécanique de la carotide (20 à 30min) (140 souris)
Impact sur les animaux
Les expérimentations réalisées dans ce projet sont de classe modérée. L’ovariectomie, la pose de pellet, pose de mini pompes sont des chirurgies qui peuvent générer une douleur modérée et un stress lié aux manipulations. L’agression électrique ou mécanique de la carotide sont des chirurgies qui peuvent générer une douleur modérée ainsi qu’une légère perte de poids et une légère modification de la reprise d’alimentation après chirurgie. Elles peuvent également générer un stress lié aux manipulations.
Devenir
A l'issu de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des analyses et des prélèvements de tissus.
Remplacement
L'utilisation du modèle murin nous permettra d'identifier et de quantifier les changements progressifs et dynamiques impactant la cellule endothéliale qui surviennent après un traitement hormonal. Aucun système de culture cellulaire n'a pu reproduire des variations hormonales qu'auront à subir les cellules endothéliales et ceci d’autant plus que l’ensemble des lignées cellulaires endothéliales « perdent » l’expression du récepteur des oestrogènes. De plus l'étude de l'effet du sexe (via la sécrétion d'hormones stéroïdiennes : oestrogène et testostérone) font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant la réalisation de ce projet.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux pour cette étude, nous avons réalisé une veille bibliographique, tenu compte de nos expériences passées et conçu les expériences afin d’obtenir un pouvoir statistique suffisant avec un nombre minimum d’individus. Pour réduire au maximum le nombre d’animaux, plusieurs procédures expérimentales de classe modérée seront réalisées sur les mêmes groupes d’animaux dès lors que les animaux auront recouvré un bien-être général et dans la mesure où les procédures ne peuvent pas interférer entre elles.
Raffinement
Lors de leur arrivée en zone expérimentale les souris resteront en acclimatation pendant un minimum d'une semaine en présence d'enrichissement (de type sizzlenest, batons ou balle en bois) pour réduire le stress qui pourrait être causé par le transport. Dès leur arrivée, les animaux sont pris en charge par le personnel de la zootechnie compétent qui vérifiera leur état et bien-être. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Ce suivi aura pour but de détecter de la douleur, d’évaluer la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, il sera anesthésié puis, après perte de conscience, l’animal sera euthanasié. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis seront surveillés permettant de mettre en application l’arbre décisionnel pouvant aboutir aux critères d’arrêt des souffrances.
Choix des espèces
Le choix de l'espèce s'est orienté vers la souris car c'est le seul modèle pour lequel la modification génétique des cellules endothéliales est réalisable. Elle est utilisée dans de nombreuses publications nationales et internationales Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisé chez la souris adulte (à partir de 8 semaines).
Etude des mécanismes pathogènes et des facteurs environnementaux dans un modèle de sclérodermie chez la souris 2/3
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
1 214 souris vont être utilisées dans un modèle de sclérodermie, chacune pouvant recevoir 24 injections intrapéritonéales, 40 gavages, deux injections intraveineuses caudales et deux instillations oro-pharyngées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À cela s'ajoutent une imagerie, un acte chirurgical et des transports entre trois établissements, dont le porteur reconnaît qu'ils stressent les animaux. Les atteintes cutanées apparaissent vers la quatorzième semaine, la perte de poids et la mobilité réduite vers la dix-septième. Toutes les souris sont tuées, une partie faute de porter le génotype recherché, tandis que les bénéfices annoncés se limitent à identifier "à terme" de nouveaux candidats médicaments.
Objectifs
La sclérodermie est une maladie rare du tissu soutenant les organes et des petites artères dont la principale caractéristique est un durcissement (fibrose) de la peau et des organes internes. Les atteintes pulmonaires constituent les complications potentiellement graves de la sclerodermie. Les artères allant du cœur aux poumons peuvent également être affectées ce qui entraîne une hypertension artérielle pulmonaire. La fibrose est la conséquence d’une réaction inflammatoire inadaptée, il existe en effet une activation anormale du système immunitaire. Les causes de cette maladie sont favorisées par des facteurs de l’environnement. La silice a été reconnue comme responsable du déclenchement de la maladie. Notre projet a pour but de bloquer, par une approche thérapeutique, les molécules engagées dans l’activation des cellules et d’explorer l'impact des contaminants environnementaux sur la gravité de la maladie.
Bénéfices attendus
A terme, les résultats de ce projet permettront d'éclairer notre compréhension sur les mécanismes mis en jeu dans le développement de la maladie. Ces données nous permettront d'identifier de nouveaux candidats médicaments dans cette maladie capables de prévenir ou freiner le développement des atteintes potentiellement mortelles chez les patients.
Procédures
Le projet se déroulera dans 3 établissements utilisateurs : l’élevage et traitement dans l’établissement 1, l’imagerie dans l’établissement 2, la chirurgie dans l’établissement 3. Les animaux vigiles seront soumis à : 1) contention et injections intrapéritonéales tous les 2 jours pendant 2 mois, au total 24 injections d’une durée de 20 secondes 2) contention et gavage 5 jours consécutifs pendant 2 mois, au total 40 gavages d’une durée de 20 secondes, 3) injection intraveineuse caudale réalisée 2 fois d'une durée de 40 secondes. Les animaux anesthésiés seront soumis à : 1) Instillations oro-pharyngées réalisée 2 fois sous anesthésie générale en 2 minutes 2) prélèvement sanguin unique sous anesthésie générale en 30s 3) imagerie unique sous anesthésie générale en 5 minutes 4) acte chirurgical unique sous anesthésie générale en 15 minutes.
Impact sur les animaux
Le modèle va induire à partir de 14 semaines des potentielles atteintes cutanées. A partir de 17 semaines, une perte de poids et une mobilité réduite pourraient être observées. le gavage va induire une irritation potentielle et du stress, les injections intrapéritonéales et intraveineuses vont induire du stress et une douleur légère de courte durée. L’instillation oropharyngée va induire du stress. La chirurgie pourra induire une douleur. Les transports des souris entre les 3 sites utilisateurs vont induire du stress aux souris.
Devenir
Une partie des animaux seront mis à mort car sans génotype d'interêt. L'autre partie seront mis à mort pour prélèvement de tissus spécifiques : sang, poumon, rate, peau, afin de réaliser une évaluation approfondie de l’atteinte pulmonaire et de l’hypertension artérielle pulmonaire par différentes techniques.
Remplacement
Les cellules spécifiques du système immunitaire ont été traitées avec les différentes molécules thérapeutiques et ont montré leur intérêt dans des expérimentations in vitro. Néanmoins, ces expériences de cultures cellulaires ne permettent pas de recréer les interactions entre les différentes cellules de l’organisme. Ainsi l'expérimentation animale est un élément clé de ce projet.
Réduction
Un nombre minimum d'animaux nécessaires, déterminé par une analyse de puissance statistique, sera inclus dans chaque groupe. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Nous nous efforcerons quotidiennement de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Les traitements débutent à un stade précoce avant l’apparition des premiers signes cliniques. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Une surveillance régulière et une application de points limites stricts et spécifiques au projet permettra de garantir le bien-être des animaux. Une grille de score sera utilisée et des actions réalisées en cas d’atteintes, L’instillation oropharyngée a été choisie car elle est moins invasive et moins douloureuse qu’une chirurgie, elle sera réalisée sous anesthésie générale. Des anesthétiques seront utilisés pour le prélèvement sanguin. L’imagerie sera réalisée sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sur souris ayant reçu un analgésique, puis une anesthésie générale. Les souris seront transférées dans des cages de transport agrées, bords opaques, sans visibilité de l’extérieur.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les études de processus inflammatoire. Seule cette espèce possède une lignée transgénique permettant l’étude de la fibrose et de l'hypertension pulmonaire avec une séquence temporelle identique à celle de la maladie humaine. Les souris jeunes adultes seront mises en accouplement à 8 semaines. Les souris génétiquement modifiées et les souris contrôles seront âgées soit de 6 à 14 semaines pour l’administration de traitement.
Evaluation d’anticorps thérapeutiques ciblant des facteurs de virulence bactériens
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Infectées par la bactérie de l'anthrax puis traitées par un anticorps monoclonal, 796 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les effets attendus sont une mobilité fortement réduite, une paralysie possible et la formation d'œdèmes. Le porteur indique que toutes les manipulations susceptibles de causer des désagréments se font sous anesthésie, tout en listant parmi ces effets des douleurs lors des injections et des prélèvements. Toutes les souris sont tuées à la fin du protocole, au motif que des animaux infectés seraient eux-mêmes une source de contamination.
Objectifs
L'anthrax, maladie rare qui affecte principalement la peau et les poumons, est due à une bactérie considérée comme l'un des agents potentiellement les plus dangereux en matière de bioterrorisme. Dès les premières phases de l’infection, deux toxines se forment let sont libérées dans l’organisme de la personne infectée, pouvant entraîner rapidement son décès. Bien que les antibiotiques soient efficaces pour éliminer la bactérie, il est crucial de neutraliser rapidement ces toxines afin de diminuer le taux de mortalité, particulièrement élevé dans le cas de l'anthrax pulmonaire. Ainsi, combiner une antibiothérapie avec une immunothérapie ciblant ces toxines présente un intérêt thérapeutique notable. Dans ce contexte, nous avons déjà développé une série d’anticorps monoclonaux spécifiques des toxines qui pourraient être utilisés à cet effet. Nous les avons partiellement caractérisés et évalués pour leur capacité de neutralisation dans un modèle de cytotoxicité cellulaire in vitro, ce qui nous a permis de sélectionner un nombre restreints d’anticorps aux propriétés protectrices prometteuses. Le projet vise désormais à évaluer leur efficacité in vivo dans des modèles d’infection et à sélectionner le meilleur anticorps ou la meilleure combinaison d’anticorps protecteurs.
Bénéfices attendus
La bactérie responsable de l’anthrax est considérée comme l’un des agents biologiques les plus dangereux. Bien que les antibiotiques soient efficaces pour éliminer cette bactérie, une neutralisation rapide des toxines produites au cours de l’infection est essentielle pour réduire le taux de mortalité, particulièrement dans le cas de l’anthrax pulmonaire où le taux de mortalité approche 100% sans traitement. Le bénéfice attendu de ce projet est de rendre disponible un traitement combinant un ou des anticorps monoclonaux avec des antibiotiques pour assurer une prise en charge rapide et efficace des personnes contaminées.
Procédures
Toutes les manipulations susceptibles de causer des désagréments (prélèvements sanguins, instillation/inoculation d’agents infectieux et injection d’anticorps) seront effectuées sur des animaux sous anesthésie. Seules la pesée et l’observation de leur état général quotidiennes seront réalisées sur animaux vigiles. Les animaux seront infectés rapidement (temps de réalisation : 60 secondes) et un seul traitement anticorps sera ensuite administré par animal en 30 secondes. Un prélèvement sanguin sera réalisé 24h après infection avec un temps de réalisation de 30 secondes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables dans ces modèles d’infection sont une mobilité fortement réduite, une possible paralysie, la formation d’œdèmes, ainsi que des douleurs lors des injections et/ou prélèvements et le stress lors des manipulations et pesées.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans le projet seront euthanasiés à la fin du protocole, le but étant d’éliminer les animaux infectés ou potentiellement infectés car ils pourraient eux-mêmes être source de contamination.
Remplacement
Des tests préliminaires in vitro utilisant des cellules en culture ont été réalisés dans le laboratoire afin de sélectionner les anticorps les plus prometteurs avant de réaliser les tests in vivo. Ces tests cellulaires permettent de réaliser un grand nombre de combinaisons, et ainsi d’éviter une utilisation importante d’animaux. Cependant, il est déjà établi que, bien que ces modèles soient utiles pour une présélection ou une pré-évaluation, des disparités subsistent entre les résultats obtenus in vitro et ceux obtenus in vivo : les mécanismes d’action des anticorps peuvent être multiples et un effet à l’échelle cellulaire ne reflète pas toujours un effet sur un organisme entier. Il est donc indispensable d’utiliser des modèles d’études plus complexes, tels que les modèles murins, qui prennent en compte la distribution des agents infectieux et celle de la molécule thérapeutique, ainsi que les réponses inflammatoire et immunitaire. En l’état actuel des connaissances, il n’existe pas de modèles in vitro ou in silico capables de rendre compte de cette complexité.
Réduction
Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, seul un nombre restreints d’anticorps thérapeutiques seront testés chez l’animal. Lors de travaux préliminaires, un grand nombre d’anticorps a été évalué dans un modèle cellulaire pour leur capacité à neutraliser les toxines, ce qui a permis de sélectionner les anticorps les plus prometteurs. Sur la base des analyses statistiques, le nombre d’animaux par lot a été défini de façon à recueillir suffisamment de données pour une évaluation et une comparaison fiables des anticorps thérapeutiques.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en cage collective afin de favoriser les relations sociales. Une maison en carton ainsi qu’une feuille de cellulose seront ajoutées afin d’optimiser le bien-être des animaux et leur permettre de faire leur nid. Les animaux seront observés biquotidiennement tout au long des procédures par du personnel qualifié. Pour réduire le stress et la douleur dus aux expérimentations, celles-ci seront effectuées sous anesthésie. Pour éviter une déshydratation et une dénutrition possible des animaux, de l’aliment hydraté sera disposé dans les cages. Une grille d’évaluation de la douleur et de l’état de santé des animaux sera établie, décrivant les signes (physiques et comportementaux) dont l’apparition justifierait l’euthanasie de l’animal pour limiter sa souffrance.
Choix des espèces
Dans la littérature, le modèle murin est majoritairement utilisé, étant donné sa sensibilité aux toxines bactériennes. De plus, la caractérisation du système immunitaire de la souris a démontré une similitude suffisante avec celui de l’humain, permettant ainsi des conclusions pertinentes. Les animaux utilisés seront au stade adulte (22-24g), un stade où le système immunitaire est pleinement mature. Cette maturité est essentielle pour étudier les effets des toxines et des traitements administrés sur le système immunitaire.
Rôle du cholestérol sur le développement de métastases à partir de cellules prostatiques humaines
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Tuées au bout d'un mois pour que soient prélevées la tumeur greffée et les tissus atteints à distance, 44 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans la prostate, sous anesthésie, une greffe de cellules de cancer prostatique humain, et une partie d'entre elles trois injections intrapéritonéales par semaine d'un inhibiteur d'entrée du cholestérol. Le porteur fixe le protocole à un mois, durée qu'il présente comme suffisante pour quantifier l'essaimage métastatique avant que les métastases n'atteignent des tailles douloureuses. S'agissant d'une prolongation, il affirme qu'une analyse rétrospective confirme l'absence de toute nuisance liée à l'implantation, tout en maintenant un suivi renforcé pour détecter des nuisances inattendues.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans l’étude et la compréhension des mécanismes promoteurs de la dissémination métastatique de cellules tumorales prostatiques. Nous analysons l’étendue de la dissémination tumorale dans les tissus distants de la tumeur greffée grâce au suivi de fluorescence émise par les cellules. Plusieurs types de cellules modèles seront utilisées présentant des modifications génétiques d'intérêts. Alternativement, les souris porteurs de greffes seront traitées avec des inhibiteurs d'entrée du cholestérol. Un mois post-greffe, les tissus seront prélevés et analysés par des techniques permettant l’étude de marqueurs d’agressivité tumorale.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont d'évaluer le bénéfice thérapeutique potentiel d'un ciblage du récepteur des HDL pour le traitement des lésions métastatique de cancer de la prostate sur un modèle préclinique. Bien entendu, ces résultats sont à intégrer dans un projet de recherche plus large conduit sur les modèles cellulaires, pour définir les paramètres d'invasion et de migration des cellules, et un volet d'étude conduit sur une cohorte humaine de tumeurs prostatique visant à définir le potentiel pronostique et thérapeutique de cette cible.
Procédures
Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale visant à réaliser la greffe des cellules d'intérêt qui dure environ 15 minutes (procédure de mise en anesthésie + geste opératoire + réveil). Cette intervention sera réalisé avec les préconisations d'usage pre, per et post-opératoire qui assureront une absence de nuisance lié à la prise en charge anesthésique et antalgique. Puisqu'il s'agit d'une demande de prolongation, nous bénéficions d'une analyse retrospective qui confirme qu'aucune nuisance n'est observée suite à la procédure d'implantation. Néanmoins, nous maintenons un suivi post-procédure renforcé, comme indiqué dans la demande, pour assurer un bien-être optimal des animaux inclus dans le protocole. Les animaux des lots 5 et 6 correspondant aux traitements pharmacologiques seront soumis à des injections par voie intraperitoneale trois fois par semaine. Cette injection nécessite une contention de l'animal et une nuisance lié à la piqure, l'intégralité du geste ayant une durée de 10 à 15 secondes.
Impact sur les animaux
La procédure d'implantation intraprostatiques des cellules PC3 est maitrisée et a été conduite à plusieurs reprises dans le laboratoire. Ainsi nous avons un très bon recul sur cette procédure. L'implantation de cellules tumorales au long court sur une souris porte-greffe peut-être associée à certaines douleurs, voir altérer le statut sanitaire de l'animal, en fonction de la pousse tumoral. Le protocole proposé se trouve en dehors de cette fenêtre puisque limité à 1 mois. Nous avons un bon recul sur la cinétique de développement de la tumeur et métastases associées, la cinétique de 1 mois est optimale car permet de quantifier l'esseimage métastatique sans permettre aux métastases d'attendre des tailles critiques qui seraient suceptibles d'induire de la souffrance chez l'animal. Malgré tout, une attention particulière sera apportée sur l'état de bien être et de souffrance éventuelle de l'animal pour identifier toutes nuisances inattendues.
Devenir
Mise à mort pour prélèvements du site primaire d'implantation de la tumeur et des tissus distants pour un bilan d'extension métastatique.
Remplacement
Cette étude fait suite à des tests réalisés ex vivo en culture de cellules ayant permis de caractériser les paramètres d’agressivité. Grâce à cette approche rationnelle, nous avons ainsi sélectionné les modèles ayant démontrés leur efficacité, nous avons également déterminé les doses optimales pour les traitements pharmacologiques. Une partie des tests seront également complété par des analyses sur des tumoroïdes en culture 3D pour apprécier certain paramètres biologiques. L'ensemble de ces travaux complémentaires nous permet de réduire de manière considérable la quantité d'animaux utilisés en les substituant par des approches alternatives.
Réduction
le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante à l’issue du protocole, celui-ci a été fixé à 44 individus.
Raffinement
En parallèle, la dissémination de cellules tumorales peut conduire à l’apparition de lésions douloureuse pour l’animal. Un suivi régulier tout au long du protocole sera mis en place pour évaluer l’apparition de signe de douleur et une prise en charge par traitements antalgiques. Les points limites d’expérimentation seront particulièrement adaptés à ce risque. Un enrichissement important de la cage est prévu dans le but d’optimiser le bien-être animal
Choix des espèces
Le modèle souris correspond au standard pour la greffe de cellules tumorales humaines et l’étude de la formation de métastases chez les mammifères. En effet, ce modèle vient en complément des modèles d’étude in vitro d’invasion et de mobilité cellulaire. Il est important de noter que les cellules utilisées in vivo ont été validés en amont sur leurs propriétés d’agressivité tumorale (migration, invasion, prolifération). Nous utiliserons des individus de 2 à 4 mois. Les cellules utilisées étant des cellules prostatiques nous devons utiliser des animaux en période post-pubertaire.
Formation du personnel aux gestes techniques nécessaires à l’expérimentation chez des souris hébergées en isolateurs stériles
- Formation professionnelle
Pour entraîner des expérimentateurs aux gestes techniques en isolateur stérile, 600 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal subit plusieurs gestes répétés : gavage, injections intrapéritonéale et sous-cutanée sur animal vigile, injection intra-rectale sous anesthésie, prélèvements sanguins à la veine submandibulaire et à la veine caudale, puis dislocation cervicale. Les souris sont tuées dès qu'elles atteignent 4 mois ou le nombre maximal de gestes prévus, à raison d'une quinzaine d'animaux par personne à former. Les novices s'exercent d'abord sur des cadavres, mais le porteur conclut que seul l'animal vigile en isolateur permet une formation adéquate.
Objectifs
La plate-forme assure l’élevage de rongeurs dépourvus de micro-organismes hébergés dans des enceintes confinées et stériles, appelées isolateurs. Elle met aussi à disposition des équipes de recherche les isolateurs nécessaires aux protocoles expérimentaux sur rongeurs dépourvus de microorganismes ou à microbiote (ensemble des micro-organismes et bactéries) contrôlé. La manipulation de ces animaux en isolateur demande une adaptation spécifique des gestes techniques habituels, à laquelle doivent être formés les expérimentateurs. Nous souhaitons donc mettre à leur disposition, sous la supervision d’un tuteur, un isolateur hébergeant des souris, grâce auquel les personnes concernées pourront se familiariser avec les spécificités des manipulations en isolateurs : savoir gérer l’espace disponible tout en prenant les précautions nécessaires pour éviter tout incident (coupure d’un gant avec une paire de ciseaux, trou avec une aiguille etc.) ; s’entrainer à l’entretien des animaux (changer la litière, remplir des biberons etc.) ; se former à certaines techniques d’expérimentation (contentions, gavages, injections et prélèvements de sang) en conditions réelles. Ces apprentissages permettront par la suite de favoriser la qualité de réalisation des protocoles et le bien-être des animaux utilisés dans les projets de recherche. L’objectif général de ce projet est donc de veiller à respecter la législation en matière de protection et de bien-être des animaux d’expérimentation en assurant la formation pratique initiale et le maintien des compétences de toute personne devant participer à des projets expérimentaux en isolateurs.
Bénéfices attendus
Les formations permettent d’avoir du personnel qualifié qui pourra intervenir sur des projets au sein de la plateforme. De plus, avoir du personnel formé aura pour conséquence une réduction du stress des animaux utilisés lors des procédures.
Procédures
Les souris subiront les interventions suivantes (7 types d’intervention) : - Gavage (1 à 2 minutes) sur animal vigile - Injection intrapéritonéale (1 minute), sous-cutanée (1 minute) sur animal vigile - Injection et intra-rectale (1 à 2 minutes) sur animal anesthésié - Prélèvement sanguin au niveau de la veine submandibulaire (1 à 2 minutes) et de la veine caudale (1 à 2 minutes) sur animal vigile - Dislocation des cervicales (1 minute) sur animal anesthésié et vigile. Les souris ne subiront pas toutes les procédures mais plusieurs d’entre elles, si les expérimentateurs en ont besoin, le tout en respectant des temps de récupération pour chaque type d’intervention.
Impact sur les animaux
Les gestes qui seront réalisés sur les souris sont les gestes les plus habituellement réalisés dans les protocoles conduits à la plateforme, à savoir contention, gavage, prélèvement sanguin, injections. Ils peuvent provoquer un stress (contention, gavage) ou une douleur (prélèvement sanguin, injection, dislocation) légère, de courte durée nous avons prévu des points limites adaptés à chaque procédure.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par du personnel qualifié lorsque les animaux auront atteint l’âge limite de 4 mois ou qu'ils auront atteint le nombre maximum de geste technique.
Remplacement
Les animaux sont des modèles expérimentaux permettant d’étudier des questions d’intérêt biologique très variées et c’est pourquoi les animaux, et plus particulièrement les souris sont largement utilisées dans les projets expérimentaux. Pour une bonne conduite des projets expérimentaux et afin de respecter au mieux la législation en matière de protection et bien-être des animaux d’expérimentation, les manipulateurs doivent avoir été formés aux gestes qu’ils pratiqueront sur les souris en isolateur. Les manipulateurs novices recevront une formation sur cadavres au préalable avant d’utiliser les animaux vigile. Cependant, seul l’animal vigile en conditions d’isolateur peut répondre à l’objectif du projet et permettre une formation adéquate des manipulateurs.
Réduction
Sur une année, nous prévoyons d’utiliser au maximum 120 animaux donc pour 5 ans nous prévoyons d’utiliser 600 animaux maximum pour les formations. Le nombre exact d’animaux par geste technique n’est pas déterminé car il dépendra des besoins en formation des manipulateurs (5 manipulateurs à former en moyenne par an). Cependant, nous pouvons prévoir qu’un maximum de 15 souris seront utilisées par manipulateurs pour apprendre le geste technique souhaité.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans un isolateur non stérile dans des cages standards par groupe de sexes identiques (2 à 5 par cage) avec un enrichissement comprenant du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher. Les animaux seront manipulés plusieurs jours avant le début des procédures afin de les habituer aux manipulateurs. Les animaux sont surveillés quotidiennement. De plus, il sera mis en place une fiche précise de suivi des animaux où sera notée la date, la technique expérimentée (ex : gavage), la cage avec le nombre d’animaux ainsi que le nom de l’utilisateur et du formateur. Cette fiche permettra de respecter le temps de récupération de chaque souris entre chaque procédure réalisée. Des points limites ont été déterminés pour s’assurer du bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est très largement utilisée comme modèle expérimental. Au sein de la plateforme, les projets sont majoritairement réalisés chez la souris. C’est pourquoi nous avons besoin de cette espèce afin de former les expérimentateurs aux gestes techniques qu’ils seront amenés à utiliser dans leurs projets. Les animaux seront utilisés à partir de 6-8 semaines car la majorité des expérimentations utilisent des animaux à partir de cet âge-là. Le personnel se forme sur les animaux qui utiliseront dans leur projet.
Le rôle du système inhibiteur du système vestibulospinal
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
32 souris subissent une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie générale pour recevoir une injection dans la moelle épinière cervicale, et sont toutes tuées ensuite pour l'étude histologique. Le porteur annonce des saignements, une douleur après l'opération, un risque d'infection de la suture, une réduction de la mobilité, un déséquilibre et une perte de poids, dans des procédures classées en souffrance sévère. L'objet est de cartographier les neurones inhibiteurs qui utilisent la glycine pour réguler la posture et l'équilibre, un travail d'anatomie dont le RNT n'annonce aucune application clinique. Des essais pilotes chez le xénope ont servi à caler les protocoles avant le passage à la souris, que le porteur juge "indispensable" faute de modèle in vitro reproduisant ces conditions.
Objectifs
Ce projet de recherche cherche à mieux comprendre comment le cerveau et la moelle épinière travaillent ensemble pour contrôler nos mouvements, comme se tenir debout ou marcher de façon stable. Même si on connaît bien certaines parties du système nerveux qui envoient des signaux pour activer les muscles, les interactions avec les parties qui inhibent ou freinent ces signaux sont moins bien comprises. Pour étudier ces mécanismes, nous allons utiliser des souris spécialement modifiées pour rendre visibles des neurones particuliers qui jouent un rôle d'inhibition, utilisant une substance appelée glycine. Grâce à ces souris, nous pourrons cartographier et analyser ces réseaux de neurones, pour mieux comprendre leur rôle dans la coordination des mouvements et de la posture, et voir comment ils interagissent avec les autres circuits nerveux. .
Bénéfices attendus
Notre projet permettra une meilleure compréhension du système postural impliqué dans le maintien corporel d’un être vivant. L’étude anatomique de ce système d’adaptation apportera des connaissances utiles pour la compréhension de son fonctionnement en situation physiologique et pathologique.
Procédures
32 animaux seront soumis à 1 chirurgie d’injection dans la moelle épinière, d’une durée de 30 à 45 min sous anesthésie générale.
Impact sur les animaux
Il s’agit de risques généraux suite à la chirurgie tel que le saignement, la douleur post-chirurgicale, l'infection au niveau de la suture, la réduction de la mobilité à court terme, le déséquilibre, la perte de poids.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation pour l'étude histologique.
Remplacement
En accord avec la Directive Européenne et le principe des 3Rs, nous avons réfléchi à nos expériences afin d'intégrer les approches alternatives. A notre connaissance, seuls les modèles mammaliens, et plus particulièrement la souris, répondent aux questions scientifiques posées par notre étude. Le recours donc au modèle animal « souris » est indispensable pour la réalisation de cette étude qui nécessite une évaluation comportementale et un ciblage de neurones spécifiques. Aucun modèle in vitro ne peut reproduire de telles conditions. Cependant, nous avons réalisé des études pilotes chez le xénope pour mettre au point les protocoles et s’assurer de leur fonctionnement avant de les adapter à la souris.
Réduction
Avant la mise en place de ce projet, nous avons réalisé des expériences pilotes pour la mise au point des injections spinales cervicales afin de diminuer au maximum le nombre d’animaux du projet. La réduction du nombre d’animaux a été prise en compte tout en conservant une signification scientifique statistique. Le nombre maximal, en prenant en compte les variations expérimentales, 8 animaux par groupe pour cette étude anatomique. De plus, nous utiliserons des souris mâles et femelles, ce qui permet d’inclure tous les animaux des portées
Raffinement
Tous les protocoles sont réalisés par des experts dans le domaine et sont ainsi optimisés pour soulager le stress et la douleur des animaux. Les animaux sont hébergés tout au lond de l'expérimentation en cage collective avec enrichissement du milieu (tunnel, maisonnette, cellulose pour le nid). L’utilisation d’anesthésique et d’analgésiques est prévue pour soulager les douleurs post-chirurgicales. De plus, de la nourriture enrichie est fournie pendant au moins 3 jours suivant la chirurgie et si besoin plus. Les animaux seront surveillés quotidiennement par l'expérimentateur avec une surveillance renforcée après la chirurgie jusqu’à la fin de l’expérimentation avec la mise en place d’une réhydratation, un réchauffement, des traitements vétérinaires si besoin. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter la souffrance des animaux, pour cela, les animaux seront suivis régulièrement pour détecter d’éventuels signes cliniques (perte de poids, apparence physique, comportements provoqués/non provoqués). En plus des points limites spécifiques (score>4) sont déterminés suite à la chirurgie (poids, mobilité, respiration) et ce pendant 3 jours après la chirurgie. Les sutures seront particulièrement surveillées pendant la première semaine et seront reprises en cas d’ouverture.
Choix des espèces
La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. C’est l’espèce qui présente le plus de modèles génétiquement modifiés permettant de répondre à notre problématique. Il n’existe en effet pas de modèles autres de la modification génétique qui nous interesse dans ce projet. Nous utiliserons des animaux adultes âgés de minimum 8 semaines lorsque les réseaux neuronaux sont mis en place et le système nerveux est mature.
Développement d’un traitement de thérapie génique pour la déficience en acide lipase lysosomale par édition du génome.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Toutes tuées à l'issue, 1 700 souris déficientes en lipase acide lysosomale vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chacune subit un prélèvement au bout de la queue, quatre injections espacées de vingt-quatre heures destinées à détruire son système sanguin, une greffe de cellules souches sous anesthésie, puis jusqu'à trente-six prises de sang. Le porteur indique que l'échec de la greffe empêchera définitivement ces souris de produire du sang et les tuera, tout en classant 1 500 animaux sur 1 700 en souffrance légère. Ces souris sont construites pour accumuler des graisses dans les organes comme les nourrissons atteints de la maladie de Wolman, qui meurent entre trois et huit mois. L'effectif retenu repose sur des groupes de huit souris, sans que le RNT explique le passage de ce chiffre au total de 1 700.
Objectifs
Le déficit en la protéine : lipase acide lysosomale (LAL) est une maladie génétique rare. Elle induit une accumulation de gras au niveau des organes, notamment dans le foie qui est fatal chez les patients. La gravité de l'affection dépend de la quantité d'enzymes. La forme la plus sévère de la maladie (maladie de Wolman), absence totale de l’enzyme (
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de développer un traitement curatif pour la déficience en protéine LAL qui pourra être utilisé pour d'autres maladies.
Procédures
Les souris auront un petit prélèvement à l'extrémité de la queue pour analyser leur profil génétique. Les souris recevront 4 injections de traitement pour supprimer leur système sanguin, espacées de 24 heures, chaque injection prenant environ 10 minutes. 24 heures après la dernière injection, elles recevront une injection de cellules souches sous anesthésie, ce qui prendra aussi environ 10 minutes. Quatre semaines plus tard, un prélèvement de sang sera effectué, sous anesthésie gazeuse, pendant environ 10 minutes. En tout, les souris auront 5 injections et plusieurs prises de sang (au maximum 36).
Impact sur les animaux
Les souris déficient en lipase acide lysosomale vivent moins longtemps (environ 8 à 10 mois) et ont un excès de plaquettes dans le sang, mais cela n'affecte pas leur développement ni le bon fonctionnement de leurs organes, car aucune caillot de sang n'a été observé. Le prélèvement à l'extrémité de la queue provoque une douleur passage (
Devenir
Toutes les souris du projet seront euthanasiées.
Remplacement
Pour évaluer de nouveaux traitements innovants basées sur la correction de cellules souches de patient pour la déficience en lipase acide lysosomal, nous devons d’avoir étudier la transplantation de cellules souches dans un modèle de souris. En effet, seuls des cellules de patient sont disponibles actuellement in vitro, ce qui n’est pas suffisant pour reproduire la complexité du compartiment hématopoïétique.
Réduction
Afin de respecter le principe de réduction du nombre de souris, nos prévisions d'effectif sont basées sur des calculs de statistiques comparant la prise de greffe à notre valeur observée de référence. Pour cela, nous avons utilisé un test statistique et selon ces calculs, il faudrait inclure 8 souris par groupe d'études.
Raffinement
Les souris déficientes en lipase acide lysosomale sont plus petites que les souris saines, mais n'ont pas de problèmes de motricité ou de douleur, donc aucune condition particulière d’hébergement n'est nécessaire. Après le prélèvement nécessaire à l'identification des souris, celles-ci seront surveillées pendant une demi-heure afin de s'assurer qu'il n'y a pas de complications. Lors de la réalisation des gestes techniques, les souris seront anesthésiées. Tout au long des études, l'état général des souris (apparence, posture, comportement, etc.) ainsi que leur poids seront surveillés une fois par semaine. Des points limites ont été définis et seront appliqués afin d'éviter toute souffrance des animaux. En cas de plaies, un traitement local sera appliqué. Si les plaies ne cicatrisent pas dans un délai d'une semaine, les souris seront euthanasiées.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris déficientes en lipase acide lysosomal car ce modèle mine l’accumulation de lipides observés chez les patients. De plus, la protéine lipase acide lysosomal humaine est fonctionnelle sur les souris, donc permet d’étudier l’effet thérapeutique in vivo de notre approche. Le prélèvement de queue sera réalisé 7 jours après la naissance des souris. Afin d’étudier la correction de la maladie, les animaux seront greffés à l’âge adulte entre 8 et 12 semaines pour reproduire les procédures de thérapie génique appliqués à l’homme adulte. L’efficacité du traitement nécessitera un suivie de 16 semaines et de 9 mois (36 semaines).
Une nouvelle opportunité pharmacologique pour limiter le développement de l’insuffisance cardiaque post-infarctus du myocarde dans un modèle murin de pré-diabète
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
Pour tester une molécule nommée GC7 sur l'insuffisance cardiaque qui suit un infarctus, 112 souris rendues pré-diabétiques par un régime riche en gras et en sucre vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal suit ce régime pendant dix à vingt-six semaines, subit cinq jeûnes de six heures suivis d'injections de glucose ou d'insuline et de prises de sang, cinq échocardiographies sous anesthésie générale, puis une chirurgie qui bloque une artère du cœur pendant quatre-vingt-dix minutes avant le réveil. Le porteur décrit une prise de poids importante, un retentissement progressif sur la fonction cardiaque, une douleur modérée de quelques heures après l'opération, et un risque de mortalité péri-opératoire "non nul" intégré au calcul des effectifs. Toutes sont tuées huit, douze ou seize semaines après l'infarctus, pour prélever le cœur, le foie, les reins et le tissu adipeux.
Objectifs
L’insuffisance cardiaque touche près d’un million de personne en France et on lui attribue 70 000 décès par an. Elle se traduit par un remodelage du muscle cardiaque délétère associé à des altérations fonctionnelles qui conduisent le plus souvent à la mort. Elle survient, très souvent suite à un infarctus du myocarde aigu dont la survenue est plus fréquente chez les patients avec un syndrome métabolique. L’objectif du projet est d’utiliser un modèle murin ayant développé un pré-diabète. Nous induirons sur ce modèle un infarctus du myocarde dans le but d’étudier le developpement d’une insuffisance cardiaque. Nous testerons les effets d’une drogue nommée GC7 ayant pour cible un facteur d’initiation de la traduction (protéine se liant au ribosome pour permettre la traduction de l’ARNm en proteines) EiF5A, en aigue, sur la taille d’infarctus, et à long terme sur le developpement d’une insuffisance cardiaque en verfiant si la poursuite d’une diète riche en gras et en sucre altère ou non les effets du traitement. Des études antérieures ont pu montrer que cette drogue permet de moduler l’énergétique mitochondriale. La limitation de l'infarctus et l'amélioration de la récupération fonctionnelle à long terme sont des objectifs majeurs pour améliorer la morbi-mortalité et le bien-être des patients. C’est pourquoi, le suivi dans le temps de ce modèle nous permettra de mieux comprendre l’évolution de cette pathologie cardiaque et de pouvoir évaluer l’efficacité́ de ce nouveau traitement donné à la phase aigüe de l’infarctus dans un contexte métabolique altéré. Nous nous attacherons donc a évaluer l’efficacité de notre traitement à distance de l’infarctus, sur les altérations de la fonction cardiaque ainsi que sur le developpement d’une insuffisance cardiaque, à différents temps (8, 12 et 16 semaines post-ischémie). Nous déterminerons également, en aigu (24h après l’infarctus), la taille d’infarctus. En fin de chaque protocole, des tissus (cœur, sang, reins, tissu adipeu, foie) seront prélevés afin d’évaluer l’inflammation systémique et tissulaire, la fibrose tissulaire au niveau cardiaque et rénale et les atteintes métaboliques du tissu adipeu et du foie. La maladie métabolique peut avoir un retentissement sur la maladie cardiaque et inversement. Il est donc important de comprendre quels sont les effets cardiaques et métaboliques de notre intervention pharmacologique.
Bénéfices attendus
Notre objectif principal est l’évaluation du succès de la transposition de l'effet protecteur ischémique d’un nouveau composé pharmacologique le GC7 dans un modèle in vivo d’insufisance cardiaque post-infarctus chez la souris lorsqu'il est utilisé à une dose unique au moment de la reperfusion. De plus ce travail nous permettra de définir si le GC7 peut être un agent cardioprotecteur lorsqu'il est administré en juste après l’infarctus dans un modèle de souris nourries avec un régime riche en graisses et en sucres. Notre objectif final serait de montrer que le GC7 est un traitement efficace dans la prévention du développement de l'insuffisance cardiaque dans un contexte de pré-diabète quand il est administré à la phase aigue de l’infarctus.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - Un régime riche en gras et en sucre pendant 10 ou 26 semaines selon les groupes - 5 tests consistant en l’administration de glucose ou d’insuline (durée < 1 minute) puis prélèvements de sang (durée < 30 secondes). Ces tests sont espacés de minimum 7 jours les uns des autres et sont précédés d’un jeûne court de 6h. - 5 examens échocardiographiques sous anesthesie générale (durée : 15-30 minutes), espacés également de minimum 9 jours les uns des autres. - Une chirurgie mimant l’infarctus du myocarde sous anesthésie générale profonde et couverture analgésique adaptée. Les souris seront soumises à 90 minutes d’infarctus sous anesthésie puis reveillées suite à la recanalisation de l’artère occluse. - Mise à mort pour prélèvement final du sang et des organes d’intérêt.
Impact sur les animaux
Le régime riche en sucre et en gras pendant 26 semaines maximum est associé à une prise de poids corporelle importante et rapide, ainsi qu’à un retentissement progressif sur la fonction cardiaque. Ceci peut induire, après plusieurs semaines de ce régime, un inconfort d’intensité légère à modérée de longue durée pour l’animal. L’induction de l’anesthésie (pour la chirurgie), ainsi que le réveil peuvent s’accompagner d’un léger inconfort et stress de courte durée. La chirurgie cardiaque induit une douleur modérée de durée moyenne (quelques heures). Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs). La chirurgie, c’est-à-dire 90 minutes d’infarctus chez des individus pré-diabétique est susceptible d’être accompagnée d’un risque de mortalité peri-opératoire non nul qui a été pris en compte dans la calcul des effectifs.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des 2 protocoles afin de prélever des tissus (cœur, foie, tissu adipeu et reins) en vue d’analyses ultérieures.
Remplacement
Il s’agit ici de l’utilisation d’un modèle chirurgical animal d’étude de l’insuffisance cardiaque post ischémique, nécessitant par essence le recours à l’animal. En effet, l’insuffisance cardiaque post-infarctus est une pathologie complexe que les méthodes alternatives actuelles ne permettent pas de simuler dans son ensemble. Aussi, réaliser un suivi de la fonction cardiaque, sur plusieurs semaines d’évolution de la pathologie nécessite le recours à un organisme entier. De plus, le contexte métabolique altéré (pré-diabète) impliquera des altérations fonctionnelles des tissus adipeux et hépatique qui pourraient retentir sur le remodelage cardiaque. Néanmoins, afin de mieux comprendre certains des mécanismes intracellulaires mis en jeu par l’utilisation du traitement, un des nos collaborateurs effectuera certaines experiences sur des cellules humaines en culture afin de limiter le nombre d’animaux necessaires à cette étude. Ces études sur modèle cellulaire ne pourront pas nous apporter de réponse quand à l’effet à long terme.
Réduction
Les effectifs ont été estimés au minimum nécessaire afin d’obtenir des résultats exploitables : Le nombre d’animaux par groupe a été calculé à l’aide de tests de puissance sur la base des résultats des études précédentes. Le nombre d’animaux de cette étude a été déterminé par une analyse statistique sur un logiciel spécifique. Afin d’analyser nos résultats, nous effectuerons des tests statistiques adaptés afin de comparer nos groupes experimentaux.
Raffinement
Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisées sous prémédication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. La chirurgie sera réalisée sous anesthesie générale avec prémedication par injection sous cutané d’un antidouleur. La mise à jeun courte de 6h avant les tests métaboliques est réalisée au matin, ce qui correspond au début de période diurne pour les animaux (c’est à dire à leur période de plus faible activité et en situation post-prandiale). Les prélèvements d’autres tissus (reins, tissu adipeux, foie et sang) en parallèle du cœur sont réalisés sur les mêmes souris afin de compléter l’analyse du profil d’insuffisance cardiaque qui est souvent associé en clinique humaine à une défaillance multi-organes. Des points limites adaptés aux procédure envisagées ont été mis en place.
Choix des espèces
La souris est un modèle largement utilisé dans la littérature dans le cadre d’études mécanistiques ou précliniques portant sur les maladies cardiovasculaires. La différence physiologique majeure au niveau cardiaque entre la souris et l’homme est la fréquence cardiaque. Néanmoins, ce modèle animale semble être adapté au vu des réponses physiologiques et physiopathologiques dans le cadre de l’étude de l’infarctus du myocarde et du developpement de l’insufisance cardiaque. Les animaux participant à ce projet devront être de jeunes adultes (5 à 10 semaines au début de la procédure) pour faciliter les examens échographiques : plus les os sont denses, plus ils gênent le passage des ondes ultrasonores, créant des « cônes d’ombre » sur les images échographiques, dont l’analyse peut alors s’avérer plus complexe. De plus, des experiences préliminaires menées au laboratoire ont permis de mettre en évidence que la diète riche en gras et en sucre devait commencer tôt afin d’avoir des effets cardiovasculaires marqués.
Rôle du microbiote précoce en tant que facteur de risque d’autisme. Etude chez la souris. Site 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Gavées avec les selles de nouveau-nés grands prématurés, 160 femelles gestantes et 640 souriceaux subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les 800 souris de ce site sont toutes tuées. 384 souriceaux passent 20 tests comportementaux différents entre 6 et 68 jours de vie, dont un test de mémoire visuelle et spatiale de 66 minutes, chaque petit étant séparé de sa mère jusqu'à trente minutes et de sa portée jusqu'à quinze minutes. Les mères sont tuées après le sevrage parce que leur microbiote modifié interdit de les rendre à l'élevage, et les souriceaux en surnombre le sont aussi. Le porteur reconnaît que les souris colonisées ne reflètent pas exactement les interactions entre microbiote et hôte chez l'être humain, et présente pourtant ce modèle comme un système expérimental valide pour relier microbiote précoce et autisme.
Objectifs
Ce projet se déroulera dans deux établissements distincts, et certains animaux seront transportés de l’établissement utilisateur EU1 vers l’établissement utilisateur EU2 à J25. Le microbiote intestinal, ou l’ensemble des microbes peuplant le tractus digestif, est considéré comme un composant essentiel dans le développement et la physiologie de l’hôte, notamment pour certains organes comme l’intestin et le cerveau. Alors que 11% des naissances dans le monde sont des naissances prématurées, plusieurs études démontrent que le microbiote intestinal est souvent plus immature et moins diversifié chez l’enfant prématuré par rapport à un enfant né à terme, et ce déséquilibre pourrait être un facteur de risque d’un développement cérébral anormal. Une analyse récente du microbiote intestinal de nouveau-nés prématurés âgés d’1 mois a permis d’associer la composition de leur microbiote intestinal avec un développement cérébral normal ou un développement cérébral atypique, bien qu’il n'ait pas encore été prouvé que le microbiote intestinal cause directement ces différences. Dans ce contexte, nous cherchons à comprendre si la composition du microbiote intestinal dans les premiers jours de la vie pourrait être un facteur de risque de l’autisme. Pour cela, nous transférerons des matières fécales de nouveau-nés prématurés, associés soit à un développement cérébral normal, soit à un développement cérébral anormal. Nous observerons ensuite comment ce transfert de matières fécales humaines affecte chez la souris la physiologie et le comportement, de la période néonatale jusqu'à l’âge adulte.
Bénéfices attendus
L’avantage majeur de ce projet est de reproduire les effets potentiels d’un microbiote intestinal humain sur la physiologie et la santé d’un modèle vivant. Bien que les souris colonisées avec un microbiote intestinal humain ne soient pas le reflet parfait des interactions microbiote-hôte chez I’être humain, il a été montré que la composition et la diversité du microbiote humain implanté étaient conservés chez la souris colonisée. Ce modèle animal représente donc un système expérimental valide pour la compréhension des mécanismes sous-jacents aux interactions entre le microbiote intestinal, les intestins et le cerveau. Dans ce projet, il s’agira d’étudier l’impact potentiel de microbiotes fécaux d’enfants prématurés sur le développement et la fonction du système digestif, du cerveau, et des comportements associés au TSA (Trouble du Spectre autistique) chez la souris colonisée. Nous souhaitons également identifier les mécanismes par lesquels les premiers micro-organismes colonisant le tractus digestif pourraient impacter son propre développement mais aussi celui d’autres organes avec lesquels il communique : les intestins et le cerveau, et si cela constituerait un facteur de risque pour le TSA. En outre, il n’existe pas à notre connaissance de modèle équivalent dans la littérature permettant d’identifier si des microbiotes humains précoces de compositions définies affectent le développement du microbiote lui-même, celui du système digestif, du cerveau et des comportements, et comment cela peut être lié au(x) risque(s) de TSA.
Procédures
Dans ce projet, des gavages seront réalisés pendant 1 à 2 minutes maximum chez l’animal vigile. Un gavage sera réalisé sur un maximum de 160 femelles gestante et 640 souriceaux âgés de 22 jours. Par ailleurs, des échantillons de fèces seront prélevés lors du change hebdomadaire à partir de 14 jours de vie pour chaque souris, à raison de 3-4 selles fraîches émises spontanément après placement de l’animal vigile dans un contenant individuel. Chaque prélèvement de selles n’excédera pas 5 minutes. Pour l’ensemble du projet, 8 prélèvements de fèces seront donc prévus au maximum pour chaque souriceau. 384 souriceaux au total, seront soumis à 20 tests comportementaux différents, réalisés entre 6 jours et 68 jours de vie. Plus précisément, le temps cumulé de test par âge sera de : A 6 jours, 5 minutes maximum, dans 4 tests des réflexes moteurs du nouveau-né. A 7 jours, 10 minutes maximum, dans un test de mémoire olfactive. A 18, 30 et 60 jours de vie, 10 minutes maximum dans des tests d’activité locomotrice et de réflexes moteurs. A 19, 31 et 61 jours, 66 minutes maximum, dans un test de mémoire visuelle et spatiale. A 20, 37 et 67 jours, 30 minutes maximum, dans un test évaluant l’anxiété et le comportement répétitif, des traits comportementaux communs à beaucoup de formes de TSA. A 21 jours, 5 minutes maximum, dans un test d’interaction sociale. De 32 à 34 jours de vie et de 62 à 64 jours, 16 minutes maximum, dans un test mesurant la capacité à résoudre un problème. A 38 et 68 jours, 15 minutes maximum, dans un autre test d’interaction sociale, évaluant aussi la mémoire sociale. Ces tests dureront entre 15 secondes et 30 minutes chacun par animal. Pour les tests de comportement avant sevrage, les souriceaux et leur nid seront séparés de la mère pendant 30 minutes maximum. Pour chaque test individuel, un souriceau sera séparé du reste de la portée pendant 15 minutes maximum. Après sevrage, les souriceaux seront séparés de leurs congénères pendant 30 minutes maximum. Enfin, ces tests seront répétés maximum 3 fois au cours du temps entre 6 et 68 jours de vie, à l’exception du test réalisé à 7 jours et celui réalisé à 21 jours. Ces interventions seront réalisées dans l’EU1, sauf pour 128 souris à 25 jours (moitié mâle, moitié femelle) parmi les 640 souriceaux du projet, transportées de l’EU1 à l’EU2.Le prélèvement de fèces, la mise à mort et le prélèvement d’organes de ces souris s’effectueront à 38 jours de vie dans l’EU2.
Impact sur les animaux
Lors des tests comportementaux avant le sevrage, l’ensemble de la portée sera séparé de la mère pendant 30 minutes maximum, ce qui pourrait provoquer un stress chez les souriceaux. Pour chaque essai comportemental individuel, chaque souriceau sera séparé du reste de la portée pendant une période maximale de 15 minutes, ce qui pourrait induire un stress supplémentaire. De plus, des fèces seront prélevés pour chaque souriceau placé dans un contenant individuel lors de la pesée hebdomadaire et un stress pourrait être induit pendant quelques minutes lors de cette pesée. Par ailleurs, un risque de fausse route ou blessure de l’œsophage peut survenir lors du gavage des mères et des petits de 22 jours. Enfin, le transport peut engendrer un stress éventuel.
Devenir
Les mères seront mises à mort après sevrage de leurs souriceaux car leur microbiote a été modifié et ne pourront pas être utilisées dans d’autres projets ni réintégrées dans l’élevage. Pour la même raison, les souriceaux en surnombre qui n’ont pas servis à équilibrer les portées moins nombreuses, seront mis à mort. Les souriceaux inclus dans le projet seront mis à mort pour des prélèvements d’organes d’intérêt.
Remplacement
Ce projet consiste à transférer le microbiote fécal d’enfants grands prématurés à des souris. Ce modèle animal permettra de déterminer si le microbiote intestinal a des effets sur la santé, et notamment sur le développement cérébral et le comportement des souris. L’utilisation d’animaux dans ce projet est donc indispensable pour cette étude, car il n’existe pas à ce jour de modèles informatiques ou de méthodes de laboratoire pour répondre à cette question scientifique de manière globale et complète.
Réduction
Au préalable, des échantillons de microbiote humain de bébés prématurés auront été sélectionnés selon des critères cliniques spécifiques, liés notamment au développement cérébral de l’enfant, correspondant le mieux à nos objectifs scientifiques. Par ailleurs, ces expérimentations seront réalisées de manière égale chez la progéniture mâle et la progéniture femelle en utilisant tous les animaux d’une portée, de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés du projet. Un test de puissance statistique nous a permis de calculer, à partir de données comportementales précédentes, le nombre minimal d’animaux nécessaires dans le projet. Pour la colonisation avec un échantillon de microbiote humain donné (1 groupe d’animaux), 16 souriceaux par sexe + 8 souriceaux par sexe (servant uniquement de souris inconnues pour les souris testées dans un test d’interaction sociale), seront nécessaires. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Seront ajoutés les éléments suivants dans chaque cage : un tunnel transparent en plastique, des bâtons en bois à ronger, du matériel de nidification et du papier absorbant. Lors des tests comportementaux réalisés avant sevrage, les souriceaux seront séparés de la mère mais seront conservés avec l’ensemble de la portée dans une cage différente pendant la durée de chaque test. Cette cage contiendra de la litière de la cage d’origine ainsi que du matériel de nidification et du papier absorbant déchiqueté par la mère. Après chaque test comportemental, l’ensemble de la portée sera replacé rapidement dans la cage d’origine avec la mère. Lors du change hebdomadaire de la cage, une petite partie de la litière et le nid établi par la mère seront conservés pour éviter tout rejet de la portée. Le bien-être de chaque animal sera surveillé attentivement et régulièrement, et chaque animal sera pesé une fois par semaine. Des points limites adaptés seront mis en place et appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure. Pour le transport, les animaux seront transférés en cage de transport avec leurs congénères initiaux pour ne pas provoquer un stress supplémentaire dû à l’isolement ou à la cohabitation avec des nouveaux congénères. Les animaux seront transportés dans une boite de transport stérile à laquelle sera ajoutée de la litière propre mais aussi de la litière et le nid établi dans la cage d’origine, des bâtons à ronger et du matériel de nidification et de la nourriture provenant de leur cage d’hébergement. Ils seront ensuite emmenés jusqu’à l'EU2 dans un véhicule agréé climatisé (40 min de transport) et seront maintenus au repos 2 semaines avant l’euthanasie pour prélèvement d’organes.
Choix des espèces
Les modèles animaux les plus utilisés pour étudier l’impact d’un microbiote intestinal complexe humain sur le développement et la santé de l’hôte sont les rongeurs. A l’heure actuelle, la souris est le rongeur le plus utilisé dans le cadre de l’étude des interactions entre le microbiote intestinal, les intestins et le cerveau, et permet donc une comparaison fiable par rapport à la littérature actuelle. Plus particulièrement, des souris totalement dépourvues de germes, nées et élevées en conditions stériles, permettront d’étudier l’impact d’un microbiote de prématuré humain sur le développement et la santé des souris. Les souris seront utilisées du stade néonatal (6 jours de vie) jusqu’à l’âge adulte (70 jours) puisque nous souhaitons déterminer si les premiers micro-organismes du microbiote intestinal représentent un facteur de risque déterminant pour le développement cérébral.
Étude du rôle des pièges extracellulaires des neutrophiles dans la progression tumorale du cancer de la peau induite par les ultraviolets dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
1 140 souris sans poils vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles sont exposées aux ultraviolets B trois fois par semaine pendant trente semaines, jusqu'à développer des tumeurs de la peau, et reçoivent jusqu'à 210 injections quotidiennes dans l'abdomen ou 90 injections d'anticorps. Le porteur décrit des rougeurs, des irritations, de rares ulcérations et des tumeurs "généralement bien tolérées", tout en admettant que des masses de taille importante peuvent gêner les déplacements. Il indique avoir choisi une souche dépourvue de poils pour éviter le rasage et garantir une exposition uniforme, et affirme que les modèles in vitro déjà utilisés ne reproduisent pas la complexité des tissus vivants.
Objectifs
Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines molécules de l'immunité innée, un système de défense naturel du corps, peuvent contribuer à l'aggravation des cancers de la peau. Nous nous concentrons sur des traitements potentiels pour ralentir ou stopper la progression tumorale. Les recherches portent sur des cancers de la peau causés par des expositions prolongées aux Ultraviolets B, qui sont un facteur clé du développement de ce type de cancer chez l’être humain. En laboratoire, nous avons observé que certaines molécules de l'immunité innée favorisent le développement des tumeurs. Nous voulons maintenant confirmer ces résultats en utilisant un modèle chez la souris, ou les souris sont exposées aux Ultraviolets B trois fois par semaine pendant 30 semaines (à raison de 2 minutes par exposition) afin de tester différentes drogues capables d'inhiber ces molécules. L’objectif final est de vérifier si ces traitements peuvent réduire efficacement la progression des cancers de la peau, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles options thérapeutiques pour les patients.
Bénéfices attendus
Si ce projet aboutit, il pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour traiter les cancers de la peau et, plus largement, améliorer la compréhension des mécanismes qui favorisent le développement des tumeurs dans d’autres maladies. Les résultats pourraient permettre de développer des traitements ciblant des molécules spécifiques de l’immunité innée, offrant ainsi des options innovantes pour ralentir ou stopper la progression des cancers. De plus, ce projet contribuera à enrichir les connaissances scientifiques sur le rôle de ces molécules dans la formation des tumeurs, ce qui pourrait bénéficier à la recherche sur d’autres types de cancers.
Procédures
- Injections intrapéritonéale : 20 secondes x nombre d’injection (quotidien pour les inhibiteurs soit 210 injections, 3 fois par semaine pour les anticorps, soit 90 injections) par animal. Une rotation des sites d’injections sera effectuée à chaque injection. - Manipulation pour prise de poids : 15 secondes par animal, ce qui est le temps nécessaire pour prendre la souris, la poser sur la balance, reporter son poids et la reposer dans sa cage.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de cette étude, certaines interventions peuvent entraîner des effets indésirables sur les animaux. L’exposition répétée aux UVB peut provoquer des rougeurs ou des irritations cutanées, et des ulcérations superficielles peuvent apparaître dans de rares cas. Les tumeurs cutanées développées dans ce modèle sont généralement bien tolérées. Cependant, elles peuvent, dans certains cas, entraîner un inconfort, pouvant se manifester par une modification de la posture ou une réduction de l’activité. Des tumeurs de taille importante pourraient également affecter les déplacements des animaux. Les injections intrapéritonéales prévues dans le protocole peuvent provoquer des réactions locales comme des rougeurs temporaires. Par ailleurs, en réponse à l’exposition aux UVB et à l’évolution tumorale, certains animaux pourraient présenter une perte d’appétit ou une réduction de leur activité.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des tumeurs et l’analyse post mortem des échantillons. Les tumeurs primaires, ainsi que les tissus environnants, seront prélevées pour des analyses histologiques et biochimiques afin de répondre aux objectifs scientifiques du projet. Les critères d’analyse incluront : 1. La taille et le nombre des tumeurs pour évaluer la progression tumorale. 2. La présence de cellules immunitaires dans les lésions tumorales, afin de confirmer leur implication dans le développement des cancers. 3. La fibrose tumorale, qui correspond à l'épaississement et au durcissement des tissus autour de la tumeur, pour comprendre comment ces transformations du tissu peuvent favoriser la croissance et la progression de la tumeur. Ces analyses permettront de valider ou d’infirmer les hypothèses du projet, notamment en ce qui concerne l’efficacité des inhibiteurs et anticorps testés pour ralentir ou stopper la progression des tumeurs. En résumé, la mise à mort des animaux est essentielle pour atteindre les objectifs expérimentaux, tout en garantissant que les animaux ne subissent aucune souffrance inutile à l’issue de la procédure.
Remplacement
Pour comprendre le développement des cancers de la peau, nous avons d'abord utilisé des modèles en laboratoire sans recours aux animaux (modèles in vitro). Ces travaux ont montré que certaines cellules du système immunitaire, appelées neutrophiles, jouent un rôle dans la progression des tumeurs. Cependant, ces modèles ne permettent pas de reproduire la complexité des interactions qui existent dans les tissus vivants, comme celles entre les cellules cancéreuses, les cellules immunitaires et les modifications des tissus environnants. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux est nécessaire pour ce projet.
Réduction
Nous avons soigneusement calculé le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats fiables. Les tests statistiques préalables et les données obtenues en laboratoire nous ont permis d’optimiser le design expérimental afin de limiter l’utilisation des animaux tout en garantissant la validité scientifique. De plus, des résultats déjà publiés sur des modèles similaires nous aident à prévoir la progression de la maladie, réduisant ainsi le nombre de souris nécessaires. Ainsi un nombre de 10 souris par groupes sera nécessaire pour tester nos hypothèses. Un total de 1140 souris sera ainsi utilisé pour tester toutes nos hypothèses scientifiques.
Raffinement
Des mesures spécifiques seront mises en place pour garantir le bien-être des animaux tout au long de l’expérience. Les souris utilisées seront hébergées dans des conditions optimales, dans des cages ventilées et enrichies, afin de minimiser leur stress. Les manipulations, comme les injections, seront effectuées avec soin, souvent sous anesthésie pour réduire la douleur. Une surveillance régulière (trois fois par semaine) permettra de détecter rapidement tout signe de mal-être, et une fiche d’évaluation sera utilisée pour assurer un suivi rigoureux. Si un point limite est atteint, l’animal sera immédiatement retiré de l’étude de manière éthique.
Choix des espèces
Nous cherchons à comprendre le rôle système immunitaire, dans le développement de certains cancers de la peau. L’utilisation de souris comme modèle d’étude est pertinente car elles partagent de nombreuses similitudes avec l’être humain, notamment dans leur réponse immunitaire et leur réaction au stress causé par les ultraviolets. Nous avons choisi une souche de souris sans poils, particulièrement adaptée aux études d’exposition chronique aux ultraviolets. Leur absence de poils permet une exposition uniforme à la lumière, évitant ainsi le stress lié à des manipulations supplémentaires comme le rasage. Ces souris sont également connues pour leur sensibilité à développer des cancers sous l’effet des ultraviolets, ce qui garantit des résultats fiables et reproductibles. L’exposition aux ultraviolets sera réalisée sur des souris âgées de 7 à 9 semaines, une période correspondant à leur maturité physique initiale. Cela permet de reproduire des conditions similaires à celles observées chez l’adulte humain, où les mécanismes de développement des cancers de la peau sont comparables. Nous nous concentrons uniquement sur l’étude de ces cancers chez l’adulte, car les réactions tumorales et immunitaires diffèrent chez les jeunes ou les animaux âgés. Les prélèvements des tumeurs auront lieu au plus tard 30 semaines après le début des expositions (a raison de 3 expositions de 2 minutes par semaine) ou dès que des critères définis dans le protocole seront atteints. Les souris seront euthanasiées avant tout prélèvement, conformément aux normes éthiques en vigueur. Ce modèle garantit une étude rigoureuse des mécanismes liés aux cancers de la peau, tout en permettant des résultats applicables à la physiopathologie humaine.
Impact d’amyloïdes protecteurs sur la pathologie Alzheimer chez des souris transgéniques de la maladie
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Des souris transgéniques destinées à l'étude de la maladie d'Alzheimer subissent toutes une chirurgie du crâne de 30 minutes pour recevoir un produit qui induit la maladie. 3 441 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Après un prélèvement de queue pour le génotypage, certaines subissent une seconde chirurgie du crâne pour recevoir un médicament, et une partie reçoit un médicament par injection dans une veine à trois mois. Le porteur prévoit une perte de mémoire légère, des crises d'épilepsie fugaces chez certaines souris et des évaluations comportementales qu'il ne détaille pas. Les reproducteurs qui donnent naissance aux souris d'expérience sont tués en fin de période de fertilité.
Objectifs
Dans le monde, les maladies neurodégénératives touchent 55 millions de personnes avec plus de 10 millions de nouveaux cas par an. Elles sont la 7ème cause de décès et la première cause d’invalidité et de dépendance chez les personnes âgées. Parmi elles, la maladie d’Alzheimer (MA) représente 60 à 70% des cas. La MA, est une maladie du sujet âgé, dont le premier facteur de risque est le vieillissement. Actuellement, seuls des traitements à visée symptomatique sont disponibles ; c’est-à-dire qu’ils ne traitent pas la maladie mais masquent certains déficits comportementaux. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouveaux médicaments visant à traiter efficacement cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra mettre en évidence de nouveaux traitements dans la lutte contre la maladie d'Alzheimer.
Procédures
L'ensemble des animaux seront soumis à des prélèvements de queue pour génotypage (1 fois par souris, durée de l'acte : 1 seconde), une chirurgie au niveau du crâne afin de pouvoir injecter un produit qui induit la maladie d'Alzheimer (âge adulte, durée de la chirurgie : 30 minutes). Certains animaux recevront une deuxième chirurgie au niveau du crâne pour administrer un médicament (âge adulte, durée de la chirurgie : 30 minutes). Une partie des animaux recevra un médicament injecté dans les veines pour traiter la maladie d'Alzheimer (à 3 mois, duré de lacte : moins d’une minute).
Impact sur les animaux
Lors de la procédure d'élevage, un stress lors de la contention des animaux afin de réaliser le tatouage et le génotypage peut être généré. L’induction de la pathologie Alzheimer peut conduire à une perte de mémoire légère et certaines souris peuvent développer des crises d’épilepsie fugaces. La chirurgie peut conduire à une légère perte de poids transitoire (de 48 à 72h).
Devenir
Tous les animaux nécessaires à la réalisation de ce projet seront mis à mort à la fin de l’étude, c’est-à-dire à la fin des procédures expérimentales, afin de récupérer le cerveau pour des analyses histologiques. Les animaux reproducteurs utilisés pour générer les souris d'expérimentation seront euthanasiés en fin de période de fertilité.
Remplacement
La maladie d'Alzheimer est une pathologie qui touche de façon très intégrée le système nerveux central et altère les fonctions cognitives et comportementales des patients. L’hypothèse que nous posons vise à identifier le potentiel thérapeutique de certains produits pouvant conduire à l’amélioration des troubles cognitifs et comportementaux. A ce niveau d’intégration, seuls des tests in vivo sur animaux vigiles peuvent répondre à cette question. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, les études in vitro et in silico ne permettent pas à l’heure actuelle de prédire l’efficacité d’un traitement sur l’amélioration de troubles cognitifs. De plus, le nombre et la complexité des mécanismes mis en jeux dans la propagation des protéines altérées dans le cerveau ne sont actuellement pas modélisés par des méthodes alternatives alors qu’ils sont présents de façon similaire chez la souris. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut donc être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.
Réduction
Sur la base de notre expérience de ce modèle, nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce modèle présente une variabilité importante en ce qui concerne les résultats obtenus lors des évaluations comportementales ou des observations neuroanatomiques post-mortem (propagation de la protéine notamment). Cette variabilité, bien que comparable à ce qui se passe dans la réalité clinique, entraine l’utilisation d’un nombre important d’animaux par groupe afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Ainsi, nous concilions le nombre minimum d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique.
Raffinement
Le suivi quotidien des souris hébergées en groupe de 2 à 5 individus, nourris ad-libitum, et ayant accès à l'eau à volonté, dans un milieu enrichi et l’application de critères d’arrêt en élevage et en expérimentation permettra de garantir leur bien-être et de mettre en œuvre des traitements appropriés si besoin. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. Les protocoles de chirurgies ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. Des points limites précoces précis et stricts ont été définis. Des échelles cliniques, un soutien nutritionnel adapté et l’application de critères d’arrêts basés sur les points limites permettent de veiller au bien-être des rongeurs. Les animaux bénéficieront de périodes de récupération suffisantes après les anesthésies générales et les gestes chirurgicaux.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront des souris modèles de la maladie d'Alzheimer. La souris est l’espèce animale qui a été et est encore la plus étudiée dans le domaine des maladies neurodégénératives notamment dans le cadre de développement de médicaments. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les performances de mémoire et les effets d’un médicament sur le développement dans la MA. La maladie se déclare la plupart du temps chez le sujet âgé, mais des déficits discrets apparaissent longtemps en amont du diagnostic. Nous étudierons donc les souris à un temps précoce et à un temps tardif pour refléter les effets observés en début et en fin de maladie, soit entre 4 et 11 mois.
Etudes des circuits neuronaux et des dynamiques corticales impliqués dans les crises audiogéniques chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
À 18 jours de vie, puis chaque jour pendant une semaine à partir de 23 jours, des souris sont exposées à un son qui déclenche aussitôt une crise convulsive, et certaines subissent dix expositions déclenchant des crises, jusqu'à trois par jour. 370 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une injection dans le cerveau sous anesthésie à 1 ou 3 jours de vie, puis à 56 jours une chirurgie de deux à trois heures qui perce quatre orifices dans leur crâne, et une partie passe des séances quotidiennes d'imagerie d'une à deux heures, tête fixée, sur 31 jours. Le porteur prévoit qu'une crise peut entraîner une "douleur musculaire modérée et de courte durée", et affirme qu'il n'y a "pas de souffrance pendant la crise du fait de la perte de connaissance". Il écrit que les souris, toutes tuées à la fin de chaque procédure, ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées, et annonce que "Certains animaux utilisés pour un type d'expériences seront réutilisés pour un autre type d'expériences".
Objectifs
Le but du projet est d’approfondir la connaissance des mécanismes par lesquels une stimulation sensorielle peut déclencher une crise épileptique. Ce phénomène est bien connu dans les épilepsies humaines, avec notamment le principe de photosensibilité (déclenchement d’une crise après stimulation lumineuse intermittente), qui reste mal compris, notamment en ce qui concerne le site cérébral, où se réalise ce processus et où est générée la décharge épileptique. Les dynamiques d’activation lors d’une crise déclenchée par un son sont également mal élucidées. Ce projet permettra d’étudier comment une perception sensorielle conduit à la génération d’une activité neuronale pathologique. Une meilleure connaissance de ces mécanismes aidera à identifier des structures anatomiques à cibler dans le cadre de protocoles de neurostimulation, actuellement en plein essor dans la prise en charge des patients souffrant d’épilepsie. Enfin, ces résultats pourraient aider à comprendre au sens plus large d’autres mécanismes d’intégration sensorielle neurologique pathologiques, observés par exemple dans la migraine, les acouphènes, ou encore l’hyperacousie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus dans le domaine médical et clinique sont une meilleure connaissance des épilepsies dites « réflexes » (déclenchées par une stimulation sensorielle), incluant des phénomènes tels que celui de photosensibilité, bien connu dans les épilepsies humaines (déclenchement d’une crise après stimulation lumineuse intermittente). L’ensemble de ces épilepsies avec composante réflexe représente environ 5% des épilepsies (soit environ 30 à 50.000 patients en France) bien que ce chiffre soit probablement sous-estimé par défaut d’évaluation systématique. Les déterminants physiopathologiques des épilepsies réflexes sont encore mal connus, en particulier en ce qui concerne le site anatomique d’où sont générées ces crises, et les dynamiques d’activation et de propagation neuronale. Une meilleure connaissance de ces mécanismes aidera à identifier, à long terme, des structures anatomiques à cibler dans le cadre de protocoles de neurostimulation (invasive ou non invasive), actuellement en plein essor dans la prise en charge des patients souffrant d’épilepsie. Ceci impliquera au préalable une phase de translation de ces résultats aux patients, par exemple via l’imagerie fonctionnelle ou d’autres études invasive ou non-invasive. Enfin, ces résultats pourraient aider à comprendre au sens plus large d’autres mécanismes d’intégration sensorielle neurologique pathologiques, observés par exemple dans la migraine, les acouphènes, ou encore l’hyperacousie.
Procédures
Les souris seront soumises à: - une exposition sonore à l’âge de 18 jours, pour une durée maximale de 60 secondes (un jour) - une exposition sonore à l’âge de 23 jours, quotidienne pendant 7 jours, pour une durée maximale de 60 secondes. Ces expositions sonores déclenchent une crise convulsive immédiatement après l’exposition. - une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie à l’âge de 1, 3 et 56 jours. La durée de la chirurgie est de 2 à 3 heures. - pour certains 10 expositions sonores déclenchant des crises convulsives. Chaque animal subira un maximum de 3 crises par jour. -pour certains animaux des sessions d’1 à 2 heures d’imagerie en contention, quotidiennes sauf le weekend sur 31 jours, après une phase d’entraînement à la contention de 7-15 jours. Les nuisances attendues sur les souris sont essentiellement liées au stress généré par les expositions sonores et les crises épileptiques, ainsi qu’aux lésions réalisées lors des gestes chirurgicaux et aux douleurs que celles-ci peuvent entraîner.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sur les souris sont : -L’exposition sonore à une intensité contrôlée peut entraîner une douleur légère de courte durée (durée maximale de 60 secondes) -La survenue d’une crise convulsive après l’exposition sonore ou la stimulation lumineuse peut entraîner dans les suites une douleur musculaire modérée et de courte durée (pas de souffrance pendant la crise du fait de la perte de connaissance). Les souris ne subiront pas plus de 3 crises par jour. -L’injection de certains composés à l’âge de 1 ou 3 jours se fait sous anesthésie et analgésie mais peut entraîner des douleurs post-opératoires légères et de courte durée. -La réalisation de 4 orifices crâniens à l’âge de 56 jours se fait sous anesthésie et analgésie mais peut entraîner des douleurs post-opératoires légères pendant 1 à 2 jours selon les observations faites dans des protocoles similaires. -Pour certains animaux, la réalisation une autre chirurgie craniale se fait sous anesthésie et analgésie et peut entraîner des douleurs post-opératoires modérées pendant 1 à 2 jours. -Pour certains animaux, la réalisation de sessions d’imagerie en contention, tête fixée, sur une durée maximale de deux heures par jour pendant 31 jours, peut entraîner un inconfort modéré pendant la durée de la contention. -Le maintien en place d’un dispositif crânien pour envelopper les électrodes intracrâniennes peut entraîner une gêne légère pour les souris, sur une durée totale d’1 à 2 mois.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet ces animaux auront subi des procédures invasives ne permettant pas de réutiliser les animaux au-delà des expériences décrites ci-dessus et auxquelles ils ont été initialement destinés, ni de les adopter en dehors de ce contexte expérimental.
Remplacement
Les outils modernes d’imagerie optique que nous utiliserons permettent d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, permettant de traiter un grand ensemble de données avec un minimum d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est aussi minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal. Le nombre d’animaux utilisé est donc essentiellement déterminé par la nécessité de mesurer des différences statistiques significatives pour la comparaison des groupes de souris. Certains animaux utilisés pour un type d’expériences seront réutilisés pour un autre type d’expériences. L’utilisation de tests statistiques sur échantillons appariés (lorsque nous compareront la fréquence de survenue de crise audiogène entre un animal stimulé et non stimulé, par exemple) permet de réduire le nombre de sujet nécessaire, chaque animal étant son propre témoin.
Réduction
Les outils modernes d’imagerie optique que nous utiliserons permettent d’enregistrer plus de 1000 neurones en parallèle, permettant de traiter un grand ensemble de données avec un minimum d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés est aussi minimisé par la possibilité de répéter le protocole de mesure sur plusieurs jours voire plusieurs semaines avec le même animal pour maximiser la taille de l’échantillon de neurones collecté sur chaque animal. Le nombre d’animaux utilisé est donc essentiellement déterminé par la nécessité de mesurer des différences statistiques significatives pour la comparaison des groupes de souris. Certains animaux utilisés pour un type d’expériences seront réutilisés pour un autre type d’expériences. L’utilisation de tests statistiques sur échantillons (lorsque nous compareront la fréquence de survenue de crise audiogène entre un animal stimulé et non stimulé, par exemple) permet de réduire le nombre de sujet nécessaire, chaque animal étant son propre témoin.
Raffinement
L’utilisation de protéines excitables par stimulation lumineuse à travers la boîte crânienne permet d’éviter une procédure de chirurgicale additionnelle. Pour toutes les procédures chirurgicales, plusieurs mesures supplémentaires seront prises. Pendant la chirurgie, une réhydratation sera mise en place. Le volume de réhydratation sera ajusté en fonction de la durée de la chirurgie. Après la chirurgie, les animaux en récupération sont placés en cage de réveil sur une plaque chauffante, puis replacés dans leur cage qu’il sera possible de continuer à chauffer par des chaufferettes, et reçoivent une analgésie supplémentaire. De l’eau gélifiée sera ajoutée dans les cages suite à la chirurgie pour faciliter l’hydratation des souris. L’environnement de la cage sera enrichi. Les animaux sont suivis quotidiennement, s’il y a des signes de douleur, des doses d’antalgiques sont ajoutées, s’il y a des signes d’infection un traitement antibiotique est mis en place. La phase de récupération est de 7 jours au minimum pendant lesquelles l’animal n’est pas manipulé sauf pour le suivi post-opératoire en première semaine. Des points limites spécifiques et précoces sont définis, entrainant l’arrêt de l’expérience ou la mise à mort si les traitements associés ne permettent pas de diminuer la douleur ou l’inconfort sous 24h. Ils sont basés sur des indicateurs de poids, la persistance pendant plus de deux jours d’une réduction de la mobilité avec dos voussé, d’une piloérection marquée, d’un manque de toilettage ou toilettage excessif ; ou encore la survenue de signes de détresse. Lors d’une crise épileptique prolongée au-delà de 2 minutes, l’animal sera placé sous un masque à oxygène. Pour diminuer le stress et l’angoisse pendant l’imagerie en contention, nous avons mis en place un protocole d’habituation progressive. La souris est placée en contention le premier jour pendant 30min puis le second et le troisième jour pendant 1h. Si à la fin de l’entrainement l’animal montre des signes de stress et d’angoisse, l’animal sera ré-entrainé le jour suivant au palier inférieur et le protocole décalé en fonction. Si ces signes perdurent l’expérience sera arrêtée pour l’animal.
Choix des espèces
Ce projet implique l’utilisation d’organismes vivants dotés d’un système nerveux central permettant l’intégration des perceptions sensorielles. Ces organismes vivants doivent par ailleurs pouvoir présenter des crises épileptiques. La souris est un modèle adapté qui répond à ces deux critères. Par ailleurs, l’utilisation de souris comme modèle animal est nécessaire pour permettre l’application des outils de manipulation ciblée des circuits neuronaux qui nous permettront d’avancer dans la compréhension des mécanismes de l’épilepsie. Ces outils sont mieux établis chez cet animal que dans d’autres espèces. Par ailleurs le modèle souris possède un système auditif similaire à l’homme et est suffisant pour l’exploration de mécanismes fondamentaux. Le stade de développement est un point crucial dans la susceptibilité des souris aux crises audiogènes. La susceptibilité maximale des souris étudiées à la procédure de « priming » (procédure qui confère la susceptibilité aux crises audiogènes après une exposition à un son bref et intense au cours de leur développement) entre 13 et 25 jours post-natal, et idéalement au 18ème jour. Il existe également une fenêtre temporelle de susceptibilité au « kindling » (expansion progressive du réseau épileptique par expositions sonores répétées) se situant entre le 21ème et le 30ème jour post-natal. Ainsi, nous réaliserons le « priming » au 18ème jour et le « kindling » au 23ème au 30ème jour. Une injection intracérébrale sera réalisé chez le souriceau à P1-P3, sous anesthésie générale, pour permettre une expression homogène et diffuse. La procédure chirurgicale principale sera réalisée à la 8ème semaine post-natale, et les expériences d’activation ou d’inhibition des différentes structures, couplées à la neurophysiologie, seront réalisées 5 semaines plus tard (environ 13ème semaine post-natale).