Rongeurs
Etude du rôle des convertases, Furin et PC7 dans le recrutement des cellules du sytème immunitaire par les tumeurs
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Toutes tuées pour collecter leurs tumeurs et leurs organes, 5 609 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. 2 912 d'entre elles sont tatouées aux phalanges ou aux coussinets entre 7 et 12 jours de vie et subissent un prélèvement du bout de la queue pour le génotypage, 1 680 reçoivent une greffe de cellules tumorales, et 1 008 sont opérées pendant 20 minutes pour induire des métastases dans le foie. Le protocole prévoit aussi des chimiothérapies trois fois par semaine, des irradiations des tumeurs et des séances d'imagerie par bioluminescence une à deux fois par semaine. Le porteur écrit que l'utilisation de la souris est "indispensable" pour comprendre l'action de deux enzymes dans un "organisme entier proche de l'homme". Pour l'analyse de survie, des groupes de 14 souris sont suivis jusqu'à l'atteinte de points limites.
Objectifs
Le système immunitaire joue un rôle important dans la mise en place et le développement des cancers. Notre projet vise à déterminer le rôle des protéines convertases (PCs) dans le recrutement du système immunitaire par les tumeurs. Les PCs sont des enzymes dont les quantités sont fortement augmentées dans de nombreux cancers et qui sont impliquées dans la progression des tumeurs et l’établissement des métastases. De plus, dans le cancer du colon les PCs sont nécessaires à la régulation de l’activité des cellules immunitaires que sont les lymphocytes T. Dans ce projet, nous souhaitons identifier précisément quelles convertases jouent un rôle dans le recrutement des cellules du système immunitaire par les tumeurs, nos candidats sont la Furine et PC7. Pour mettre en œuvre ce projet, nous créerons une lignée de souris génétiquement modifiées qui n’exprimeront ni PC7, ni la Furine dans les lymphocytes T. Ce nouveau modèle nous permettra de définir le rôle de PC7 et de la Furine dans la progression tumorale et l'adaptation des cellules immunitaires.
Bénéfices attendus
Les protéines sont des molécules biologiques présentes dans toutes les cellules vivantes. Lors de leur synthèse, elles peuvent nécessiter des modifications pour devenir actives biologiquement. Ces modifications sont mises en œuvre par les PCs et jouent un rôle important dans dans l’acquisition des caractéristiques cancéreuses des cellules, et dans l'adaptation du système immunitaire. Ce projet amènera à une meilleure compréhension du rôle des PCs , PC7 et Furine dans l'établissement des tumeurs. Nous nous intéressons plus particulièrement à ces deux convertases car des inhibiteurs spécifiques pourraient être utilisés comme de nouvelles thérapies ciblées seuls ou en combinaison avec des agents déjà existants et/ou la radiothérapie pour le traitement de certains cancers.
Procédures
2912 animaux seront soumis à deux gestes invasifs consécutifs pour être tatoués et génotypés par le personnel qualifié et expérimenté de notre établissement utilisateur: 1/ Identification par tatouage digital (réalisé une fois et durée de quelques secondes) et 2/ biopsie de la queue (réalisé une fois et durée de quelques secondes). Pour l'étude de la prolifération tumorale nous implanterons des cellules tumorales d'adenocarcinomes chez 1680 animaux. Les injections auront lieu une fois et durent 5 minutes. Les traitements avec la chimiothérapie seront faits 3 fois par semaine et durent moins d'une minute. Les traitements par irradiation des tumeurs durent entre 3 et 15 minutes et sont répétées deux fois à deux jours d'intervalle. Enfin le modèle de métastases hépatiques nécessitera une chirurgie réalisée sur 1008 animaux en 20 minutes par souris, une seule chirurgie par animal. Le suivi des tumeurs par bioluminescence dure entre 6 et 25 minutes, une à deux fois par semaine.
Impact sur les animaux
Le génotypage est composé de deux actes techniques invasifs, le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets et la biopsie de la queue qui consiste en un prélèvement de l'extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une très légère douleur. L'animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress. Le développement de tumeurs ou de metastases hépatiques peuvent générer des souffrances se manifestant par des pertes d’appétit donc de poids, des signes physiques ou moteurs. L'irradiation peut induire des irritations locales pour les tumeurs sous-cutanées. Toutes les douleurs liées au protocole seront prises en charge et des mesures compensatoires seront appliquées.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés. Les tumeurs et les organes seront collectés pour analyses immunohistochimiques, transcriptomiques et protéomiques.
Remplacement
Des tests sur des cellules tumorales et des cellules immunitaires en culture in vitro nous ont déjà permis de déterminer certains effets de l'inhibition de PC7 et de la Furine. Nous avons aussi utilisés des organoides pour intégrer une structure tridimensionnelle à nos cultures de cellules tumorales ainsi que des co-cultures (cellules tumorales et cellules immunitaires). Cependant, l’utilisation de modèles in vivo comme la souris est indispensable à la compréhension des mécanismes d’action des PCs dans un organisme entier proche de l'homme, incluant lors du développement tumoral, le microenvironnement, les contraintes physiques, le système vasculaire et le système immunitaire, qui ne sont pas retrouvés in vitro. Cette étape est également nécessaire puisque nous envisageons une potentielle et future utilisation chez l’homme comme thérapie.
Réduction
Les études statistiques seront réalisées pour comparer 4 groupes ( WT, Furin Fl/Fl*CD4-Cre+, PC7 KO/KO et PC7 KO/KO*Furin Fl/Fl*CD4-Cre+). Afin de limiter le nombre d'animaux, tous les individus porteurs d'un génotype d'intérêt seront utilisés dans nos expériences de prolifération tumorale mais aussi pour des approches in vitro réalisées à partir de prélèvements post-motem (comme par exemple l'isolation des cellules immunitaires à partir de la rate ou de la tumeur). Pour réduire le nombre d'animaux, nous avons calculé le nombre minimal de souris par groupe pour atteindre une puissance statistique satisfaisante qui correspond à 14 souris ( 7 mâles et 7 femelles) pour l’analyse de survie par le test de Kaplan-Meyer (atteinte de points limites). Nous prévoyons de répéter 3 fois les expériences, avec des lots de 14 souris pour les implantations sous-cutanées. Le sexe des animaux n'ayant pas d'influence sur nos résultats, nous utiliserons des animaux femelles et mâles
Raffinement
Le bien-être de l’animal au quotidien est nécessaire au bon déroulement de nos reproductions et expériences, mais également à la reproductibilité de nos résultats. Les animaux sont hébérgés dans des cages aux normes (au minimum 2 par cage et 5 au maximum) suivant l'âge et le poids des animaux. Des enrichissements (maisons rouges, jouets) sont présents dans les cages. Au cours de nos expériences, un suivi attentif quotidien des animaux est fait par du personnel compétent et formé, weekend, vacances et jours fériés compris. Les animaux en expérimentation sont pesés un fois par semaine, dès qu'une perte de poids est observée, du nursing et une pesée quotidienne est mis en place. Une fiche de suivie des animaux est remplie par le personnel de l'animalerie. Des mesures compensatoires sont prises si nécessaires. En revanche si l'état de l'animal malgré les mesures compensatoires ne s'améliore pas, le responsable de projet décidera de l'arrêt de l'expérience pour cet animal. Au moindre doute, nous ferons appel aux conseils de notre vétérinaire ou de la structure du Bien-Etre Animal (SBEA). Des injections d'analgésique pourront être réalisées et renouvelées en fonction de la souffrance de l'animal. Des tapis chauffants seront également utilisés dès l’anesthésie des souris, pendant l’opération, et lors de la phase de réveil.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris comme modèle car c'est un animal de petite taille, facile à héberger et à manipuler. Les séquences peptidiques des convertases sont bien conservées entre l'homme et la souris. De plus, l’organisation du système vasculaire de la souris et sa relation avec le microenvironnement tumoral sont très proches de ceux observés chez l’homme. Enfin, nous avons des modèles transgéniques disponibles uniquement chez la souris pour lesquels nous pourrons utiliser des lignées tumorales syngéniques. Les souris seront tatouées et génotypées entre 7 et 12 jours après leur naissance. Dans les expériences d’implantation de cellules tumorales, les souris auront entre 14 et 16 semaines . Ces adultes présentent de bonnes réponses immunitaires et sont faciles à manipuler.
Appétit hédonique : dimorphisme sexuel et rôle du microbiote chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Pour étudier comment l'appauvrissement de la flore intestinale modifie l'appétit pour les aliments sucrés ou gras, et pourquoi l'effet diffère selon le sexe, 1 032 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à sévère, toutes tuées à l'issue pour récupérer leurs tissus. Les procédures comprennent un cocktail d'antibiotiques et d'antifongiques qui peut provoquer une inflammation intestinale, des injections sous la peau deux fois par jour pendant quatre semaines, soit 56 par souris, et un gavage de glucose suivi de sept prises de sang à la queue en deux heures. Pour mesurer ce qu'elles mangent, les souris sont isolées jusqu'à quatre semaines, deux au plus pour la majorité. Une perte de 20 % du poids en une semaine constitue un point limite. Le porteur prévoit aussi des tests comportementaux "adaptés au modèle de dépression", dont il écrit qu'ils peuvent être stressants, sans les nommer.
Objectifs
L'appétit, la satiété et les préférences alimentaires sont influencés par le microbiote intestinal. Plusieurs études récentes indiquent que chez la souris, l'absence ou l'appauvrissement du microbiote intestinal augmentent la consommation d'aliments appétents tels qu'une solution de saccharose, des granulés de saccharose ou des aliments riches en lipides avec un effet potentiel du sexe. Dans cette étude, nous évaluerons l’effet de la déplétion du microbiote intestinal dans notre modèle sur les états émotionnels afin de comprendre les facteurs qui sous-tendent le dimorphisme sexuel observé ainsi que le rôle d'une hormone gastro-intestinale dans l’effet de la déplétion du microbiote intestinal sur la prise alimentaire hédonique.
Bénéfices attendus
Les données issues de ce projet contribueront à une meilleure compréhension des influences du microbiote intestinal selon le sexe sur l’appétit hédonique et des mécanismes associés. Cette étude chez l’animal est nécessaire pour permettre d’envisager par la suite des études plus appliquées dans des modèles de troubles du comportement alimentaire par exemple ou chez l’Homme.
Procédures
Le test de tolérance au glucose sera mené sur des animaux vigiles, une seule fois par animal. Une administration intragastrique avec une solution de glucose sera réalisé. Cette intervention prendra de 10 à 15 secondes par animal. Sept prélèvements de sang au niveau de la queue seront réalisés par ponction de la veine caudale afin de recueillir une goutte de sang par prélèvement. La durée de l’intervention (contention, ponction, prélèvement) sera de 30 secondes par animal. Les prélèvements s’étaleront sur deux heures. Des administrations sous-cutanées bi-quotidiennes pendant 4 semaines seront réalisées sur des animaux vigiles, ce qui représente 56 injections par souris. L'injection prendra de 15 à 30 secondes par animal. Les mesures de prise alimentaire nécessitent un isolement des souris. Cet isolement pourra durer jusqu'à 4 semaines. Il n'excèdera pas 2 semaines pour la majorité des souris.
Impact sur les animaux
L’administration d’un cocktail d’antifongique/antibiotiques pour dépléter le microbiote digestif peut induire des modifications de la motilité intestinale, une augmentation de l’hydratation des selles et une inflammation intestinale modérée. L’hébergement en individuel peut engendrer un stress chez la souris. Les tests de tolérance au glucose nécessitent une étape d'administration intragastrique et une ponction de sang au niveau de la veine caudale. Ces actions peuvent entraîner du stress ou de la douleur chez les souris. Les tests comportementaux adaptés au modèle de dépression peuvent être stressant pour les souris. Les autres interventions ne devraient pas entraîner d'autres souffrances ni d'angoisses.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour récupérer les tissus biologiques, indispensables pour mener les expérimentations en lien avec les questions de recherche du projet.
Remplacement
Cette étude comprenant des mesures neuro-comportementales ne peut être ni réalisée in vitro ni modélisée in silico. Elle nécessite donc l’utilisation d’animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données issues de la littérature et des travaux antérieurs au sein de l’équipe. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de détecter des différences neurocomportementales ou de réponses physiologiques entre les groupes expérimentaux. La réalisation d’une expérience pilote permettra de choisir des doses d’agents pharmacologiques efficaces sur nos paramètres d’intérêt sur un nombre limité d’animaux afin de garantir le succès des procédures concernées. L’utilisation d’un plan d’étude croisé (administration consécutive des différentes doses du traitement au même sujet) permet de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l'expérience pilote.
Raffinement
Les souris seront logées en groupe de 4 par sexe, dans des cages enrichies offrant des zones où elles pourront se dissimuler. Un surenrichissement de la cage sera prévu lors des phases d'hébergement individuel (ajout de matériel de nidification supplémentaire et stimulant le comportement exploratoire). De même, les souris seront habituées à l'administration intragastrique et à la contention avant le test de tolérance au glucose. Les souris seront pesées régulièrement, et elles seront toutes observées chaque jour afin de prévenir la survenue d’un potentiel problème. Dès que nécessaire, des analgésiques seront utilisés pour prévenir la douleur. Des points limites stricts et spécifiques au projet seront appliqués, comme la perte de poids >20% du poids sur une semaine.
Choix des espèces
Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur des individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines à l’arrivage pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.
Evaluation de l’effet de substances pharmacologiques sur la sensibilité gustative
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 600
600 souris et 600 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chaque animal voyant son accès à l'eau réduit à une plage de trente minutes à quatre heures par jour, pendant cinq jours. Ils reçoivent les substances testées en une fois ou par perfusion lente, en administration unique ou répétée sur plusieurs semaines, puis leur aversion pour des solutions amères est mesurée. 900 sont tués parce que les effets à moyen et long terme des substances restent méconnus, les 300 animaux témoins pouvant être réutilisés après accord du vétérinaire. L'objet réel est d'ajuster le goût de candidats médicaments pour que les patients suivent mieux leur traitement, bénéfice formulé au conditionnel face à une soif imposée et à des substances qui peuvent provoquer, selon les termes du porteur, une gêne ou une sensation de mal-être.
Objectifs
L’objectif principal de ce projet est de déterminer comment différentes molécules (candidats médicaments en cours de développement) ayant une potentielle interaction avec les récepteurs gustatifs et/ou les voies impliquées dans la perception gustative au niveau du SNC affectent les préférences et les aversions gustatives chez l’animal. La réponse gustative des animaux en présence de ces molécules sera analysée à travers des tests d'aversion (notamment pour des substances amères). En effet, de nombreux médicaments peuvent altérer le goût, influençant ainsi l'appétit et l'adhésion au traitement. En identifiant et en caractérisant ces effets dès les phases de développement, il est possible d'optimiser les formulations médicamenteuses pour minimiser les impacts négatifs sur le goût et le comportement alimentaire.
Bénéfices attendus
En évaluant les effets des candidats médicaments ayant une potentielle interaction avec le goût, il devient possible de concevoir des traitements mieux tolérés, favorisant une meilleure adhésion des patients à leur régime thérapeutique. Une adhésion accrue mène généralement à une efficacité thérapeutique optimisée, améliorant ainsi les résultats de santé pour les patients.
Procédures
La principale intervention subie par les animaux est la préhension des animaux et l'administration des substances d'essais en bolus d'une durée de quelques secondes ou par perfusion lente de quelques minutes.. Les administrations peuvent être uniques ou répétées pendant plusieurs jours ou quelques semaines en fonction de l’objectif de l’étude. Les animaux ont un accès à l'eau limité de 30 minutes à 4 heures par jour pour une période maximale de 5 jours.
Impact sur les animaux
L'accès à l'eau est limité à une période journalière définie (sessions d'habituation et de test) ce qui peut entrainer une sensation de soif et un stress temporaire. Les manipulations/contentions réalisées notamment pendant les phases d'administration ou de prélèvements peuvent également entrainer un léger stress. Par ailleurs, certaines substances testées peuvent provoquer une gêne ou une sensation de mal-être.
Devenir
Tous les animaux ayant reçu une substance d’essai dont les effets à moyen et long terme sont méconnus seront euthanasiés en fin d’étude afin de s’assurer que le traitement expérimental n’induira pas d’effet délétère sur l’animal. Les animaux contrôles peuvent être réutilisés après l’approbation du vétérinaire.
Remplacement
Dans le cadre du développement des médicaments, des tests in vitro ont déjà eu lieu avant l'utilisation de l'animal, ce qui constitue un point de départ permettant de générer des données préliminaires et d’effectuer un tri moléculaire. En vue de réduire le nombre d'animaux utilisés dans ce projet, seules seront testées les molécules qui ont montré un impact potentiel sur la sensibilité gustative.
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Nos données historiques indiquent qu’un effectif de 10 animaux est généralement nécessaire pour atteindre une sensibilité correcte du test.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la régle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance
Choix des espèces
Les rongeurs (rats et souris) demeurent l'espèce privilégiée pour évaluer les effets de candidats médicaments sur la sensibilité gustative. Les procédures utilisées sont largement décrites dans la littérature. Tous les animaux seront utilisés à partir de 4 semaines de développement (après sevrage) que ce soient des rats ou des souris, conformément à la littérature.
Vaccination ciblant les composés de surface de Clostridioides difficile dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Rendues sensibles par un antibiotique injecté dans l'abdomen, 300 souris de six à sept semaines sont ensuite infectées par gavage avec une souche pathogène de Clostridioides difficile. Les procédures sont classées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à la fin. Elles reçoivent trois injections vaccinales sous la peau et deux prises de sang à la mandibule, avec un recueil de selles tous les deux jours, l'infection provoquant deux à trois jours de diarrhée et une perte de poids de 5 à 15 %. Le porteur justifie la mise à mort par l'infection elle-même et par l'analyse des tissus, et présente la vérification des candidats vaccins chez l'animal comme "exigible réglementairement" avant toute phase clinique.
Objectifs
Clostridioides difficile (C. diff) est la première cause de diarrhées bactériennes associées aux soins chez l’adulte dans les pays développés et en particulier en France (> 24000 cas par an, dont 14 % de formes compliquées). La mortalité associée aux infections à C. difficile (ICD) est de l'ordre de 3%. Les ICD peuvent évoluer sur un mode épidémique avec la survenue de cas groupés d’infection voire de véritables épidémies locorégionales. Elles représentent un coût sanitaire important pour nos sociétés, en raison de l’augmentation des durées moyennes de séjours et des surcoûts liés à leur prise en charge spécifique. Une antibiothérapie est le plus souvent efficace pour traiter une infection liée à C. difficile, mais les rechutes sont fréquentes (environ 20% des patients). La vaccination est la meilleure approche à long terme pour réduire le nombre de ces infections. Le but de cette vaccination est de lutter contre le développement de la bactérie au niveau du tube digestif et donc de réduire les symptômes ainsi que la dissémination de la bactérie dans l’environnement. Les antigènes testés ont démontré in vitro et in silico des qualités requises pour être considéré comme un bon antigène. Il est toutefois nécessaire de réaliser des tests in vivo dans un modèle d'infection chez la souris qui permet d'étudier la réponse immunitaire induite par la vaccination. L'objectif de ce projet est d'obtenir une preuve de concept de l'efficacité in vivo de ces nouveaux antigènes. Une analyse de l’immunité des animaux sera vérifiée avant et après immunisation. L'efficacité vaccinale sera évaluée par le suivi de la présence de la bactérie pathogène dans le tube digestif (par numération de la bactérie dans les fèces des animaux), une analyse de l’inflammation intestinale et ceci sera corrélé à la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Le développement de nouvelles méthodes de prévention des infections à C. difficile permettrait d’offrir de nouvelles options thérapeutiques aux patients et limiter le risque d’infections communautaires et nosocomiales et de diminuer la dissémination de cette bactérie pathogène dans l’environnement. Le développement d'un vaccin permettrait de prévenir les infections à C. difficile ou leur récidive. Les antigènes vaccinaux utilisés dans cette étude sont des facteurs impliqués dans la colonisation par la bactérie du tube digestif et des facteurs de virulence. Si une réponse immunitaire efficace est induite lors de ces essais de vaccination, la bacterie sera limitée dans son développement et les symptomes cliniques de l'infection ne seront donc plus visibles.
Procédures
Le modèle nécessite 3 types d’actes expérimentaux à savoir les immunisations par voie sous-cutanée, l’administration par voie orale de C. difficile (un gavage unique durant la procédure, qui dure moins de 10 secondes par animal) et une injection intrapéritonéale d’antibiotique sous anesthésie locale (une seule injection durant la procédure, anesthésie locale par pommade 10 min avant l'injection qui dure moins de 10 secondes). De plus, le recueil de selles fraiches sera réalisé tous les deux jours, sur la durée de l'essai, ce recueil dure moins d'une minute. Le prélèvement de sang sera réalisé par voie submandibulaire sur animaux vigiles mais anesthésiés localement par lidocaïne, 2 prélèvements à J-52 et J-5. Le prélèvement sera réalisé très rapidement (moins d'une minute) par une personne très expérimentée.
Impact sur les animaux
Le modèle nécessite 3 types d’actes expérimentaux à savoir l’administration par voie orale de C. difficile et 3 injections par voie parentérale (sous-cutanée) pour les immunisations, 1 injection intrapéritonéale (moins de 5 secondes) d’un antibiotique et 2 prélèvements sanguins (moins de 10 secondes) par voie submandibulaire. Suite à l’infection, le modèle peut induire des diarrhées allant de 2 à 3 jours et des pertes de poids qui varient entre 5 et 15% du poids initial des animaux. Les nuisances suite aux infections peuvent être considérées comme modérées. Un arrêt de la diarrhée et un retour au poid initial est généralement observé 3 jours après l'infection. La procédure de gavage par voie orale occasionne pour les animaux une angoisse modérée, de courte durée (moins de 5 secondes) ; le prélèvement de fèces n’occasionne aucune douleur mais peut provoquer une angoisse légère (de très courte durée) dans la mesure où il nécessite de manipuler l’animal.
Devenir
Ayant été infectés par une souche pathogène de C. difficile, et en raison de l'interet de l'analyse des prélèvements des tissus, tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.
Remplacement
Plusieurs tests in vitro et in silico ont permis d'évaluer l'intérêt des candidats vaccins. L'étape de vérification de leurs qualités antigéniques in vivo est exigible réglementairement avant toute nouvelle phase de développement clinique. Le recours à l'animal est indispensable pour valider l'effet thérapeutique. La reconstitution des interactions entre, l’hôte, son système immunitaire et les pathogènes sont complexes et à ce jour aucun modèle in vitro ou in silico n'est capable de reproduire la complexité de ce processus dans son intégralité.
Réduction
Une planification statistique minutieuse a permis de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés au nombre de 300, tout en préservant la validité statistique de l'étude. Afin de pouvoir conclure à l'issue de ces expérimentations sans avoir besoin de les répéter, 12 animaux par groupe seront nécessaires.
Raffinement
Les animaux seront hébergés avec suffisamment d'espace, par groupe de 5 avec comme enrichissement un tunnel de carton et du papier pour construction de nids. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur entretien sera effectué dans des conditions soigneusement contrôlées pour s'assurer que les animaux subissent le minimum de stress possible. En particulier, les litières seront changées de façon hebdomadaire et les animaux auront un accès direct et illimité à l'eau de boisson et à la nourriture. La procédure d'expérimentation sera pratiquée en utilisant des anesthésiques permettant de limiter la souffrance des animaux qui bénéficieront d'une procédure d'euthanasie anticipée et une sortie d'étude prématurée en cas d'atteinte des points limites éthiquement non acceptables. Des point limites adaptés et des critères d'arrêt précoces de souffrance ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
La souris est l'animal le plus utilisé dans le modèle de colonisation par C. difficile car il reproduit de façon rapide et reproductible cette pathologie. Les souris seront manipulées à l'âge de 6 ou 7 semaines (maturité sexuelle atteinte). Ce choix est motivé par la nécessité d'utiliser des animaux ayant atteints l'âge adulte et qui répondent au modèle de colonisation par C. difficile.
Mise en évidence et caractérisation des phénomènes de NETose dans deux modèles de sclérodermie systémique chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Les souris subissent cinq injections sous-cutanées par semaine pendant dix, vingt-huit ou quarante-deux jours, ou une incision dorsale sous anesthésie pour implanter une mini-pompe diffusant un inducteur de fibrose pendant sept à vingt-huit jours. 126 souris âgées de six à huit semaines sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Le produit injecté enflamme et épaissit la peau, les poumons et les reins, ce qui reproduit une partie de la sclérodermie systémique pour y repérer des pièges extracellulaires de neutrophiles. Le porteur annonce une surveillance rapprochée destinée à détecter des points limites "préalablement établis", sans indiquer lesquels.
Objectifs
La sclérodermie systémique est une maladie qui modifie et épaissit la peau et d’autres organes les empêchant de fonctionner correctement. Il n’existe pas encore de traitement efficace. Certains globules blancs de notre organisme (les neutrophiles) sont capables d’éjecter autour d’eux un ensemble de molécules que l’on appelle NETs et qui dans des conditions normales forment des pièges à bactéries. Cependant, ces molécules peuvent être libérées de façon incontrôlée et être impliquées dans la progression de certaines maladies. Le rôle des NETs dans la sclérodermie est encore mal compris. Nous avons montré que des neutrophiles de patients libérent plus de NETs que ceux de sujets sains lorsqu’ils sont stimulés in vitro. Dans ce projet, nous visons à mettre en évidence l’existence de NETs dans des souris chez lesquelles nous aurons reproduit en partie la sclérodermie afin de pouvoir tester dans le futur des médicaments qui empêcheraient la formation des NETs et qui potentiellement freineraient l’avancement de la maladie.
Bénéfices attendus
A court terme, ce projet permettra d’acquérir des connaissances supplémentaires sur les phénomènes mettant en jeu les NETs dans les tissus et dans la circulation sanguine lors de la progression de la maladie et ainsi démontrer la pertinence de chacun des modèles pour l’utilisation ultérieur d’un inhibiteur de NETs. A plus long terme, cela nous permettra de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les NETs dans un contexte de sclérodermie systémique.
Procédures
Dans une première procédure, les souris subiront une injection sous-cutanée d'une solution induisant la fibrose ou d'une solution saline, 5 fois par semaine pendant 10, 28 ou 42 jours. Dans une seconde procédure, les souris subiront 1) une injection sous-cutanée d'une solution d'anesthésiant, 2) une incision au niveau dorsal pour créer une poche sous-cutanée dans laquelle sera implantée la mini-pompe osmotique contenant une solution induisant la fibrose ou une solution saline et 3) une suture. La durée de l'intervention sera de 10 à 15 minutes et la diffusion sous-cutanée de la solution fibrosante durera 7, 18 ou 28 jours.
Impact sur les animaux
L’injection sous-cutanée peut causer une douleur légère de courte durée. La manipulation, l’anesthésie et l’intervention chirurgicale peuvent être des sources importantes de stress physiologique et psychologique chez la souris. Lors de la pose de la mini-pompe, les souris peuvent ressentir de la douleur ou de l’inconfort à l’endroit de l’implantation. Les injections répétées ainsi que la diffusion sous-cutanée des inducteurs de fibrose induisent une inflammation et un épaississement des tissus cutané, pulmonaire et rénal.
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire et des NETs en particulier nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.
Remplacement
Les résultats précédemment publiés par la communauté scientifique nous ont confirmé qu’il n’existe pas d'autre possibilité que l'animal nous permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes mettant en jeu plusieurs types cellulaires au cours de la sclérodermie systémique. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons calculé le nombre d'animaux nécéssaire au plus juste grâce à un logiciel de statistique afin de limiter le nombre de souris utilisées. Pour l’analyse des résultats a posteriori, des tests statistiques adaptés seront utilisés. Une répartition aléatoire des animaux sera réalisée dès leur arrivée. Une banque de tissus sera récupérée pour éviter de refaire des expériences dans l’avenir.
Raffinement
Nous utiliserons une mini-pompe pour faire diffuser l'inducteur de fibrose dans la peau, évitant les injections répétées. Le deuxième inducteur de fibrose que nous utiliserons est très instable dans le temps et nécessite d’être préparé extemporanément. Dans le cas des injections répétées de ce second inducteur, les injections seront réalisées par deux expérimentateurs au niveau du dos de l’animal. Une rotation systématique dans le sens des aiguilles d’une montre sera faite afin de ne pas injecter quotidiennement au niveau du même site. Par ailleurs, ces expériences (injections multiples ou implantation pompe) ne se feront pas en un seul essai (126 animaux) mais seront fractionnées de façon à travailler sur des groupes plus petits améliorant la prise en charge de chacune des souris. Dans le cas de l’implantation de la mini-pompe, une analgésie pré-opératoire sera effectuée par injection sous-cutanée de buprénorphine. Une surveillance post-opératoire rigoureuse sera mise en place après l’intervention pour détecter tout signe de douleur, d’infection ou autres complications. Les animaux feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter les points limites préalablement établis et d’éviter ainsi tout stress et souffrance. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.
Choix des espèces
Il n’existe aucun modèle cellulaire capable de reproduire la complexité des interactions entre le système immunitaire, le système vasculaire et les tissus. La souris est considérée comme le modèle le plus approprié à l’étude de ces interactions complexes et plus particulièrement à l’étude du système immunitaire. En effet, la maturation ainsi que la réponse à un stimulus du système immunitaire murin sont très proches de celles de l’Homme. Les souris utilisées dans ce projet seront des souris « jeune adulte » âgées de 6 à 8 semaines. Les souris à cet âge ont un système immunitaire mature, essentiel pour modéliser la réponse inflammatoire et fibrotique propre à la sclérodermie. En termes de poids et de taille, les souris de 6 à 8 semaines sont assez robustes pour tolérer les injections répétées sans causer de stress excessif pouvant conduire à une mort prématurée. Les souris de cet âge peuvent par ailleurs subir l’intervention chirurgicale associée à l’implantation de la mini-pompe sans complication post-opératoire. Enfin, ce stade de développement permet une tolérance à la mini-pompe sous-cutanée et favorise une diffusion homogène de l'inducteur de fibrose.
Evaluation d’éventuels changements neurologiques induits par un candidat médicament et sa pharmacocinétique chez le rat
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
570 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 450 tués et 120 transférés vers un autre projet après accord du vétérinaire. Ils reçoivent le candidat médicament par voie orale, une à deux fois par jour pendant six mois, passent deux tests de mémoire, huit séries d'observations neurologiques, des évaluations d'anxiété et des tests de réflexes auditifs deux fois par semaine pendant six semaines, avec jusqu'à huit prélèvements sanguins dans une même journée. La molécule agit sur des cellules du cerveau dont l'activation excessive est associée à des troubles dégénératifs et psychiatriques, et le porteur reconnaît que ses effets indésirables ne sont pas prévisibles au départ. Parmi les bénéfices attendus, il inscrit une amélioration des connaissances scientifiques "pour le rat", et décrit l'animal comme un "passage obligatoire" avant toute administration à l'être humain.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets sur la mémoire, l’anxiété, le comportement général de l’animal, l’activité locomotrice, la coordination motrice, les différents réflexes neurologiques, sur la température corporelle et le poids chez le rat d’un candidat médicament induisant des modifications au niveau des cellules spécifiques du cerveau. Ces cellules fournissent un mécanisme contre les blessures et les infections, mais l'activation chronique ou excessive est considérée comme préjudiciable et a été impliquée dans de nombreux troubles dégénératifs et psychiatriques.
Bénéfices attendus
Ce projet permet de vérifier que des composés activant les cellules spécifiques du cerveau n’induisent pas de troubles dégénératifs et psychiatriques en fonction des expositions dans le sang. Ce projet permettra également de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont principalement une amélioration des connaissances scientifiques pour le rat grâce au développement de méthodes de raffinement de plus en plus adaptées et à la sélection de l’espèce la plus adéquate pour répondre aux objectifs scientifiques attendus.
Procédures
Les animaux seront administrés avec les composés à tester par voie orale (-2 min par administration généralement 1 administration / jour pendant 3 mois et jusqu’à 2 administrations par jour pendant 6 mois au maximum) puis auront 2 tests de mémoire d’une durée maximale de 40 min et 4 fois par test en 6 mois. Les animaux seront évalués d'un point de vue neurologique par une série d'observation pour une durée maximum d’1h et 8 fois en 6 mois. L’anxiété sera évaluée pour une durée maximum de 5 minutes et 4 fois en 6 mois. Enfin, des reflexes auditifs seront évalués pour une durée maximum de 30 minutes et 2 fois/semaine sur 6 semaines. Des prélèvements de sang sur animal vigile ou anesthésié pourront être effectués (2 minutes par prélèvement) avec un maximum de 8 prélèvements par jour et 6 jours non consécutifs sur 6 mois et des prélèvements de tissus pourront être réalisés sur animaux anesthésiés en fin d'expérience.
Impact sur les animaux
La manipulation lors du passage en cage d’hébergement aux arènes de test ou pour induire l’anesthésie ou lors de l’administration du composé à tester pourra induire un stress mineur de courte durée. Lors de certaines administrations nécessitant une aiguille, telles que l'induction de l'anesthésie, ainsi que lors des prélèvements, les animaux pourront aussi subir une douleur légère et brève liée à la piqûre avec une aiguille. L'administration par voie orale qui se fera sur plusieurs mois pourra induire un léger stress de courte durée à chaque administration. L'administration sous cutanée sur plusieurs jours pourra induire un léger stress de courte durée à chaque administration. L’anesthésie peut induire un stress à l’endormissement. Dans le test de coordination motrice, les animaux pourraient ressentir un léger stress par le fait de devoir s’accrocher à un axe en rotation. Ils pourront également resssentir un stress léger lié à la chute de l’axe ou de l'arène surélevée. Dans le test de stimulation auditive, les animaux pourraient ressentir un stress par la contrainte de l'espace disponible et les stimulations auditives.Les effets potentiellement indésirables du/des produits testés ne sont pas prévisibles à l’initiation du projet. Les effets potentiellement indésirables feront l’objet d’échanges avec les membres de la Structure de Bien-Etre Animal (SBEA) pour adapter les outils d’observations des animaux afin de mettre en place les traitements de potentiels signes cliniques.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rat car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur l'établissement d'une lésion ou d'un dysfonctionnement du système nerveux central ou périphérique. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques : 60 (30 mâles et 30 femelles) / par groupe. L’analyse statistique sera adaptée au modèle.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales (manipulation des animaux, habituation à la contention et habituation aux arènes expérimentales)• L'utilisation d'anesthésie adaptée associée à une analgésie pour la réalisation des prélèvements
Choix des espèces
Le rat est l'une des espèces animales les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur la mémoire, l'anxiété et les potentiels effets secondaires d'un produit sur le système nerveux central, la coordination motrice, l'activité locomotrice spontannée du fait des homologies entre le comportement humain et de ce rongeur et des homologies structurelles entre le système nerveux humain et de ce rongeur. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.
Etude de l’impact d’une invalidation du gène anti-apoptotique TP53 combinée à l’expression d’un mutant activateur de Myd88 dans la lignée plasmocytaire.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Biopsiées à la queue sous anesthésie quand elles sont juvéniles, 244 souris reçoivent ensuite du tamoxifène, des substances introduites dans l'estomac et des immunisations, et subissent des prises de sang sous anesthésie. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger. Ces souris sont construites pour développer des tumeurs de plasmocytes, par désactivation d'un gène qui déclenche la mort des cellules et activation d'un autre qui stimule leur multiplication. Le porteur s'attend à des déformations osseuses liées aux tumeurs, à des difficultés à se déplacer ou à se tenir debout et à l'apparition de masses dans les organes lymphatiques. Toutes seront tuées à la fin de l'étude, le RNT indiquant par ailleurs qu'une partie des animaux modifiés pourra servir à établir de nouvelles lignées.
Objectifs
Dans ce projet, nous créons un modèle de souris pour mieux comprendre comment certains gènes peuvent provoquer des tumeurs dans les plasmocytes, qui sont des cellules du système immunitaire produisant des anticorps pour nous protéger contre les infections. Nous allons modifier l'ADN de ces souris en désactivant un gène qui entraîne la mort des cellules et en activant un autre qui stimule leur multiplication. Cela permettra à ces cellules de survivre et de se multiplier davantage. Grâce à ce modèle, nous espérons comprendre comment ces changements génétiques conduisent à la formation de tumeurs et trouver de nouveaux traitements pour ce type de cancer.
Bénéfices attendus
Notre projet cherche à comprendre comment le cancer se développe en étudiant le rôle de deux gènes dans un type particulier de cellule, les plasmocytes, qui produisent des anticorps. Ces gènes jouent un rôle clé dans la croissance des cellules et sont impliqués dans un cancer du sang appelé myélome multiple. En étudiant ces gènes, nous espérons découvrir comment ils contribuent à la formation de ce cancer, en particulier dans ses stades avancés. L’un de ces gènes aide normalement les cellules à maintenir leur ADN stable, ce qui les protège contre le cancer. Cependant, dans le myélome multiple, ce gène est souvent modifié, rendant les cellules plus vulnérables aux mutations et favorisant leur croissance incontrôlée. L’autre gène, impliqué dans la survie des cellules immunitaires, est souvent activé de manière anormale dans les cellules cancéreuses. En étudiant ces gènes dans les plasmocytes, nous souhaitons mieux comprendre leur rôle dans le développement du myélome multiple. Une meilleure compréhension de ce processus pourrait conduire à la mise au point de nouveaux traitements plus efficaces pour les personnes atteintes de ce cancer complexe, offrant ainsi de nouvelles options thérapeutiques et améliorant les perspectives de traitement pour les patients.
Procédures
Les animaux de ce projet seront soumis à plusieurs interventions dans le cadre des expériences, telles que : 1. Alimentation contrôlée: Des substances spécifiques seront introduites dans l'estomac des animaux pour répondre aux besoins de l'étude. 2. Stimulations du système immunitaire : Des injections seront réalisées pour activer la réponse immunitaire des animaux. 3. Prélèvements sanguins sous anesthésie : Du sang sera prélevé afin d'analyser l'état de santé et certains paramètres biologiques des animaux. 4. Analyse génétique : Un petit échantillon de tissu sera prélevé sur la queue des souris juvéniles sous anesthésie pour déterminer leurs caractéristiques génétiques et sélectionner celles qui participeront aux expériences.
Impact sur les animaux
1. Réactions immunitaires : Les animaux pourraient avoir des réactions indésirables liées à l’activation de leur système immunitaire. 2. Changements de comportement : Des changements dans le comportement des animaux, comme plus de calme ou de fatigue, peuvent être observés. 3. Perte de poids : Si l’animal perd une quantité importante de poids. 4. Problèmes osseux : Des changements dans la structure de ses os, comme des déformations liés aux tumeurs. 5. Problèmes de mobilité ou de posture : Des difficultés à se déplacer ou à se tenir debout. 6. Apparition de grosseurs: Formation de masses ressemblant à des tumeurs, particulièrement dans les organes lymphatiques. Par ailleurs, certaines interventions techniques pourraient occasionner un inconfort pour les animaux : - Biopsies de queue Effectuées sous anesthésie, elles peuvent provoquer une légère douleur passagère ainsi qu’un stress dû à la manipulation. -Injections de tamoxifène : Ce traitement peut entraîner une irritation au point d’injection et un stress temporaire. Un suivi attentif sera mis en place pour assurer le bien-être des animaux tout au long de l’étude.
Devenir
À la fin de l'étude, tous les animaux seront euthanasiés. Ceux qui ne seront pas intégrés aux expériences ou aux croisements seront retirés dès que possible. Pour les animaux ayant subi des modifications génétiques, certains pourront être réutilisés pour établir de nouvelles lignées sans nécessiter d'autres tests. Une fois les expériences terminées, l’analyse des organes des animaux permettra d’approfondir notre compréhension des effets des traitements étudiés.
Remplacement
Bien que des modèles cellulaires, comme les cellules provenant de patients ou des lignées de cellules, puissent être utilisés pour étudier certaines tumeurs de plasmocytes, telles que celles du myélome multiple ou de la maladie de Waldenström, ces recherches en laboratoire ne reproduisent pas la complexité des processus qui se déroulent dans la moelle osseuse ou les organes lymphoïdes, où ces maladies apparaissent naturellement. De même, bien que certaines modifications génétiques des cellules en laboratoire nous aident à mieux comprendre certains aspects de ces tumeurs, elles ne reflètent pas entièrement la manière dont elles se forment et évoluent dans un organisme vivant. C’est pourquoi l’utilisation de modèles animaux, comme la souris, est essentielle pour approfondir nos connaissances. En recréant ces tumeurs chez la souris, nous pourrons observer comment ces modifications affectent l’organisme dans un environnement naturel et complexe. Cela nous permettra d’obtenir des résultats plus précis et de tester de nouvelles thérapies pour traiter ces cancers.
Réduction
Pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans nos expériences, nous avons mis en place plusieurs mesures pour être plus efficaces tout en respectant leur bien-être. Voici les principales stratégies : - Choix du modèle animal : Nous utilisons une lignée de souris spécifique, ce qui permet d'avoir moins de variations entre les animaux et d’obtenir des résultats plus fiables. - Planification des expériences: Nous organisons les études pour éviter les manipulations répétées, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires. - Utilisation de mâles et femelles : Nous ne faisons pas de distinction entre les sexes, ce qui permet de réduire le nombre total d'animaux. - Euthanasie à la fin des expériences : Les animaux sont euthanasiés à la fin des études, et tous leurs organes sont prélevés pour maximiser les informations obtenues. - Analyses statistiques : Nous utilisons des méthodes d’analyse qui nous permettent de tirer des conclusions solides avec moins d’animaux. - Suivi des animaux : Selon les résultats des analyses sanguines, les animaux sont suivis et euthanasiés à des âges différents pour optimiser leur utilisation. Ces stratégies nous aident à minimiser le nombre d'animaux tout en respectant les règles éthiques et en garantissant leur bien-être.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans un environnement adapté pour minimiser leur stress. Nous les habituons progressivement aux manipulations et assurons un contact régulier avec le personnel soignant. Lors des interventions, des méthodes douces sont utilisées pour réduire le stress, et seules des personnes expérimentées réalisent les manipulations. Les animaux sont anesthésiés pour les prélèvements sanguins. Après chaque intervention, nous les surveillons attentivement pour nous assurer qu'ils se rétablissent bien et qu'ils ne souffrent pas. Ces mesures garantissent leur bien-être et la qualité des résultats.
Choix des espèces
Dans notre projet, nous utilisons des souris qui développent des problèmes similaires à ceux que l'on trouve chez les humains, comme le myélome multiple. Les mécanismes de ces maladies chez les souris sont très proches de ceux observés chez les humains. Par exemple, des protéines appelées immunoglobulines, qui jouent un rôle clé dans le développement de ces maladies, sont très similaires dans les deux espèces. Pour notre expérience, nous avons choisi de faire nos expériences sur des souris âgées de 8 semaines . Cet âge est choisi car les souris ont alors un système immunitaire bien développé, ce qui est important pour commencer les immunisations.
Rôle du microbiote précoce en tant que facteur de risque d’autisme. Etude chez la souris. Site 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Nées et élevées sans aucun germe, 800 souris reçoivent par gavage les matières fécales de nouveau-nés grands prématurés. Elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré et sont toutes tuées pour prélèvement d'organes. 128 souriceaux de 25 jours voyagent quarante minutes en camion vers un second établissement, où ils sont maintenus deux semaines avant d'être tués à 38 jours. Le porteur affirme qu'il n'existe à ce jour ni modèle informatique ni méthode de laboratoire capable de répondre à la question posée, et que le recours aux animaux non-humains est donc "indispensable".
Objectifs
Ce projet se déroulera dans deux établissements distincts, et certains animaux seront transportés de l’établissement utilisateur EU1 vers l’établissement utilisateur EU2 à J25. Le microbiote intestinal, ou l’ensemble des microbes peuplant le tractus digestif, est considéré comme un composant essentiel dans le développement et la physiologie de l’hôte, notamment pour certains organes comme l’intestin et le cerveau. Alors que 11% des naissances dans le monde sont des naissances prématurées, plusieurs études démontrent que le microbiote intestinal est souvent plus immature et moins diversifié chez l’enfant prématuré par rapport à un enfant né à terme, et ce déséquilibre pourrait être un facteur de risque d’un développement cérébral anormal. Une analyse récente du microbiote intestinal de nouveau-nés prématurés âgés d’1 mois a permis d’associer la composition de leur microbiote intestinal avec un développement cérébral normal ou un développement cérébral atypique, bien qu’il n'ait pas encore été prouvé que le microbiote intestinal cause directement ces différences. Dans ce contexte, nous cherchons à comprendre si la composition du microbiote intestinal dans les premiers jours de la vie pourrait être un facteur de risque de l’autisme. Pour cela, nous transférerons des matières fécales de nouveau-nés prématurés, associés soit à un développement cérébral normal, soit à un développement cérébral anormal. Nous observerons ensuite comment ce transfert de matières fécales humaines affecte chez la souris la physiologie et le comportement, de la période néonatale jusqu'à l’âge adulte.
Bénéfices attendus
L’avantage majeur de ce projet est de reproduire les effets potentiels d’un microbiote intestinal humain sur la physiologie et la santé d’un modèle vivant. Bien que les souris colonisées avec un microbiote intestinal humain ne soient pas le reflet parfait des interactions microbiote-hôte chez I’être humain, il a été montré que la composition et la diversité du microbiote humain implanté étaient conservés chez la souris colonisée. Ce modèle animal représente donc un système expérimental valide pour la compréhension des mécanismes sous-jacents aux interactions entre le microbiote intestinal, les intestins et le cerveau. Dans ce projet, il s’agira d’étudier l’impact potentiel de microbiotes fécaux d’enfants prématurés sur le développement et la fonction du système digestif, du cerveau, et des comportements associés au TSA (Trouble du Spectre autistique) chez la souris colonisée. Nous souhaitons également identifier les mécanismes par lesquels les premiers micro-organismes colonisant le tractus digestif pourraient impacter son propre développement mais aussi celui d’autres organes avec lesquels il communique : les intestins et le cerveau, et si cela constituerait un facteur de risque pour le TSA. En outre, il n’existe pas à notre connaissance de modèle équivalent dans la littérature permettant d’identifier si des microbiotes humains précoces de compositions définies affectent le développement du microbiote lui-même, celui du système digestif, du cerveau et des comportements, et comment cela peut être lié au(x) risque(s) de TSA.
Procédures
Dans ce projet, des gavages seront réalisés pendant 1 à 2 minutes maximum chez l’animal vigile. Un gavage sera réalisé sur un maximum de 160 femelles gestante et 640 souriceaux âgés de 22 jours. Par ailleurs, des échantillons de fèces seront prélevés lors du change hebdomadaire à partir de 14 jours de vie pour chaque souris, à raison de 3- 4 selles fraîches émises spontanément après placement de l’animal vigile dans un contenant individuel. Chaque prélèvement de selles n’excédera pas 5 minutes. Pour l’ensemble du projet, 8 prélèvements de fèces seront donc prévus au maximum pour chaque souriceau. 384 souriceaux au total, seront soumis à 20 tests comportementaux différents, réalisés entre 6 jours et 68 jours de vie. Plus précisément, le temps cumulé de test par âge sera de : A 6 jours, 5 minutes maximum, dans 4 tests des réflexes moteurs du nouveau-né. A 7 jours, 10 minutes maximum, dans un test de mémoire olfactive. A 18, 30 et 60 jours de vie, 10 minutes maximum dans des tests d’activité locomotrice et de réflexes moteurs. A 19, 31 et 61 jours, 66 minutes maximum, dans un test de mémoire visuelle et spatiale. A 20, 37 et 67 jours, 30 minutes maximum, dans un test évaluant l’anxiété et le comportement répétitif, des traits comportementaux communs à beaucoup de formes de TSA. A 21 jours, 5 minutes maximum, dans un test d’interaction sociale. De 32 à 34 jours de vie et de 62 à 64 jours, 16 minutes maximum, dans un test mesurant la capacité à résoudre un problème. A 38 et 68 jours, 15 minutes maximum, dans un autre test d’interaction sociale, évaluant aussi la mémoire sociale. Ces tests dureront entre 15 secondes et 30 minutes chacun par animal. Pour les tests de comportement avant sevrage, les souriceaux et leur nid seront séparés de la mère pendant 30 minutes maximum. Pour chaque test individuel, un souriceau sera séparé du reste de la portée pendant 15 minutes maximum. Après sevrage, les souriceaux seront séparés de leurs congénères pendant 30 minutes maximum. Enfin, ces tests seront répétés maximum 3 fois au cours du temps entre 6 et 68 jours de vie, à l’exception du test réalisé à 7 jours et celui réalisé à 21 jours. Ces interventions seront réalisées dans l’EU1, sauf pour 128 souris à 25 jours (moitié mâle, moitié femelle) parmi les 640 souriceaux du projet, transportées de l’EU1 à l’EU2.Le prélèvement de fèces, la mise à mort et le prélèvement d’organes de ces souris s’effectueront à 38 jours de vie dans l’EU2.
Impact sur les animaux
Lors des tests comportementaux avant le sevrage, l’ensemble de la portée sera séparé de la mère pendant 30 minutes maximum, ce qui pourrait provoquer un stress chez les souriceaux. Pour chaque essai comportemental individuel, chaque souriceau sera séparé du reste de la portée pendant une période maximale de 15 minutes, ce qui pourrait induire un stress supplémentaire. De plus, des fèces seront prélevés pour chaque souriceau placé dans un contenant individuel lors de la pesée hebdomadaire et un stress pourrait être induit pendant quelques minutes lors de cette pesée. Par ailleurs, un risque de fausse route ou blessure de l’oesophage peut survenir lors du gavage des mères et des petits de 22 jours. Enfin, le transport peut engendrer un stress éventuel.
Devenir
Les mères seront mises à mort après sevrage de leurs souriceaux car leur microbiote a été modifié et ne pourront pas être utilisées dans d’autres projets ni réintégrées dans l’élevage. Pour la même raison, les souriceaux en surnombre qui n’ont pas servis à équilibrer les portées moins nombreuses, seront mis à mort. Les souriceaux inclus dans le projet seront mis à mort pour des prélèvements d’organes d’intérêt.
Remplacement
Ce projet consiste à transférer le microbiote fécal d’enfants grands prématurés à des souris. Ce modèle animal permettra de déterminer si le microbiote intestinal a des effets sur la santé, et notamment sur le développement cérébral et le comportement des souris. L’utilisation d’animaux dans ce projet est donc indispensable pour cette étude, car il n’existe pas à ce jour de modèles informatiques ou de méthodes de laboratoire pour répondre à cette question scientifique de manière globale et complète.
Réduction
Au préalable, des échantillons de microbiote humain de bébés prématurés auront été sélectionnés selon des critères cliniques spécifiques, liés notamment au développement cérébral de l’enfant, correspondant le mieux à nos objectifs scientifiques. Par ailleurs, ces expérimentations seront réalisées de manière égale chez la progéniture mâle et la progéniture femelle en utilisant tous les animaux d’une portée, de manière à réduire le nombre d’animaux utilisés du projet. Un test de puissance statistique nous a permis de calculer, à partir de données comportementales précédentes, le nombre minimal d’animaux nécessaires dans le projet. Pour la colonisation avec un échantillon de microbiote humain donné (1 groupe d’animaux), 16 souriceaux par sexe + 8 souriceaux par sexe (servant uniquement de souris inconnues pour les souris testées dans un test d’interaction sociale), seront nécessaires. Les résultats seront analysés avec des tests statistiques adaptés.
Raffinement
Seront ajoutés les éléments suivants dans chaque cage : un tunnel transparent en plastique, des bâtons en bois à ronger, du matériel de nidification et du papier absorbant. Lors des tests comportementaux réalisés avant sevrage, les souriceaux seront séparés de la mère mais seront conservés avec l’ensemble de la portée dans une cage différente pendant la durée de chaque test. Cette cage contiendra de la litière de la cage d’origine ainsi que du matériel de nidification et du papier absorbant déchiqueté par la mère. Après chaque test comportemental, l’ensemble de la portée sera replacé rapidement dans la cage d’origine avec la mère. Lors du change hebdomadaire de la cage, une petite partie de la litière et le nid établi par la mère seront conservés pour éviter tout rejet de la portée. Le bien-être de chaque animal sera surveillé attentivement et régulièrement, et chaque animal sera pesé une fois par semaine. Des points limites adaptés seront mis en place et appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis de la procédure. Pour le transport, les animaux seront transférés en cage de transport avec leurs congénères initiaux pour ne pas provoquer un stress supplémentaire dû à l’isolement ou à la cohabitation avec des nouveaux congénères. Les animaux seront transportés dans une boite de transport stérile à laquelle sera ajoutée de la litière propre mais aussi de la litière et le nid établi dans la cage d’origine, des bâtons à ronger et du matériel de nidification et de la nourriture provenant de leur cage d’hébergement. Ils seront ensuite emmenés jusqu’à l'EU2 dans un véhicule agréé climatisé (40 min de transport) et seront maintenus au repos 2 semaines avant l’euthanasie pour prélèvement d’organes.
Choix des espèces
Les modèles animaux les plus utilisés pour étudier l’impact d’un microbiote intestinal complexe humain sur le développement et la santé de l’hôte sont les rongeurs. A l’heure actuelle, la souris est le rongeur le plus utilisé dans le cadre de l’étude des interactions entre le microbiote intestinal, les intestins et le cerveau, et permet donc une comparaison fiable par rapport à la littérature actuelle. Plus particulièrement, des souris totalement dépourvues de germes, nées et élevées en conditions stériles, permettront d’étudier l’impact d’un microbiote de prématuré humain sur le développement et la santé des souris. Les souris seront utilisées du stade néonatal (6 jours de vie) jusqu’à l’âge adulte (70 jours) puisque nous souhaitons déterminer si les premiers micro-organismes du microbiote intestinal représentent un facteur de risque déterminant pour le développement cérébral.
Modèles souris pour l’étude des mécanismes de l’hypermutation somatique (affinité des anticorps) et de l’instabilité des lymphocytes B
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Une perte de poids rapide, une difficulté respiratoire, un dos voûté ou un isolement déclenchent la mise à mort. 1 027 souris génétiquement modifiées vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le génotypage passe par le prélèvement d'un morceau de queue sous anesthésie gazeuse, les souris immunisées reçoivent des injections dans l'abdomen suivies de quatre prises de sang à la mandibule, et celles qui servent à fabriquer des chimères sanguines reçoivent en plus du busulfan, qui les fatigue et leur fait perdre du poids. Le porteur affirme que la maturation des anticorps ne s'opère qu'au sein d'un "organisme entier". Les souris dont le génotype ne sert pas au projet sont tuées, certaines versées à des procédures de tutorat en animalerie, tandis que 430 animaux repartent en zone d'élevage et 597 sont tués.
Objectifs
Notre projet étudie les processus biologiques complexes qui améliorent l’efficacité de notre système immunitaire. Les mécanismes que nous étudions provoquent volontairement des mutations dans les gènes des anticorps dans le but de les améliorer. Ces mécanismes se produisent naturellement lors d’une infection (ou lors d’une vaccination) et permettent à l’organisme de répondre efficacement et rapidement afin de se protéger contre la maladie. Comme ces mécanismes d’amélioration des anticorps ne peuvent pas être reproduits dans un tube mais se produisent uniquement dans un organisme entier ; nos études nécessitent l’utilisation de la souris, qui possède une réponse immunitaire proche de celle de l’homme. En pratique, nous étudions le système immunitaire et les anticorps de modèles de souris génétiquement modifiés chez lesquels l’amélioration des anticorps est soit augmentée soit diminuée.
Bénéfices attendus
Notre étude est utile pour la société, les scientifiques et les médecins car il est très important de comprendre les processus biologiques qui conduisent aux changements (aussi appelés mutations) des anticorps et donc à leur amélioration. Une meilleure compréhension de ce mécanisme est utile pour l’optimisation des vaccins et des nouveaux médiaments basés sur l'administration d'anticorps thérapeuthiques. Un autre bénéfice est la compréhension de l’apparitions de mutations dans d’autres gènes (appelés oncogènes) qui contribuent à l’apparition de cancers des cellules immunitaires (les lymphomes et les myélomes). Ces études de recherche fondamentale participent à comprendre les mécanismes qui sont à l’origine des cancers. Notre équipe collabore avec une équipe Grecque avec laquelle nous partagerons nos modèles de souris génétiquement modifiées ; nos laboratoires sont complémentaires et notre projet participe à la mise en commun de moyens au service de la recherche pour la société, en Europe.
Procédures
Pour la procédure 1 (Génotypage) les animaux sont soumis au prélèvement d'un morceau de queue sous anesthésie gazeuse courte. Le prélèvement de la biopsie de queue dure moins d'une minute. Pour la procédure 2 (Immunisation), les animaux sont soumis à une ou deux injections intra-péritonéales et 4 prélèvements de sang sous-mandibulaires sous anesthésie gazeuse. Pour la procédure 3 (Reconstitution de chimères hématoppïétiques), les animaux sont soumis à une injection intra-péritonéale, 1 injection sous-cutnée, une injection dans la veine de la queue et 2 prélèvements de sang en sous-mandibulaires sous anesthésie gazeuse. Une injection sur animal vigile, quelque soit sa localisation, dure environ 30 secondes et un prélèvement de sang environ une minute.
Impact sur les animaux
Pour tous les animaux soumis au protocole d'immunisation, l'introduction de l'aiguille va entraîner une faible douleur (aiguille de très petite taille 26G) de courte durée accompagnée d'un stress physique de courte durée. Lors du protocole d'induction des Chimères hématopoïétiques, le traitement au Busulfan implique également l'introduction d'une aiguille qui va entraîner une faible douleur (aiguille de très petite taille 26G) de courte durée accompagnée d'un stress physique de courte durée; l'effet du médicament Busulfan induit un état de fatigue conduisant à une perte de poids transitoire. Le traitement de prévention de la douleur par voie sous-cutanée induit une douleur transitoire et de faible durée suite à l'injection et un stress physique de courte durée.
Devenir
Pour la procédure 1 "Maintien de lignées et Génotypage", sur la totalité des animaux génotypés, les animaux porteurs du génotype sans intérêt pour le projet seront mis à mort. Pour les animaux porteurs du génotype d'interêt, une partie sera inclus dans la procédure 2 "Immunisation", le reste des animaux sera replacés en zone d'élevage. Tous les animaux inclus dans la procédure 2 "Immunisation" et la procédure 3 "Création de chimères hématopoïétique" seront mis à mort à l'issu de l'expérimentation pour analyse.
Remplacement
Bien que nous tentions, autant que possible, de réaliser des expérimentations préliminaires dans des lignées cellulaires (lymphocytes B de souris et/ou humains), certaines fonctions des lymphocytes B telles que les mutations des gènes d'immunoglobulines ou les mutations occasionnées dans les oncogènes nécessite une coopération cellulaire complexe qui ne s'opère qu'au sein d'un organisme entier (mammifère). De ce fait, nos études étant focalisées sur ces mécanismes, l'utilisation de souris génétiquement modifiées pour l'étude des mutations et de l'instabilité du génome est indispensable.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés et d'éviter la mise à mort de nombreuses souris, en accord avec la règle des 3R, nous planifions les expérimentations pour obtenir l'ensemble des prélèvements souhaités sur chacune des souris. Si les plaques de Peyer sont utilisées pour l'étude de l'hypermutation somatique, la rate et le sérum pourront étre collectés sur ces animaux pour évaluer d'autres méchanismes: pour exemple la rate issue d'une même souris peut servir pour plusieurs expériences in vitro afin de collecter des données cellulaires et moléculaires (activation, prolifération, régulation génique... ). Le nombre de souris utilisé sera réduit au maximum dans la mesure d'un résultat statistique selon les études réalisées précedemment au laboratoire. La significativité des résultats obtenus sera évaluée par un test statistique spécifique au lot de petits nombres. Les animaux de la procèdure 1 qui n'auront pas le génotype attendu pourront être utilisés dans des procèdures de tutorat au sein de l'animalerie.
Raffinement
Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié pour détecter le moindre signe de souffrance. Les personnes amenées à interagir avec les animaux sont systématiquement des personnes formées et compétentes afin de réduire l'impact de l'expérimentation sur l'animal (stress, douleur...) Seuls les animaux immunodéprimés pourraient être fragiles mais leur hébergement dans une animalerie protégée (en conditions exempt de pathogènes et opportunistes) qui garantit leur bonne santé, comparable à celle d'animaux non génétiquement modifiés. L'apparition d'un signe clinique physique inquiétant (perte de poids rapide, difficultés respiratoire, apparence du pelage...) ou comportemental (animal isolé, immobile ou avec le dos voutés....) constitue le point limite de l'expérimentation et entrainera la mise à mort de l'animal. Les souris entrant dans des protocoles expérimentaux sont surveillées quotidiemment et font l'objet d'une évaluation de la douleur via une grille de score. En cas d'évaluation positive de la douleur; les animaux ciblés recevront une médication adpatée. Les gestes douloureux seront effectués le matin afin de permettre un suivi des animaux sur la journée permettant l'administration d'analgésique au besoin.
Choix des espèces
La souris est le plus petit mammifère doté d'un système immunitaire très proche du système immunitaire humain. Le génome de la souris étant très proche du génome humain, le modèle est reconnu comme idéal pour comprendre les mécanismes fins et très complexes qui régulent cette fonction essentielle qu'est l'immunité acquise. Pour la procédure 1 (Maintien de lignées et Génotypage), les soigneurs de l'animalerie protégée de notre site réalisent le prélèvement au moment du sevrage (entre 3 et 4 semaines) Pour les autres procédures ainsi que pour l'euthanasie des animaux à étudier, nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines à 12 mois (dotés d'un système immunitaire mature) selons les besoins de l'étude.
Rôle des vésicules extracellulaires microgliales dans les effets du stress précoce
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Trois chocs électriques de deux secondes à 0,5 milliampère servent à conditionner la peur chez des souris dont les mères ont été privées de litière et d'enrichissement pendant les vingt et un premiers jours de leur vie. 3 325 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit ces chocs comme n'entraînant pas d'altération de l'état général des animaux, et présente la réponse de stress induite chez les mères et leurs petits comme "nécessaire au projet scientifique". Toutes, géniteurs compris, sont tuées pour prélever le cerveau et des organes périphériques. Il annonce enfin jusqu'à cinq tests comportementaux à l'âge adulte, pour un total de 93 minutes, sans préciser lesquels.
Objectifs
Le stress précoce englobe un large éventail d'événements défavorables survenant pendant la période périnatale critique, tels que la maltraitance, la négligence, la pauvreté, la famine et la séparation parentale. Une des principales conséquences de l'exposition au stress précoce est un risque accru de troubles mentaux à l'âge adulte, notamment le trouble de stress post-traumatique. Ce dernier est associé à des altérations des comportements sociaux et cognitifs et, s'il n'est pas traité, peut avoir un impact grave sur la qualité de vie d'une personne. Des études ont montré que les souris exposées à un stress précoce présentent des anomalies cognitives et psychologiques. Un acteur clé dans ce processus est la microglie, la population résidente de cellules immunitaires du système nerveux central, qui joue un rôle important dans le développement cérébral. Pendant le stress précoce, la fonction de la microglie est perturbée, ce qui entraîne un développement du cerveau anormal, contribuant aux troubles de comportements observés. Les vésicules extracellulaires participent dans le cerveau à la communication entre les cellules. Les vésicules extracellulaires sont capables de transporter une grande variété de molécules avec des effets sur les cellules du cerveau. Cependant, dans le contexte du stress précoce, l'implication des vésicules extracellulaires dérivées de la microglie est inconnue. Par conséquent, l'objectif global de ce projet est d'explorer le rôle des vésicules extracellulaires du cerveau dans les mécanismes à l'origine de l'impact négatif de l'exposition à un stress précoce sur la fonction cérébrale normale chez la souris. Enfin, nous avons démontré des bénéfices sur la santé du cerveau d’approches nutritionnelles permettant une augmentation des acides gras de type Omega-3. Nous testerons dans le projet les effets protecteurs d’une augmentation des Omega-3 dans le contexte du stress précoce.
Bénéfices attendus
Notre étude explorera le rôle des EVs dérivées de la microglie comme nouvelle cible dans la pathologie et la progression des troubles liés au stress précoce. Cela apportera un nouvel éclairage sur les mécanismes impliqués dans les troubles liés au stress précoce en tant que trouble développemental, un domaine de recherche encore peu exploré. Nous prévoyons que de nouvelles cibles moléculaires seront identifiées, ce qui pourrait offrir des perspectives prometteuses pour la compréhension et le traitement des troubles liés au stress précoce. Ce sujet est d'intérêt public actuel en raison du fardeau croissant des sujets souffrants de conséquences de stress précoces et des estimations selon lesquelles environ 60 % des enfants sont exposés à une forme de stress précoce.
Procédures
1- stress précoce : 21 jours en limitation de litière et absence d'enrichissement. 2- procédure chirurgicale durant moins de 30 minutes avec un suivi du bien être des animaux. 3- test de peur conditionnée à l'âge adulte nécessitant une association entre 3 chocs de 2 secondes et 0,5mA d'intensité durant la phase d'acquisition en J1. 4- les souris sont soumises à maxium 5 tests comportementaux à l'âge adulte pour une durée totale de 93 minutes (1 test par jour, séparé de minimum 24heures).
Impact sur les animaux
La procédure chirurgicale est susceptible d'induire un épisode de nuisance chez l'animal nécessitant un suivi de son bien être avant sa complète convalescence. La procédure de stress précoce va induire une réponse de stress chez les descendants et la mère, nécessaires au projet scientifique. Les animaux subiront des chocs électriques de faible intensité pour le test de peur conditionnée, sans entrainer d'altération de l'état général des animaux. les autres tests ne durent que quelques minutes et n'induisent pas d'altération de l'état général des animaux. Les animaux transgéniques utilisés ne présentent pas d'altérations de l'état général de santé.
Devenir
Les animaux incluant les géniteurs seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules du cerveau, ainsi que des organes périphériques nécessaires pour les études du projet.
Remplacement
L'étude des effets du stress précoce nécessite l'utilisation d'animaux vivants, car il s'agit d'un stimulus environnemental qui ne peut être reproduit à l'aide de modèles cellulaires. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que chez des animaux vivants et éveillés. L'objectif général du projet est de comprendre les conséquences comportementales et les causes des troubles liés au stress précoce au niveau cellulaire chez la souris. Comme les causes initiales de la pathologie liée au stress précoce sont encore inconnues, il est impossible de les modéliser efficacement en culture cellulaire. Par conséquent, l'utilisation de modèles animaux pertinents et appropriés pour des études in vivo reste une nécessité expérimentale. Ce projet s'efforce d'identifier de tels déclencheurs moléculaires de la pathologie liée au stress précoce, afin que des études futures puissent adopter une approche in vitro. À ce jour, aucune duplication des travaux proposés n'a été identifiée.
Réduction
Pour minimiser le nombre d’animaux utilisés pour ces expériences, nous avons adopté une approche statistique pour calculer les tailles d’échantillons nécessaires par groupe afin de démontrer un effet significatif. Nous avons alors choisi un nombre permettant un équilibre entre la robustesse des données omiques générées malgré la faible puissance statistique liée au nombre de groupes générés. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre dans les destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer, notamment concernant l'étude des exosomes. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure.
Raffinement
Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communeauté scientifique.
Choix des espèces
Nous avons changé le paragraphe comme suit : « Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Leurs données préliminaires ont été générées chez la souris, et l'ajout de nouvelles données issues d’un modèle murin permettra de raffiner les données existantes grâce à une analyse conjointe avec les données nouvellement générées. Dans le cadre d’une étude explorant le lien entre la nutrition et le cerveau, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste une nécessité expérimentale pour comprendre la réalité physiologique de nos résultats. Les stades de développement décrits ici sont conformes à la littérature actuelle, qui suggère que les souris sont les plus susceptibles de développer des symptômes similaires au syndrome post-traumatique pendant le développement postnatal précoce (P0-P21). Par conséquent, nous visons à surveiller les changements dans les vésicules extracellulaires au cours de cette période ainsi qu'à des stades adultes ultérieurs afin de déterminer si ces changements sont durables. »
Étude du compartiment vasculaire dans un modèle transgénique de souris atteint de la mucoviscidose
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Jusqu'à vingt injections par animal réparties sur douze semaines, dont l'injection de cellules tumorales sous la peau ou dans le poumon : 298 souris vont être utilisées dans des procédures dont le niveau de souffrance va de léger à sévère. Toutes sont tuées pour prélèvement de tissus, le porteur écartant toute réutilisation au motif qu'elle introduirait une variabilité indésirable. Le projet cherche à établir qu'un défaut du gène de la mucoviscidose augmente l'incidence des cancers, en passant par un modèle transgénique où ce gène est invalidé dans les vaisseaux. Cent souriceaux âgés de 1 à 14 jours sont inclus pour l'étude de la rétine. Le laboratoire indique disposer de sphéroïdes, de puces microfluidiques et de cellules de patients qui lui permettent de se passer d'animaux pour la majorité de ses expériences, et juge malgré tout l'approche sur "organisme entier" nécessaire pour suivre la formation des tumeurs.
Objectifs
Ces dernières décennies, les nouvelles thérapies de transplantation pulmonaire et celles visant à corriger l’expression du gène responsable de la mucoviscidose, ont permis à ces patients de dépasser les 40 ans. L’augmentation de l’espérance de vie des patients a également accentué l’apparition de nouvelles comorbidités associées à cette maladie, dont un risque accru de développer plusieurs types de cancers (cancers digestifs, pulmonaires, cutanés, etc.). Dans ces comorbidités, la composante vasculaire y est affectée mais encore peu étudiée. Néanmoins, nos travaux ont démontré que le gène responsable de la mucoviscidose avait un rôle insoupçonné dans les cellules endothéliales, en promouvant une dysfonction/inflammation endothéliale qui est également impliquée dans les pathologies menant à l’apparition de cancers (ex : obésité, diabète, inflammation chronique de l’intestin). De plus l’expression du gène responsable de la mucoviscidose est souvent réprimée dans de nombreux cancers et un haut taux de ce gène est corrélé à une mauvaise survie des patients. Notre projet vise donc à démontrer l’augmentation de l’incidence de cancer dans un modèle de souris déficiente pour le gène responsable de la mucoviscidose, puis d’expliquer comment une dysfonction des cellules endothéliales serait associée à ce développement tumoral. Nos différents travaux publiés et en cours démontrent l’implication des cellules endothéliales dans ce phénomène, mais dans une optique de transfert vers la clinique requiert le passage dans des modèles animaux vivants qui reproduisent de façon pertinente la physiologie des tumeurs et les réponses immunitaires systémiques associées.
Bénéfices attendus
Les dernières avancées thérapeutiques ont permis aux patients atteints de mucoviscidose de voir leur qualité et espérance de vie augmentées de façon significative. En revanche de nombreuses comorbidités préjudiciables à leur santé sont également apparues. Parmi celles-ci des atteintes cardiovasculaires et un risque élevé de cancers gastro-intestinaux, qui est maintenant pris en charge par un dépistage précoce chez ces patients. Ce risque élevé est également retrouvé pour d’autres entités tumorales comme le cancer pulmonaire. En revanche la cause principale du risque élevé de développer certains cancers n’est pas bien comprise, et le compartiment vasculaire pourrait avoir un rôle important. Grâce à ce projet, l’utilisation de différents modèles tumoraux, et à différents stades de la tumorigénèse, permettra d’ouvrir de nouvelles pistes pour expliquer l’élévation de l’incidence des cancers chez les patients atteints de mucoviscidose, et mettre en lumière de potentiels développements thérapeutiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées ou intrapulmonaires de cellules tumorales (1 seule injection par animal), ou à des injections intra-péritonéales répétées de traitements (1 injection hebdomadaire pendant 10 semaines ou 1 injection journalière pendant 2 semaines). Il n’y aura jamais plus qu’une injection par jour par animal. Chaque injection durera une trentaine de secondes, à raison d'un maximum de 20 injections par animal réparties sur 12 semaines.
Impact sur les animaux
Les données de la littérature sur le modèle d’induction tumorale par injection intra-péritonéale d’uréthane (1 fois par semaine) ne font état d’aucun effet indésirable notoire pour les animaux lorsque ceux-ci sont euthanasiés au cours du 6ème mois suivant la première injection d’uréthane. Néanmoins, l'établissement et la croissance des tumeurs pourra générer des douleurs qui seront détectées précocement grâce aux points limites préalablement établis pour chaque procédure.
Devenir
Des prélèvements de tissus seront nécessaires pour les études histologiques de nos procédures. De fait, tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chaque procédure. De même, les animaux ne pourront être réutilisés car les procédures précédentes pourraient potentiellement introduire une variabilité indésirable sur les prochaines expérimentations.
Remplacement
Notre laboratoire a développé au cours des dernières années des systèmes de culture in vitro complexes (sphéroïdes multicellulaires, puces microfluidiques) et de cellules primaires dérivées de patients qui nous permettent de nous affranchir de l'utilisation d'animaux pour une majorité de nos expériences. Grâce à ces modèles nous avons d’ailleurs validé de nombreux aspects qui soutiennent notre hypothèse. L'approche sur organisme entier nous est en revanche nécessaire pour analyser des processus plus complexes et sur le long terme comme la tumorigénèse.
Réduction
Les effectifs utilisés dans les procédures ci-dessous sont calculés avec le logiciel G*Power. Toutes les données seront ensuite analysées avec les logiciels R et GraphPad Prism. Notre projet nécessitera 298 animaux au total, et sera décomposé en 7 procédures. La procédure #1 sera reproduite sur des rétines à P14 uniquement si les résultats indiquent une angiogenèse modifiée chez les animaux mutées à P6. Pour cela nous aurons besoin, au maximum, de 20 portées de 5 souriceaux soit environ 33 souriceaux Cftrlox/lox – CDH5creERT2 (mutés), 33 souriceaux Cftrwt/lox – CDH5creERT2 (hétérozygotes), et 34 souriceaux Cftrlox/lox (contrôles). Ce second temps nous permettra d’établir si le défaut d’angiogenèse est temporaire ou permanent. Les différents paramètres mesurés seront comparés par des tests statistiques adaptés aux très petits échantillons. Procédure #1 : 2 groupes test de 33 souris, et 1 groupe contrôle de 34 souris : soit 100 animaux total. Procédure #2 : 3 groupes test de 10 souris, et 3 groupes contrôles de 4 souris : soit 42 animaux total. Procédure #3 : 2 groupes test de 10 souris, et 1 groupe contrôle de 10 souris : soit 30 animaux total. Procédure #4 : 3 groupes test de 10 souris, et 6 groupes contrôle de 10 souris : soit 90 animaux total. Procédure #5 : 2 groupes test de 12 souris, et 1 groupe contrôle de 12 souris : soit 36 animaux total.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages ventilées (5 souris maximum par cage) en milieu enrichi (copeaux de litière, lambeaux de papier) dans des salles à température et hygrométrie contrôlées. Les litières sont changées chaque semaine par le personnel qualifié de l’animalerie. Toutes les procédures prévues dans ce projet sont de classe modérée. L’utilisation d’antalgiques morphiniques n’est pas envisagée car les animaux seront immédiatement euthanasiés en fin de procédure ou d’atteinte d’un point limite. Des points limites adaptés à l’espèce utilisée ont été prévus pour chaque procédure. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel zootechnique et les expérimentateurs. En cas d’atteinte d’un des points limites suivants un signalement sera fait au responsable de la SBEA ainsi qu’au responsable de l’étude ou à son suppléant. Les animaux seront alors euthanasiés directement afin de prévenir toute douleur au stade le plus précoce possible et d’éviter la collecte de données altérées en raison d’un stress chez les animaux. •Critères cliniques : - Mauvais état du pelage (diminution du toilettage, perte excessive de poils, plaies) - Faciès contracté et position anormale des vibrisses - Yeux clos et larmoyant - Gonflement abdominal pouvant être causé par l’accumulation de liquide d’ascites en raison des tumeurs - Fèces liquides ou absence de fèces. - Respiration anormalement rapide et synonyme d’une masse tumorale intrathoracique trop importante (dans le cas des tumeurs thoraciques des Procédures #2 et #3). •Critères comportementaux : - Position recourbée (dos voûté, prostration) - Diminution de la mobilité interférant avec l’activité de base de l’animal (alimentation, toilettage) - Réduction de l’activité, isolement - Signes de stress (hyper-sensibilité aux bruits, agressivité, stéréotypie) •Critères zootechniques : - Perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids initial de l’animal ou comparativement au poids moyen des individus soumis au même protocole expérimental.
Choix des espèces
L’objectif principal de notre projet est de déterminer l’impact d’un défaut du gène responsable de la mucoviscidose sur le développement vasculaire et tumoral. Nos précédents travaux publiés ont mis en lumière des défaut vasculaires et une inflammation accrue dans les poumons et foie de modèle de souris atteintes de mucoviscidose, ce qui pourraient expliquer l’apparition de cancers à long terme chez les patients. De fait, l’utilisation de ce modèle de souris transgénique permettant une invalidation de Cftr dans le compartiment vasculaire nous apparaît pertinente et essentielle pour apporter une preuve solide étayant notre hypothèse. Nous utiliserons des nouveaux nés âgés de P1 à P14 (post naissance), et des souris adultes (6 à 8 semaines). Le stade de développement est justifié par la nécessité d’observer des phénomènes de développement vasculaire embryonnaire, et d'avoir des animaux adultes avec un système immunitaire mature (nécessaire pour l’influence tumorale).
Effet de l’injection d’un nouveau type de molécule anti-inflammatoire dans un modèle murin de traumatisme crânien pédiatrique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Tués à 8 ou 21 jours de vie pour prélèvement d'organes, 1 010 souriceaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. À sept jours de vie, chacun subit un traumatisme crânien sous anesthésie de moins de deux minutes, puis reçoit chaque jour l'une des deux molécules testées, par injection dans l'estomac ou par gavage. Le porteur chiffre la mortalité du modèle à moins de 4 %, attribuée à l'anesthésie ou au traumatisme lui-même, et ajoute 1 % de mortalité liée au gavage. Il affirme qu'aucune solution alternative n'est possible et que les conséquences cérébrales d'un traumatisme ne peuvent s'évaluer ni sur cellules en culture ni par modélisation informatique, l'amélioration annoncée du devenir des enfants blessés restant au conditionnel.
Objectifs
Le traumatisme crânien (TC) correspond aux lésions cérébrales traumatiques et aux altérations des fonctions cérébrales qui en résultent : lésions primaires (consécutives à l’impact), secondaires (suite aux conséquences des lésions primaires) et tertiaires (survenant de façon chronique). Les traumatismes crâniens chez l’enfant sont fréquents et sous-diagnostiqués, c’est pourtant un enjeu de santé publique majeur. En effet, ils sont potentiellement responsables de troubles de l’acquisition des connaissances et comportementaux chez l’adulte. Dans le cerveau, les cellules importantes pour la réponse inflammatoire sont les cellules microgliales et les astrocytes. Elles analysent en permanence leur environnement et participent au bon fonctionnement du cerveau. La réponse inflammatoire initiale dans le cerveau ou neuroinflammation suite à un traumatisme crânien est surtout due à une mort cellulaire abondante suite à la lésion. Une inflammation anormale peut persister pendant des semaines voire des années après le traumatisme. Des molécules spécifiques, les interférons de type I, sont libérés par la microglie et les astrocytes pour stimuler la neuroinflammation. L'activité anormale d’une protéine qui va augmenter la production de ces interférons est de plus en plus reconnue comme néfaste dans différentes contextes d’inflammation comme le traumatisme crânien. Des travaux ont montré que la suppression de l’activité de cette protéine était neuroprotectrice et permettait de limiter les lésions dues à un traumatisme crânien dans un modèle de souris adultes au moment du traumatisme. Le but de l’étude est de voir l’effet de molécules qui vont empêcher la production d’interférons juste après un traumatisme crânien pédiatrique. Pour cela, nous utiliserons un modèle de traumatisme crânien modéré chez le souriceau de 7 jours sous anesthésie générale. Les animaux recevront une des 2 molécules 30 minutes après le traumatisme puis quotidiennement, par voie orale. Ce modèle est maitrisé au sein de l’équipe pour analyser les phénomènes inflammatoires. Nous étudierons : 1) l’épaisseur d’une partie du cerveau (le corps calleux) 14 jours après le traumatisme ; 2) la mort cellulaire (apoptose) 24 heures après le traumatisme ; 3) l’activation de la microglie par étude de l’expression de gènes sur cellules microgliales triées 24 heures après le traumatisme. Ces différents paramètres permettront de savoir si une des molécules est efficace pour atténuer l’effet du traumatisme crânien.
Bénéfices attendus
Nous nous attendons à voir une diminution des effets du traumatisme crânien due à la réduction de l’inflammation grâce à la molécule administrée. Le fait de pouvoir administrer une molécule de façon précoce suite à un traumatisme crânien pourrait ouvrir la voie pour diminuer la morbidité liée au traumatisme crânien et ainsi permettre un meilleur pronostic pour les patients. Enfin nous pourrons également voir s’il y a un effet de dose de la molécule administrée. Le but est de pouvoir améliorer le devenir des enfants avec un traumatisme crânien.
Procédures
Cinq groupes de souriceaux subiront un traumatisme crânien à 7 jours de vie sous anesthésie générale, moins de 2 minutes d’anesthésie ; puis des injections intragastriques, moins d’une minute, puis des administrations orales, moins d’une minute, de la molécule que nous souhaitons tester : 1 groupe sans traitement et 4 groupes avec 2 doses différentes de 2 molécules distinctes. Un groupe contrôle sera réalisé, avec anesthésie générale de moins de 3 minutes mais sans traumatisme avec molécule : 1 groupe sans traitement et 4 groupes avec 2 doses différentes de 2 molécules distinctes.
Impact sur les animaux
Grâce à notre expérience du modèle, nous savons que la mortalité est de moins de 4% (principalement due l’anesthésie générale ou au traumatisme crânien lui-même). Très rarement, il pourrait y avoir un hématome suite à l’injection intragastrique ou une irritation de la gorge suite aux gavages. Les effets de la molécule ne sont pas encore connus mais la mortalité estimée due à l’injection intragastrique ou au gavage est estimée à 1 %. Le fait de manipuler les souriceaux quotidiennement n’entraîne pas de rejet par la mère lors de la remise au nid car les souris utilisées ne sont pas perturbées par cela.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à 8 jours de vie ou 21 jours de vie pour prélèvement d’organes pour analyse.
Remplacement
L’étude de l’effet d’une molécule sur l’impact du traumatisme crânien ne peut être envisagée que dans des conditions « in vivo », c’est-à-dire dans un organisme vivant. Aucune solution alternative n’est possible pour conduire ce projet de recherche. Il est impossible d’évaluer les conséquences sur le fonctionnement cérébral d’un traumatisme crânien sur un modèle de cellules en culture ou sur des modélisations informatiques.
Réduction
Le nombre d’animaux estimé et les tests statistiques utilisés sont basés sur notre expérience pour ce type d’étude. En effet, des études antérieures sur ce modèle permettent d’évaluer la mortalité et ainsi d’avoir le nombre d’animaux nécessaire pour avoir des résultats statistiquement corrects. Ce nombre minimum nous permettra d’être certains de répondre aux questions scientifiques de ce projet.
Raffinement
La procédure chirurgicale de traumatisme crânien sera réalisée sous anesthésie générale inhalatoire. Les animaux seront remis dans leur nid et on vérifiera que l’adoption par la mère se fait bien. Des arbres décisionnels seront proposés en fonction de l’âge des animaux, déterminant ainsi des points limites prédictifs : à la phase aiguë, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités et le tonus ; à distance du traumatisme crânien, on réalisera une surveillance régulière de la prise de poids, de l’absence de troubles du comportement (isolement, agressivité). Les animaux seront hébergés en groupe en milieu enrichi pour minimiser leur stress. Avant sevrage, les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. Les animaux recevront la molécule quotidiennement et on en profitera pour faire une surveillance étroite de leur état de santé. Le personnel technique de l’animalerie réalise aussi une surveillance quotidienne des animaux et de leurs conditions d’hébergement (nourriture, eau, température de la pièce, taux d’humidité) et nous alerte en cas de problème.
Choix des espèces
La problématique de l’inflammation du cerveau est une thématique très étudiée dans notre laboratoire. Les études chez l’animal permettent d’étudier les conséquences d’un traumatisme crânien modéré localisé sur l’ensemble du cerveau et de mimer au mieux la pathologie humaine. Au vu de la littérature, la souris est l’espèce la plus utilisée pour la réalisation des modèles de lésions du cerveau et notamment le traumatisme crânien. De plus, ce modèle de souris présente l’avantage de ne pas rejeter les petits après une séparation de courte durée. Les souris seront utilisées de 7 jours de vie à 21 jours de vie. Le traumatisme crânien sera fait à 7 jours de vie, pour mimer la survenue d’un traumatisme crânien chez le jeune enfant humain. L’injection du médicament sera réalisée 30 minutes après le traumatisme pour mimer une intervention rapide. Les effets seront analysés 24h et 2 semaines après le trauma pour voir les effets aux phases aiguë et tardive, car l’inflammation pendant le développement cérébral est un processus complexe qui doit être étudié dans le temps.