Rongeurs

Pour vérifier si la graisse corporelle protège le foie des polluants, 192 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection déclenche chez elles une fonte progressive du tissu adipeux, de 50 % en un mois et de 80 % en trois mois, puis elles reçoivent les polluants par gavage hebdomadaire et subissent des tests de tolérance mensuels au glucose et à l'insuline, avec prélèvements sanguins à la queue. Le porteur affirme que ce dialogue entre organes ne peut être étudié hors d'un organisme vivant. Il ajoute que si un effet apparaît, les mécanismes seront ensuite explorés sur des modèles cellulaires déjà utilisés au laboratoire.

Objectifs

Les maladies non-alcooliques du foie (i.e. NAFLD: non-alcoholic fatty liver disease) sont devenues une priorité de santé publique à cause de leur prévalence grandissante (20% de la population générale et plus 70% des personnes obèses). Elles débutent avec la stéatose hépatique (foie gras), stade bénin, qui peut progresser vers la stéatohépatite ou NASH (non-alcoholic steatohepatitis), propice au développement des cirrhoses et cancers du foie. Bien que les causes/mécanismes de cette progression pathologique restent à clarifier, l’exposition aux perturbateurs endocriniens (PE) seuls ou mélange, est suspectée. Il apparait donc urgent de développer de nouveaux modèles permettant de mieux évaluer l’impact des PE sur la santé, en particulier dans les NAFLD. Le tissu adipeux, aussi appelé graisse corporelle, est l'endroit principal où notre corps stocke les lipides, c'est-à-dire les graisses. En plus de cette fonction de réserve d'énergie, il joue un rôle important en capturant les perturbateurs endocriniens (PE), des substances chimiques pouvant perturber le fonctionnement de nos hormones, et aide ainsi à protéger les autres organes de leurs effets nocifs. Certaines études ont montré que plusieurs polluants présents dans notre environnement favoriseraient le développement de maladies du foie liées à des troubles métaboliques, comme le « foie gras ». Nous faisons l'hypothèse que le tissu adipeux pourrait agir comme un bouclier pour le foie, en le protégeant des effets de ces polluants.

Bénéfices attendus

Ce travail expérimental pourrait permettre de démontrer le potentiel protecteur du tissu adipeux contre l’exposition aux polluants. Ces résultats pourraient avoir des répercussions importantes en termes de santé publique, notamment en soulignant l’importance du tissu adipeux dans la protection contre les effets néfastes des polluants environnementaux. Une meilleure compréhension de ce mécanisme de protection pourrait ouvrir de nouvelles voies pour la prévention des maladies hépatiques liées à l'exposition aux polluants, et renforcer les politiques de santé publique visant à limiter cette exposition.

Procédures

Pour induire la délétion du tissu adipeux, nous injectons des souris transgéniques avec un agent pharamacologique donné . Cette procédure n’entraine pas d’autre inconfort que l’injection par voie intrapéritonéale. L’exposition aux polluants se fait par gavage hebdomadaire. Cette procédure n’entraine pas d’autre inconfort que celle d’un gavage. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. L'administration du glucose se fait par voie orale (gavage), celle de l'insuline par injection intra-péritonéale.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont des irritations aux points d'injection, des douleurs lors des prélèvement à la queue (prise de glycémie), et de l'inconfort lors des gavages oraux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort afin de prélever les tissus sur lesquels les analyses moléculaires seront réalisés. Ces analyses sont l'objectif premier du projet et nous permettrons d'établir l’effet du tissu adipeux sur le développement de la NASH en situation d’exposition aux polluants.

Remplacement

Le but de notre étude est d’étudier l’effet du tissu adipeux sur les maladies métaboliques lors d’une exposition à des polluants. Ce dialogue inter-organe ne peut être utilisé hors d’un organisme vivant. Si un phénotype est observé, les mécanismes pourront être abordé ultérieurement sur des modèles cellulaires utilisés au laboratoire.

Réduction

Le projet nécessite l’utilisation d’un total de 192 animaux, ce qui, dans un souci de réduction, correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. L'utilisation d'un ouill statistique de prédiction prévoit un usage de 16 animaux par groupe pour obtenir des données robustes, notamment pour les tests métaboliques. La répartition du tissu adipeux étant différente chez les mâles et les femelles, il est indispensable de réaliser les analyses sur les deux sexes. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés pour évaluer la relevance de nos données.

Raffinement

Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis, ainsi qu'un tube tunnel, tous deux fabriqués en polycarbonate. De plus, nos interventions chirurgicales se dérouleront avec une couverture anesthésique et analgésique adaptée pour les gestes invasif et en conditions de stérilité. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, ce qui réduit la douleur. Nous utilisons des sondes de gavage en polypropylène, ce qui diminue la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en termes de points limites gradués et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne, y compris le week-end, permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.

Choix des espèces

Nous avons généré et étudié des souris qui présente une perte progressive du tiss adipeux. Nous connaissons bien le modèle et nous savons d'ores et déjà que suite à l’injection de tamoxifene, la masse adipeuse va progressivement réduire, de 50% en 1 mois et de 80% en 3 mois. Adulte, des souris de 8 semaines, le phénotype des animaux à cet âge a été caractérisé dans notre publication précédente et nous avons montré que, à ce stade, les animaux traités développent une perte de tissus adipeux.

Opérés une première fois pour rétrécir l'urètre, puis six à huit semaines plus tard pour implanter des cathéters dans la vessie, 1 350 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes. Leur vessie est perfusée pendant au moins trois heures sur animal éveillé, et ils peuvent passer 24 heures en cage à métabolisme ou 48 heures en cage individuelle. L'objet est de tester, pour des clients, des candidats médicaments contre l'instabilité vésicale. Le porteur écrit que chaque geste est très rapide et limite le stress, tout en indiquant environ 30 % de mortalité dans ce modèle et en reconnaissant qu'aucun test statistique ne fixe les quinze animaux par groupe.

Objectifs

L’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur un modèle d’instabilité vésicale chez le rongeur éveillé. L’instabilité vésicale est un trouble urologique chronique qui se caractérise par une envie soudaine et fréquente d’uriner. Cette envie peut survenir le jour ou la nuit et peut être accompagnée de fuites urinaires. Quand on souffre d’instabilité vésicale, la vessie se contracte de façon involontaire même quand la vessie n’est pas pleine, ce qui provoque une envie soudaine et parfois extrêmement pressante d’uriner. Le syndrome de la vessie instable pose problème au quotidien : besoin d’avoir des toilettes à proximité en permanence, fuites urinaires… Cela peut créer un handicap aussi bien au niveau personnel que professionnel et affecte sérieusement la qualité de vie de nombreux patients. Le modèle d’instabilité vésicale provoqué par obstruction urétrale partielle chronique chez le rat est largement décrit dans la littérature.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints de dysfonctions vésicales.

Procédures

Les animaux vont subir des chirurgies sous anesthésie générale qui durent environ 30 min chacune (1 pour induire le modèle et 1 autre 6-8 semaines après pour l’implantation des cathéters). Les animaux vont recevoir plusieurs administrations par les voies classiques décrites. Chaque geste étant réalisé par du personnel compétent est très rapide (moins d’une minute), limitant le stress des animaux. Des cathéters vont être implantés dans la vessie et cette dernière sera perfusée avec du liquide physiologique pour pouvoir mimer le remplissage naturelle de la vessie et les mictions (3 H minimum). Des cathéters veineux ou pour d’autres voies d’administrations pourront être implantés. Les animaux pourront être mis dans des cages à métabolisme pendant 24 heures (avec eau de boisson et nourriture à volonté). Pour certaines procédures expérimentales, les animaux seront hébergés individuellement dans des cages à métabolisme (pendant 24H maximum) ou dans des cages individuelles après des chirurgies (pendant 48H)) mais pourront toujours avoir un contact visuel, auditif et/ou olfactif avec leurs congénères. Des prélèvements sanguins (1 prélèvement maximum par semaine) durant l’expérimentation ou en terminal pourront être réalisés. Ces gestes sont très rapides et demandent environ 2-3 minutes selon les volumes souhaités.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments. Toutefois, des manipulations, administrations répétées, prélèvements de sang, anesthésies sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille). L’obstruction urétrale peut provoquer des troubles urinaires chez les animaux pouvant conduire à la mort de l’animal si celle-ci est trop importante (environ 30% de mortalité dans ce modèle). L’hébergement en cage individuelle, dans des cages à métabolisme peut entraîner du stress chez l’animal du fait de ne pas être avec ses congénères. La cystométrie sur animal éveillé peut également induire du stress chez l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et des organes seront collectés.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement des dysfonctions vésicales. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Aucun test statistique sera utilisé pour calculer le nombre d’animaux par groupe mais de par notre forte expérience en expérimentation animale, les publications scientifiques publiées, un nombre minimum de 15 animaux par groupe sera utilisé pour avoir des résultats statistiquement différents et fiables. Des tests statistiques seront réalisés pour évaluer la différence entre les groupes.

Raffinement

En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et auront une phase d’acclimatation de 3-4 jours minimum avant d’être manipulés. Un enrichissement (type tunnel, aspen brick (morceau de bois à ronger)…) sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de ces congénères. Une vidange vésicale sera nécessaire pendant 3 jours après la chirurgie afin que l’animal reprenne de lui-même son réflexe mictionnel naturel. Une attention particulière à chaque animal sera donc apportée. Une administration d’analgésique en pré et post-opératoire sera réalisée ainsi qu’un traitement antibiotique. De plus, un gel oculaire sera utilisé pour éviter la déshydratation des yeux des animaux lors des chirurgies. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin ou autre soin (désinfection de plaie par exemple). Si son état ne s’améliorait pas dans les 72h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

Le modèle d’instabilité vésicale provoqué par obstruction urétrale partielle chronique chez le rat est largement décrit dans la littérature. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7 à 8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

2 624 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et chacune peut être bloquée jusqu'à quatre fois, sans anesthésie, en position fœtale au bout d'un tube en plastique percé, pour mesurer sa masse grasse. Pour celles nourries d'un régime riche en graisses avant l'âge adulte, le porteur estime que la prise de poids "ne devrait pas dépasser 200% du poids initial". 1 472 souris subissent une neurochirurgie de 90 minutes et autant un gavage quotidien de cinq jours. 1 312 passent dix jours seules en cage hermétique, et autant subissent un jeûne de 7 heures puis des tests de tolérance au glucose et à l'insuline, avec des glycémies prises par entaille de la queue, une zone que le porteur dit "non innervée". Toutes sont tuées à l'issue, 2 560 d'entre elles par une injection dans l'abdomen sous sédation et sans anesthésie, pour prélever cerveau et tissu gras. Les thérapies contre l'obésité restent au conditionnel : ce projet "pourrait ainsi conduire à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques", écrit le porteur.

Objectifs

Le poids de notre corps reste assez stable tout au long de la vie adulte grâce à un mécanisme que l'on appelle le "set-point", qui correspond à un poids de référence que notre organisme cherchera à conserver Ce mécanisme est contrôlé par le cerveau, en particulier par une région appelée l'hypothalamus, qui communique avec les graisses du corps pour gérer l'énergie disponible en modifiant le comportement alimentaire, le stockage et l’utilisation des calories ingérées. Cependant, des facteurs biologiques et environnementaux peuvent modifier le set-point du poids corporel comme c’est le cas dans la maladie de l'obésité. Lorsqu'une personne prend du poids, le corps met en place des mécanismes pour le maintenir, ce qui rend difficile de perdre du poids de manière durable. Cela explique pourquoi 80 % des personnes qui ont suivi un régime ou ont recours à une thérapie de l’obésité reprennent du poids rapidement après l'avoir perdu. De récentes recherches scientifiques suggèrent que les altérations du système nerveux et des cellules du système immunitaire du cerveau, appelées microglie, puissent jouer un rôle dans le set-point du poids. Elles pourraient expliquer pourquoi le corps "se souvient" de l'obésité, ce qui facilite la reprise de poids. Ici nous proposons d’étudier leur rôle dans le maintien et dans la reprise du poids.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’1 milliard le nombre de personnes souffrant d’obésité à travers le monde, ce qui représente un problème de santé publique de la plus haute importance. Malgré l’existence de thérapies pour la réduction du poids, la plupart des patients reprennent du poids. Cette reprise de poids et l’incapacité de maintenir dans le temps le poids perdu sont de vraies urgences clinques pour la gestion de l’obésité. Il est donc crucial d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes biologiques participant au changement du set-point du poids corporel, dans l’espoir de fournir à l’avenir de meilleurs traitements aux personnes affectées. À court terme, notre projet apportera des informations nouvelles sur les mécanismes biologiques concernant l’altération du set-point du poids corporel, qui contribue au maintien de l’obésité et des comorbidités associées. À plus long terme, ce projet pourrait ainsi conduire à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre l’obésité

Procédures

Voici la liste des gestes techniques réalisés sur les animaux. 1) Analyse de la composition corporelle (2624 souris) : l’analyse de la composition corporelle (mesure de la masse grasse et de la masse maigre) nécessite que la souris soit bloquée en position fœtale à l’extrémité d’un tube en plastique présentant des trous afin de permettre le passage de l’air, pour une durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris feront au maximum quatre analyses de ce type au cours du projet. 2) Neurochirurgie : (1472 souris) cette technique d’injection intra-cérébrale est réalisée sous anesthésie générale, pour une durée totale d’environ 90 minutes. Une injection sous-cutanée sera réalisée sur souris vigiles 30 minutes avant la neurochirurgie, puis 1 par jour dans les 2 jours suivants, afin d’administrer les médicaments anti-douleurs. Cinq autres injections sous-cutanées seront réalisées lorsque les souris seront anesthésiées (2 d’anesthésiques locaux, 1 d’anti-douleur et 2 de réhydratation). Les souris concernées n’auront qu’une seule neurochirurgie au cours de l’étude. 3) Injections abdominales (2624 souris) : 1152 souris recevront des molécules par injection abdominales ponctuelle sans anesthésie durant deux semaines maximums. Toutes les souris (2560) recevront également un euthanasiant par voie abdominale (injection unique), sans anesthésie préalable mais sous sédation, après une injection sous-cutanée d’un sédatif. 4) Gavage oral (1472 souris) : un gavage oral sera réalisé 1 fois par jour durant 5 jours, sans anesthésie. 5) Cages pour l’étude de la dépense énergétique (1312 souris) : les souris seront transférées dans des cages hermétiquement fermées pour étudier leur dépense énergétique, ce qui augmente leur état d’isolation social. Elles vivront dans ces cages pour une durée de 10 jours. Cela n’aura lieu qu’une seule fois au cours de l’étude. 6) Test de tolérance au glucose (GTT) et d’insuline (ITT) (1312 souris): ces tests nécessitent de réaliser, après un jeûne d’une durée maximale de 7 heures, une injection dans l’abdomen des souris, puis de mesurer leur glycémie à différents temps post-injection. Entre 4 et 6 mesures de glycémie se font grâce à une goutte de sang obtenue après entaille de l’extrémité de la queue, une région non innervée qui ne cause pas de douleur. Ces tests se réalisent sans anesthésique ou analgésique qui biaisent les résultats de glycémie. Ces tests durent au maximum 120 minutes et ne seront réalisés qu’une seule fois.

Impact sur les animaux

Les différents tests utilisés dans ce projet permettent un hébergement en cage collective tout le long de l’expérience. Cependant, pour les tests de dépense énergétique au sein de cages hermétiquement fermées, les souris adultes devront être hébergées de manière individuelle pendant 10 jours maximum, empêchant ainsi les interactions sociales. Pour l’ensemble des procédures, les souris subiront un stress d’immobilisation d’une durée de 5 minutes au maximum lors de l’analyse de composition corporelle, qui nécessite l’insertion de la souris dans un tube en plastique afin de pouvoir faire l’analyse, avec des trous pour le passage d’air. Les souris sous régime alimentaire gras vont prendre du poids de manière significative. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. Les souris qui passeront les tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent perdre du poids après le jeûne, d’une durée totale de 7 h. La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10% du poids mesuré le jour précédent. Enfin, des douleurs post-opératoires sont possibles pour les souris ayant une neurochirurgie. Il est possible d’observer une perte de poids/appétit lors de la période post-opératoire. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés et certains de leurs organes seront récupérés (cerveaux, tissu gras, autres) pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle du système nerveux et des cellules immunitaires du cerveau dans la reprise de poids et l’obésité. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et communique avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu gras…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de ce dialogue entre le cerveau et différents organes. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire, le changement du poids, la dépense énergétique, nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons conçu nos expériences de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximum dont nous estimons avoir besoin durant les 5 ans que durera ce projet. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera (par exemple en regroupant les mâles et les femelles dans nos analyses, si nous constatons que le sexe n’influence pas les résultats de nos tests).

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 4 semaines et y seront habitués pendant 1 semaine minimum. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux possiblement dû au nouvel espace d’hébergement. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages inclut l’utilisation de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. En outre, nous utiliserons les tunnels pour manipuler les souris, qui est la méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite une neurochirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès le début de l’anesthésie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le risque de déshydratation post-opératoire est prévenu par injection sous-cutanée d’une solution de réhydratation. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropries ont été́ définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie/suture (le cas échéant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera immédiatement retiré de l’étude et euthanasié, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel et du comportement alimentaire est depuis longtemps étudiée chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à̀ ce type d’études. En effet, la forte proximité́ biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel fait de cette espèce un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de notre étude, la réaction inflammatoire induite par un régime alimentaire riche en graisses est retrouvée à la fois chez la souris et chez l’Homme, ce qui rend d’autant plus pertinent l’étude de ce phénomène chez cette espèce. Enfin, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Toutes les souris de cette étude arriveront à 4 semaines d’âge dans notre animalerie. Cet âge a été choisi car il est important que le début du régime riche en graisses commence avant l'âge adulte. En effet, des scientifiques ont montré que les effets de l'obésité sont plus marqués lorsqu'ils sont induits avant l'âge adulte.

Immunodéprimés par deux injections à cinq jours d'intervalle, habitués progressivement à la contention dans un tube d'aérosol de 2 à 10 minutes, puis infectés aux poumons par intubation sous anesthésie, 448 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur attend une perte de poids inférieure à 15 %, une prostration et une mobilité réduite pendant les 24 heures suivant l'infection, avec une antalgie morphinique toutes les six heures. Quarante-huit rats reçoivent l'antibiotique de référence par injection, les 384 autres par aérosol pendant dix minutes. Tous sont tués pour prélever les tissus et mesurer la prolifération bactérienne.

Objectifs

La résistance aux antibiotiques est un problème mondial qui cause de nombreux décès chaque année, dont plus de 25 000 en Europe et 1,3 million dans le monde en 2019. Certaines bactéries sont particulièrement préoccupantes et reconnue par l’Organisation mondiale de la santé comme un danger prioritaire. Ces bactéries sont particulièrement problématiques, car elles peuvent survire longtemps sur les surfaces et développe facilement des résistances en échangeant des gènes avec d’autres bactéries. Elles causent souvent des infections graves dans les hôpitaux, surtout en soins intensifs. Pour combattre cette menace, un projet européen développe des versions inhalables d’un antibiotique actuellement testé en clinique par injection. Cinq formulations différentes de cet antibiotique sont à l’étude pour renforcer son efficacité contre ces infections graves. L’avantage de cet antibiotique est de provoquer moins de résistances que d’autres antibiotiques inhalés tout en étant plus efficace. En l’administrant directement dans les poumons, on atteint une forte concentration au niveau de l’infection, en limitant la diffusion dans le reste du corps et en réduisant ainsi les risques de toxicité. Les premiers tests en laboratoire sont encourageants. La prochaine étape consiste à tester ces formulations chez des rats infectés pour voir si cette administration directe est plus efficace qu’une injection.

Bénéfices attendus

Des tests in vitro de stabilité, d'aérosolisation, de toxicité pour les cellules humaines et d'efficacité antimicrobienne ont été réalisés dans un premier temps, avec des résultats prometteurs. La prochaine étape cruciale consiste à mener des expériences in vivo pour faire progresser le projet vers l'utilisation chez l'humain. Les études in vivo sont indispensables, car aucun modèle in vitro ne peut reproduire intégralement l'ensemble complexe des facteurs influençant l'efficacité et la tolérance d'un antibiotique administré par inhalation. Les études in vivo sur des modèles animaux offrent une évaluation exhaustive de l'administration de médicaments par voie pulmonaire, englobant tant les considérations d'efficacité que de sécurité. Ces études permettent de vérifier la distribution du médicament dans les tissus et d'identifier d'éventuels effets secondaires ou toxicités non détectables in vitro, assurant ainsi une compréhension plus approfondie et une optimisation de la thérapie avant les essais cliniques sur l'homme.

Procédures

Tous les animaux vigiles recevront deux injections à 5 jours d’intervalle dans le cadre d’un traitement immunosuppresseur (durée : 30 secondes par injection). Ils participeront également à des séances d’habituation au maintien en contention dans le dispositif utilisé pour l’administration par aérosol. Ces séances, réalisées quotidiennement sur 5 jours, verront leur durée augmenter progressivement de 2 à 10 minutes maximum. Tous les rats seront soumis à une infection bactérienne pulmonaire induite par intubation sous anesthésie gazeuse, effectuée une seule fois (durée : 10 minutes). Une couverture antalgique sera administrée à tous les rats, soit par des injections en condition vigile toutes les 6 heures (1 à 4 administrations, durée : 30 secondes par injection), soit via l’eau de boisson. Une partie des rats vigiles (48 animaux) recevra un traitement antibiotique de référence par injection (durée : 5 minutes), tandis que les 384 autres recevront l’antibiotique par voie d’aérosol (durée : 10 minutes). Un lavage pulmonaire et un prélèvement sanguin seront réalisés sous anesthésie et antalgie à des moments définis. Chaque rat subira un seul prélèvement (durée : 2 minutes).

Impact sur les animaux

- Injections: légère douleur, brève et transitoire. - Induction et réveil de l’anesthésie : inconfort mineur et éphémère. - Injection de l'immunosuppresseur : perte de poids liée à une diminution de l'appétit et à des troubles gastro-intestinaux. - Induction de l’infection pulmonaire : inconfort modéré pendant et après l’induction, atténué par l’administration d’antalgiques. Une perte de poids inférieure à 15 % est attendue, accompagnée de prostration et d’une réduction de la mobilité pendant les 24 heures suivant l’infection. - Traitement : inconfort léger pendant les 10 minutes d’exposition au système d’inhalation, réduit grâce à une phase d’habituation progressive.

Devenir

Les animaux à la fin de chaque procédure seront tous mis à mort pour réaliser des prélèvements de tissus pour évaluer la prolifération bactérienne

Remplacement

À ce jour, il est encore impossible de remplacer complètement l’utilisation des animaux pour cette étude, car les modèles de laboratoire (in vitro) ou informatiques (in silico) ne peuvent pas reproduire tous les paramètres nécessaires pour évaluer l’efficacité et la sécurité des antibiotiques administrés par inhalation. Cependant, des progrès importants ont été réalisés sans utiliser d’animaux vivants. Des tests en laboratoire ont démontré que le nouvel antibiotique est efficace contre de nombreuses souches bactériennes cliniques. De plus, des recherches ont permis d’identifier les meilleures formulations pour une administration par inhalation. Des expériences ont ensuite été menées sur des poumons de rat isolés et perfusés, en collaboration avec un laboratoire européen. Cette méthode, qui n’implique pas d’animaux vivants, a fourni des informations essentielles sur la capacité des formulations à garantir une exposition prolongée dans les poumons, réduisant ainsi le recours aux animaux vivants. La prochaine étape sera de confirmer ces résultats sur des animaux dans un modèle d’infection pulmonaire, une validation indispensable avant de passer à des études chez l’humain.

Réduction

Pour limiter l’utilisation d’animaux dans cette étude, une seule souche bactérienne sera testée. Cette souche a déjà été validée lors d’études précédentes sur des souris. La quantité de bactéries à administrer dans les poumons a été soigneusement déterminée et optimisée grâce à ce modèle, garantissant des résultats fiables. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum nécessaire pour détecter les différences entre les traitements. Les groupes témoins seront partagés entre les différentes formulations testées, ce qui contribuera également à réduire le nombre total d’animaux impliqués. En outre, les évaluations des différentes formulations, développées par plusieurs laboratoires européens, seront centralisées dans notre laboratoire. Cette centralisation permettra d’éviter la duplication des expériences, notamment pour les contrôles, et d’optimiser les ressources disponibles.

Raffinement

Les rats suivront une période d'acclimatation minimale de 8 jours et seront hébergés dans des cages standards installées sur des portoirs ventilés, avec un enrichissement comprenant de la sciure, des tunnels pour se cacher et des bâtonnets à ronger. Chaque cage sera limitée à deux animaux, et les groupes ne seront pas modifiés par la suite. Les rats vigiles évolueront dans un environnement ayant une température constante avec un taux d'humidité contrôlé, bénéficiant d’un accès libre à la nourriture et à l’eau. La luminosité sera régulée avec une alternance jour/nuit respectant leur cycle veille/sommeil. À partir du 9ᵉ jour, les rats seront progressivement acclimatés aux tubes de maintien du système de génération des aérosols médicamenteux. Le protocole commencera par une exposition de 2 minutes à un aérosol de solution physiologique, avec une augmentation progressive de la durée au cours des 5 jours suivants : 4 minutes au jour 10, 6 minutes au jour 11, et ainsi de suite jusqu’à 10 minutes au jour 13. Les conditions d'asepsie seront rigoureusement respectées pendant l’infection et les traitements. Les rats resteront dans leurs cages d’origine tout au long de l’étude pour éviter tout stress additionnel. Chaque animal sera surveillé au moins deux fois par jour, avec un suivi précis de son état à l’aide d’une grille d’évaluation permettant de détecter rapidement tout signe de mal-être et d’intervenir si nécessaire. Les rats seront anesthésiés et bénéficieront d’une couverture antalgique avec un dérivé morphinique tout au long des expérimentations

Choix des espèces

Les expériences seront menées chez les rats pour plusieurs raisons. Tout d'abord, leur système respiratoire présente des similitudes importantes avec celui des humains, tant par sa structure que par ses mécanismes de défense contre les infections respiratoires. Cela en fait un modèle pertinent pour étudier l’efficacité des traitements. Les rats de 7 semaines ou plus permettent également de prélever des quantités suffisantes de liquide de lavage pulmonaire, indispensable pour mesurer la concentration de l’antibiotique étudié dans les poumons. Ces mesures aident à comprendre comment le médicament agit dans les poumons et à évaluer son efficacité contre les infections. En outre, les méthodes utilisées, comme l’administration de médicaments par aérosols et le prélèvement de liquide pulmonaire, sont bien maîtrisées chez les rats.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des candidats médicaments et des agents perturbateurs de la respiration, jusqu'à deux fois par jour pendant 30 jours consécutifs, subissent jusqu'à dix micro-prélèvements de sang après section de la pointe de la queue, et peuvent présenter bronchoconstriction, dépression respiratoire ou bronchospasme. Le porteur présente ces micro-prélèvements sur animal non contenu comme laissant la souris "signifier librement tout manquement à leur bien-être". L'effectif de 1 080 découle d'une estimation de quinze candidats médicaments sur cinq ans dans "l'hypothèse la plus défavorable", sans que ce nombre de composés soit justifié.

Objectifs

La pléthysmographie sur animaux vigiles et non contraints et la mesure des oscillations forcées sur animaux anesthésiés sont des techniques utilisées pour étudier la fonction pulmonaire chez les rongeurs de laboratoire. Ces techniques mesurent les variations de fréquence, de débit et de pression qui se produisent avant et après l'exposition à un médicament ou toutes autres provocations. A ce jour, aucun modèle alternatif n’est suffisamment intégré et complexe pour permettre d’étudier l’effet d’un candidat-médicament sur la fonction pulmonaire et seule la mesure directe sur animal vivant permet de mettre en évidence l’absence d’effet ou un effet délétère d’un candidat-médicament sur la fonction pulmonaire. Il est également possible de mesurer une activité bénéfique si le candidat-médicament permet de rétablir une fonction respiratoire normale après qu’elle est été perturbée par un agent perturbateur (constituant bactérien, allergènes, médicaments…) Notre objectif est de mesurer l’effet de produits pharmacologiques en cours de développement, candidats-médicaments, sur la fonction pulmonaire chez la souris dans le but de sélectionner les traitements sans impact ou rétablissant une fonction respiratoire normale.

Bénéfices attendus

La mesure de l'activité des composés pharmacologiques sur les paramètres respiratoires permettra de sélectionner les composés ne présentant aucun effet délétère et ceux présentant une activité bénéfique lorsqu’il permet de rétablir une fonction respiratoire normale après qu’elle est été perturbée par un agent sensibilisant (constituant bactérien, allergènes, médicaments…). Ce projet permet de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs afin de poursuivre leur développement pour le traitement des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections pour administrer les candidats-médicaments étudiés et des agents perturbateurs de la fonction respiratoire. Ces composés pourront être administrés sur animaux vigiles ou sur animaux anesthésiés (anesthésie de quelques minutes). Les candidats-médicaments pourront être administré de 1 à 30 jours consécutifs et de 1 à 2 fois par jour. Les traitements 2x/jour et/ou de longue durée ne seront effectués qu’avec des voies d’administration qui le permettent. Afin de suivre les paramètres sanguins (biochimiques, formule sanguine…) au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang sur une durée minimum de 72h. Un prelèvement de sang terminal sera effectué sous anesthésie.

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention des animaux entrainent un stress léger et de courte durée. Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins de 0.5mm) utilisée pour permettre les prélèvements sanguins. Les agents perturbateurs peuvent entrainer un remodelage bronchique (sans phénotype visible), ou des effets transitoires tel qu’une bronchoconstriction, une dépression respiratoire ou un léger bronchospasme qui se traduit par une courte période d’apathie (quelques secondes à quelques dizaines de minutes et visible des expérimentateurs les plus aguerris) suivi d’une récupération rapide et complète de l’animal

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…) et pharmacocinétiques. Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans la distribution et l’activité des médicaments ou la complexité des réponses inflammatoires, circulatoires et de la fonction pulmonaire. De plus, les affections pulmonaires sont également fortement influencées par la respiration (mécanique) et les échanges gazeux qui impactent fortement les réponses cellulaires mais aussi l’organisme dans son entier. Une dysfonction de la respiration entraine irrémédiablement une atteinte de tous les organes et fonctions biologiques, elles-mêmes impliquées dans la réponse immunitaire et l’ADME d’un médicament (Administration, Distribution, Métabolisme et Elimination). Pour ces raisons, une approche chez l’animale, reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. Les études seront réalisées chez la souris, car cette espèce est la mieux caractérisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments et permet le recourt à de très nombreux outils (animaux GM, pléthysmographie, produits et tests biologiques…) permettant de valider leur efficacité.

Réduction

L’étude de la variabilité des paramètres mesurés dans les études précédentes a permis de calculer que des lots de 6 à 12 animaux par groupe permettent une analyse statistique efficace des résultats. Les effectifs utilisés seront déterminés en fonction des analyses réalisées. D’après notre expérience, nous estimons qu’un maximum de 15 candidats-médicaments seront évalués sur une période de 5 ans, soit un maximum de 1080 souris selon l’hypothèse la plus défavorable (6 groupes de 12 souris pour chaque candidat-médicament étudié).

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’une maisonnette, d’une roue d'activité (Fast-trac), d’une balançoire, d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine minimum en cas de contrainte temporelle (délai de livraison, délai trop court avant une période de travaux ou de vide sanitaire…). Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur avant le début de l’étude puis plusieurs fois par jour. Les souris seront anesthésiées pour permettre certaines administrations. Les souris seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie et jusqu’au réveil complet des animaux. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Malgré les précautions prises en amont, les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments, pour mettre en évidence l'atteinte d'un point limite. Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence pour l’étude de la fonction pulmonaire, avec de multiples modèles expérimentaux disponibles. De plus, de nombreux outils permettant de caractériser les réponses biologiques sont disponibles pour cette espèce. Les souris seront âgées d’au minimum 7 semaines, animaux adultes afin que les systèmes respiratoire, circulatoire et immunitaire soient entièrement développés et mature.