Rongeurs

358 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue pour le prélèvement du cerveau et des poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun passe soixante minutes immobilisé dans un tube de contention pour inhaler un aérosol de particules de tungstène, après six séances d'habituation à ce tube réparties sur deux semaines. Une partie reçoit en plus une irradiation gamma du corps entier, puis viennent quatre échographies de trente minutes et cinq prélèvements sanguins échelonnés sur trois mois. Le rat a été retenu parce que la plateforme d'inhalation du laboratoire est dimensionnée pour lui : les animaux doivent peser 350 grammes à quinze grammes près pour tenir dans les tubes sans trop y bouger.

Objectifs

Le concept d’exposome prend en compte le fait que, tout au long de sa vie, un individu va être exposé à un ensemble de polluants environnementaux et professionnels qui vont avoir une répercussion sur sa santé. Ces expositions multiples peuvent produire des effets plus prononcés que lorsque l’on considère un polluant séparément. Notre projet porte sur les effets biologiques d’une coexposition à un stresseur chimique et à un stresseur radiologique sur le cerveau. Ce nouveau projet, fort de la base de résultats acquis au cours des projets précédents, viendrait compléter les connaissances en se concentrant sur la vascularisation du cerveau. Les stresseurs sélectionnés : particules de tungstène métal - valence chimique de notre co-exposition - et irradiation gamma – valence radiologique - sont pertinents au regard de ceux auxquels les travailleurs du nucléaire pourraient être exposés de façon accidentelle lors de taches spécifiques qu’ils auraient à effectuer. L’objectif de notre étude est d’identifier les mécanismes impliqués dans la réponse de la vascularisation cérébrale à une exposition aigüe à des doses faibles de rayonnements ionisants, associée ou non à l’inhalation d’un aérosol particulaire de tungstène chez le rat in vivo. Les analyses réalisées permettront d’étudier si l’exposition à ces deux stresseurs ensemble induit des effets potentiellement plus prononcés que lorsque les expositions se font séparément. Pour cela, l’évaluation de potentielles conséquences sera réalisée à différents niveaux d’analyse : de l’expression de gènes, à la cellule jusqu’au fonctionnement et à l’intégrité des vaisseaux. Cette approche permettra d’identifier les principaux processus biologiques qui sont affectés selon les différents types d’exposition.

Bénéfices attendus

En associant les résultats de ce projet avec les précédentes études, nous pourrons mieux comprendre le rôle de la vascularisation cérébrale dans les effets observés en lien avec notre schéma de coexposition. Ces résultats permettront de prendre en compte l’ensemble des effets avec les autres composantes du cerveau, notamment les différents types cellulaires : les neurones, les cellules gliales. A plus long terme, cette étude alimentera les réflexions sur l'évolution du système de radioprotection dans la gamme des faibles doses de rayonnement ionisants. Cette étude permettrait une meilleure identification des risques réels pour une optimisation des normes d’un point de vue sanitaire et la connaissance des effets biologiques après exposition à des doses faibles combinées à un autre stresseur sur le cerveau.

Procédures

Un nombre réduit d’animaux participeront à la mise au point de certaines étapes : prélèvements sanguins répétés sur animal anesthésié (max 5 prélèvements par animal) et réalisation d’échographie avec produit (1 injection i.v. par animal sur animal anesthésie suivie d’une échographie). Les animaux seront exposés en une seule fois à un aérosol de particules de tungstène (durée 60 min en tube à contention). Pour l’habituation à cette contention, ils auront eu 6 séances d’habituation d’une durée allant de 10 à 60 min réparties sur deux semaines à raison de 3 séances par semaine. Certains lots recevront une dose unique d’irradiation sous la forme de rayonnement gamma en corps entier à une faible dose de 50 mGy. Pour cette irradiation, ils seront placés dans une boite d’irradiation. Ils seront en vigile pour cette irradiation. La durée de l’irradiation est d’une minute. La durée totale de la mise en boite, transport dans le bâtiment, irradiation et remise en cage n’excède pas 30 minutes. Certains lots seront exposés aux deux types de stresseurs dans la même journée en dose unique également. Pour tous les animaux, les échographies et les prélèvements de sang sont non invasifs et effectués sous anesthésie. Les animaux auront 4 séances d’échographies de 30 minutes chacune : une avant l’exposition, puis à 24 heures, 28 jours et 3 mois. Le nombre de prélèvements sanguins est de 5 reparti entre 15 minutes et 3 mois post-exposition, et le volume n’excèdera pas 500 microlitres à chaque prélèvement.

Impact sur les animaux

Les protocoles d’exposition impliquent des périodes de contention dont le stress est réduit par des procédures prévues. Les expositions par inhalation et/ou d’irradiation ne sont pas susceptibles d’induire de douleurs nécessitant l’administration de produits antalgiques, ni avant, ni après la procédure. Les prélèvements sanguins et les administrations i.v. nécessitent une piqure qui va entrainer une douleur légère et de courte durée. Ces actes seront réalisés sur des animaux anesthésiés dans le respect des bonnes pratiques. Il n’est pas attendu d’effet secondaire des produits administrés. Les animaux seront surveillés après chaque manipulation.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les rats seront euthanasiés pour prélever les organes (cerveau, poumons, notamment) pour permettre de réaliser les analyses biologiques (biologie moléculaire, histologie) complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.

Remplacement

Pour mimer l’exposition corps entier à une irradiation externe et à une inhalation sous la forme d’un polluant particulaire qui mime nos situations d’exposition professionnelles, il est nécessaire d’avoir recours à une exposition sur un modèle intégré (système nerveux central, voies aériennes supérieures, poumons, reins). Pour répondre à nos objectifs scientifiques, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles de rayonnement ionisant et à l’inhalation de particules. Elles ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique. Cet argument est également valable pour les modèles d’organoïdes de cerveau car ils n’intègrent pas les cellules responsables de la réponse neuroinflammatoire. Il est également très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules. Dans ce projet l’idée est d’évaluer la vascularisation organique cérébrale, et la niche neurovasculaire qui regroupe différents types cellulaires qui ne peuvent pas être tous cultivés en même temps. De plus, il n’est pas possible d’évaluer l’irrigation fonctionnelle du cerveau dans des modèles in-vitro.

Réduction

Au total, 358 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre d’animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques. Des analyses statistiques ont permis d’optimiser le nombre d’animaux par groupe selon les effets attendus. Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de la littérature existante sur des schémas d’exposition similaires et sur le retour d’expérience des projets précédents.

Raffinement

Les rats font l’objet d’un suivi quotidien. Ils sont pesés à l’arrivée pour vérifier la conformité avec le poids demandé au fournisseur. Ils sont également pesés au cours de la procédure d’habituation aux tubes à contention, témoin de leur état de santé et de l’adéquation de leur prise de poids avec la taille des tubes. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues à des bagarres par exemple entrainera l’euthanasie anticipée. Si le comportement d’un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids. Lors des différentes procédures, un arrêt cardiaque durant l’anesthésie sera traité par massage cardiaque. Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement. Le transfert des animaux de l’animalerie à la plateforme d’irradiation située dans le même bâtiment se fera en boite de transport opaque et possédant un filtre. Le stress potentiel lié à ce transport est nettement réduit pas la procédure d’habituation à la contention. Les prises de sang et les injections par la veine caudale sont réalisées sous anesthésie.

Choix des espèces

Le rat est le modèle de référence pour les études en toxicologie de l’inhalation en mode nose-only. La plateforme d’inhalation que nous possédons au laboratoire est également adaptée au rat : vitesse des flux d’air au sein de la chambre d’inhalation, taille des tubes de contention, taille des emplacements dans la chambre d’inhalation. Cette espèce est le modèle utilisé dans les protocoles d'inhalation précédents réalisés au laboratoire. Le rat est également un modèle de référence pour les systèmes physiologiques étudiés dans ce projet : système nerveux, voies olfactives : épithélium nasal, nerfs olfactifs et bulbes olfactifs, voie pulmonaire. Ainsi, nos résultats pourront être comparés aux précédentes études que ce soit celles du laboratoire et celles issues de la littérature pour les modes d’exposition par inhalation, mais également par irradiation. Les rats sont utilisés au stade adulte de 12 semaines afin de pouvoir comparer les résultats obtenus avec les expériences précédentes au laboratoire et avec la littérature portant sur les effets d’exposition par inhalation à des particules métalliques et par irradiation externe. Le stade adulte correspond au stade auquel l’homme est le plus exposé par ces modes d’exposition combinés pour la population cible que nous visons, c’est-à-dire les travailleurs. Tel qu’évoqué précédemment, le rat mâle de 12 semaines sera utilisé et le poids à l’arrivée doit être situé aux alentours de 350 ± 15 grammes pour tous les animaux afin d’être dans la gamme de taille et de poids adéquate pour pouvoir rentrer dans les tubes à contention au bout des deux semaines d’habituation. Il faut qu’ils puissent être capables de rentrer dans les tubes tout en étant suffisamment contenu à l’intérieur afin de limiter les mouvements dans les tubes pendant les expositions à l’aérosol et qu’ils ne s’agitent pas trop.

Issus d'autres études quand c'est possible, 3 500 rongeurs et lapins vont être utilisés pour entraîner des expérimentateurs aux gestes techniques : 1 500 souris, 1 500 rats, 300 cobayes, 100 lapins, 50 hamsters dorés et 50 gerbilles. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré, 360 individus seront réutilisés dans un autre projet et les autres seront tués, notamment lorsque le volume prélevé ne permet pas leur survie. Ils subissent des administrations par six voies différentes, dont l'intrathécale, jusqu'à trois prélèvements sanguins par semaine dans la limite de 7,5 % du volume sanguin total, une pose de cathéter de quarante-cinq minutes et une ponction de liquide céphalorachidien. Le porteur indique que certains gestes s'apprennent sur peaux et animaux artificiels, mais que l'évaluation des critères de réussite "impose que l'animal soit vivant".

Objectifs

Le but du projet est de permettre à une personne en formation (zootechnicien, technicien de laboratoire, directeur d’étude) de se former à la réalisation de gestes techniques. Ce projet résume un certain nombre de gestes techniques que doivent acquérir les expérimentateurs pour pouvoir réaliser des expériences sur l'animal de laboratoire. Il s'inscrit dans le cadre de l'acquisition de la compétence des expérimentateurs (arrêté du 1er février 2013, Bonnes pratiques de laboratoire, AAALAC).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la maitrise de gestes techniques. La formation initiale des personnes doit être complétée par une formation spécifique en fonction des études qu'elles seront amenées à faire pour maitriser les gestes en toute sécurité.

Procédures

Dans ce projet, les animaux vigiles seront administrés par différentes voies (orale, sous-cutanée, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse et intrathécale) avec -2 min par administration. Des administrations sur l'animal transitoirement anesthésié pourront également être faites : intradermique, oro-pharyngée, intraveineuse et intratrachéale - environ 5 minutes par administration. Des prélèvements de sang seront réalisés sur l’animal vigile (2 minutes par prélèvement) ou sur l'animal anesthésié (environ 5 minutes par prélèvement). Ces prélèvements seront en général de 0.05 à 2 mL, avec un maximum de 3 prélèvements par semaine et dans la limite de 7.5% du volume sanguin total en adaptant la période de récupération. Une implantation de cathéter pourra être faite sur l'animal anesthésié environ 45 minutes de chirurgie 1 seule fois. Un prélèvement de liquide céphalo-rachidien (1 seul prélèvement) sera réalisé sur animal anesthésié avec un volume maximal de 0,1 ml prélevé

Impact sur les animaux

Les gestes techniques enseignés ne doivent pas affecter la bonne santé / l'état général des animaux utilisés. En fonction du geste et de ses conséquences sur l’animal, un échange se fera avec les responsables du Bien-Etre Animal pour adapter les outils d'observation des animaux en cas de réalisation imparfaite du geste concerné et d'impact négatif sur l'animal. Les contentions des animaux vigiles pour induire l'anesthésie, administrer le produit et pour les prélèvements peuvent engendrer un stress mineur à l'animal. Les chirurgies peuvent induire des douleurs post-chirurgicales qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie, analgésie et un protocole de soins post-opératoire. Les animaux de ce projet pourront aussi subir un stress lié à une douleur équivalente à la piqûre d'une aiguille lors des administrations intramusculaire, sous-cutanée, intrapéritonéale, intradermique, intraveineuse ou intrathécale ou une contrainte légère liée à l'administration per os lors de l'administration du produit ainsi qu'une douleur équivalente à la piqûre d’une aiguille lors des prélèvements sanguins.

Devenir

euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal ou réutilisation des animaux dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Avant tout début de formation, la formation débute par une partie théorique avec une personne expérimentée et certains gestes pourront être réalisés sans animaux grâce notamment à des méthodes alternatives (peaux artificielles, animaux artificiels). Les gestes à acquérir, par du personnel déjà formé aux techniques de base de l'expérimentation animale, imposent que l’animal soit vivant pour évaluer les critères de réussite.

Réduction

Dans la mesure du possible, les animaux seront issus d'études et seront utilisés, après avis du vétérinaire, pour plusieurs gestes techniques de ce projet. Une supervision étroite garantira une utilisation des animaux en minimisant le risque d'erreur.

Raffinement

Les procédures seront réalisées par du personnel compétent déjà formé aux sciences et techniques des animaux de laboratoire, mais devant acquérir une expertise supplémentaire. Ce personnel de formation sera sous la supervision d'une personne experte. Le raffinement sera obtenu par • La mise au point de procédures rigoureuses, • Un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • Le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques et des points limites, •Des protocoles d'anesthésie et d'analgésie adaptés et maîtrisés, un suivi de l'état de santé des animaux ainsi que des soins adaptés pour permettre une bonne récupération, • La mise en groupe des animaux, • La mise en place de jouets dans les cages. • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire.

Choix des espèces

Les espèces (rongeurs et lapin) qui seront utilisées dans ce projet correspondent aux espèces cibles autorisées pour l’établissement utilisateur, que les personnes en formation auront à manipuler au cours des expérimentations. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Automutilation, saignement incontrôlable, perte de poids supérieure à 15 % : un seul de ces signes suffit à déclencher la mise à mort. 96 rats mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour que leur calvaria soit prélevée et analysée. Chaque animal reçoit deux trous de quatre millimètres percés dans la partie supérieure du crâne, comblés par un matériau expérimental, puis des radiographies hebdomadaires sous anesthésie courte et deux injections de colorants. La perte osseuse visée chez l'humain concerne la mâchoire, mais le crâne a été retenu parce qu'il simplifie l'opération.

Objectifs

L'objectif du projet est de tester de nouveaux matériaux pour combler une perte osseuse importante (plus de 1 cm²) dans la mâchoire humaine. Ces matériaux doivent favoriser la repousse osseuse, permettre une bonne circulation sanguine et lutter contre les bactéries. L'expérience sera menée sur des rats. Au lieu de la mâchoire, nous choisirons la partie supérieure du crâne pour créer le défaut osseux. Cela simplifiera l'opération et améliorera le bien-être des animaux en réduisant les risques de complications. Les matériaux testés forment une structure poreuse composée d'un plastique biodégradable et de particules de verre spéciales, parfois enrichies d'un élément antibactérien. Ils sont conçus pour être suffisamment solides pour être manipulés par les chirurgiens et supporter la repousse osseuse. Nous avons déjà évalué plusieurs propriétés de ces matériaux, notamment leur dégradation dans l'eau, leur toxicité pour les cellules et leur efficacité contre les bactéries. Des essais préliminaires sur des rats n'ont montré aucun effet secondaire négatif.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de valider chez les animaux le potentiel de régénération osseuse et de revascularisation d’un matériau poreux constitué d’un réseau de bioverres (supplémentés ou non avec un ion cationique) et d’un polymère biodégradable. Cette étude pourrait participer à l’élaboration d’un nouveau traitement pour la reconstruction osseuse consécutive à l’ORN (ostéoradionécrose, une complication sévère de la radiothérapie, liée à un défaut de cicatrisation du tissu osseux). Ce matériau a pour objectif d’être pratique à utiliser pour les cliniciens et efficace pour la repousse osseuse, la revascularisation et ayant effet antibactérien (propriété de l’ion cationique).

Procédures

Les animaux seront soumis à l’implantation d’un biomatériau chargé ou non en cation au niveau d’un défaut osseux critique sur la partie supérieure du crâne (calvaria) de rats réalisé au préalable (temps opératoire max : 20 minutes). Cette procédure chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale et une analgésie adaptée sera appliquée. Certains des animaux seront anesthésiés de manière hebdomadaire sur des temps courts pour effectuer des radiographies de suivi de repousse osseuse (temps 10 à 20 secondes). L’ensemble des animaux vigiles seront aussi soumis à deux injections intrapéritonéales de colorants vitaux de quelques secondes, 14 et 2 jours avant leur mise à mort. Aucun prélèvement sur animaux vigiles ne sera réalisé.

Impact sur les animaux

Un des modèles les plus pertinents utilisés pour étudier la régénération osseuse est le défaut critique (4 mm) de calvaria chez le rongeur. Par conséquent, ce modèle d’étude sur le rat consanguin Lewis a été étudié depuis plusieurs années, validé et publié. Les effets indésirables attendus peuvent être une difficulté de récupération de l’animal suite à l’anesthésie, l’apparition de douleurs au site d’implantation, une gêne fonctionnelle due à une réaction inflammatoire ou une mauvaise cicatrisation. De façon générale, différents points limites (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué…) seront attentivement regardés.

Devenir

En fin d’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort. Les cadavres des animaux seront évacués exceptés les calvarias qui seront prélevées, fixés et préparées pour réaliser les analyses radiologiques et histologiques au laboratoire qui permettront l’évaluation de la néoformation osseuse et des propriétés angiogéniques des biomatériaux.

Remplacement

Cette étude portant sur le tissu osseux, il n'existe pas de solution de remplacement utilisant des invertébrés L'utilisation de rongeurs reste donc nécessaire afin de vérifier si les nouveaux matériaux sont bien tolérés par l'organisme et s'ils favorisent la croissance osseuse. Dans ce but, des études ont été réalisées en laboratoire sur des cellules, il est maintenant nécessaire de tester nos matériaux sur des petits animaux vivants pour observer les effets réels sur un organisme entier.

Réduction

Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les biomatériaux utilisés ont été sélectionnés en amont et déjà testés in vitro et in vivo (expérience pilote) pour leur biocompatibilité. Lors de la procédure, les défauts osseux seront réalisés sur chaque os pariétal qui compose la calvaria de rats, soit 2 défauts par animal, réduisant de fait le nombre d’animaux tout en préservant la puissance statistique. De plus, une étude bibliographique nous a permis de déterminer la quantité d’implants nécessaires à l’obtention de résultats significatifs (n=7). Cela nous permet ainsi de constituer des groupes avec un nombre d’animaux nécessaires et suffisants pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs, reproductibles et valorisables. Le nombre d’animaux est ainsi réduit au strict minimum.

Raffinement

Afin de raffiner la méthodologie, les procédures de manipulation et de surveillance régulière sont élaborées avec l’objectif d’éliminer toute forme de souffrance animale. Chaque étape de l’étude tiendra compte du bien-être de l’animal, de son arrivée dans l’animalerie spécialisée à sa mise à mort en fin d’étude. Une analgésie chimique est assurée en pré- et post-opératoire. Les rats sont anesthésiés par inhalation d'un gaz durant toute la procédure. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 20 minutes, sera effectuée sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle. Les rats seront ensuite transférés dans une couveuse chauffante le temps de récupérer suite à ce réveil. Le reste du temps, les rats seront hébergés en groupe sociaux de 2 individus par cage avec enrichissement physique sous forme de tunnel en carton 12x9cm, un bâton de bois à ronger et recevront une nourriture standard et de l’eau de boisson ad libitum Aucune souffrance (ou très faible) n'est attendue lors des manipulations prévues. Les animaux seront observés tous les jours. Cela étant, nous serons vigilants à ces critères: - Signes cliniques notables (Le point limite est atteint en présence de 3 signes simultanés) Lésion sans effraction cutanée Signes spécifiques: grattage de cicatrice en regard de la reconstruction calvariale Agitation/agressivité Hypomotilité/hyporéactivité Incoordination modérée Stéréotypie Poil piqué Coloration anormale de la peau Flaccidité musculaire généralisée Gonflement abdominal Zone ano génitale souillée Fèces liquides Fèces mucoïdes Perte de poids inférieure à 15% Diminution/absence de prise de nourriture -Signes cliniques sévères (Le point limite est atteint en présence d’un seul signe) Lésion sévère automutilation masse ulcérée Signes spécifiques: infection de la cicatrice, saignement incontrôlable, plaie suintante Akinésie Décubitus Difficulté/impossibilité de mobilisation Incoordination marquée Tremblements généralisés Convulsion Hémiplégie Persistance du pli cutané Coloration jaune ou bleue des muqueuses Voussure du dos/dos cambré Absence de fèces Urines rouges Perte de poids supérieure à 15% Absence de prise de nourriture> à 2/jour En cas d’apparition d’un de ces symptômes malgré le traitement antalgique adapté ou en cas d'atteinte du point limite l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié dans les plus brefs délais.

Choix des espèces

L’utilisation du rat est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques. De plus, de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Le modèle de défaut osseux critique de calvaria chez le rongeur est couramment utilisé dans la littérature pour l’étude de la régénération osseuse et est parfaitement validé. Les animaux inclus dans cette étude seront des rats mâles âgés de 12 semaines au début de la procédure. Ceci permet d’avoir des animaux matures sans pathologies associées au vieillissement tout en limitant les biais liés à la croissance osseuse physiologique.

Mis en reproduction une nuit, puis soumis à un frottis vaginal sans anesthésie pour dater la gestation, 220 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié des femelles gestantes passent les vingt-deux jours de gestation sous régime pauvre en protéines, avec inactivité et perte de poids attendues. Au seizième jour, chacune subit une laparotomie pour une électroporation in utero de quarante minutes, dont le réveil peut être suivi de douleurs pendant deux à trois jours. Les nouveau-nés sont maintenus en vie jusqu'au prélèvement de leurs tissus à trois, huit ou trente jours. Les mères et les petits surnuméraires sont proposés en interne pour un autre projet avant d'être tués.

Objectifs

Le retard de croissance intra-utérin (RCIU) est la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. C’est une pathologie caractérisée par un retard de croissance général du fœtus en développement qui représente la deuxième cause la plus fréquente de mortalité périnatale. Touchant près de 3 à 9% des naissances dans les pays développés, c’est une insuffisance placentaire qui est le plus fréquemment mise en cause mais il peut également résulter d’une carence alimentaire de la mère dans les pays moins développés. Un tel retard dans le développement du fœtus entraine des déficits cognitifs à long terme caractérisés par des troubles de la concentration, de l’attention, une hyperactivité, un quotient intellectuel plus faible ainsi que des désordres moteurs. Le cortex ainsi que son réseau neuronal est le siège des fonctions cognitives de haut niveau. Ce projet consistera à utiliser le modèle de rat de RCIU pour appliquer une technique innovante qui permet de marquer de manière très claire des neurones isolés pour nous permettre d’apprécier d’une part les morphologies neuronales et d’autre part les interactions des neurones avec les vaisseaux sanguins environnants que l'on pourra mettre en évidence par des techniques classiques d'histologie.

Bénéfices attendus

Etudier les conséquences d’un RCIU sur l’intégrité du système nerveux central et plus précisément sur l’intégrité de ces réseaux neuronaux est indispensable pour mieux comprendre la mise en place de ces déficits cognitifs observés à long terme, afin d’envisager des stratégies thérapeutiques applicables dès la naissance pour limiter ces troubles cognitifs.

Procédures

Deux prélèvements sont effectués dans le cadre de ce projet. Le projet débute avec une mise en reproduction de deux animaux (un mâle et deux femelles par cage maximum) pendant une nuit seulement. Un prélèvement vaginal sur animaux vigiles est ensuite effectué pour confirmer la présence de spermatozoïdes et donc valider le premier jour de gestation. Quelques secondes seulement sont nécessaires pour procéder au frottis et aucune contrainte physique n’est appliquée à l’animal. Une anesthésie n’est pas envisagée pour éviter d’appliquer un stress supplémentaire à l’animal. Ces femelles gestantes sont ensuite soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation (22jours). Une chirurgie expérimentale appelée électroporation in utero est appliquée sur chacune de ces femelles au 16e de gestation. La chirurgie ne dure pas plus de 40 minutes à partir de l’anesthésie jusqu’au réveil.

Impact sur les animaux

Les femelles sont soumises à un régime hypo-protéiné qui peut affecter leur comportement durant toute la période de gestation. Une inactivité ainsi qu’une perte de poids associé à ce régime pourra être observé durant la période de gestation. Le régime n’induit pas de perturbation du système digestif, si ce n’est des fèces d’une couleur plus claire. Ces effets indésirables n’ont pas de conséquences sur la mise bas des femelles d’après les projets déjà évalués. La taille des portées issues d’un RCIU peut être plus petite mais aucune mortalité supplémentaire n’est observée. La laparotomie appliquée à ces mêmes femelles au 16e jour de gestation peut également entrainer des changements dans le comportement de la femelle. Le réveil suite à la chirurgie peut être source de stress et suivie d’une inactivité et de douleurs. Ces observations ne durent pas plus de 2 à 3 jours selon les projets déjà évalués.

Devenir

Tous les animaux subissent la chirurgie d’électroporation in utero. En revanche, la moitié des femelles gestantes de ce projet ne sont pas soumis à un régime hypo-protéinée durant la période de gestation pour constituer un groupe contrôle. Après la mise à bas, les nouveau-nés seront maintenus en vie jusqu’au prélèvement des tissus à différents temps (P3, P8 ou P30). Parce que des différences métaboliques et une réaction inflammatoire influençant le développement du système nerveux central peuvent être observées entre les portées d’une femelle ayant déjà subi une intervention chirurgicale et notamment une laparotomie, nous ne réutiliserons pas ces mêmes animaux pour produire d’autres portées. En revanche, les femelles ainsi que les petits surnuméraires seront proposées en interne pour une réutilisation dans un autre projet avant de les mettre à mort.

Remplacement

Bien que des modèles in vitro de barrières hémoencéphaliques (cellules endothéliales cérébrales) existent, ils ne permettent pas d’étudier de façon concomitante la mise en place des réseaux neuronaux et vasculaires. Les séquelles neurologiques résultantes d’une atteinte périnatale dépendent de mécanismes complexes impossibles à reproduire in vitro, et la maturation des neurones ainsi que leur connectivité (entre eux mais aussi avec le réseau vasculaire environnant) ne peuvent être étudiés qu’in situ, dans un animal vivant. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal pour étudier la pathologie. L’analyse in vivo reste donc incontournable pour ce projet de recherche.

Réduction

Toutes les expériences sont planifiées avec un nombre minimal d’animaux, mais nous devons garantir une pertinence statistique significative. Des calculs statistiques de puissance, ainsi que les expériences passées du laboratoire démontrent que 10 animaux par groupe permettent d'obtenir des résultats significatifs à la suite de tests statistiques bilatéraux non paramétriques sur des échantillons indépendants. Les expériences passées dans le laboratoire ainsi que des recherches bibliographiques démontrent un taux d’efficacité d’électroporation moins important chez le rat que dans les modèles murins à partir desquelles le projet s’est inspiré. Cela signifie qu’un nombre plus important de femelles est nécessaire pour obtenir suffisamment d’embryons pour lesquels l’électroporation a été efficace, positive. Ce nombre est néanmoins réduit car il nous sera possible d’utiliser les résultats des animaux du groupe contrôle d’un projet déjà existant utilisant la même procédure pour deux stades dedévelopement. Notre approche expérimentale nous permet d’analyser plusieurs dizaines de neurones ainsi que leur réseau vasculaire sur un même animal. Par ailleurs, les mêmes cerveaux pourront être utilisés pour d’autres marquages immunohistochimiques, permettant ainsi de minimiser le nombre d’animaux nécessaire à ce projet. Il existe dans le laboratoire un système de préservation jusqu’à plusieurs années de toutes les séries de coupes non utilisées. Cette banque de tissus permet d’optimiser sur le long terme l’utilisation du tissu tout en réduisant le nombre d’animaux utilisé. Les mères ayant subi cette procédure, ainsi que les petits surnuméraires, sont proposés en interne pour être réutiliser dans le cadre d’un autre projet.

Raffinement

De nombreuses actions de raffinement seront mises en place lors de ce projet. La mise en reproduction s’effectue en respectant les normes d’hébergement. Nous réunissons au maximum deux femelles et un mâle par cage pour une nuit seulement. Nous surveillons leur comportement et si la moindre violence est observée alors les animaux sont immédiatement séparés. Les femelles gestantes sont pesées tous les trois jours afin de prévenir d’une perte de poids trop importante associée au régime alimentaire. Nous mettons fin au protocole si la femelle perd plus de 10% de son poids initial (pesée le jour de la mise en reproduction). Toute procédure de chirurgie sera accompagnée d’utilisation d’anesthésiques et/ou d’analgésiques, et d’un suivi journalier des animaux afin de détecter et traiter immédiatement tout signe d’inconfort.

Choix des espèces

Les expériences décrites dans ce projet seront effectuées sur des rats Sprague Dawley (SD) puisqu’il s’agit de l’espèce utilisée dans l’équipe pour plusieurs projets. C’est une espèce de prédilection pour des expérimentations qui requiert une optimisation des gestations. Les femelles de cette lignée ont en effet des portées importantes et régulières. Elles s’occupent très bien de leurs petits et récupèrent très vite après une chirurgie. Les électroporations in utero seront effectuées à 16.5 jours embryonnaires (E16.5) pour nous permettre le ciblage des progéniteurs donnant naissance aux neurones corticaux superficiels. Les animaux seront mis à mort à 3 jours postnatal (P3), P8 et P30. Ces différents temps nous permettront d’analyser l’organisation des réseaux neurovasculaires au cours du développement postnatal et ainsi apprécier des modifications qui persisteraient à long terme.

Un gavage jusqu'à deux fois par jour, une injection intrapéritonéale quotidienne et trois mesures de glycémie par semaine, vingt semaines durant : 11 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs tissus. Certaines injections se font dans la veine de l'œil, sous anesthésie. Il s'agit de tester des composés dans trois modèles de diabète auto-immun, dont des souris rendues diabétiques par transfert de cellules immunitaires ou par la streptozotocine. Le porteur décrit la souris NOD comme un modèle "très performant" et juge le recours à la souris "incontournable", au motif qu'aucun modèle in vitro ne permettrait d'étudier ces mécanismes immunitaires.

Objectifs

Le diabète représente un enjeu majeur de santé publique dont l’importance ne cesse de s’accroitre. Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune complexe qui résulte de la destruction spécifique des cellules pancréatiques qui produisent l'insuline et de la perte de la capacité à contrôler le niveau de glucose dans le sang. La maladie survient suite à une réaction anormale du système immunitaire. Ce projet vise à tester des composés dans 3 modèles de diabète auto immun. Ce travail pourrait permettre de trouver de nouveaux traitements du diabète de type 1.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de diabète de type 1.

Procédures

1) Mesure de glycosurie grâce à une bandelette, 3 fois par semaine, test rapide en prélevant naturellement une goutte d’urine lorsque l’animal urine, en 10 sec sur animal vigile. 2) Dosage glycémique avec un lecteur de glycémie capillaire, 3 fois par semaine et pendant 20 semaine à l’apparition d’une glycosurie positive. Test rapide par une goutte de sang prise à la queue (piqure avec une aiguille fine), en 10 sec sur animal vigile. 3) Dosage de la glycémie lors d’un test de tolérance au glucose réalisé une fois par étude : 4 mesures réalisées en 10 secondes sur 2 heures de test sur animal vigile 4) L’injection de splénocytes ou lymphocytes en intraveineux est réalisé en 20 sec sous anesthésie et après traitement antalgique au niveau de l’œil. 5) Les composés ou leur solvant seront administrés par gavage (maximum deux fois par jour), par voie intraveineuse (maximum trois fois par semaine) ou intrapéritonéale (une fois par jour) pendant 20 semaines maximum: moins d’une minute à chaque administration, vigile. 6) Trois autres prélèvements au maximum dans une journée, veine saphène médiale ou submentale (n’excédant pas en tout 150μL, répartis sur 1 ou 2 jours, 15 minutes en tout, vigile) pour l’analyse de la pharmacocinétique des composés.

Impact sur les animaux

Le degré de sévérité des procédures expérimentales dans lesquelles sont inclus les animaux est modéré. Le diabète est une pathologie silencieuse qui ne déclenche pas de signe clinique douloureux. Il peut être responsable d’une augmentation de la soif et d’une déshydratation et tardivement une perte de poids. Ces manifestations sont précédées d’une augmentation du taux de sucre dans le sang et les urines. Les injections intrapéritonéales ou intraveineuse et les prélèvements sanguins au niveau de la veine de la queue induisent une douleur de courte durée. L’animal peut subir un stress au cours de l’anesthésie ou lors de l’administration par gavage ou par le injection intrapéritonéales.

Devenir

Les souris seront mises à mort. Les tissus seront collectés post-mortem pour l’analyse de la physiopathologie.

Remplacement

Les modèles animaux représentent un outil incontournable dans l’étude des mécanismes immuno-pathologiques. Aucun modèle alternatif in vitro n’est disponible pour étudier les mécanismes immunitaires complexes intervenant dans la physiopathologie du diabète auto-immun. La souris NOD représente un modèle très performant et hautement informatif. Étant donné que le paramètre principal étudié dans ce projet est la survenue d’une maladie résultant d’un ensemble complexe d’acteurs cellulaires et de médiateurs solubles, l’utilisation du modèle de la souris est incontournable.

Réduction

Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de réduire le nombre d’animaux. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique.

Raffinement

Les points finaux pour chaque procédure ont été établis afin d’éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés dans des cages adaptées, 3-5 souris par cage pour préserver leurs interactions sociales et limiter les phénomènes de disputes ou de stress engendrés par une surpopulation. L’environnement est enrichi par des objets. Les animaux sont observés quotidiennement par le personnel de l'animalerie formé au bien-être des animaux et par les expérimentateurs. Les injections intraveineuses à l’œil sont réalisées sous anesthésie générale avec un analgésique. Les injections à la queue et les prélèvements à la queue sont effectuées sous anesthésie locale.

Choix des espèces

L'utilisation de la souris est basée sur une littérature abondante décrivant les différents modèles de diabète de type 1 chez la souris. La souris NOD ou encore induit par le transfert de splénocytes ou de lymphocytes à des souris immunodéficientes ou encore traité avec de la streptozotocine. Les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés d’intérêt à visée anti-inflammatoire sur un système immunitaire mature.