Rongeurs

3 660 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant subir une chirurgie du dos de trente minutes pour une injection entre les méninges, six prélèvements de sang en vingt-quatre heures et jusqu'à dix-sept heures en cage à métabolisme. Avant la mise à mort, une aiguille traverse la peau à la base du crâne pour ponctionner le liquide céphalorachidien. L'objet est de mesurer la toxicité de candidats médicaments administrés par voie intrathécale, en amont d'études réglementaires qui utiliseront davantage d'animaux non-humains. Le porteur indique que 183 rats pourront être réutilisés dans un autre projet, ceux ayant subi un premier geste invasif sans avoir reçu de traitement, les 3 477 autres étant tués pour prélèvement de sang, de liquide céphalorachidien et d'organes.

Objectifs

De nos jours, une proportion très importante des pathologies pouvant être décrites atteint le système nerveux. Ces maladies neurologiques, difficiles à traiter, sont très invalidantes, voire mortelles et considérées comme la première cause de handicap dans le monde. En effet, en 2021, il était estimé que près de 3 milliards d’individus étaient atteints d’une maladie neurologique. De même, le nombre de cancers atteignant le système nerveux représente une proportion non négligeable du nombre total de cancers, avec de même une difficulté de traitement du fait de leur localisation. Dans ce contexte, l’objectif principal de la R&D (recherche et développement) pharmaceutique est de développer de nouveaux candidats médicaments qui seront évalués durant des essais cliniques afin de satisfaire les besoins médicaux grandissants et d’améliorer le traitement de ces maladies touchant le système nerveux. Pour beaucoup de ces maladies, un dérèglement de la production de protéines ou une accumulation de celles-ci au niveau cérébral est en cause. Il est possible aujourd’hui de cibler l’ARN d’une protéine du cerveau au fonctionnement anormal pour l’éliminer. Cela nécessite la mise en œuvre de candidats médicaments qui doivent atteindre les cellules du système nerveux. Le passage de la barrière hématoencéphalique (BHE) étant critique, la plupart des candidats médicaments utilisés pour le traitement des maladies neurologiques est administrée au niveau des lombaires entre les méninges par administration dans l’espace intrathécal (IT) chez l’Homme. L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérabilité puis le profil de sécurité complet de candidats médicaments et/ou véhicules (agents de transport du principe actif) administrés par voie IT chez le rat. En effet, le rat présente une forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme.. De plus, la voie intrathécale utilisée en clinique humaine peut être réalisée chez cette espèce. Ainsi, après sélection par screening in vitro puis in vivo des formulations et des candidats médicaments les plus prometteurs, les études préliminaires vivo de sécurité non clinique incluses dans ce projet vont permettre de déterminer le profil de sécurité des candidats médicaments et de connaître ainsi la fenêtre thérapeutique (en comparant la dose toxique à la dose efficace). Les données d’efficacité et de sécurité permettent conjointement de décider à chaque étape l’arrêt ou la poursuite du développement du médicament.

Bénéfices attendus

Actuellement, une grande majorité des médicaments pour le traitement de maladies affectant le système nerveux et notamment neurodégénératives est administré par voie intrathécale, permettant le passage de la barrière hémato-encephalique et l’action du médicament sur le cerveau. Cependant, la voie intrathécale est contraignante pour le patient et le candidat médicament peut, au cours de son développement, être confronté à des problèmes de tolérabilité, de distribution et de dégradation précoce. Le bénéfice apporté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments en évaluant très précocement leur toxicité éventuelle, en déterminant un profil de sécurité complet (réduction ainsi du nombre d’études réglementaires et du nombre global d’animaux utilisés pour un projet thérapeutique) et en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental avant d’initier des études réglementaires qui nécessitent un nombre plus important d’animaux. Cette approche permet également de réduire les contraintes auxquelles les animaux sont soumis dans ces études en s’assurant de la bonne tolérance du candidat médicament. En effet, les deux procédures de ce projet permettent la sélection du meilleur candidat et l’arrêt des candidats les moins prometteurs, réduisant ainsi le nombre d’études réalisées et donc le nombre d’animaux utilisés au total pour un projet thérapeutique.

Procédures

- A l’administration (unique à 1 fois toutes les 3 semaines maximum) de composés par voie intrathécale nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie et couverture analgésique – durée de la chirurgie environ 30 minutes - A l’administration d’analgésique en pré, péri et post opératoire ou lors de l’euthanasie -administration de 10 secondes environ - A des prélèvements de sang grâce à la technique du microsampling sur animal vigile (faible volume de sang prélevé à la veine marginale de la patte) : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum dans l’étude – contention de 30 secondes environ et prélèvement durant 10 secondes environ - A des recueils urinaires d’une durée maximale de 17 heures en cage à métabolisme (1 fois par étude au maximum) - A un prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A un prélèvement unique de Liquide Céphalo Rachidien réalisé par voie transcutanée (ponction avec une aiguille au travers de la peau) via la cisterna magna (cavité située en bas de la boîte crânienne) sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A des examens paracliniques (ophtalmologie, cardiologie,) nécessitant une contention légère de 2 minutes environ au maximum 2 fois par étude

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : • Administration intrathécale : la phase de chirurgie nécessaire à l’administration du composé testé (d’une durée d’environ 20 minutes) et du suivi post-opératoire peut générer du stress et de la douleur (degré de sévérité modérée) • Administrations d’analgésique : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’administration (moins de 10s) de la douleur (degré de sévérité léger) • Prélèvements de sang à la veine marginale de la patte ou à la veine caudale : La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (degré de sévérité léger) • Induction de l’anesthésie gazeuse (pour chirurgie ou prélèvement de sang ou autre liquide biologique, liquide céphalo-rachidien (LCR), préalable à l’euthanasie etc) : l’induction qui est rapide peut générer du stress (degré de sévérité léger). - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques (modifications de la prise de poids, baisse d’activité locomotrice par exemple) et peut provoquer une nuisance pour l’animal.

Devenir

L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour la collecte de sang/ liquide cephalo-rachidien (LCR) pour analyse (biologie clinique, biomarqueurs) et d’organes pour lecture anatomopathologique. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les rats pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire ex : micro-sampling) et qui n’ont pas reçu de candidat traitement /véhicule : -du fait d’une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre rat traité du groupe par exemple

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer la tolérabilité puis d’établir un profil de sécurité de candidats médicaments à visée neurologique. Actuellement, il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux tout comme il n’existe pas de modèle vitro suffisamment complet pour juger du passage de la barrière hématoencéphalique ainsi que la tolérabilité et le profil de sécurité de ces candidats médicaments. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et le rat est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet (voie intrathécale possible chez cette espèce, processus physiologiques très semblables à l’Homme). L’ensemble des designs expérimentaux de ce projet est néanmoins optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus des méthodes alternatives de screening vitro de passage de la barrière hémato-encéphalique sont utilisées pour caractériser et sélectionner les candidats médicaments ou véhicules à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement leur nombre.

Réduction

Une sélection des candidats médicaments les plus prometteurs est réalisée à l’aide de screening vitro et/ou silico avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre habituel d’animaux (2 à 8 animaux/dose avec une mixité selon la procédure conduisant à 2 à 4 individus/sexe/dose ou candidat médicament) est déterminé pour être un compromis efficace afin d’atteindre les objectifs des différentes procédures, pour générer de la donnée consolidée pour les études ultérieures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint possible Le choix de ce nombre est basé sur la littérature (recommandations sur les bonnes pratiques d’études de sécurité non clinique) et sur l’expérience interne. Les études de ce projet sont mises en place précocement et profitent des informations apportées par les études de pharmacologie réalisées en parallèle (efficacité, engagement de la cible) avant de réaliser les études vivo nécessaires à la poursuite du développement de la molécule. Elles correspondent ainsi à une étape supplémentaire de sélection du candidat médicament, visant à réduire le nombre total d’animaux utilisés : selon les résultats de ces études et des études d’efficacité pharmacologique, le développement de la molécule peut être arrêtée évitant ainsi de réaliser les études suivantes comportant un effectif d’animaux plus important. Selon la procédure, les études permettent de mesure de nombreux paramètres sur un même animal, grâce à différents examens cliniques et paracliniques peu invasifs (observations cliniques, poids et température corporelle, prélèvement de sang pour pharmacocinétique ou biologie clinique, prélèvements d’organes…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire dans ce projet. Enfin, l’utilisation de la technique du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale de la patte) peu invasive, rapide, permet de réaliser une cinétique complète sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux (en évitant l’ajout d’animaux dédiés à la pharmacocinétique dans l’étude), tout en respectant les limites de volémie physiologiques et le bien-être animal et sans chauffage préalable pour provoquer la dilatation des vaisseaux. En cas de protocole particulier (exemple : besoin de suivre plus précisément un paramètre particulier) le service de biostatistiques pourra être mis à contribution pour définir le design expérimental le plus optimal.

Raffinement

Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, et si les animaux sont en phase d’étude ou pas, une prescription de soins, un arrêt de traitement, ou une euthanasie peuvent être mis en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique à l’espèce étudiée, mise en place avant l’apparition des points limites. L’administration par voie IT est réalisée dans des conditions d’asepsie optimales, sous anesthésie gazeuse avec tapis chauffant, analgésie et anesthésie locale pré, péri et post-opératoire Le protocole d’analgésie sera adapté au cas par cas. L’ensemble des animaux est hébergé et manipulé dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants. Les animaux sont régulièrement manipulés et l’ensemble du personnel technique formé pour générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant l’hébergement individuel n’excédant pas 6 heures, recueil urinaire n’excédant pas 17 heures), avec de l’enrichissement adapté aux besoins du rat (matériel de nidification, matériel à ronger). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie transitoire). Pour les prélèvements de sang, la technique du microsampling (prélèvement d’un faible volume de sang à la veine marginale de la patte) est mise en place. Cette technique, rapide, peu invasive, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites physiologiques du rat (recommandations SBEA disponibles en interne). Elle permet également d’éviter le placement préalable de l’animal dans une enceinte thermorégulée nécessaire à la bonne réalisation du geste. Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision une analgésie est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.

Choix des espèces

L’ensemble des procédures de ce projet est réalisé sur l’espèce rat car : - Le rat présente une forte homologie physiologique, comportementale et anatomique avec l’Homme et ainsi une forte valeur translationnelle. De plus la voie intrathécale nécessaire à l’administration des formulations de ce projet peut être réalisée chez le rat. - Les structures cérébrales, dont certaines sont la cible des futurs candidats médicaments sont plus faciles à discerner chez cette espèce. - Les études réglementaires ultérieures et nécessaires au développement d’un candidat médicament utilisent ce modèle expérimental. La sélection se fait aussi sur des critères réglementaires, éthiques, scientifiques afin d’obtenir la meilleure prédiction possible de la réponse chez l’Homme. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature) relatives au rat (âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en amont. Les rats utilisés sont des jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.

Une injection de cellules tumorales sous la peau ou dans le sang, puis des injections dans l'abdomen ou des gavages trois à cinq fois par semaine, et une à deux séances d'imagerie sous anesthésie chaque semaine : 5 505 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les tumeurs du flanc gênent les déplacements aux stades avancés et que les métastases pulmonaires peuvent provoquer une détresse respiratoire. Le protocole court sur huit semaines, jusqu'à quatre-vingt-dix jours de traitement pour certaines expériences, afin de chercher de nouvelles cibles contre la résistance thérapeutique du mélanome. Aucun seuil n'est donné pour les critères d'arrêt annoncés comme précis et précoces, et l'effectif de 5 505 souris est rapporté à un logiciel d'analyse de puissance qui n'est pas nommé.

Objectifs

Le mélanome cutané est le type de cancer de la peau le plus grave avec un fort taux de mortalité associé aux stades avancés de la maladie. Même si le développement récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie a permis d’améliorer considérablement la prise en charge des patients atteints de mélanome avancé, certains patients ne répondent pas à ces traitements et de nombreux rechutent en raison du developpement de résistances à ces traitements. L’un des enjeux majeurs de la cancérologie cutanée pour les années à venir est donc d’identifier de nouvelles cibles/stratégies permettant de prévenir ou de contourner les situations d’échappement thérapeutique. Notre projet propose d’explorer l’implication possible de certains de nouvelles protéines dans la réponse thérapeutique du mélanome avancé afin de révéler des cibles/stratégies nouvelles pour éliminer les cellules résistantes à ces traitements.

Bénéfices attendus

Notre projet propose d’explorer l’implication possible de nouvelles protéines dans la réponse thérapeutique du mélanome avancé afin de révéler des cibles/stratégies nouvelles pour éliminer les cellules résistantes à ces traitements. Nos travaux devraient permettre de mieux comprendre les processus responsables du développement métastatique et de l'échappement au traitement des mélanomes et pourraient à terme permettre d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les interventions réalisées sur les animaux seront les suivantes : injection sous-cutanée ou intraveineuse unique de cellules tumorales (durée: moins de 1 minute/souris), injections intrapéritonéales et/ou des gavages oraux à raison de 3 à 5 fois par semaine (durée: moins de 1 minute/souris). Séances d'imagerie (bioluminescence) sous anesthésie : 1 à 2 fois par semaine (durée : moins de 30 minutes).

Impact sur les animaux

1/Contention et douleur induites lors de l'injection i.v ou s.c de cellules tumorales. Durée de la procédure : 1 minute/souris; 2/ Inconfort/ difficultés de déplacement dues à la présence de tumeurs sur le flanc aux stades les plus avancées de la croissance tumorale; 3/ Possible détresse respiratoire due à la présence de métastases pulmonaires aux stades les plus avancées de la dissémination métastatique; 4/ Possible inflammation lors des injections intrapéritonéales répétées; 5/ Introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons lors des gavages oraux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélever les tumeurs et les analyser par biochimie, biologie cellulaire, analyse transcriptomique et histopathologique.

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement, les études in vitro ont été réalisées sur des lignées cellulaires de mélanome et des cellules primaires de mélanome fraichement isolées de patients au lieu de cellules isolées à partir des animaux. Cependant, pour mieux comprendre les conséquences du ciblage des canaux calciques de type L dans la progression, la dissémination métastatique et la résistance thérapeutique du mélanome, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas d’appréhender l’impact des antagonistes calciques sur le fonctionnement des différents types cellulaires qui composent le microenvironnement tumoral et leurs interactions avec les cellules tumorales.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, les souris « sauvages » seront commandées chez un fournisseur agréé afin de ne pas générer d’animaux surnuméraires. . L'utilisation d'un logiciel d'analyse de puissance et de tests statistiques appropriés nous a permis de réduire au minimum la taille des groupes permettant de démontrer une différence statistique.

Raffinement

Un effort de raffinement sera réalisé en utilisant préférentiellement des femelles de façon à limiter les risques de blessures consécutives aux agressions entre congénères. Pour réduire l'angoisse des animaux, nous hébergerons 6 souris/cage dans des conditions enrichies d’élevage (igloo en polycarbonate et une tigette en papier irradié pour permettre la nidification). Dans les différentes procédures, le suivi pondéral régulier des souris sera un bon indicateur de leur état général. Dans le cas d’injections intrapéritonéales répétées, nous effectuerons une rotation des sites d’injection et surveillerons quotidiennement l’aspect des sites d’injection. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (au moins 3 fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure. Enfin, lorsque ce sera possible, nous aurons recours à l'utilisation de techniques d'imagerie non invasive pour suivre l'évolution de la tumeur, afin de prendre en compte et soulager au plus tôt toute douleur manifestée par les animaux. Lors des acquisitions d'images, les souris seront anesthésiées et placées sur un plateau chauffant de façon à éviter l'hypothermie

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser la souris car la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 semaines pour une période de 8 semaines, certaines expériences pouvant aller à 90 jours de traitement. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée.

Une activité préclinique de service, menée sur des composés thérapeutiques pour le compte de tiers : 2 160 rats vont être utilisés dans ce cadre, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un virus est injecté dans leur cerveau pour détruire les neurones dopaminergiques, en une heure, avant des traitements administrés sur un à deux mois, des prélèvements sanguins et des mesures du comportement moteur pouvant durer trois heures, deux à quatre fois. Le porteur liste les atteintes possibles selon la voie d'administration, fausse route et irritation des muqueuses nasales, réactions cutanées, douleurs postopératoires de deux jours en moyenne, hémorragie ou infection au site opératoire. Leurs cerveaux sont prélevés après la mise à mort, et le porteur annonce qu'un modèle animal reproduisant toutes les caractéristiques motrices et cognitives de la maladie reste l'objectif à terme de cette prestation.

Objectifs

La maladie de Parkinson se définit par un dysfonctionnement du système nerveux central et périphérique. La maladie de Parkinson touche un nombre important de personnes dans le monde. L'origine de cette maladie est encore mal comprise et les traitements actuels visant à soulager les symptômes ne sont pas optimaux. Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel.Pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques, nous proposons la réalisation de modèles rongeur de la maladie de Parkinson qui permettent d’en reproduire les symptômes, afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements et de comprendre leurs mécanismes d’action.

Bénéfices attendus

Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensables avant les essais chez l’homme. Le bénéfice attendu est l’identification de nouveaux outils thérapeutiques.

Procédures

Les animaux vont subir une injection intracérébrale (1 heure), une administration de traitement dans le corps (1 à 2 mois/1 min) ou une chirurgie (1 chirurgie/30 min), des prélèvements de sang (1 à 4 fois/5 min) et des mesures du comportement moteur (2 à 4 fois/3 heures).

Impact sur les animaux

Les nuisances possibles pour chaque méthode d'administration sont : Per os : il existe un risque faible de fausse route, ce qui peut entraîner des problèmes respiratoires passagers et un risque faible d’irritation à la suite de gavages répétés. SC et IP : l'injection peut causer une douleur ou une irritation locale au niveau du site d'injection. Intranasal : elle peut provoquer une irritation des muqueuses nasales de l'animal, entraînant un inconfort temporaire. Intradermique : certains animaux peuvent développer des réactions cutanées locales. L’administration du traitement par injection stéréotaxique ou intrathécale pourra entrainer des douleurs postopératoires qui devraient durer 2 jours en moyenne. La chirurgie entraine également un léger risque d’hémorragie ou d’infection au niveau du site opératoire.

Devenir

A l’issu de la procédure, les animaux seront mis à mort et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques.

Remplacement

Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité préclinique de service. Ce projet recourt à l’utilisation de rats pour plusieurs raisons éthiques : - L’utilisation d’approches neurobiologiques invasives ne peut être faite chez l’homme ce qui rend ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf pour les études invasives). -Dans le cadre des modèles de maladie neurodégénérative, l’objectif à terme est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (motrice, cognitive) de ces affections. Aucun modèle in vitro ne permet l’étude de telles fonctions. De ce fait, le recours à l’animal pour étudier les manifestations comportementales de la maladie et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques. Une analyse de puissance a été effectuée, permettant de réduire le nombre maximum d'animaux par groupe à 12, pour des résultats statistiques exploitables. Pour chaque animal, un grand nombre de prélèvements post mortem sera réalisé pour maximiser l’utilisation qui peut être faite : les différentes structures cérébrales, la moelle, le liquide céphalorachidien, le sang et les organes. L’utilisation des mâles et des femelles nous permettra de porter une attention particulière au R de réduire dans la règle des 3R.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (2 par cage) et ils bénéficieront d’un enrichissement de leur milieu (tunnel, bâton de bois à ronger). Le confort de l’animal sera pris en compte à tout moment. Leur surveillance est assurée par un suivi visuel journalier (weekend et jours fériés inclus) et une pesée hebdomadaire. Le constat de signes de souffrance entraine une surveillance accrue, avec enregistrement sous forme de fiche de suivi spécifique avec les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc.) et l’évolution des signes. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie avec administration d'un analgésique et d'un anesthésique local permettant de réduire la douleur des animaux. Le lendemain de la chirurgie, les animaux reçoivent une injection d'un analgésique. Un suivi post opératoire spécifique de 3 jours est mis en place. Le bien être est scoré via l’observation de différents critères de bien-être. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, des traitements vétérinaires si nécessaire. Les procédures sont réalisées par un personnel compétent.

Choix des espèces

Le rat est un excellent modèle pour les maladies humaines, car son système nerveux est proche de celui de l’homme. Ce modèle a un intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point de traitements thérapeutiques. De plus la dégénérescence dopaminergique par l’injection de virus est bien établie dans notre équipe et les travaux sur le rat sont largement décrits dans les études des maladies neurodégénératives. La maladie de Parkinson apparait préférentiellement à l’âge adulte, les animaux seront donc utilisés à partir de 5 semaines d’âge.

Des souris immunodéficientes reçoivent des injections de composés qui tuent les cellules de leur foie, puis une greffe de cellules hépatiques humaines ou d'implants, avec un risque d'hémorragie accru quand l'injection passe par la veine porte. 7950 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, où des candidats médicaments contre des infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques sont administrés par voie respiratoire, orale ou injectable. Le porteur indique que l'humanisation n'aboutit que dans environ 50 % des cas, écrit que le nombre de souris par étude sera "réduit au maximum", et précise que le total a été fixé en anticipant une croissance chaque année, "en accord avec le plan commercial". 200 souris pourront être réutilisées dans d'autres projets de l'établissement, dont un projet de formation interne aux gestes techniques, les autres étant tuées parce qu'elles ne recouvreront pas leur état de santé, selon le porteur.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d'insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Les cellules hépatiques humaines pourront ensuite par exemple être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de recréer, dans la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. De plus les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente pourront également être exploitées pour l’étude de l'insuffisance hépatique.

Procédures

1 ou plusieurs injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection SC d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie respiratoire, orale ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole d’étude et sera contrôlée par un vétérinaire.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant l’injection d’hépatocytes via la veine porte, le risque hémorragique accru pour l’injection d’hépatocytes via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le MESRI dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.

Réduction

Un total de 7950 souris seront utilisées, couvrant une période 5 ans et permettant de réaliser par exemple 78 études précliniques de 50 souris sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série et sur base des données historiques collectées par l’entreprise. De plus, 150 souris seront utilisées dans le cadre de l’implantation du patch correspondant à une étude pilote de 5 souris et une première étude de 145 souris pour la mise en place du modèle d’insuffisance hépatique et l’évaluation de l’efficacité du patch. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes (PE1)) et donc l’utilisation de moins d’animaux.

Raffinement

En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, les fréquences sont limitées et définies dans le protocole d’étude. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.

Choix des espèces

90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. De plus, la souche immunodéficiente présente une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.

Un prélèvement sanguin de grand volume par piqûre dans le cœur, sous anesthésie sans réveil et pouvant provoquer un arrêt cardiaque, attend chaque souris en fin d'expérience. 1 440 souris CD-1 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et environ 288 d'entre elles, écartées du protocole faute d'un poids suffisant ou à cause d'un problème à l'injection, sont d'abord utilisées pour l'entraînement à des gestes techniques avant d'être tuées. Les autres reçoivent une injection dans la veine de la queue puis quatre prélèvements de sang par éraflure de cette même veine, sur vingt-huit jours, pour mesurer la tolérance de candidats médicaments anticancéreux. Le porteur affirme qu'un "organisme entier" et vivant est "nécessaire" et qu'"aucune alternative" ne peut se substituer à la souris.

Objectifs

Ce projet vise à déterminer la tolérance lors de l’administration des candidats de thérapie ciblée anticancéreuse. Les données de tolérance sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine en dose unique. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de tolérance (projet actuel), seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, à définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Ils permettront également d’objectiver des évènements indésirables. La première dose de cette étude sera déterminée en se basant sur une dose de référence connue, efficace et bien tolérée.

Bénéfices attendus

Les données de tolérance seront nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et ainsi, à terme, de déterminer les doses et les fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.

Procédures

# Une contention et des prélèvement(s) sur animal vigile seront prévues sur chaque animal : -lors de l’injection par voie intraveineuse dans le veine de la queue des candidats anticancéreux J(0) (5minutes) -lors de chacun des prélèvements sanguins (en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3), J(0), J(3) et J(9) post-traitement - 5 minutes). Une anesthésie générale sans réveil sera effectuée sur chaque animal en fin d’expérimentation et/ou atteignant les critères éthiques pour effectuer un prélevement sanguin final de grand volume, suivie d’une mise à mort (10 minutes).

Impact sur les animaux

Projet en sévérité modérée: # Les animaux subirons un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) anesthésies. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de l’injection par voie intraveineuse des candidats anticancéreux (au temps J(0)), et (2) de chacun des prélèvements sanguins (en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3), J(0), J(3) et J(9) post-traitement). Ces prélèvements faibles sont généralement très bien tolérés par l'animal. # S’agissant d’une expérience de tolérance, les composés de la classe thérapeutique utilisée peuvent induire des évènements indésirables à haute dose (parmi les plus attendus : perte d’appétit, fatigue, diarrhées, perte de poils…). Il est à noter que ces effets sont généralement transitoires (environ une semaine pour les doses les plus fortes et culminant autour du 3ème jour post-traitement). Il est à noter que ces études ne sont pas conditionnées à une atteinte de la dose maximale tolérée chez l'animal et que la dose maximale de cette étude est plafonnée à une dose considérée comme bien tolérée en clinique pour cette classe de médicaments. # Un prélevement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil sur l’ensemble des animaux arrivant en fin d’expérience (à 28 jours post-traitement) ou en cas d'atteinte des critères éthiques.

Devenir

# Tous les animaux ayant atteint les critères éthiques ainsi que les animaux arrivant en fin d’expérience à 28 jours post-traitement auront un prélèvement sanguin de grand volume (par piqure dans le coeur) effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil. # Les animaux non entrées en protocole (problème à l'injection, poids inférieur à 24g... env 20%), seront réutilisées pour pouvoir pratiquer des entrainement aux geste techniques, puis mises à mort selon les critères de la formation sous controle de la SBEA et/ou controle vétérinaire.

Remplacement

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.

Réduction

Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus seront également mieux maîtrisées. En cas d’obtention de la dose maximum tolérée, les animaux prévus pour les doses suivantes seront annulés. Les animaux étant livrés chaque semaine pour les différents tests de dose, cela permettra de diminuer le nombre d’animaux entrés en protocole. Pas d’utilisation de groupe contrôle nécessaire par rapport aux échantillonnages de par l’utilisation d’un prélèvement sur les souris en expérience à J(-3) avant traitement par les candidats anticancéreux (permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux).

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Chaque essai de dose sera séparé du précédent d’une semaine, ce qui permettra d’ajuster au mieux les doses (ainsi que la souffrance résultant d’utilisation de doses trop élevées). Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et d’éviter au mieux toute souffrance animale. Les animaux seront observés sur critères physiques et comportementaux deux fois par jour pendant les trois premiers jours de traitement, puis une fois par jour jusqu’à la fin de l’expérience à J(28), et seront pesés une fois par jour pendant la première semaine, puis trois fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience à J(28). Un système de surveillance est mis en place au sein de l'établissement utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score n'atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement...). Une pommade antalgique/anesthésique pourra également être utilisée en cas d’inflammation au site d’injection. Le prélèvement sanguin final de grand volume sera effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil et la mise à mort de l'animal sera assurée par surdose d'anesthesiques. Les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.

Choix des espèces

S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris, aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études. En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de pharmacocinétique (le devenir du médicament dans le sang au cours du temps) seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux les doses et les fréquences d'administration de ces candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse chez l'Homme. Les animaux seront livrés à 7 semaines de développement et inclus en expérience à 8 semaines . A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une tolérance pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.

Des souris génétiquement modifiées pour ne plus exprimer certaines molécules du réseau lymphatique, mais aussi des nouveau-nés, des femelles gestantes et des embryons : 520 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les nouveau-nés de cinq à onze jours subissent deux gavages et une biopsie de la queue, les adultes jusqu'à cinq prélèvements sanguins, deux injections et un prélèvement de lymphe sous anesthésie. Le porteur indique que l'immunisation peut provoquer une ulcération au site d'injection et une perte de mobilité des membres inférieurs, et que les transports entre sites partenaires ajoutent du stress. Toutes sont mises à mort en fin de projet pour analyse post-mortem, le porteur affirmant que la culture cellulaire ne reproduit pas ces mécanismes de façon juste.

Objectifs

Les cellules immunitaires, comme les lymphocytes B ou T, circulent à travers des ganglions lymphatiques afin d’y rencontrer des pathogènes provoquant une réponse immune. Les pathogènes sont amenés par le réseau lymphatique dans les ganglions. Un lien entre la fonction du réseau lymphatique et la taille et la structure du ganglion lymphatique a été suspecté mais jamais démontré. Ce projet vise à mieux comprendre cette relation en utilisant des modèles de souris présentant des défaillances dans le réseau lymphatique tissulaire et en analysant les conséquences sur le ganglion lymphatique et la réponse immunitaire. D’ores et déjà, nous savons que l’engagement du récepteur RANK exprimé par les cellules endothéliales lymphatiques par son ligand RANKL est nécessaire pour le développement du ganglion lymphatique. Le projet est un projet multi-sites.

Bénéfices attendus

Ces résultats apporteront à court terme des données importantes sur la régulation et le développement du système immunitaire. Etant donné qu’une thérapie visant une des molécules étudiée est actuellement utilisé en thérapie contre l’ostéoporose, ces résultats auront des retombées à moyen terme sur une nouvelle application dans des maladies impliquant le système immunitaire comme l’autoimmunité, l’infection ou le cancer.

Procédures

Des souris nouveau-nés seront soumises à 2 gavages (durée moins d’une minute). Le gavage permet une meilleure prise du traitement et est moins douloureux qu’une injection. Les souris adultes seront soumises selon les groupes à 5 prélèvements de sang d’une durée inférieure à 1 minute, à deux injections d’une durée inférieure à 1 minute sur animal anesthésié et à un prélèvement de lymphe (durée 2 minutes) sur animal anesthésié au site où la lymphe est la plus accessible. Les délais entre les prises de sang sont au minimum de 7 jours. Les nouveau-nés (entre jour 5 et jour 11 après naissance) seront soumis à une biopsie de queue (inf à 1mm) pour déterminer une mutation génétique (durée inférieure à 1 minute). Des souris gestantes recevront une injection (durée moins d’une minute).

Impact sur les animaux

Le gavage, l’injection des produits (par exemple l’anesthésie) et le prélèvement sanguin sous maxillaire nécessite une contention qui est source d’inconfort et de stress pour l’animal pendant quelques secondes. L’immunisation des souris pourrait conduire bien que très rarement à une ulcération au site d’injection et à une perte de mobilité des membres inférieurs. Le transport entre les sites partenaires et les procédures effectuées pourront générer un stress. Les procédures peuvent également induire une perte de poids, ainsi qu’un changement de comportement avec risque d’essoufflement pour certains lots. Des ulcérations et des raideurs de la patte peuvent advenir.

Devenir

Mise à mort de toutes les animaux à la fin du projet pour analyse post-mortem

Remplacement

Il n’est pas possible de remplacer les animaux car les mécanismes cellulaires et moléculaires régulant le système lymphatique et la réponse immunitaires dans les ganglions lymphatiques ne peuvent pas, à l’heure actuelle, être reproduits de manière reproductible et juste par des expériences en culture cellulaire.

Réduction

Les sites d’injections ont été choisis de manière à pouvoir diminuer la variabilité inter-expérimentale, car elles ciblent de façon quasi exclusive les ganglions lymphatiques précisément identifiés. Le nombre d'animaux par groupe a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupe dans une animalerie agrée avec un statut sanitaire contrôlé. Elles sont hébergées dans des cages enrichies par fratrie tout en respectant le nombre de souris admises. Si un animal devient agressif, il est aussitôt séparé du groupe. Les souris sont observées quotidiennement par un personnel expérimenté avec une mise en place de points limites évalués à l’aide d’une grille d’observation de critères définis. Des actions prévenant une possible douleur, stress ou inconfort sont entrepris (tapis chauffant, gavages avec des canules adaptées, anesthésie, antidouleur, apport de nourriture humidifiée). En cas ou le point limite est atteint l’animal est mis à mort. Le transport des souris entre les sites s’effectue par un professionnel agrée. A l’arrivée les souris sont pris en charge par un personnel expérimenté pendant la quarantaine d’une semaine avant le transfert en zone de maintenance. Les animaux seront acclimatés à la nouvelle structure au minimum 2 semaines avant le début de la procédure.

Choix des espèces

Le modèle murin a été choisi pour réaliser les expériences de ce projet. La structure du ganglion lymphatique, la circulation sanguine et le drainage de la lymphe sont identiques entre l’homme et la souris. La souris Mus musculus étant de mieux en mieux connue du point de vue génétique, est un très bon modèle d’étude pour nos travaux. De plus, des modèles de souris génétiquement modifiées invalidées pour l'expression des molécules d’intérêt existent et leur utilisation permet d'aborder directement le rôle des protéines d'intérêts dans la formation du réseau lymphatique. La mesure de la réponse immunitaire utilise des moyens techniques qui n’existent que chez la souris. Toutes modifications génétiques ont été introduites chez la souris. Les souris seront étudiées à un âge où le système immunitaire est mature (à partir de 4 semaines). Des embryons et des nouveau-nés ont également été choisis, puisque le développement du réseau et des ganglions lymphatiques commence pendant l’embryogenèse.