Rongeurs

Enfermés seuls deux heures par jour pendant une semaine, le temps d'avaler un repas à base de viande, 180 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Sous anesthésie, deux prélèvements de sang sont faits dans la veine porte et dans l'artère abdominale, avec les contenus digestifs, avant la mise à mort. Le projet cherche à identifier les peptides libérés par la digestion des protéines à deux âges, et le porteur revendique par là une contribution au remplacement, les données devant servir à valider un modèle de digestion in vitro. Le rat est retenu pour son espérance de vie de vingt-quatre mois, deux groupes étant comparés à six et à dix-huit mois.

Objectifs

La digestibilité, mais surtout la vitesse de digestion, sont des déterminants importants dans l’optimisation de l’apport protéique chez les populations cibles telles que les seniors ou les malades chroniques. En plus de son rôle de fournir des acides aminés à l’organisme, la digestion des protéines alimentaires conduit également à la libération de peptides. Ces peptides sont l’objet de nombreuses études en raison de leur importance dans le déterminisme de l’effet santé des aliments. En effet, le peptidome, défini comme l’ensemble des peptides issus de la digestion des protéines, varie quantitativement et qualitativement tout au long du tractus digestif. Ce peptidome contient des peptides potentiellement bioactifs à propriétés antioxydantes, antihypertensives, ou encore anti-diabétiques. La question de l’altération des fonctions digestives au cours du vieillissement est clairement posée concernant la digestibilité des protéines alimentaires, mais son impact sur le peptidome biologiquement actif reste non exploré, ainsi que son rôle dans l’altération de certaines fonctions du tractus digestif ou organes périphériques. Une des raisons de ce peu d’information sur l’impact du vieillissement du tractus digestif sur la composition du peptidome est qu’il faut faire face à un verrou méthodologique qui est l’identification par spectrométrie de masse des peptides issus de la digestion, dans un milieu complexe, appelée peptidomique ou digestomique. Par ailleurs, des questions se posent également concernant les modèles pertinents pour étudier la digestion des protéines alimentaires et la libération des peptides, i.e. in vivo sur digestats à différents niveaux du tractus digestif ou in vitro sur digesteur artificiel.

Bénéfices attendus

A court terme, les prélèvements de contenus digestifs d’aliments marqués permettront de travailler sur la mise au point d’une méthode d’identification des peptides issus de la digestion, sans ambigüité avec les peptides endogènes. Ce point est un verrou méthodologique très important limitant grandement les études sur la digestion des aliments protéinés. A moyen terme, ce projet permettra d’obtenir des données physiologiques objectives sur le vieillissement de la fonction digestive ; il s’agit là d’un véritable verrou de connaissance pour lequel il y a très peu d’éléments de bibliographie. Lever ce verrou permettra d’approfondir les recherches sur les difficultés d’adaptation au cours du vieillissement des organismes à leur environnement ; des défauts d’adaptation pouvant potentiellement conduire à des dysfonctionnements métaboliques et fonctionnels des organes. Le long du tractus digestif, une altération et/ou diminution de l’efficacité de la digestion des aliments affecte la dégradation des aliments en nutriments, leur biodisponibilité et leur devenir métabolique. En conséquence, une moindre biodisponibilité en nutriments est un des éléments potentiellement explicatifs du développement de la malnutrition des séniors et augmenterait le risque de développement de pathologies associées au vieillissement. Il est en effet aujourd’hui admis que le besoin en acides aminés d’origine alimentaire est augmenté lors du vieillissement, et que l’apport en protéines alimentaires doit être supérieur à celui d’individus adultes plus jeunes. Les raisons sont multiples, et notamment d’origine métabolique, mais une altération de la digestion des protéines et de sa vitesse a été évoquée pour expliquer cela. In fine, la combinaison des résultats obtenus avec ceux obtenus in vitro en utilisant le protocole standardisé de digestion in vitro permettra à plus long terme de valider cette approche pour l’étude de la digestion chez l’âgé, et permettrait à l’avenir de s’affranchir de modèles in vivo sur animaux. Par ce biais, ce projet participe à apporter des éléments à un des piliers des 3R, le Remplacement.

Procédures

Les animaux seront hébergés en cages individuelles, 2h par jour pendant une semaine, le temps de manger un repas à base de viande. En fin d'expérimentation, après un repas ils subiront sous anesthésie et analgésie 2 prélèvements de sang (en veine porte et en artère abdominale) et de contenus digestifs. Après les prélèvements qui dureront moins de 10 minutes, les animaux seront euthanasiés.

Impact sur les animaux

Les procédures nécessitent de contrôler la consommation alimentaire des animaux et requiert donc une mise en cage individuelle des animaux pour le temps du repas. Celle-ci sera faite 10-12 jours avant le protocole expérimental afin d’acclimater les animaux.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure afin de procéder à des prélèvements de tissus et organes pour des analyses.

Remplacement

Le seul modèle de digestion in vitro repose seulement sur des recommandations sur des paramètres physiologiques (pH, concentration en enzymes, durée de vidange des compartiments digestifs) moyennés selon les informations issues de la bibliographie. Comme le mentionnent les auteurs eux-mêmes, des études sont nécessaires pour valider ce modèle in vitro chez le sénior et s’assurer que les adaptations du protocole de digestion in vitro sont bien représentatives de la physiologie digestive au cours du vieillissement. Il y a donc un réel besoin de données objectives quant à la physiologie digestive au cours du vieillissement afin de pouvoir valider le modèle in vitro et ainsi proposer une alternative fiable aux modèles animaux. Néanmoins, si nos résultats de tests de comparaison entre les données in vivo et in vitro sont concluants, nous pourrons utiliser, lors d’étude ultérieures, les modèles in vitro pour étudier la génération de peptides lors de la digestion chez les adultes jeunes et âgés, au moins lors des étapes de screening lors d’étude ultérieures.

Réduction

La mise en œuvre de la première procédure pour étudier la faisabilité de plusieurs conditions a été conçue pour réduire au maximum les effectifs de la seconde procédure, et notamment limiter les conditions Témoin (i.e repas sans protéines), si les résultats de marquage des protéines permettent de distinguer les peptides alimentaires des peptides endogènes, et donc permettent de s’affranchir du groupe ‘Témoin’.

Raffinement

A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés à 2 par cage pour une période de deux semaines correspondant à la période d’habituation et d’acclimatation à l’animalerie. Les animaux seront hébergés dans des conditions standard d’animalerie conventionnelle, dans des cages de taille conforme à la réglementation (1800 cm3) et transparentes afin que les animaux puissent se voir et positionnées proches les unes des autres afin que les animaux puissent s’entendre et se sentir. Les animaux bénéficieront d'enrichissement de leur environnement : ils auront dans leurs cages des objets en inox : balles et tunnels en alternance pour continuer à susciter de l'intérêt Les animaux seront pesés 2 fois par semaine et observés quotidiennement, y compris le week-end et les jours fériés, par des animaliers expérimentés.

Choix des espèces

L’étude porte sur les modifications de la fonction digestive au cours du vieillissement. Pour cela, deux populations de rats seront comparées, âgées de 6 et de 18 mois.Les animaux seront des rats Wistar âgés de 6 mois (jeunes) et 18 mois (âgés). Le rat est un animal de référence dans les études sur le vieillissement de par son espérance de vie de 24 mois.

Dépourvues de système immunitaire pour que les greffons humains ne soient pas rejetés, 600 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un carré de peau de 20 mm de côté leur est retiré sur toute l'épaisseur au milieu du dos, un substitut cutané est suturé dans la plaie, et les pansements sont changés deux fois par semaine sous anesthésie générale. Le porteur attribue un stress à l'isolement en cage individuelle pendant trois à quatre semaines, isolement qu'il impose pour éviter que les souris ne s'arrachent entre elles les greffons. Elles sont tuées par groupes de six, quinze, trente, soixante, quatre-vingt-dix et cent vingt jours après la greffe, pour prélever la peau autour de la zone greffée.

Objectifs

L’objectif de notre projet est d’évaluer la fonctionnalité de différents substituts cutanés afin de sélectionner les formulations qui permettront de favoriser la régénération du tissu cutané, la revascularisation et la repigmentation au cours du temps après réalisation d’une greffe cutanée. Ce projet est la suite de projets précédemment autorisés au cours desquels nous avons évalué les premiers substituts cutanés sur 3 modèles de plaie cutanée différents. Les substituts cutanés sont obtenus à l’aide de la première machine automatisée au monde à produire des greffes de tissu cutané personnalisées pour les adultes et les enfants présentant des lésions cutanées graves, telles que des brûlures profondes. Ce processus innovant implique la croissance d’une nouvelle peau en utilisant les propres tissus de l’organisme comme modèle. Ces substituts cutanés, produits à partir de prélèvements de peau de différents donneurs (enfant, adulte, homme, femme, peau claire, peau sombre), et sélectionnés sur la base de résultats d’analyses préalables, seront greffés sur des souris immunodéficientes afin d’éviter le rejet des greffes, après induction d’une plaie cutanée sur toute l’épaisseur de la peau. Les nouveaux substituts cutanés seront préparés à partir de cellules de peau jeunes, moyennement âgées et très âgées, avec une seule ou plusieurs couches de cellules, et comprenant ou non des cellules pigmentées. Des prélèvements seront effectués à différents temps après réalisation des greffes de substituts cutanés afin d’étudier la fonctionnalité des différents substituts cutanés greffés, les interactions se mettant progressivement en place entre les substituts cutanés et l’environnement de l’hôte, le développement d’un réseau vasculaire, la régénération du tissu cutané à partir du greffon lors de la cicatrisation, et la repigmentation du tissu cutané régénéré. Un ensemble d’analyses seront effectués sur les prélèvements cutanés collectés et permettront de caractériser au cours du temps la fonctionnalité des substituts cutanés, d’appréhender les interactions se mettant progressivement en place au cours du temps entre les substituts cutanés et l’hôte, et de suivre l’évolution des substituts cutanés au cours du temps. Les résultats obtenus permettront de déterminer les paramètres optimaux pour obtenir le substitut cutané idéal en fonction de chaque donneur.

Bénéfices attendus

Les substituts cutanés sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les auto-transplantations (donneur et receveur sont la même personne) sont les greffes de première intention pour la couverture des plaies, elles se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limité de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Des greffes de tissu "étranger" peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau, avant de laisser la place à une auto-transplantation. Subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. La technologie utilisée pour produire les substituts cutanés que nous allons évaluer va permettre de révolutionner les traitements actuellement disponibles pour les lésions cutanées les plus sévères et plus particulièrement les grandes brûlures. Il s’agit d’un processus innovant impliquant la croissance d’une nouvelle peau en utilisant les propres tissus de l’organisme comme modèle, évitant ainsi toute forme de rejet de cette auto-transplantation, et permettant de produire une surface de nouvelle peau très importante. Il est donc important de tester ces nouveaux substituts cutanés sur des modèles de plaies simples et chroniques représentatifs chez l’animal qui pourront être utilisés par la suite chez l’Homme et ainsi permettre d’améliorer la cicatrisation de grandes brûlures et de larges plaies cutanées.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation d’une greffe de substitut cutané. Sous anesthésie générale, un prélèvement de peau carré de 20 mm de côté sur toute l’épaisseur de la peau sera effectué au milieu du dos et en arrière des omoplates sur l’ensemble des souris. Un substitut cutané sera placé dans le lit de la plaie cutanée et suturé en plusieurs points indépendants. Un traitement analgésique des souris sera administré avant la chirurgie puis après la fin de celle-ci. La chirurgie sera réalisée en 25 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes de substitut cutané seront protégées par des compresse et pansement changés 2 fois par semaine, sous anesthésie générale pendant 10 minutes environ, permettant d’effectuer des observations et de scorer différents paramètres au niveau des greffes cutanés. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations, week-ends et jours fériés inclus. Un maintien des souris greffées en cage individuelle sera nécessaire pendant 3 à 4 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les compresse et pansement et surtout le greffon cutané. Après régénération tissulaire et cicatrisation complètes, 3 à 4 semaines maximum après réalisation des greffes cutanées, les souris seront replacées à 2 par cage jusqu’à la fin des expérimentations.

Impact sur les animaux

L’induction d’une plaie cutanée pour la réalisation de la greffe cutanée va engendrer une douleur modérée transitoire pendant quelques heures. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées, nécessaire tout au long du processus cicatriciel et de régénération tissulaire, soit pendant 3 à 4 semaines maximum, pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon cutané, et l’ensemble compresse, pansement et bandes de sparadrap, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 600 souris seront euthanasiées à différents temps après réalisation de la greffe cutanée, 15, 30, 60, 90 et 120 jours après, avec 6 souris, 3 souris mâles et 3 souris femelles, par temps de prélèvement. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la région greffée pour réaliser un ensemble d’analyses permettant de caractériser sur des temps précoces et prolongés la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation…).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité et l’évolution de substituts cutanés greffés, processus dépendants de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, mise en place de la vascularisation …). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous ne grefferons que des substituts cutanés sélectionnés sur la base de résultats d’analyses préalables. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ainsi, 6 souris par temps de prélèvements, 3 souris mâles et 3 souris femelles, seront suffisants. Ce nombre a été déterminé sur la base des résultats des études précédentes obtenus sur différents modèles de greffe cutanée et suivant les mêmes conditions expérimentales. La réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permettra également de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe cutanée (traitement pour supprimer la douleur avant la chirurgie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (traitement pour supprimer la douleur après la chirurgie et observations régulières). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine à chaque renouvellement de pansement, et si une perte de poids trop importante par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques. Les animaux seront placés dans des conditions permettant d’observer leur comportement pendant leur phase d’activité et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie). Des bâtonnets de coton seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies à traiter chez l’Homme, et la souche de souris utilisée est dépourvue de système immunitaire, permettant d’éviter les risques de rejet suite à une greffe de peau d’un organisme étranger. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6-7 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7-8 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune recevant une greffe de cellules tumorales puis jusqu'à seize injections de traitement en deux mois. Elles sont anesthésiées pour être placées dans le dispositif qui irradie la tumeur, et toutes sont tuées pour que tumeurs et tissus soient analysés. L'objectif immédiat est de trouver la dose d'un antiviral, le brincidofovir, qui ralentit la tumeur sans l'éliminer, une dose pleinement efficace empêchant de mesurer l'effet de l'association avec la radiothérapie. Le porteur annonce un "changement radical" dans l'administration des radiosensibilisants. La baisse d'appétit, la réduction d'activité et les modifications du comportement social, elles, sont attendues dès la croissance des tumeurs.

Objectifs

Nous prévoyons d'étudier un agent antiviral, pour lequel des études précliniques ont montré qu'il possède des propriétés anti-tumorales et radio-sensibilisantes. L'immunothérapie est devenue un pilier du traitement du cancer, mais son utilisation en association avec la radiothérapie reste limitée. Le projet actuel vise à explorer la synergie potentielle entre ce médicament anti-viral et l'immuno-radiothérapie. Cela pourrait ouvrir la voie à de nouvelles combinaisons thérapeutiques et conduire à un changement radical dans l’administration concomitante de radio-sensibilisants, qui sont restés depuis des décennies bloqués sur des agents relativement anciens et parfois toxiques tels que les dérivés du platine, générant un gain thérapeutique relativement faible (gains de survie souvent de l’ordre de 5 à 10 % par rapport à la radiothérapie seule). Les objectifs de ce projet consistent à : 1-determiner dans un premier temps la dose de médicament permettant d’obtenir un ralentissement de la croissance tumorale sans toutefois induire une élimination totale de la tumeur. Il est à noter qu’il n’y a aucun intérêt à combiner une dose élevée et très efficace de médicament (permettant une élimination totale de la tumeur) avec la radiothérapie, car ceci empêcherait de voir l’effet de la combinaison. De plus, utiliser une très forte dose de médicament pourrait induire des effets secondaires, 2-ensuite, combiner le médicament avec la radiothérapie et l’immunothérapie afin d’évaluer l’effet anti-tumoral de la combinaison, 3-Enfin, comprendre les mécanismes biologiques impliqués en collectant les tumeurs pour réaliser des analyses de cytométrie de flux.

Bénéfices attendus

A travers ce projet, nous visons à minimiser les limitations des thérapies utlisées seules, à améliorer les résultats thérapeutiques et à augmenter la réponse globale des tumeurs en modulant les réactions immunitaires dans le microenvironnement tumoral. Cette stratégie de traitement à multiples facettes non seulement promet d'améliorer les résultats thérapeutiques actuels mais pourrait également nous conduire à développer de nouvelles stratégies de traitement antitumoral plus efficaces. Avec une conception expérimentale et une analyse des données approfondies, ce projet espère fournir une base solide et de nouvelles perspectives pour optimiser les traitements cliniques futurs tout en réduisant les effets secondaires des thérapies en question.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections de cellules tumorales (n=1, 25 secondes) et à des injections de traitements (au maximum 16 injections sur deux mois, durée 25 secondes), sous anesthésie locale. Les animaux vont recevoir une anesthésie générale afin de les placer dans les dispositifs qui permettent la réalisation des irradiations localisées au niveau des tumeurs (n=1, durée 12 minutes en tout).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent subir un stress léger en raison de leur manipulation par l'expérimentateur, lors des procédures expérimentales (telles que les injections, etc.). Les animaux peuvent également ressentir douleur et inconfort légers à modérés lors des injections sous-cutanées pour l'implantation des tumeurs, les traitements de radiothérapie ou les traitements pharmacologiques. En raison de la croissance des tumeurs ou des effets secondaires des traitements, les animaux peuvent présenter des changements de comportement modérés, tels qu'une diminution de l'appétit, une réduction de l'activité ou des modifications du comportement social.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour études sur les tumeurs et tissus post-mortem.

Remplacement

Ce projet a pour but d’évaluer l'effet thérapeutique d'un agent antiviral, le brincidofovir, combinés à la radiothérapie et à des immuno-modulateurs sur la réponse tumorale. Ceci exige donc un système immunitaire dynamique complet (composé de toutes les cellules immunitaires) en interaction direct avec le stroma tumoral. L’étude du recrutement et de la réponse des cellules immunitaires dans la tumeur ainsi que leur interaction complexe nécessite le recours à un modèle animal vivant entier et ne peut pas être réalisé in vitro ni in silico.

Réduction

Afin de pouvoir observer des différences qui soient statistiquement interprétables entre les différents groupes de traitements, nous avons besoin d’utiliser des tests statistiques solides et adéquats. Ces tests exigent l’utilisation d’un nombre minimum d’animaux par groupe. Afin de réduire au minimum le nombre d’animaux à utiliser nous permettant d’atteindre les objectifs du projet, nous avons réalisé une analyse statistique a priori, afin de calculer le nombre d’animaux nécessaires pour détecter des différences significatives pour chaque procédure expérimentale. De plus, notre expertise dans le domaine de la radiobiologie ainsi que les données de la littérature nous permettent de réduire les conditions expérimentales et donc réduire le nombre d’animaux. Le critère de jugement principal pour le calcul de puissance est la taille tumorale . Ce critère est aussi utilisé pour la randomisation des animaux. La randomisation est réalisée de façon à avoir la même moyenne taille tumorale dans chaque groupe de traitement. Ce plan d'étude et cette méthodologie stricts vont nous permettre d'avoir des résultats fiables et valides sur le nombre minimum d'animaux nécessaires.

Raffinement

Toutes les manipulations expérimentales seront menées en veillant à adhérer aux normes les plus élevées pour minimiser la douleur et le stress chez les animaux. Une anesthésie adéquate sera utilisée pendant les expériences. Les conditions d'hébergement des animaux seront optimisées, en fournissant l'environnement et la nourriture nécessaire. Leur environnement sera enrichi avec du coton ou des maisons en carton afin de diminuer leur angoisse. Le comportement et l'état de santé des animaux seront surveillés quotidiennement, pour identifier et traiter toute anomalie. Les souris seront élevées en groupe pour minimiser le stress de l'isolement. Une pesée sera effectuée régulièrement. Les points limite précoces définis seront strictement appliqués.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale de référence pour les études de radiobiologie et des réponses immunitaires pendant le développement tumoral. La physiologie et la génétique de la souris sont de mieux en mieux connues et de nombreuses études ont déjà validé des découvertes faites chez la souris en les appliquant pendant des essais cliniques, ce qui facilite le transfert des résultats obtenus chez la souris en clinique. Les souris seront utilisées à un âge de 8 ou 9 semaines, âge auquel les souris sont suffisamment matures.

Pour comparer la durée de la gestation entre deux lignées génétiquement modifiées, 128 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Les femelles gestantes passent deux échographies sous anesthésie gazeuse, restent isolées quatorze jours sous surveillance vidéo, puis reçoivent une injection intrapéritonéale d'anesthésique avant une ponction sanguine sous la mâchoire et l'ouverture de l'abdomen pour prélever les embryons et le liquide amniotique, juste avant leur mise à mort. Le porteur range parmi les effets attendus le stress lié à la manipulation et à l'isolement, ainsi qu'une douleur légère due aux anesthésies. Il affirme qu'aucun modèle alternatif ne permet d'étudier la durée de la gestation et ses déterminants génétiques.

Objectifs

Les anomalies de la durée de la gestation compliquent plus d’un quart des grossesses dans l’espèce humaine. La prématurité est la première cause d'évènements indésirables et de mortalité périnatales dans les premières années de vie, et de handicaps dans la petite enfance. Le dépassement du terme est associé à une incidence accrue de morts-nés et de fragilité fœtale, ainsi qu’à un taux accru d’accouchements par césarienne qui sont associés à un risque plus élevé de complications médicales chez la mère. Chez la souris, les lignées de laboratoires présentent des différences de durée de gestation qui sont génétiquement fixées. Nous utiliserons deux lignées de souris génétiquement modifiées pour étudier les différences de durée de gestation entre plusieurs lignées de souris. Ces études permettront de mieux comprendre le rôle de certains gènes dans la durée de la gestation, dans la prématurité et le dépassement de terme.

Bénéfices attendus

L’étude d’un contrôle génétique de la durée de la gestation chez la souris nous permettra de mieux connaitre les mécanismes de l'accouchement. Une meilleure connaissance de ces mécanismes pourrait permettre d’identifier des déterminants du déclenchement du travail dans l’espèce humaine, de mieux comprendre la physiologie de l’accouchement à terme et la physiologie de l’accouchement prématuré. , et éventuellement d'ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour ces pathologies de la grossesse humaine.

Procédures

Echographie sous anesthésie générale gazeuse, d'une durée de 5 mn (2 échographies pendant la gestation/ animal) Anesthésie générale par injection intrapéritonéale d'anesthésique (15 sec/souris), puis prélèvement sanguin par ponction sous-mandibulaire (

Impact sur les animaux

Stress du à la manipulation et à l’isolement. Douleur légère et stress dus à l'anesthésie gazeuse lors des échographies et aux injections intrapéritonéales d'anesthésiques.

Devenir

Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes et de sang

Remplacement

Il n’existe pas de modèle alternatif pour étudier la durée de la gestation et ses déterminants génétiques.

Réduction

L'utilisation de lignées modifiées génétiquement permet de beaucoup réduire le nombre d'animaux utilisés, par rapport à une approche par croisements entre lignées. De plus, tous les animaux des lignées seront utilisables. L'échographie permet de détecter précocément la gestation et de réduire le nombre d'animaux à utiliser. Les données de la littérature permettent de réduire le nombre d’animaux pour la comparaison des durées de gestation. Des tests statistiques seront réalisés pour analyser les données. L'étude sera réalisée en deux phases afin de valider dans un premier temps notre hypothèse sur le rôle d’une séquence d’ADN sur la durée de la gestation. La 2ème phase, qui nous permettra d’explorer en profondeur les mécanismes impliqués dans la mise-bas, ne sera nécessaire que si l'hypothèse est validée dans la première phase de l'étude.

Raffinement

Les animaux disposeront d'enrichissement. Les durées d'isolement des animaux seront réduites au maximum. L'échographie et les procédures sous anesthésie générale permettront de limiter la souffrance et le stress des animaux. La vidéo infrarouge en continu permettra également un suivi sans perturber les animaux. Des points limites ont été définis entrainant une mise à mort anticipée si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est déjà utilisée comme modèle de la gestation humaine dans plusieurs articles, notamment au moment de la parturition et pour les questions relative à l'immunologie de la gestation . Les modèles murins sont très activement utilisés par la communauté scientifique internationale pour l'étude de la prématurité ainsi qu'attesté par de nombreuses revues récentes dans la littérature. Les souris âgées de 8 semaines seront utilisées pour les croisements : souris jeunes, sexuellement matures, n'ayant encore jamais développé de gestation.

Soumises à une chirurgie d'une heure au maximum pour déclencher la formation d'un caillot dans une artère, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent jusqu'à six injections sous la peau et une injection derrière l'œil sous anesthésie, le porteur indiquant que des saignements oculaires peuvent apparaître après l'administration des antiplaquettaires et que le caillot peut migrer et provoquer un accident vasculaire cérébral chez la souris. L'objet du projet est de suivre l'évolution d'un caillot occlusif sur un jour puis sur une semaine et de tester des molécules ciblant les plaquettes. Les retombées annoncées pour les patients sont renvoyées au long terme, quand la carotide et le cerveau de chaque souris sont prélevés après sa mise à mort.

Objectifs

L’hémostase est le processus biologique assurant l’arrêt des saignements. Elle implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion du vaisseau, vont former un agrégat, appelé clou plaquettaire, qui limite le saignement. Un processus similaire intervient lors de la thrombose artérielle qui survient dans une artère malade présentant une plaque d’athérosclérose. Suite à la rupture de cette plaque, les plaquettes forment un agrégat pouvant entrainer des pathologies graves comme un accident vasculaire cérébral (AVC). Dans certains cas, l’agrégat peut boucher le vaisseau ce qui stoppe totalement la circulation sanguine. Le but de ce projet est de mieux comprendre l’évolution d’un agrégat occlusif au cours du temps, sa sensibilité à des traitements contre les plaquettes ainsi que sa potentielle évolution vers un AVC.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre l’évolution d’une thrombose occlusive ainsi que d’étudier l’impact du ciblage de différents récepteurs plaquettaires sur celle-ci. A long terme, cela nous permettra d’améliorer la prise en charge des patients présentant une thrombose artérielle occlusive et de réduire les séquelles à long terme de cette pathologie, comme l’AVC ischémique.

Procédures

Le modèle nécessite une procédure chirurgicale pour induire la thrombose, celle-ci sera de maximum 60 min. Les animaux seront soumis à des injections sous-cutanées (maximum 6) et rétro-orbitales (maximum 1) (animal anesthésié).

Impact sur les animaux

Une des complications attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Des saignements pourraient apparaitre au site d’incision ou site chirurgical. Des signes de douleur peuvent également apparaitre après l’intervention chirurgicale, notamment au niveau du site chirurgical. On pourrait observer des saignements au niveau de l’œil suite à l’administration des traitements antiplaquettaires. De plus, le thrombus pourrait emboliser et entraîner un accident vasculaire cérébral (AVC) chez la souris.

Devenir

Les souris sont mises à mort à la fin de la procédure afin de récupérer la carotide et le cerveau pour réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier l’évolution d’une thrombose occlusive au cours du temps ainsi que le rôle de différents récepteurs plaquettaires. La pathologie étudiée, la thrombose artérielle, étant un processus particulièrement complexe faisant intervenir plusieurs types cellulaires (plaquettes, globules rouges, globules blancs) ainsi que les conditions hémodynamiques (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus. De plus, nous ne disposons pas à l’heure actuelle de modèle de thrombose occlusive in vitro. Nous souhaitons également évaluer l’évolution du thrombus sur de longue période (1j et 1 semaine), ce qui est impossible in vitro du fait que le sang doit être utilisé dans les 4h suivant son prélèvement.

Réduction

Le projet se fera par étapes, comme indiqué dans le déroulé du projet. Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 10 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs sont calculés par des tests statistiques adaptés, le critère recherché est la comparaison de moyennes.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Aucun geste n’est réalisé sur animal vigile, nous n’avons donc pas prévu d’habituation. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une habituation au gel nutritif 3 jours avant l’opération • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’opération • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin de lutter contre l’hypothermie pendant la chirurgie ainsi que son réveil en boite thermostatée à 37°C • Par l’injection d’analgésique et d’anesthésique local avant chaque procédure en sous-cutanée et également appliqué sur l’œil après injection intraveineuse. • Par application de gel ophtalmique sur les yeux lors de l’anesthésie afin de les protéger, et par injection d’1 mL de sérum physiologique à la fin de la procédure chirurgicale pour assurer l’hydratation de l’animal en plusieurs points d’injection (au moins 2). Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont largement maitrisés et caractérisés, notamment les modèles de thrombose artérielle. De plus, les techniques de mutation ont permis de générer des souris exprimant certains récepteurs plaquettaires humains, permettant ainsi de tester de nouveaux traitements de la thrombose artérielle. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris pubères et ne présentant pas encore de vieillissement. Une exception sera faite pour un type de souris car leur carotide est plus grosse à âge égal, elles seront utilisé à 1 mois afin de générer une thrombose suffisante.