Rongeurs
Caractérisation d’un nouveau modèle murin de cardiomyopathie arythmogène d’origine génétique EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une stimulation électrique poussée jusque dans le cœur, sous anesthésie et sans réveil, termine le parcours des souris transférées vers l'animalerie d'expérimentation. 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées, les cœurs prélevés pour analyse. Le porteur décrit l'échocardiographie comme une procédure "non invasive et non douloureuse", et indique par ailleurs que la lignée porte un phénotype dommageable pouvant provoquer des troubles du rythme jusqu'au décès. Les reproducteurs en fin de reproduction, les animaux écartés à cause de leur génotype et les hétérozygotes "générés en surplus" sont tués sans entrer dans le projet.
Objectifs
Le projet s’insère dans un contexte de recherche qui a pour but de comprendre les mécanismes à l’origine de pathologies cardiovasculaires afin de pouvoir envisager de nouveaux traitements. Pour cela l’effet de diverses substances ou de protéines mutantes introduites chez des souris normales est étudié et leurs conséquences physiologiques chez l’animal sont mesurées. Ces expériences nécessitent un suivi phénotypique. L’objectif du projet est la caractérisation fonctionnelle d’une mutation humaine dans un gène qui vient d'être découvert comme responsable d'une nouvelle forme de cardiomyopathie associée à des troubles du rythme cardiaque pouvant conduire à des pertes de connaissance et à une mort subite. Le but de ce projet est donc de comprendre les mécanismes sous-jacents impliqués dans les régulations auxquelles participe cette protéine. Ces connaissances seront facilitées en utilisant un modèle in vivo qui garantit la présence des molécules partenaires dans un contexte physiologique.
Bénéfices attendus
L'étude de ce modèle murin nous permettra de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie liée à des troubles du rythme cardiaque atrial et ventriculaire, et de déterminer si les souris développent ou non une cardiopathie associée. A plus long terme, des stratégies thérapeutiques pourront être testées sur ce modèle car ces arythmies peuvent être mortelles chez l'Homme et nous ne disposons pas de traitements efficaces. Du point de vue de l’incidence, c’est certainement une maladie rare, en particulier en Europe où il y a peu de familles consanguines. Quand les résultats de nos recherches seront publiés, d’autres études viendront conforter et compléter nos premiers résultats. Il est probable que des mutations fondatrices existent dans certaines régions du monde, transmises de génération en génération et que seuls les patients homozygotes par descendance soient atteints avec une incidence locale plus élevée et un réel besoin de traitements pour prévenir le développement d'arythmies ventriculaires possiblement léthales.
Procédures
Une biopsie sera réalisée pour génotypage (animal vigile, 1 fois, 1 minute, EU1). Les animaux seront transférés de l’établissement d’élevage vers l’établissement secondaire où seront effectuées les différentes explorations (EU2). Les enregistrements électrocardiographiques avec le système Tunnel sont effectués sur animal vigiles qui sont juste placés dans un tunnel, avec chaque patte positionnée sur une plaque, ce qui permet l’enregistrement de l’électrocardiogramme (4 fois au maximum, 5 min, EU2). L’échocardiographie est enregistrée sur animal anesthésié très légèrement afin de juste les maintenir immobiles. C’est une procédure non invasive et non douloureuse. Les animaux se réveillent juste après l’arrêt de l’anesthésie (4 fois au maximum, 30 min, EU2). Les animaux seront également soumis à une stimulation transoesophagienne pour mettre en évidence et analyser une éventuelle susceptibilité à déclencher une fibrillation atriale (sous anesthésie et analgésie, 3 fois au maximum, 30 min, EU2). Le protocole de stimulation intracardiaque ne sera fait qu’une seule fois (acte unique, sous anesthésie et analgésie, durée 40 min, EU2), car c’est une procédure terminale, sans réveil, avant euthanasie. Les souris subissent cette procédure chirurgicale afin d’évaluer la susceptibilité des modèles murins aux arythmies ventriculaires.
Impact sur les animaux
Les nuisances découlant des procédures sont 1) l’utilisation de lignées transgéniques qui nécessite l’identification génétique des souris réalisée par une biopsie, ce qui peut être une cause de stress et de douleur légère de courte durée, 2) ce projet consiste à phénotyper une nouvelle lignée murine, le phénotype dommageable des animaux pourrait entrainer des troubles du rythme cardiaque pouvant provoquer le décès dans les cas les plus graves, 3) le stress lié au transport des animaux de l'animalerie d'élevage à l'animalerie d'expérimentation, 4) le stress lié aux diverses manipulations pour les administrations ou durant le suivi, 5) douleur légère de courte durée au point d'injection, 6) lors de certains actes sous anesthésie gazeuse, une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire.
Devenir
Tous les reproducteurs en fin de période de reproduction ou exclus du fait de leur génotype ne pouvant être inclus dans le projet, ainsi que les hétérozygotes générés en surplus seront euthanasiés. Tous les animaux transférés pour l'expérimentation seront euthanasiés à la fin de la procédure chirurgicale et les cœurs seront prélevés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Les maladies cardiaques d’origine génétique sont difficiles à modéliser dans des systèmes ex vivo ou en culture cellulaire. Les cardiomyocytes sont des cellules qui n’existent pas en lignées. Nous disposons de protocoles d’établissement de cardiomyocytes issus d’iPS (des cellules pluripotentes capables de donner tous les types cellulaires de l’organisme) et utilisons également ce modèle, mais ils présentent des inconvénients comme une immaturité et la présence de plusieurs types cellulaires. Ces cellules ne permettent pas de remplacer le recours aux animaux en particulier pour les analyses physiopathologiques nécessitant l’intégration de signaux neuro-humoraux et mécaniques comme pour les pathologies cardiaques.
Réduction
640 animaux au maximum seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Une étude pilote sera effectuée afin de définir précisément les âges optimaux pour réaliser les analyses. A la fin des études expérimentales, des organes seront prélevés sur tous les animaux afin de maximiser les informations analysables. Un isolement et une étude des cardiomyocytes isolés seront également réalisés. Ce modèle cellulaire ex vivo permettra de tester l’effet de composés pharmacologiques pour tenter de corriger des anomalies à l’origine des dysfonctionnements cardiaques, plutôt que de tester directement in vivo l’effet de ces composés afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. En élevage, une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. Le transport entre les deux EU est réalisé sans changement de cage pour limiter le stress des animaux. Les cages sont délicatement placées dans un sac kraft et sur un chariot. Le transfert est réalisé par un tunnel sous terrain sans passage par l'extérieur. La durée du trajet est de 5 minutes. Le projet a également été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés (anesthésie, analgésie...) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris pour les raisons générales suivantes : 1) la mutation d'intérêt a été introduite chez cette espèce 2) le développement et la physiologie sont bien connus. 3) le fonctionnement du système cardiovasculaire est proche de celui de l’Homme (échocardiographie, ECG). 4) de nombreux modèles physiopathologiques sont disponibles et caractérisés. Les animaux seront utilisés entre 7 et 14 jours de vie pour réaliser une biopsie, entre 2 et 6 mois pour la reproduction et entre 15 jours et 8 mois de vie pour le suivi (poids, fonction cardiaque)
Evaluation d’agonistes inverses du GPER dans la douleur cancéreuse
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Toutes mises à mort au motif que leur souffrance est jugée irréversible, 152 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Cent quatre d'entre elles subissent une chirurgie d'implantation de cellules cancéreuses, puis des mesures de bioluminescence sous anesthésie deux fois par semaine pendant trois semaines. Toutes reçoivent l'anticancéreux qui provoque la neuropathie, dont la douleur est ensuite évaluée en appliquant des filaments sur la patte, au test de von Frey. Le porteur situe le débouché du projet sur le marché du cancer du sein triple négatif et annonce un dépôt de brevet avant tout passage chez l'être humain.
Objectifs
Le cancer du sein triple négatif présente un taux de survie à 5 ans de 77% qui chute à 11% si métastases. Les douleurs associées à ce type de cancer sont de deux types : les douleurs neuropathiques périphériques induites par la chimiothérapie et les douleurs métastatiques. Nous avons montré que le récepteur GPER (pour G protein-coupled estrogen receptor), était impliqué dans le cancer et la douleur. Sur la base de ces résultats, nous émettons l’hypothèse que des molécules modulant le récepteur GPER pourraient améliorer le cancer triple négatif et les douleurs associées. Pour ceci, de telles molécules seront synthétisées. Après plusieurs étapes de screening in vitro, les meilleurs ligands (10 molécules maximum) seront alors évalués par nos soins (objet de cette procédure APAFIS) sur la douleur neuropathique induite par les chimiothérapies grâce à l’utilisation d’un modèle murin. Le ligand présentant la meilleure efficacité sera alors évalué sur : (1) le développement de la tumeur, (2) la douleur neuropathique induite par les chimiothérapies et (3) la douleur métastasique grâce à l’utilisation de modèles murins. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Le produit attendu est un nouvel antalgique et antitumoral permettant de lutter contre la progression tumorale ainsi que les symptômes neuropathiques, tels que les douleurs induites par certaines chimiothérapies, mais aussi prévenant (lorsqu’il sera co-administré avec les chimiothérapies) l’apparition de neuropathies pour lesquelles il n’existe aucun traitement efficace. L’utilisation d’animaux est indispensable dans ce contexte d’interaction entre système nerveux, tumeur, dissémination sanguine et système immunitaire. Ces travaux compileront les bases nécessaires au dépôt de brevet de molécule dans le but de passer ensuite à des études chez l’Homme. Le marché visé est principalement celui des cancers du sein triple négatif, permettant d’améliorer non seulement le pronostic vital de nombreuses patientes, mais aussi leur qualité de vie.
Procédures
*L’ensemble des animaux subiront des injections pour administrer l’anticancéreux responsable de la mise en place du modèle et des composés à tester. La piqure d'aiguille pour l’injection est réalisée en quelque secondes sur animal vigil. *L’application de filaments au niveau de la patte de l’animal vigile pendant quelques secondes sera réalisée afin d’évaluer la douleur. *104 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale pour l'implantation des cellules cancéreuses qui durera environ 5 minutes par animal. *La mesure de la bioluminescence (durée : 5 min par animal) sera réalisée 2 fois par semaines pendant 3 semaines sous anesthésie générale. *Toutes les interventions sont réalisées à l’établissement utilisateur EU1 à l’exception de la mesure de la bioluminescence qui sera effectuée à l’EU2.
Impact sur les animaux
L’induction de la neuropathie chimio-induite (CIPN) ainsi que de tumeur chez l’animal seront des nuisances à part entière et irréversibles, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN ainsi que les métastases osseuses seront associées à des désordres douloureux qui seront évalués dans le cadre du projet. Elle sera aussi responsable d’une diminution du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement. Une application de quelques secondes de filament au cours du test de von Frey est susceptible d’induire chez l’animal une douleur légère.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort puisque la souffrance de l’animal est irréversible.
Remplacement
Plusieurs étapes de screening réalisées en amont des expériences demandés dans cette procédure seront effectués afin de réduire le nombre de molécules à évaluer et donc le nombre d’animaux. En effet, l’ensemble des molécules designées ou synthétisées subiront : - un screening in silico des dérivés (seules les molécules se fixant sur le GPER seront retenues) - un screening in vitro des dérivés (seules les molécules présentant une action agoniste inverse sur le GPER et une action antiproliférative sur cellules TNBC seront retenues). S'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux. Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN et de métastases osseuses n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. S'agissant d'étude sur la croissance tumorale, un screening des composés et une étude de l’interaction de ces composés avec le paclitaxel in vitro sera réalisé préalablement au passage chez l’animal. Ces approches alternatives ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux. En effet, les modèles animaux vivant sont, dans les derniers stades d’études, nécessaire pour explorer et évaluer l’effet antitumoral, que ce soit la dissémination de métastases dans la circulation sanguine, mais aussi l’impact du système immunitaire, par le biais d’imagerie. Ce type d'étude sur modèle animal de métastases osseuses est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.
Réduction
*Ces travaux seront précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les molécules les plus prometteuses à des doses adaptées. *Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. *De plus le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. *La PROCEDURE 1 est une étape de GoNoGo, c’est-à-dire que si les résultats de celle-ci sont négatifs (pas d’effet antalgique de chaque composés) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées. *Toutes les procédures seront réalisées sur des groupes randomisés avec un groupe témoins négatif (recevant du véhicule ou une chirurgie factice), et menées en aveugle. *L’ensemble des résultats, y compris négatifs, feront l’objet d’une publication afin d’éviter la reproduction d’expérience.
Raffinement
Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (température, hygrométrie, luminosité). Le nombre d’animaux est adapté à la taille de la cage et en adéquation avec la règlementation . De plus, le milieu est enrichi par du matériel de nidification (coton), un abri (dôme carton) et des matériaux à ronger (bois tendre). L’hébergement en groupe est maintenu pour le bien-être animal. Une surveillance des conflits sera réalisée. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Les expérimentateurs sont tous titulaires du niveau « concepteur et réalisateur de projet » ainsi que de la formation de chirurgie sur rongeurs. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. De plus, le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs utilisent dès que possible la technique du cupping pour limiter l’anxiété des souris lors du transfert des animaux. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum. Le transport des animaux entre l’animalerie (EU1) et le centre d’imagerie (EU2), s’effectuera en voiture. Les animaux seront hébergés dans des boites opaques avec couvercle filtrant. Un document de transport (avis/accord du vétérinaire) accompagnera les animaux. Le transport sera conditionné à l’état des animaux et les conditions climatiques.
Choix des espèces
La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur les CIPN et la croissance tumorale. D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie et le développement tumoral. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.
Détermination préliminaire de la tolérabilité ou du profil de sécurité/toxicocinétique de candidats médicaments ou de candidats véhicules administrés par voie intrathécale chez le Rat pour le traitement de maladies neurologiques
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
3 660 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun pouvant subir une chirurgie du dos de trente minutes pour une injection entre les méninges, six prélèvements de sang en vingt-quatre heures et jusqu'à dix-sept heures en cage à métabolisme. Avant la mise à mort, une aiguille traverse la peau à la base du crâne pour ponctionner le liquide céphalorachidien. L'objet est de mesurer la toxicité de candidats médicaments administrés par voie intrathécale, en amont d'études réglementaires qui utiliseront davantage d'animaux non-humains. Le porteur indique que 183 rats pourront être réutilisés dans un autre projet, ceux ayant subi un premier geste invasif sans avoir reçu de traitement, les 3 477 autres étant tués pour prélèvement de sang, de liquide céphalorachidien et d'organes.
Objectifs
De nos jours, une proportion très importante des pathologies pouvant être décrites atteint le système nerveux. Ces maladies neurologiques, difficiles à traiter, sont très invalidantes, voire mortelles et considérées comme la première cause de handicap dans le monde. En effet, en 2021, il était estimé que près de 3 milliards d’individus étaient atteints d’une maladie neurologique. De même, le nombre de cancers atteignant le système nerveux représente une proportion non négligeable du nombre total de cancers, avec de même une difficulté de traitement du fait de leur localisation. Dans ce contexte, l’objectif principal de la R&D (recherche et développement) pharmaceutique est de développer de nouveaux candidats médicaments qui seront évalués durant des essais cliniques afin de satisfaire les besoins médicaux grandissants et d’améliorer le traitement de ces maladies touchant le système nerveux. Pour beaucoup de ces maladies, un dérèglement de la production de protéines ou une accumulation de celles-ci au niveau cérébral est en cause. Il est possible aujourd’hui de cibler l’ARN d’une protéine du cerveau au fonctionnement anormal pour l’éliminer. Cela nécessite la mise en œuvre de candidats médicaments qui doivent atteindre les cellules du système nerveux. Le passage de la barrière hématoencéphalique (BHE) étant critique, la plupart des candidats médicaments utilisés pour le traitement des maladies neurologiques est administrée au niveau des lombaires entre les méninges par administration dans l’espace intrathécal (IT) chez l’Homme. L’objectif de ce projet est d’évaluer la tolérabilité puis le profil de sécurité complet de candidats médicaments et/ou véhicules (agents de transport du principe actif) administrés par voie IT chez le rat. En effet, le rat présente une forte homologie physiologique et anatomique avec l’Homme.. De plus, la voie intrathécale utilisée en clinique humaine peut être réalisée chez cette espèce. Ainsi, après sélection par screening in vitro puis in vivo des formulations et des candidats médicaments les plus prometteurs, les études préliminaires vivo de sécurité non clinique incluses dans ce projet vont permettre de déterminer le profil de sécurité des candidats médicaments et de connaître ainsi la fenêtre thérapeutique (en comparant la dose toxique à la dose efficace). Les données d’efficacité et de sécurité permettent conjointement de décider à chaque étape l’arrêt ou la poursuite du développement du médicament.
Bénéfices attendus
Actuellement, une grande majorité des médicaments pour le traitement de maladies affectant le système nerveux et notamment neurodégénératives est administré par voie intrathécale, permettant le passage de la barrière hémato-encephalique et l’action du médicament sur le cerveau. Cependant, la voie intrathécale est contraignante pour le patient et le candidat médicament peut, au cours de son développement, être confronté à des problèmes de tolérabilité, de distribution et de dégradation précoce. Le bénéfice apporté par ce projet est l’optimisation du développement de candidats médicaments en évaluant très précocement leur toxicité éventuelle, en déterminant un profil de sécurité complet (réduction ainsi du nombre d’études réglementaires et du nombre global d’animaux utilisés pour un projet thérapeutique) et en ajustant au mieux les doses et le schéma expérimental avant d’initier des études réglementaires qui nécessitent un nombre plus important d’animaux. Cette approche permet également de réduire les contraintes auxquelles les animaux sont soumis dans ces études en s’assurant de la bonne tolérance du candidat médicament. En effet, les deux procédures de ce projet permettent la sélection du meilleur candidat et l’arrêt des candidats les moins prometteurs, réduisant ainsi le nombre d’études réalisées et donc le nombre d’animaux utilisés au total pour un projet thérapeutique.
Procédures
- A l’administration (unique à 1 fois toutes les 3 semaines maximum) de composés par voie intrathécale nécessitant un abord chirurgical sous anesthésie et couverture analgésique – durée de la chirurgie environ 30 minutes - A l’administration d’analgésique en pré, péri et post opératoire ou lors de l’euthanasie -administration de 10 secondes environ - A des prélèvements de sang grâce à la technique du microsampling sur animal vigile (faible volume de sang prélevé à la veine marginale de la patte) : 6 prélèvements maximum sur 24 heures, 2 fois maximum dans l’étude – contention de 30 secondes environ et prélèvement durant 10 secondes environ - A des recueils urinaires d’une durée maximale de 17 heures en cage à métabolisme (1 fois par étude au maximum) - A un prélèvement unique de sang réalisé sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A un prélèvement unique de Liquide Céphalo Rachidien réalisé par voie transcutanée (ponction avec une aiguille au travers de la peau) via la cisterna magna (cavité située en bas de la boîte crânienne) sous anesthésie et analgésie avant l’euthanasie - A des examens paracliniques (ophtalmologie, cardiologie,) nécessitant une contention légère de 2 minutes environ au maximum 2 fois par étude
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet, des nuisances ou douleurs peuvent survenir à savoir : - Conséquences directes des actes expérimentaux : • Administration intrathécale : la phase de chirurgie nécessaire à l’administration du composé testé (d’une durée d’environ 20 minutes) et du suivi post-opératoire peut générer du stress et de la douleur (degré de sévérité modérée) • Administrations d’analgésique : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress et l’administration (moins de 10s) de la douleur (degré de sévérité léger) • Prélèvements de sang à la veine marginale de la patte ou à la veine caudale : La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress et de la douleur (degré de sévérité léger) • Induction de l’anesthésie gazeuse (pour chirurgie ou prélèvement de sang ou autre liquide biologique, liquide céphalo-rachidien (LCR), préalable à l’euthanasie etc) : l’induction qui est rapide peut générer du stress (degré de sévérité léger). - Conséquence indirecte des actes expérimentaux : La molécule administrée peut en elle-même induire des effets cliniques (modifications de la prise de poids, baisse d’activité locomotrice par exemple) et peut provoquer une nuisance pour l’animal.
Devenir
L’ensemble des animaux ayant reçu l’administration d’un candidat médicament dans ce projet seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure pour la collecte de sang/ liquide cephalo-rachidien (LCR) pour analyse (biologie clinique, biomarqueurs) et d’organes pour lecture anatomopathologique. Les seuls cas de réutilisation possible dans un autre projet concernent les rats pour lesquels au moins un premier geste invasif a été réalisé dans le cadre de la procédure (entrant dans la définition de la procédure expérimentale réglementaire ex : micro-sampling) et qui n’ont pas reçu de candidat traitement /véhicule : -du fait d’une décision anticipée d’arrêt de l’étude ou d’un groupe à la suite d’observation de signes cliniques sur un autre rat traité du groupe par exemple
Remplacement
Ce projet a pour but d’évaluer la tolérabilité puis d’établir un profil de sécurité de candidats médicaments à visée neurologique. Actuellement, il n’existe pas d’alternative, validée scientifiquement, éthiquement et réglementairement, à l’utilisation d’animaux tout comme il n’existe pas de modèle vitro suffisamment complet pour juger du passage de la barrière hématoencéphalique ainsi que la tolérabilité et le profil de sécurité de ces candidats médicaments. L’utilisation d’un modèle animal reste donc nécessaire et le rat est l’espèce rongeur la plus adéquate pour répondre à l’ensemble des objectifs du projet (voie intrathécale possible chez cette espèce, processus physiologiques très semblables à l’Homme). L’ensemble des designs expérimentaux de ce projet est néanmoins optimisé afin de n’utiliser que le strict minimum d’animaux et de générer des données utilisables pour les études ultérieures. De plus des méthodes alternatives de screening vitro de passage de la barrière hémato-encéphalique sont utilisées pour caractériser et sélectionner les candidats médicaments ou véhicules à tester dans ces études ce qui permet de réduire fortement leur nombre.
Réduction
Une sélection des candidats médicaments les plus prometteurs est réalisée à l’aide de screening vitro et/ou silico avant la mise en place des études incluses dans ce projet. Le nombre habituel d’animaux (2 à 8 animaux/dose avec une mixité selon la procédure conduisant à 2 à 4 individus/sexe/dose ou candidat médicament) est déterminé pour être un compromis efficace afin d’atteindre les objectifs des différentes procédures, pour générer de la donnée consolidée pour les études ultérieures tout en utilisant le nombre d’animaux le plus restreint possible Le choix de ce nombre est basé sur la littérature (recommandations sur les bonnes pratiques d’études de sécurité non clinique) et sur l’expérience interne. Les études de ce projet sont mises en place précocement et profitent des informations apportées par les études de pharmacologie réalisées en parallèle (efficacité, engagement de la cible) avant de réaliser les études vivo nécessaires à la poursuite du développement de la molécule. Elles correspondent ainsi à une étape supplémentaire de sélection du candidat médicament, visant à réduire le nombre total d’animaux utilisés : selon les résultats de ces études et des études d’efficacité pharmacologique, le développement de la molécule peut être arrêtée évitant ainsi de réaliser les études suivantes comportant un effectif d’animaux plus important. Selon la procédure, les études permettent de mesure de nombreux paramètres sur un même animal, grâce à différents examens cliniques et paracliniques peu invasifs (observations cliniques, poids et température corporelle, prélèvement de sang pour pharmacocinétique ou biologie clinique, prélèvements d’organes…) réduisant aussi le nombre d’animaux nécessaire dans ce projet. Enfin, l’utilisation de la technique du microsampling pour prélèvement de sang (prélèvement d’un faible volume à la veine marginale de la patte) peu invasive, rapide, permet de réaliser une cinétique complète sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux (en évitant l’ajout d’animaux dédiés à la pharmacocinétique dans l’étude), tout en respectant les limites de volémie physiologiques et le bien-être animal et sans chauffage préalable pour provoquer la dilatation des vaisseaux. En cas de protocole particulier (exemple : besoin de suivre plus précisément un paramètre particulier) le service de biostatistiques pourra être mis à contribution pour définir le design expérimental le plus optimal.
Raffinement
Des observations cliniques sont réalisées chaque jour. Dès que des signes cliniques sont observés, une décision est prise en concertation entre le vétérinaire, le responsable scientifique, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et les équipes en charge des animaux. Selon les signes cliniques observés, et si les animaux sont en phase d’étude ou pas, une prescription de soins, un arrêt de traitement, ou une euthanasie peuvent être mis en place, tout en tenant compte de l’objectif de l’étude. Cette décision se base si besoin sur le score d’une grille de points limites spécifique à l’espèce étudiée, mise en place avant l’apparition des points limites. L’administration par voie IT est réalisée dans des conditions d’asepsie optimales, sous anesthésie gazeuse avec tapis chauffant, analgésie et anesthésie locale pré, péri et post-opératoire Le protocole d’analgésie sera adapté au cas par cas. L’ensemble des animaux est hébergé et manipulé dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants. Les animaux sont régulièrement manipulés et l’ensemble du personnel technique formé pour générer le moins de stress possible lors des actes expérimentaux. Tous les animaux sont stabulés en groupes, sauf cas exceptionnel justifié scientifiquement (signes cliniques nécessitant l’hébergement individuel n’excédant pas 6 heures, recueil urinaire n’excédant pas 17 heures), avec de l’enrichissement adapté aux besoins du rat (matériel de nidification, matériel à ronger). Au cas par cas, on peut mettre en place des modifications des conditions d’hébergement pour raffinement (ex : chauffage en cas d’hypothermie transitoire). Pour les prélèvements de sang, la technique du microsampling (prélèvement d’un faible volume de sang à la veine marginale de la patte) est mise en place. Cette technique, rapide, peu invasive, permet de limiter l’impact d’une cinétique et de respecter les limites physiologiques du rat (recommandations SBEA disponibles en interne). Elle permet également d’éviter le placement préalable de l’animal dans une enceinte thermorégulée nécessaire à la bonne réalisation du geste. Enfin, dès qu’un acte expérimental nécessite une incision une analgésie est mise en place en plus de l’anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
L’ensemble des procédures de ce projet est réalisé sur l’espèce rat car : - Le rat présente une forte homologie physiologique, comportementale et anatomique avec l’Homme et ainsi une forte valeur translationnelle. De plus la voie intrathécale nécessaire à l’administration des formulations de ce projet peut être réalisée chez le rat. - Les structures cérébrales, dont certaines sont la cible des futurs candidats médicaments sont plus faciles à discerner chez cette espèce. - Les études réglementaires ultérieures et nécessaires au développement d’un candidat médicament utilisent ce modèle expérimental. La sélection se fait aussi sur des critères réglementaires, éthiques, scientifiques afin d’obtenir la meilleure prédiction possible de la réponse chez l’Homme. S’ajoutent à cela les données historiques (internes et issues de la littérature) relatives au rat (âge, sexe) et nécessaires à l’évaluation et l’interprétation des effets ainsi que les données des études pharmacologiques réalisées en amont. Les rats utilisés sont des jeunes adultes et adultes, conformément aux requis réglementaires et correspondant à l’âge des animaux utilisés communément dans les protocoles de recherche de candidat médicament et dans les études ultérieures à ce projet.
Effet analgésique d’un traitement dans des modèles de douleur induits chez la souris ou le rat
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
Rats : 6992
Le nombre d'études dépend des partenaires et des molécules en développement, et 303 études sont annoncées, mobilisant 10 924 souris et 6 992 rats, soit 17 916 animaux non-humains, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des injections chimiques leur provoquent une douleur qui dure de sept jours à plusieurs semaines, avec hyperalgésie au chaud ou au froid, allodynie mécanique et parfois œdème. Les tests mesurent la sensibilité à un filament, à la chaleur et au froid sur les pattes arrière, et par immersion de la queue jusqu'à quinze secondes, deux fois par semaine. Le porteur écrit que "tout est mis en œuvre pour éviter une douleur excessive", et précise plus loin que les animaux ne sont ni anesthésiés ni analgésiés afin de ne pas interférer avec les résultats.
Objectifs
Dans le cadre de programmes de maturation, nous développons au stade préclinique des nouvelles molécules pharmaceutiques ou en repositionnement. Pour chaque nouvelle molécule intégrée dans notre pipeline, des études de toxicologie (in vitro et/ou in vivo), de pharmacocinétique et d’efficacité sont réalisées. Ce projet concerne les études d’efficacité et a pour but d’étudier l’effet analgésique de différents traitements dans différents modèles de douleur chez la souris ou chez le rat. Le développement de molécules analgésiques et antalgiques pour traiter les douleurs (neuropathiques, chroniques ou aigues) est particulièrement important pour le confort des patients. Pour ce projet nous pensons effectuer 303 études avec pour chaque étude, l’utilisation de 10924 souris et 6992 rats, soit 17 916 animaux sur 5 ans. Toutefois, cela reste des estimations car le nombre d’études ne peut pas être déterminé à l’avance car il dépend de nos partenaires et de nos molécules en développement interne ainsi que du choix du modèle translationnel pour aller en clinique
Bénéfices attendus
Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet sur la douleur. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude si besoin de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’Homme. Ainsi, nos études permettront de trouver potentiellement des médicaments dont les effets seraient supérieurs aux molécules de référence déjà existantes
Procédures
Les animaux ne subiront pas de procédures chirurgicales. Les modèles seront induits par l’injection de molécules chimiques : la dose et la posologie seront déterminées à l’aide de la littérature existante et/ou d’études pilotes (varie entre 1 injection unique à plusieurs injections par semaine pendant plusieurs semaines). Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés en fin de procédure (phase terminale). Les animaux recevront les administrations des traitements soit par voie intrapéritonéale, orale ou topique, jusqu’à 7 jours par semaine pendant la durée de l’étude. Des tests de comportement seront effectués jusqu’à 2 fois par semaine pendant la durée de l’étude : soit en mesurant la sensibilité à un stimulus mécanique (stimulation pendant 5 secondes, latence de 2 minutes entre chaque stimulation soit un test durant 15 minutes en tout), la sensibilité au chaud ou au froid au niveau des pattes arrières (30 sec ou 50 sec maximum, respectivement, en test unique) ou au niveau de la queue (immersion pendant 15 sec maximum avec 3 tests séparés de 5minutes). Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour déterminer les scores des points limites.
Impact sur les animaux
Du fait de l’induction du modèle, l’animal va développer une douleur transitoire ou chronique (généralement d’une durée supérieure à 7 jours après l’induction du modèle expérimental et jusqu’à plusieurs semaines) avec hyperalgésie à la chaleur ou au froid et une allodynie mécanique ; l’animal peut également développer un œdème. Les modèles chroniques que nous utilisons sont conçus pour induire des douleurs d'intensité modérée, mimant la douleur chronique humaine, mais tout est mis en œuvre pour éviter une douleur excessive. L'intensité de la douleur est régulièrement évaluée à l’aide de tests comportementaux afin de s'assurer que les animaux ne souffrent pas inutilement. Nous anticipons une douleur chronique modérée et contrôlée, et les protocoles incluent des évaluations fréquentes pour s'assurer que celle-ci ne dépasse pas un seuil tolérable. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques) en dehors de celle induite par la piqure. De plus, les prélèvements de sang éventuels se feront en phase terminale sous anesthésie générale. Pour le modèle de neuropathie diabétique, des petits prélèvements de sang seront réalisés régulièrement (1 goutte) pour mesurer la glycémie à l’aide d’un glucomètre.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure car certains tissus devront être prélevés pour réaliser des analyses complémentaires indispensables à l'évaluation scientifique des expérimentations menées. Nous prévoyons de collecter différents tissus (comme le cerveau, la moelle épinière, les ganglions nerveux, ou encore des tissus périphériques) afin de réaliser des analyses d'expression génique ou histologique pour évaluer les éventuels changements morphologiques ou dégénératifs. Ces analyses sont essentielles pour valider les résultats comportementaux et physiopathologiques observés durant les expériences, en apportant des preuves complémentaires au niveau cellulaire et moléculaire.
Remplacement
Notre projet se focalise sur l’induction de modèles expérimentaux de de douleur nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. En effet, ce sont des modèles qui étudient principalement le comportement de l’animal. La douleur transitoire ou chronique est un sujet d’étude complexe nécessitant des expériences à l’échelle de l’organisme entier. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales alternatives n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux, pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité du traitement. Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des molécules thérapeutiques qui auront montré une efficacité lors d’études précédentes afin de limiter l’utilisation des animaux.
Raffinement
Pour minimiser les impacts négatifs sur les animaux de laboratoire, des études pilotes seront réalisées, permettant la réussite d'une étude plus large. Cela implique de tester l'étude sur un petit nombre d'animaux. Les études pilotes permettent la mise en place d’une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés. Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie durant toute la procédure expérimentale afin de maîtriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. En dehors des tests de comportement, les animaux feront l’objet d’un suivi 3 fois par semaine afin de détecter les potentiels critères d’arrêt de souffrance. Enfin, les animaux seront euthanasiés en fin d’expérimentation afin de réaliser des analyses supplémentaires. Les études sur la douleur impliquent que les animaux ne soient pas anesthésiés ni analgésiés afin de ne pas interférer avec les résultats des expériences. Les expériences de comportement seront effectuées sur des temps très courts (jusqu’à 15 minutes) afin de limiter le temps de souffrance des animaux.
Choix des espèces
La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés, ils sont appropriés pour les études comportementales et pour l’étude de la douleur. Les modèles que nous allons utiliser ont été spécialement développés afin de modéliser de manière simple la douleur et d’étudier l’effet de médicaments sur celle-ci. L’utilisation des souris et des rats est reconnue pour ces modèles. Ils développent des symptômes de douleur, décrits dans la littérature et présentés dans la partie « Nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux ». Pour comprendre l’efficacité potentielle des médicaments testés, il est nécessaire d’utiliser plusieurs modèles avec différents mécanismes d’induction de la douleur. L’utilisation de l’espèce souris ou rat se fera en fonction de l’avancée du projet : continuité du modèle pour valider les résultats dans un contexte laboratoire indépendant ou changement d’espèce pour valider les résultats dans un modèle indépendant. Le choix de l’espèce dépendra de l’efficacité de la molécule dans une espèce donnée. En effet, si celle-ci s’avère efficace elle pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèce indépendante. Les animaux seront âgés de 7-10 semaines au début de l’étude en accord avec la littérature existante ce qui correspond à un stade de développement de jeune adulte.
Détermination de l’implication d’une mutation d’un canal ionique potassique dans l’épilepsie.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Isolées dix minutes par jour pendant trois jours, puis injectées dans l'abdomen avec un composé qui déclenche une crise d'épilepsie, 96 souris sont ensuite observées seules pendant deux heures, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie reçoit en plus un activateur de canaux potassiques, pour mesurer s'il atténue la crise. Le porteur indique avoir déjà obtenu l'effet de la mutation sur des neurones en culture, et affirme que ces résultats ne suffisent pas parce que le phénotype épileptique fait intervenir plusieurs organes, d'où le "besoin" d'un système intégré. Toutes les souris sont mises à mort dès la fin de la procédure, ce que le porteur présente comme un moyen de limiter leur détresse.
Objectifs
L’épilepsie est une maladie chronique d’origine neurologique caractérisée par la récurrence de crises d’épilepsie. Ces crises sont caractérisées par divers symptômes tels que désorientation, perte de conscience, troubles du mouvement ou des sensations (gustatives, auditives, visuelles) ainsi que de l’humeur ou d’autres fonctions cognitives. Du fait de ces crises, les personnes épileptiques ont tendance à présenter davantage de problèmes physiques (fractures par exemple) et psychologiques (anxiété et/ou dépression) et le risque de décès prématuré est jusqu’à 3 fois plus élevé comparé à la population générale. Selon l’Organisation Mondiale de la Santé, environ 50 millions de personnes sont touchées par cette pathologie avec approximativement 5 millions de personnes diagnostiquées chaque année ; l’épilepsie représentant une part non négligeable de la charge de morbidité à l’échelle mondiale. Malgré le nombre important d’études menées et en cours visant à comprendre les causes de l’épilepsie, celles-ci sont encore inconnues dans 50% des cas selon l’OMS. Dans ce contexte, notre équipe se focalise sur l’étude d’une nouvelle mutation portée par un canal potassique exprimé au niveau du système nerveux central et périphérique. Chez l’Homme, la présence de cette mutation est corrélée à la présence de diverses pathologies dont l’épilepsie. Le but de ce projet est, dans un premier temps, de démontrer le lien de cause à effet entre cette mutation et l’épilepsie dans un contexte physiologique (sur animal vivant), dans un second temps, d’évaluer dans quelle mesure un composé pharmacologique activateur des canaux potassiques est capable de réduire le phénotype épileptique.
Bénéfices attendus
L’épilepsie est un problème de santé publique car, selon l’OMS, environ 50 millions de personnes dans le monde sont affectées par cette pathologie et environ 5 millions de personnes sont diagnostiquées chaque année. De plus, les symptômes associés à l’épilepsie sont importants tels que désorientation, perte de conscience, troubles du mouvement ou des sensations (gustatives, auditives, visuelles) ainsi que de l’humeur ou d’autres fonctions cognitives. Du fait de ces crises, les personnes épileptiques ont tendance à présenter davantage de problèmes physiques (fractures par exemple) et psychologiques (anxiété et/ou dépression) et le risque de décès prématuré est jusqu’à 3 fois plus élevé comparé à la population générale. Cependant, malgré la gravité de cette pathologie, son étiologie est inconnue dans environ 50% des cas, justifiant des études approfondies. Nous pensons que l’étude de cette mutation impactant la fonctionnalité d’un canal potassique sera importante pour la compréhension des origines de l’épilepsie ; une meilleure compréhension permettra un meilleur traitement de cette pathologie. De plus, il est attendu que l’activation des canaux potassiques via ce composé pharmacologique soit en mesure de réduire la gravité du phénotype épileptique et, si tel est le cas, cette étude nous permettra de valider ces canaux comme cibles de choix et ce composé pharmacologique comme outil thérapeutique prometteur pour le traitement de l’épilepsie.
Procédures
Nous induirons un phénotype épileptique à nos souris par une unique injection intrapéritonéale d’un composé épileptogène (l’injection sera rapidement réalisée en quelques secondes). Le but sera d’évaluer le degré de sévérité de la crise chez ces souris durant 2 heures maximum post injection. Sur d’autres lots d’animaux, nous évaluerons dans quelle mesure l’activation de canaux potassiques via une unique injection intrapéritonéale d’un composé pharmacologique (l’injection sera rapidement réalisée en quelques secondes) permet de réduire le degré de sévérité du phénotype épileptique chez nos souris induit par une unique injection intrapéritonéale d’un composé épileptogène (l’injection sera également réalisée rapidement en quelques secondes). Le but sera d’évaluer le degré de sévérité de la crise chez ces souris durant 2 heures maximum post injection.
Impact sur les animaux
Durant la phase d’habituation, les souris seront isolées pendant 10 minutes sur 3 jours consécutifs induisant potentiellement un léger stress. L’acte d’injection peut potentiellement induire de la douleur et des signes démangeaisons et de gonflements. Durant la phase de test, les souris seront isolées pendant 2 heures maximum induisant potentiellement un stress. Par ailleurs, l’induction pharmacologique de l’épilepsie nécessaire à la réalisation de notre projet de recherche, sera dommageable pour l’animal car induisant potentiellement de la douleur.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort immédiatement à la fin de la procédure afin de limiter la détresse des animaux.
Remplacement
Nous avons préalablement mené des expériences in vitro afin de caractériser l’effet de la mutation sur le canal. En exprimant le canal muté dans une lignée cellulaire et en enregistrant son courant, nous avons observé un fort effet délétère de la mutation sur la fonctionnalité du canal. Ce résultat a justifié une étude de l’effet de cette mutation dans un contexte plus physiologique ; pour ce faire, nous avons réalisé des cultures primaires de neurones de souris sauvages et porteuses de la mutation sur le canal. Une analyse des propriétés électriques de ces neurones nous a permis de montrer une hyperexcitabilité neuronale causée par la mutation justifiant la mise en place d’expérience de comportement in vivo. Bien que ces résultats tendent à confirmer notre hypothèse, à savoir que la mutation du canal induit le phénotype épileptique observé chez le patient, ils ne sont pas suffisants pour la confirmer formellement et une étude sur l’animal est requise. En effet, le phénotype épileptique fait notamment intervenir différents organes tels que le cerveau, les muscles etc justifiant le besoin d’un système intégré tel que l’animal vivant pour mieux l’appréhender. Une étude sur l’animal est donc essentielle et ne peut être remplacée à ce niveau.
Réduction
Le nombre d’animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l’obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel de statistiques GPower). Il sera réduit autant que possible et toute expérience rendue inutile par des résultats précédemment obtenus ne sera pas réalisée. L’évaluation des données obtenues se fera en appliquant un test statistique approprié afin de pouvoir réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables. Nos estimations suggèrent que des lots de 10 souris par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 16 souris par groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs.
Raffinement
Notre expertise nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et de réaliser les gestes techniques requis de manière précise et rapide. Nous porterons une attention particulière à limiter au niveau le plus faible le stress occasionné aux animaux. Ceux-ci seront hébergés et manipulés avec calme dans un environnement limitant toute source de nuisances, dans une salle calme uniquement dédiée à ces tests et dont l’intensité lumineuse modulable permet la réduction du stress des souris. Ainsi, nous mettrons en place 3 jours d’habituation en amont des tests (10 minutes par jour). Un enregistrement vidéo sera réalisé pour chaque souris en procédure nous permettant notamment de garder une trace du phénotype et d’effectuer d’autres analyses au besoin sans avoir à répéter l’expérience dans un objectif de réduction et de raffinement. Les animaux seront hébergés avec un environnement enrichi, sans isolement, en accord avec la réglementation en vigueur. Par ailleurs, au cours de l’expérience d’induction de la crise d’épilepsie, nous avons défini des points limites que nous veillerons à respecter scrupuleusement dans le but de limiter au maximum les nuisances potentielles liées à l’épilepsie.
Choix des espèces
Nous avons choisi Mus musculus comme modèle d’étude en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l’espèce humaine. Les souris mutantes correspondent au modèle murin de la mutation trouvée chez les patients épileptiques. Les souris invalidées pour les gènes codant pour les deux autres canaux potassiques ont été choisies car nos résultats préliminaires suggèrent que la mutation sur le canal d’intérêt altère le fonctionnement de ces deux autres canaux et que ceux-ci participent au développement du phénotype épileptique (nous nous attendons à un phénotype épileptique plus sévère comparé aux souris sauvages) notamment car il a déjà été montré que l’invalidation génétique de ces canaux rendent les souris plus sensibles à l’injection du composé épileptogène, avec un phénotype plus sévère. Des animaux âgés de 2 à 4 mois seront utilisés. A cet âge les animaux sont de jeunes adultes, ce qui nous permet de déterminer l’impact de la mutation portée par le canal TRESK en nous affranchissant de biais potentiels liés au développement et au vieillissement.
Etude du rôle de nouvelles cibles dans la dissémination métastatique et la résistance thérapeutique du mélanome cutané
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Une injection de cellules tumorales sous la peau ou dans le sang, puis des injections dans l'abdomen ou des gavages trois à cinq fois par semaine, et une à deux séances d'imagerie sous anesthésie chaque semaine : 5 505 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur indique que les tumeurs du flanc gênent les déplacements aux stades avancés et que les métastases pulmonaires peuvent provoquer une détresse respiratoire. Le protocole court sur huit semaines, jusqu'à quatre-vingt-dix jours de traitement pour certaines expériences, afin de chercher de nouvelles cibles contre la résistance thérapeutique du mélanome. Aucun seuil n'est donné pour les critères d'arrêt annoncés comme précis et précoces, et l'effectif de 5 505 souris est rapporté à un logiciel d'analyse de puissance qui n'est pas nommé.
Objectifs
Le mélanome cutané est le type de cancer de la peau le plus grave avec un fort taux de mortalité associé aux stades avancés de la maladie. Même si le développement récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie a permis d’améliorer considérablement la prise en charge des patients atteints de mélanome avancé, certains patients ne répondent pas à ces traitements et de nombreux rechutent en raison du developpement de résistances à ces traitements. L’un des enjeux majeurs de la cancérologie cutanée pour les années à venir est donc d’identifier de nouvelles cibles/stratégies permettant de prévenir ou de contourner les situations d’échappement thérapeutique. Notre projet propose d’explorer l’implication possible de certains de nouvelles protéines dans la réponse thérapeutique du mélanome avancé afin de révéler des cibles/stratégies nouvelles pour éliminer les cellules résistantes à ces traitements.
Bénéfices attendus
Notre projet propose d’explorer l’implication possible de nouvelles protéines dans la réponse thérapeutique du mélanome avancé afin de révéler des cibles/stratégies nouvelles pour éliminer les cellules résistantes à ces traitements. Nos travaux devraient permettre de mieux comprendre les processus responsables du développement métastatique et de l'échappement au traitement des mélanomes et pourraient à terme permettre d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les interventions réalisées sur les animaux seront les suivantes : injection sous-cutanée ou intraveineuse unique de cellules tumorales (durée: moins de 1 minute/souris), injections intrapéritonéales et/ou des gavages oraux à raison de 3 à 5 fois par semaine (durée: moins de 1 minute/souris). Séances d'imagerie (bioluminescence) sous anesthésie : 1 à 2 fois par semaine (durée : moins de 30 minutes).
Impact sur les animaux
1/Contention et douleur induites lors de l'injection i.v ou s.c de cellules tumorales. Durée de la procédure : 1 minute/souris; 2/ Inconfort/ difficultés de déplacement dues à la présence de tumeurs sur le flanc aux stades les plus avancées de la croissance tumorale; 3/ Possible détresse respiratoire due à la présence de métastases pulmonaires aux stades les plus avancées de la dissémination métastatique; 4/ Possible inflammation lors des injections intrapéritonéales répétées; 5/ Introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons lors des gavages oraux.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélever les tumeurs et les analyser par biochimie, biologie cellulaire, analyse transcriptomique et histopathologique.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement, les études in vitro ont été réalisées sur des lignées cellulaires de mélanome et des cellules primaires de mélanome fraichement isolées de patients au lieu de cellules isolées à partir des animaux. Cependant, pour mieux comprendre les conséquences du ciblage des canaux calciques de type L dans la progression, la dissémination métastatique et la résistance thérapeutique du mélanome, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas d’appréhender l’impact des antagonistes calciques sur le fonctionnement des différents types cellulaires qui composent le microenvironnement tumoral et leurs interactions avec les cellules tumorales.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, les souris « sauvages » seront commandées chez un fournisseur agréé afin de ne pas générer d’animaux surnuméraires. . L'utilisation d'un logiciel d'analyse de puissance et de tests statistiques appropriés nous a permis de réduire au minimum la taille des groupes permettant de démontrer une différence statistique.
Raffinement
Un effort de raffinement sera réalisé en utilisant préférentiellement des femelles de façon à limiter les risques de blessures consécutives aux agressions entre congénères. Pour réduire l'angoisse des animaux, nous hébergerons 6 souris/cage dans des conditions enrichies d’élevage (igloo en polycarbonate et une tigette en papier irradié pour permettre la nidification). Dans les différentes procédures, le suivi pondéral régulier des souris sera un bon indicateur de leur état général. Dans le cas d’injections intrapéritonéales répétées, nous effectuerons une rotation des sites d’injection et surveillerons quotidiennement l’aspect des sites d’injection. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (au moins 3 fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure. Enfin, lorsque ce sera possible, nous aurons recours à l'utilisation de techniques d'imagerie non invasive pour suivre l'évolution de la tumeur, afin de prendre en compte et soulager au plus tôt toute douleur manifestée par les animaux. Lors des acquisitions d'images, les souris seront anesthésiées et placées sur un plateau chauffant de façon à éviter l'hypothermie
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. Les animaux seront utilisés à l'âge de 8 semaines pour une période de 8 semaines, certaines expériences pouvant aller à 90 jours de traitement. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire des analyses protéiques, génomiques et histologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée.
Evaluation de l’effet d’un traitement sur un modèle rat de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une activité préclinique de service, menée sur des composés thérapeutiques pour le compte de tiers : 2 160 rats vont être utilisés dans ce cadre, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un virus est injecté dans leur cerveau pour détruire les neurones dopaminergiques, en une heure, avant des traitements administrés sur un à deux mois, des prélèvements sanguins et des mesures du comportement moteur pouvant durer trois heures, deux à quatre fois. Le porteur liste les atteintes possibles selon la voie d'administration, fausse route et irritation des muqueuses nasales, réactions cutanées, douleurs postopératoires de deux jours en moyenne, hémorragie ou infection au site opératoire. Leurs cerveaux sont prélevés après la mise à mort, et le porteur annonce qu'un modèle animal reproduisant toutes les caractéristiques motrices et cognitives de la maladie reste l'objectif à terme de cette prestation.
Objectifs
La maladie de Parkinson se définit par un dysfonctionnement du système nerveux central et périphérique. La maladie de Parkinson touche un nombre important de personnes dans le monde. L'origine de cette maladie est encore mal comprise et les traitements actuels visant à soulager les symptômes ne sont pas optimaux. Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel.Pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques, nous proposons la réalisation de modèles rongeur de la maladie de Parkinson qui permettent d’en reproduire les symptômes, afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements et de comprendre leurs mécanismes d’action.
Bénéfices attendus
Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensables avant les essais chez l’homme. Le bénéfice attendu est l’identification de nouveaux outils thérapeutiques.
Procédures
Les animaux vont subir une injection intracérébrale (1 heure), une administration de traitement dans le corps (1 à 2 mois/1 min) ou une chirurgie (1 chirurgie/30 min), des prélèvements de sang (1 à 4 fois/5 min) et des mesures du comportement moteur (2 à 4 fois/3 heures).
Impact sur les animaux
Les nuisances possibles pour chaque méthode d'administration sont : Per os : il existe un risque faible de fausse route, ce qui peut entraîner des problèmes respiratoires passagers et un risque faible d’irritation à la suite de gavages répétés. SC et IP : l'injection peut causer une douleur ou une irritation locale au niveau du site d'injection. Intranasal : elle peut provoquer une irritation des muqueuses nasales de l'animal, entraînant un inconfort temporaire. Intradermique : certains animaux peuvent développer des réactions cutanées locales. L’administration du traitement par injection stéréotaxique ou intrathécale pourra entrainer des douleurs postopératoires qui devraient durer 2 jours en moyenne. La chirurgie entraine également un léger risque d’hémorragie ou d’infection au niveau du site opératoire.
Devenir
A l’issu de la procédure, les animaux seront mis à mort et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité préclinique de service. Ce projet recourt à l’utilisation de rats pour plusieurs raisons éthiques : - L’utilisation d’approches neurobiologiques invasives ne peut être faite chez l’homme ce qui rend ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf pour les études invasives). -Dans le cadre des modèles de maladie neurodégénérative, l’objectif à terme est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (motrice, cognitive) de ces affections. Aucun modèle in vitro ne permet l’étude de telles fonctions. De ce fait, le recours à l’animal pour étudier les manifestations comportementales de la maladie et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques. Une analyse de puissance a été effectuée, permettant de réduire le nombre maximum d'animaux par groupe à 12, pour des résultats statistiques exploitables. Pour chaque animal, un grand nombre de prélèvements post mortem sera réalisé pour maximiser l’utilisation qui peut être faite : les différentes structures cérébrales, la moelle, le liquide céphalorachidien, le sang et les organes. L’utilisation des mâles et des femelles nous permettra de porter une attention particulière au R de réduire dans la règle des 3R.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (2 par cage) et ils bénéficieront d’un enrichissement de leur milieu (tunnel, bâton de bois à ronger). Le confort de l’animal sera pris en compte à tout moment. Leur surveillance est assurée par un suivi visuel journalier (weekend et jours fériés inclus) et une pesée hebdomadaire. Le constat de signes de souffrance entraine une surveillance accrue, avec enregistrement sous forme de fiche de suivi spécifique avec les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc.) et l’évolution des signes. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie avec administration d'un analgésique et d'un anesthésique local permettant de réduire la douleur des animaux. Le lendemain de la chirurgie, les animaux reçoivent une injection d'un analgésique. Un suivi post opératoire spécifique de 3 jours est mis en place. Le bien être est scoré via l’observation de différents critères de bien-être. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, des traitements vétérinaires si nécessaire. Les procédures sont réalisées par un personnel compétent.
Choix des espèces
Le rat est un excellent modèle pour les maladies humaines, car son système nerveux est proche de celui de l’homme. Ce modèle a un intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point de traitements thérapeutiques. De plus la dégénérescence dopaminergique par l’injection de virus est bien établie dans notre équipe et les travaux sur le rat sont largement décrits dans les études des maladies neurodégénératives. La maladie de Parkinson apparait préférentiellement à l’âge adulte, les animaux seront donc utilisés à partir de 5 semaines d’âge.
Evaluation de nouveaux tPA mutants pour le traitement de l’AVC ischémique.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées pour prélever organes et tissus, 350 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un AVC leur est provoqué avec ouverture du crâne sous anesthésie, puis un activateur du plasminogène muté leur est injecté, l'ensemble durant deux heures, avec deux passages de dix minutes en imagerie par résonance magnétique. Le porteur annonce une perte de masse corporelle, des douleurs postopératoires, du stress et des déficits fonctionnels, et compte un test comportemental répété quatre fois vingt secondes sans en préciser la nature. Il écrit que la mise à mort de tous les animaux répond au critère de réduction et que la sévérité de l'AVC ne permet pas, pour leur bien-être, de les garder en vie.
Objectifs
Lors d’un AVC ischémique, le traitement pharmacologique est une injection d’une enzyme recombinante (sans mutations) qui est l'activateur tissulaire du plasminogenè (tPA). Il permet de déclencher la dégradation du caillot sanguin mais présente un risque d’hémorragie, une augmentation de l’inflammation et un risque d’ouverture de la barrière hémato-encéphalique qui augmenterait la lésion. Or, le tPA existe sous deux formes : simple chaine et double chaine. Ces deux formes ont des effets différents dans l’organisme. Le tPA une fois clivé au caillot sanguin devient un tPA double-chaine qui serait responsable des effets indésirables. Alors, afin de les diminuer, nous avons muté le tPA afin de générer des nouveaux mutants originaux. Après une évaluation précise et significative in vitro de leur capacité à lyser des caillots sanguins ainsi qu’une étude préliminaire in vivo afin de déterminer leur demi-vie et leur répartition dans l’organisme nous avons sélectionné les meilleurs mutants. Notre objectif est d’évaluer chez la souris l’efficacité des nouveaux tPA mutants. Au regard du risque hémorragique, du volume de lésion, de la recanalisation, de la reperfusion, de l’inflammation et de la récupération fonctionnelle, nous déterminerons les effets des nouveaux mutants du tPA in vivo pour in fine proposer une alternative au traitement classique de l’AVC ischémique chez l’humain. De façon concomitante, nous comparerons les différences entre les deux formes du tPA afin de mieux comprendre leurs effets lors d’un traitement de l’AVC ischémique.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet pourront grandement améliorer notre compréhension de la physiopathologie de l’AVC et présentent un grand potentiel translationnel vers l’humain via l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Procédures
- Procédures 1 et 3 : habituation à la préhension (>1 semaine), test comportemental (4 fois de 20s), procédure chirurgicale (induction de l’AVC avec craniotomie sous anesthésie et analgésie suivi de l'administration du traitement (tPA), 2h ), imagerie par résonnance magnétique (2 fois pendant 10min), mise à mort (chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie en vue du prélèvement des organes, 5min). - Procédures 2 et 4 : procédure chirurgicale (induction de l’AVC avec craniotomie sous anesthésie et analgésie suivi de l'administration du traitement (tPA), 2h), imagerie par résonnance magnétique (2 fois pendant 10min), mise à mort (chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie en vue du prélèvement des organes, 5min).
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient pour l’ensemble des procédures : une perte de masse corporelle, des douleurs post-opératoires, du stress et des déficits fonctionnels.
Devenir
Tous les animaux utilisés au cours du projet seront mis à mort afin de récupérer les organes et les tissus pour des analyses cytologiques, histologiques, biochimiques et enzymatiques. Cela répond au critère de réduction puisqu’il permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. De plus la sévérité de l’AVC ischémique ne permet pas pour le bien-être animal de garder en vie les animaux.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Les alternatives comme la culture cellulaire en déprivation d'oxygène et de glucose ou encore des cultures organotypiques de tranches de cerveaux ne permettent pas dévaluer les effets secondaires du tPA dont notamment le risque pro-hémorragique et ne permettent pas d'évaluer la récupération fonctionelle à la suite du traitement. De plus, nous avons au préalable mener des expériences in vitro.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature mais aussi en fonction de la part d'inconnu avec laquelle nous souhaitons mettre au point un nouveau modèle animal. Le nombre d’animaux pourra être revu à la baisse selon l’aisance de l’expérimentateur (habileté, expérience dans les différentes techniques prévues) et de la significativité des résultats. Un nombre moyen pour chaque groupe, comprenant un pourcentage d'entrainement à ce nouveau modèle et de perte dans ce nombre (15%) a donc été défini. De plus, l'utilisation de techniques d'imagerie non invasives permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Des sous-étapes de techniques in vitro déjà validées pourront également compléter et vérifier le passage de la prochaine étape in vivo.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Il sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum et une période d'une semaine d'acclimatation sera respectée. Les animaux seront placés dans un environnement enrichie avec un dôme de cellulose, des carrés de cotons et du papier kraft dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux (acclimatation, observation, médication, réveil dans enceinte chauffée, croquettes mouillées, masse corporelle) pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant tout le projet jusqu’à la mise à mort de l’animal. Tout le matériel et consommables utilisés dans cette procédure expérimentale seront neufs (comme les seringues et aiguilles), ou soigneusement nettoyés et désinfectés pour les réutiliser (pinces métalliques).
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence utilisée pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. Les propriétés tissulaires des artères cérébrales sont identiques chez l’homme et la souris. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier le traitement de l'accident vasculaire cérébrale. Les animaux utilisés seront des souris jeunes adultes âgées de 8 à 15 semaines. Ces âges correspondent à ceux utilisés en majorité dans les modèles d’AVC.
Humanisation du foie de souris et modélisation de pathologies hépatiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Des souris immunodéficientes reçoivent des injections de composés qui tuent les cellules de leur foie, puis une greffe de cellules hépatiques humaines ou d'implants, avec un risque d'hémorragie accru quand l'injection passe par la veine porte. 7950 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, où des candidats médicaments contre des infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques sont administrés par voie respiratoire, orale ou injectable. Le porteur indique que l'humanisation n'aboutit que dans environ 50 % des cas, écrit que le nombre de souris par étude sera "réduit au maximum", et précise que le total a été fixé en anticipant une croissance chaque année, "en accord avec le plan commercial". 200 souris pourront être réutilisées dans d'autres projets de l'établissement, dont un projet de formation interne aux gestes techniques, les autres étant tuées parce qu'elles ne recouvreront pas leur état de santé, selon le porteur.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de caractériser la toxicité et l'efficacité de candidats médicaments visant par exemple à guérir les infections virales, le cancer du foie ou des maladies métaboliques, ou encore des traitements indiqués en cas d'insuffisance hépatique. Pour ce faire nous utiliserons des souris au foie humanisé permettant de recréer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. Le protocole consiste à remplacer les cellules hépatiques de souris par des cellules hépatiques humaines. Les cellules hépatiques humaines pourront ensuite par exemple être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de recréer, dans la souris, un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. De plus les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains et bien caractérisée au niveau génétique. Les propriétés génétiques de la souche immunodéficiente pourront également être exploitées pour l’étude de l'insuffisance hépatique.
Procédures
1 ou plusieurs injection(s) de composé(s) induisant la mort des hépatocytes. Chaque injection dure entre 10 et 15 secondes. Injection SC d’analgésique : moins d’une minute. Greffe des cellules ou implants thérapeutiques : entre 5 et 30 minutes. En parallèle, des candidats médicaments seront administrés par voie respiratoire, orale ou injectable pour évaluer leurs activités thérapeutiques. Pour les prélèvements sanguins, les volumes maximaux de prélèvements seront proportionnels au poids de l’animal selon un schéma établi et une limite fixée. La répartition des prélèvements figurera dans le protocole d’étude et sera contrôlée par un vétérinaire.
Impact sur les animaux
Des nuisances peuvent être induites par la ou les injection(s) de composé induisant la mort des hépatocytes, les risques inhérents à tout acte chirurgical, la greffe des cellules, une gêne au niveau du transit intestinal liée au déplacement des viscères dans les heures suivant l’injection d’hépatocytes via la veine porte, le risque hémorragique accru pour l’injection d’hépatocytes via la veine porte, l’administration de traitements, la greffe d’implants thérapeutiques (patchs ou autres), l’induction des maladies, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.
Devenir
Dans le cadre d’une utilisation continue, les animaux issus de ce projet et ayant subit une humanisation pourront être utilisés dans d’autres projets autorisés par le MESRI dans l’établissement utilisateur. Des souris pourront être utilisées dans le projet « Formation interne aux procédures et gestes techniques appliqués aux souris », sous réserve d’un avis vétérinaire favorable. Sinon, les animaux sont euthanasiés car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.
Remplacement
Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie, qui présente une architecture et un fonctionnement complexes qui ne peuvent être reproduits in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophiles, ...). La souris au foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide et pertinent pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les pathologies hépatiques, telles que les maladies virales ou métaboliques, les insuffisances hépatiques et le cancer chez l’humain.
Réduction
Un total de 7950 souris seront utilisées, couvrant une période 5 ans et permettant de réaliser par exemple 78 études précliniques de 50 souris sachant que le processus d’humanisation n’est efficient qu’à environ 50%. Ce nombre a été déterminé sur base du nombre d’études effectuées les années antérieures et anticipant une croissance chaque année, en accord avec le plan commercial. Le nombre d’animaux utilisés dans chaque étude sera réduit au maximum en se basant sur des tests statistiques adaptés aux effets attendus de la série et sur base des données historiques collectées par l’entreprise. De plus, 150 souris seront utilisées dans le cadre de l’implantation du patch correspondant à une étude pilote de 5 souris et une première étude de 145 souris pour la mise en place du modèle d’insuffisance hépatique et l’évaluation de l’efficacité du patch. L’humanisation du foie des souris via injection d’hépatocytes dans la veine porte est une mesure de réduction par l’amélioration attendue de la réussite de la greffe (autour de 50% pour l’injection splénique d’hépatocytes (PE1)) et donc l’utilisation de moins d’animaux.
Raffinement
En début d'étude et tout en respectant la réglementation en vigueur, les souris seront hébergées préférentiellement par groupes sociaux stables composés de 5 individus. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum sauf si le protocole d’étude nécessite un jeûne de nourriture. La durée de ce jeûne ne pourra dépasser 12 heures par semaine avec un maximum de 6h consécutives. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Des compléments alimentaires pourront être administrés suivant l’état de santé des animaux. La cage contiendra à minima une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. En outre, des enrichissements de qualité seront fournis dans chacune des cages : par exemple morceaux de bois, tunnel en carton, kraft et/ou boules de cotons. Les souris seront hébergées dans une atmosphère disposant d’un cycle lumière-obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 4 jours. Lors d’un changement de zone au sein de l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation d’une nuit au minimum. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle de scores appliquée dès le premier geste invasif. Le vétérinaire aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur s’il/elle le juge nécessaire. Concernant les prélèvements sanguins, les fréquences sont limitées et définies dans le protocole d’étude. Les animaux n’attendront pas dans la salle d’euthanasie. Une salle d’attente est prévue à cet effet. Lorsqu’un animal rentre en salle d’euthanasie, il doit être immédiatement euthanasié. Les points limites conduisant à une euthanasie seront fonction du score clinique et de la perte de poids.
Choix des espèces
90 % des gènes humains ont un équivalent chez la souris, permettant d’élaborer des approches génétiques et fonctionnelles valides. Lorsque les gènes produisent des effets différents entre souris et humain, le remplacement du gène de la souris par son équivalent humain permet la création de lignées humanisées. De plus, la souche immunodéficiente présente une mutation génétique permettant d’induire la mort sélective des hépatocytes murins. Cela permet non seulement de greffer des hépatocytes humains en vue d’humaniser le foie, mais également d’évaluer des solutions thérapeutiques indiquées dans le cas de défaillance hépatique. L'humanisation du foie se déroulera sur des animaux âgés de 5 à 10 semaines. Il a été décrit que travailler avec des animaux jeunes permet une meilleure prise de greffe. Par ailleurs, la taille de la rate étant, proportionnellement, supérieure, la transplantation des cellules sera facilitée. Les pathologies hépatiques pourront être induites sur les animaux humanisés ou non.
Modèles pathologiques induits chez les rongeurs
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 2500
Cochons d'Inde : 1500
Hamsters dorés : 1500
Paralysie partielle ou totale des membres, douleurs articulaires, automutilation possible : 10000 rongeurs subissent l'induction d'une encéphalomyélite auto-immune ou d'une arthrose, puis reçoivent des substances à tester, parfois chaque jour jusqu'à leur mise à mort. 4500 souris, 2500 rats, 1500 cochons d'Inde et 1500 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour des analyses in vitro et ex vivo. Les maladies sont provoquées par des injections répétées sur des rongeurs éveillés, sous la peau puis dans la cavité abdominale pour l'encéphalomyélite, afin d'évaluer l'efficacité ou la toxicité de substances et de dispositifs médicaux pour l'industrie pharmaceutique et les "clients" de l'établissement. Le porteur justifie le choix des rongeurs par leur petite taille, un organisme "similaire à l'Homme" et le fait qu'ils sont "faciles à héberger". Il affirme aussi que les traitements testés "minimiseront les nuisances", alors que l'objectif inclut d'en évaluer la toxicité.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de réaliser différents traitements chez le rongeur après induction de modèles expérimentaux, l’arthrose et l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE). Le but est d’évaluer l’efficacité ou la toxicité de substances ou dispositifs médicaux pour l’industrie pharmaceutique dans des modèles présentant les signes caractéristiques de pathologies, soit l’arthrose et la sclérose en plaques.
Bénéfices attendus
Ce projet permet d’induire des pathologies afin de tester des substances sur des modèles expérimentaux correspondants. Le bénéfice attendu est donc de pouvoir développer et tester ces substances sur l’Homme afin de proposer des traitements aux pathologies correspondantes. In fine, l’objectif est d’améliorer la santé humaine.
Procédures
Pour le développement du modèle de l’arthrose, les animaux vigiles reçoivent plusieurs injections d’une substance en sous-cutané, de 2 à 5 injections. Ensuite, une substance sera inoculée en dose unique ou répétée après le développement de l’arthrose. Ces administrations peuvent être quotidiennes jusqu’à la mise à mort des animaux. Les substances sont administrées par voie sous-cutanée, intraveineuse, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intra-articulaire ou orale. Pour la mise en place du modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, les animaux vigiles subissent l’injection d’une première substance en sous-cutanée, pratiquée sur le haut et sur le bas du dos, puis l’injection en intrapéritonéale d’une seconde substance qui est répétée 2 à 3 jours après. En fonction de l’étude, si l’administration sur animal vigile n’est pas possible, il peut être réalisée une anesthésie générale et la mise en place d’une analgésie adaptée. Une substance test peut ensuite être injectée par voie orale, intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique. A l’issue du projet, tous les animaux sont mis à mort pour des analyses vitro et ex-vivo.
Impact sur les animaux
Le modèle de développement d’arthrose peut générer de la douleur au niveau des articulations. Les effets liés au développement de modèle peuvent aboutir à une baisse d’activité ainsi qu’un changement de comportement (baisse de la prise alimentaire, agressivité, automutilation, …). Les traitements testés minimiseront les nuisances. Le modèle de développement d’encéphalomyélite auto-immune peut provoquer une paralysie partielle ou totale au niveau des membres. Cette paralysie peut s’accompagner d’une allodynie et/ou d’une douleur plus ou moins persistante au niveau des membres paralysés. Les premiers signes cliniques peuvent apparaitre avec une paralysie progressive de la queue et du train arrière qui peut se propager au niveau du train avant. Les effets liés au développement de ce modèle peuvent aboutir à des changements comportementaux (baisse d’activité, baisse de la prise alimentaire) et physiques (perte de poids, absence de réflexes, immobilité). Les traitements testés minimiseront les nuisances.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, tous les animaux sont mis à mort pour réaliser des analyses vitro et ex-vivo.
Remplacement
Le développement de produits pharmaceutiques ou de dispositifs médicaux nécessite de réaliser des expériences chez l’animal dans le cadre du développement préclinique, afin d’évaluer l’activité des produits dans un organisme complet et complexe. Des tests in vitro sont réalisés au préalable par nos clients ou par notre installation. Il est nécessaire de recourir aux animaux afin de tester une substance dans un organisme complexe. Les modèles induits décrit dans ce projet sont caractérisés par des signes cliniques physiques. Dans le cas de l’arthrose, il s’agit de douleurs et de raideurs tandis que dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale il s’agit de paralysie des membres. Ces signes pathologiques et leurs résorptions ne peuvent être observés qu’avec l’utilisation d’animaux.
Réduction
Pour chaque protocole, le nombre d’animaux est réduit au minimum requis tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Par exemple, un nombre minimum d’animaux est requis pour les essais réglementaires, chaque groupe est composé de 10 animaux minimum (5 mâles et 5 femelles minimum). Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism 4, comme décrit dans les procédures internes.
Raffinement
De l’enrichissement comme des batônnets à ronger, des huttes/tunnels, du papier kraft/coton sont ajoutés dans les cages. Les animaux sont hébergés en groupe sociaux compatibles. En fonction du mode d’administration, il est possible de mettre en place une analgésie adaptée en fonction des observations quotidiennes des animaux. En fonction du projet, le poids corporel des animaux sera enregistré deux fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience. Si nécessaire, une pesée plus régulière peut être réalisée. Les animaux sont observés quotidiennement et un monitoring (observation du déplacement, posture, paralysie, comportement, respiration, aspect des yeux, de la peau, des poils, des muqueuses et des excrétions dans la cage) peut être mis en place. La perte de poids sera évaluée en fonction du poids de départ de chaque animal. Selon les essais et besoins expérimentaux, une observation de la tolérance locale (observation de l’apparition et de l’évolution d’œdème ou d’érythème) après chaque traitement peut être réalisée. Pour le développement de modèle de l’arthrose, un scoring est réalisé pour chaque patte de l’animal (enflure et rougeur de la cheville ou poignet jusqu’aux phalanges) deux fois par semaines au minimum après traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Pour le développement de modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un scoring sera réalisé quotidiennement après traitement afin d’évaluer l’apparition d’une paralysie (queue, membres postérieures et antérieures) jusqu’à la fin de l’étude. Des points limites spécifiques sont développés pour chacune des procédures décrites.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des mammifères de petite taille ayant un organisme similaire à l’Homme. Leur génotype est connu et ils sont faciles à héberger. En outre, de nombreux articles bibliographiques sont disponibles pour décrire les différents modèles. Les animaux utilisés seront des adultes ou des jeunes adultes, car ils nécessitent un système immunitaire et des organes totalement développés et fonctionnels.
Recherche d’un effet analgésique de différents produits chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Rats : 1200
1 200 souris et 1 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La voûte plantaire d'une patte arrière est incisée sous anesthésie générale, ou un produit inflammatoire y est injecté, puis les seuils de douleur sont mesurés le lendemain. La douleur est ici l'effet indésirable attendu et le paramètre étudié, le projet visant à mesurer l'effet antalgique propre de produits déjà utilisés en clinique. Le porteur affirme que l'étude de la douleur exige un "organisme entier", pose douze animaux par condition comme un minimum, et indique que la seconde espèce ne sera pas utilisée si la première donne des résultats satisfaisants.
Objectifs
Le but du projet est de rechercher des produits efficaces pour diminuer ou supprimer une douleur aiguë, notamment les douleurs postopératoires qui sont caractérisées par une hypersensibilité tactile. La douleur est définie comme une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, liée à une lésion tissulaire existante ou potentielle. Elle peut être aiguë ou chronique, spontanée ou provoquée, discrète ou intense, mais elle est avant tout personnelle, subjective, émotionnelle et comportementale. La douleur postopératoire aiguë est causée par un geste chirurgical et elle est présente immédiatement après l'opération, provoquée par des lésions induites par la chirurgie ainsi que par un processus inflammatoire qui entraine un excès de sensibilité à la douleur (nociception). Quand la douleur postopératoire est mal traitée, une douleur postopératoire chronique peut persister pendant plusieurs semaines ou mois. Si elle persiste, elle risque de ralentir le rétablissement et de devenir chronique. Elle est alors plus difficile à traiter. Notre projet permet de déterminer l’effet antalgique propre d’un produit.
Bénéfices attendus
Une douleur postopératoire mal traitée peut entrainer des douleurs chroniques qui persistent à distance de la chirurgie pendant plusieurs semaines ou mois. Celle-ci est fréquente et peut se retrouver chez 40% des patients. Elle est associée à une hypersensibilité tactile diffuse autour de la chirurgie et qui est assez difficile à bien prévenir et ensuite à bien traiter quand elle s'est développée. La prise en charge rapide et efficace de la douleur postopératoire est importante pour assurer un confort postopératoire et une réhabilitation précoce, et pour éviter le développement de douleurs prolongées ou chroniques. Ce projet permet de déterminer précisément l'effet antalgique de produits utilisés en condition clinique, notamment sur la prévention d'une hypersensibilité tactile.
Procédures
Une chirurgie avec incision de la voute plantaire d'une patte arrière est réalisée sous anesthésie générale, en 10 minutes au maximum, la veille des tests, avec une durée maximale de 2 jours. Une administration d'un produit inflammatoire dans une patte arrière, et les tests sont réalisés le jour même avec une durée maximale d'une journée. L'objectif des procédures est de déterminer l'efficacité de molécules antinociceptives en réalisant des mesures des seuils de douleur.
Impact sur les animaux
L'administration d'un produit inflammatoire et la chirurgie se font sous anesthésie générale à l'isoflurane afin de réduire le stress de la manipulation. Cependant, les effets indésirables attendus de ces 2 protocoles sont une douleur qui est le principal paramètre étudié. Des effets indésirables peuvent survenir après la chirurgie. Une inflammation au niveau de la cicatrice peut survenir nécessitant une désinfection.
Devenir
Les procédures étant classées "sévère", les animaux ne seront pas réutilisés dans un autre projet. A la fin de chaque expérimentation, après recueil des paramètres prévus, les animaux seront euthanasiés quand la procédure est terminée. Aucun prélèvement de sang ou d’organe n’est prévu dans le projet.
Remplacement
L'étude de la douleur chez l'animal implique l'utilisation d'animaux entiers. La sensibilité à la douleur est complexe avec des symptômes qui touchent différents organes. L'utilisation de modèle avec des organes isolés ne permet pas d'évaluer l'influence de différents produits sur la sensibilité à la douleur. Des résultats obtenus lors de précédentes études et des données de la littérature permettent de sélectionner les produits à étudier (doses, voies d'administration, volumes). Des alternatives non animales ne peuvent être envisagées pour rechercher l'ensemble des objectifs prévus. Les méthodes expérimentales in vitro ou in silico ne permettent pas de reproduire l’ensemble des symptômes de la douleur, il est donc nécessaire de travailler sur un organisme entier.
Réduction
La variabilité des réponses aux effets d’un traitement chez le rongeur justifie une taille de groupe de minimum 12 animaux par condition expérimentale. Un effectif inférieur expose à un risque de devoir reproduire les procédures pour valider statistiquement la solidité des résultats obtenus par une analyse de la variance. En cas de résultat significatif, les différences entre chaque groupe et le groupe contrôle seront explorées à l’aide d’un test de comparaisons multiples adapté. En cas de trop petit nombre d'animaux, il faudrait refaire une étude pour confirmer les effets et observer des différences significatives entre les groupes. En cas de faible ou non efficacité d'un produit, son étude sera arrêtée. Si une étude réalisée chez une espèce donne des résultats antalgiques satisfaisants, la deuxième espèce ne sera pas utilisée.
Raffinement
Une surveillance attentive des animaux est réalisée. Les animaux seront hébergés à plusieurs afin de maintenir leur socialisation et dans des cages enrichies avec des tunnels et/ou du Sizzle dry et des aliments directement dans les cages (dans les copeaux). Les administrations des différents produits sont effectuées par du personnel expérimenté. L'administration par voie orale se fera à l’aide de sondes souples pour limiter les irritations. L'administration d'un produit inflammatoire et la chirurgie (animaux placés sur une plaque chauffante pour limiter le refroidissement) se feront sous anesthésie générale. Un produit protecteur est instillé au niveau de chaque oeil pour éviter le déssèchement de la cornée. Les animaux seront observés attentivement en respectant les points limites. Ils seront euthanasiés en cas d'atteinte des points limites mis en place pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse.
Choix des espèces
Après recherche bibliographique, le rat et la souris sont apparus parmi les modèles animaux les plus fréquemment décrits, et les plus appropriés pour ce projet. Les animaux utilisés sont des adultes conformément aux publications de référence.
Analyses de tolérance de candidats médicaments anticancéreux administrés a des souris CD-1 par voie intraveineuse
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Un prélèvement sanguin de grand volume par piqûre dans le cœur, sous anesthésie sans réveil et pouvant provoquer un arrêt cardiaque, attend chaque souris en fin d'expérience. 1 440 souris CD-1 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et environ 288 d'entre elles, écartées du protocole faute d'un poids suffisant ou à cause d'un problème à l'injection, sont d'abord utilisées pour l'entraînement à des gestes techniques avant d'être tuées. Les autres reçoivent une injection dans la veine de la queue puis quatre prélèvements de sang par éraflure de cette même veine, sur vingt-huit jours, pour mesurer la tolérance de candidats médicaments anticancéreux. Le porteur affirme qu'un "organisme entier" et vivant est "nécessaire" et qu'"aucune alternative" ne peut se substituer à la souris.
Objectifs
Ce projet vise à déterminer la tolérance lors de l’administration des candidats de thérapie ciblée anticancéreuse. Les données de tolérance sont nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine en dose unique. Ces composés ayant une efficacité comparable entre humains/souris, les résultats de tolérance (projet actuel), seront objectivables entre l’humain et le modèle souris et serviront, à terme, à définir les modalités d'administration du médicament (dose et fréquences), lors des premiers essais cliniques. Ils permettront également d’objectiver des évènements indésirables. La première dose de cette étude sera déterminée en se basant sur une dose de référence connue, efficace et bien tolérée.
Bénéfices attendus
Les données de tolérance seront nécessaires afin d’analyser le comportement des candidats anticancéreux dans la circulation sanguine. Ces études permettront de modéliser au mieux les doses et les fréquences à utiliser pour les études d’efficacité et ainsi, à terme, de déterminer les doses et les fréquences des premières études cliniques chez l’Homme.
Procédures
# Une contention et des prélèvement(s) sur animal vigile seront prévues sur chaque animal : -lors de l’injection par voie intraveineuse dans le veine de la queue des candidats anticancéreux J(0) (5minutes) -lors de chacun des prélèvements sanguins (en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3), J(0), J(3) et J(9) post-traitement - 5 minutes). Une anesthésie générale sans réveil sera effectuée sur chaque animal en fin d’expérimentation et/ou atteignant les critères éthiques pour effectuer un prélevement sanguin final de grand volume, suivie d’une mise à mort (10 minutes).
Impact sur les animaux
Projet en sévérité modérée: # Les animaux subirons un stress durant plusieurs minutes (pendant et suivant l’acte) lors de la manipulation : (1) changes, (2) pesées, (3) contentions et (4) anesthésies. # Les animaux subiront une douleur de légère à modérée durant plusieurs secondes pendant l’acte lors : (1) de l’injection par voie intraveineuse des candidats anticancéreux (au temps J(0)), et (2) de chacun des prélèvements sanguins (en éraflant la veine de la queue pour ne prélever qu'une goutte de sang) à chaque temps (J(-3), J(0), J(3) et J(9) post-traitement). Ces prélèvements faibles sont généralement très bien tolérés par l'animal. # S’agissant d’une expérience de tolérance, les composés de la classe thérapeutique utilisée peuvent induire des évènements indésirables à haute dose (parmi les plus attendus : perte d’appétit, fatigue, diarrhées, perte de poils…). Il est à noter que ces effets sont généralement transitoires (environ une semaine pour les doses les plus fortes et culminant autour du 3ème jour post-traitement). Il est à noter que ces études ne sont pas conditionnées à une atteinte de la dose maximale tolérée chez l'animal et que la dose maximale de cette étude est plafonnée à une dose considérée comme bien tolérée en clinique pour cette classe de médicaments. # Un prélevement sanguin final de grand volume, pouvant induire un arrêt cardiaque, sera pratiquée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil sur l’ensemble des animaux arrivant en fin d’expérience (à 28 jours post-traitement) ou en cas d'atteinte des critères éthiques.
Devenir
# Tous les animaux ayant atteint les critères éthiques ainsi que les animaux arrivant en fin d’expérience à 28 jours post-traitement auront un prélèvement sanguin de grand volume (par piqure dans le coeur) effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil. # Les animaux non entrées en protocole (problème à l'injection, poids inférieur à 24g... env 20%), seront réutilisées pour pouvoir pratiquer des entrainement aux geste techniques, puis mises à mort selon les critères de la formation sous controle de la SBEA et/ou controle vétérinaire.
Remplacement
S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris.
Réduction
Le procédé de micro-échantillonnage lors des prélèvements sanguins permet d’obtenir l’ensemble des valeurs pour un même animal en ne lui prenant que de très faibles quantités de sang. Le nombre d’animaux utilisés est ainsi considérablement réduit par rapport à un prélèvement sanguin classique et les variations inter-individus seront également mieux maîtrisées. En cas d’obtention de la dose maximum tolérée, les animaux prévus pour les doses suivantes seront annulés. Les animaux étant livrés chaque semaine pour les différents tests de dose, cela permettra de diminuer le nombre d’animaux entrés en protocole. Pas d’utilisation de groupe contrôle nécessaire par rapport aux échantillonnages de par l’utilisation d’un prélèvement sur les souris en expérience à J(-3) avant traitement par les candidats anticancéreux (permettant ainsi de limiter le nombre d’animaux).
Raffinement
Les animaux seront hébergés par groupe sociaux de 4 à 5 dans des cages transparentes et aux dimensions adaptées avec un accès à l’eau et à la nourriture ad libitum et un enrichissement de l’environnement (coton pour nidification, tunnels, bâtons à ronger, ou équivalents). Avant la mise en place du protocole, les souris seront acclimatées pendant une période d’une semaine afin de limiter leur stress. Chaque essai de dose sera séparé du précédent d’une semaine, ce qui permettra d’ajuster au mieux les doses (ainsi que la souffrance résultant d’utilisation de doses trop élevées). Une surveillance comportementale et physiologique poussée des animaux ainsi que la définition d’une grille de score adaptée et suffisamment prédictive permettra d’anticiper et d’éviter au mieux toute souffrance animale. Les animaux seront observés sur critères physiques et comportementaux deux fois par jour pendant les trois premiers jours de traitement, puis une fois par jour jusqu’à la fin de l’expérience à J(28), et seront pesés une fois par jour pendant la première semaine, puis trois fois par semaine jusqu’à la fin de l’expérience à J(28). Un système de surveillance est mis en place au sein de l'établissement utilisateur pour le suivi des animaux nécessitant une surveillance accrue le week-end et les jours fériés. Les animaux inclus dans la grille de score n'atteignant pas les critères éthiques de mise à mort recevront des soins adaptés (alimentation et abreuvement facilités, réchauffement...). Une pommade antalgique/anesthésique pourra également être utilisée en cas d’inflammation au site d’injection. Le prélèvement sanguin final de grand volume sera effectuée sous anesthésie/antalgie générale sans réveil et la mise à mort de l'animal sera assurée par surdose d'anesthesiques. Les prélèvements d’organes seront réalisés après la mort de l'animal.
Choix des espèces
S’agissant d’analyses de tolérance, un organisme entier et vivant est nécessaire afin d’obtenir des résultats représentatifs. De plus, les candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse étudiés dans ce projet ayant une efficacité comparable entre humains/souris, aucune alternative ne peut se substituer à un modèle souris. La souris est une espèce animale à la fois petite et bien caractérisée pour ces études. En plus, les données d’efficacité anticancéreuses et de pharmacocinétique (le devenir du médicament dans le sang au cours du temps) seront générées sur cette même espèce animale afin de déterminer au mieux les doses et les fréquences d'administration de ces candidats médicaments de thérapie ciblée anticancéreuse chez l'Homme. Les animaux seront livrés à 7 semaines de développement et inclus en expérience à 8 semaines . A cet âge-là, les animaux sont adultes avec un système immunitaire et des organes matures permettant une tolérance pertinente par rapport au type de thérapies utilisées dans ce projet.