Rongeurs
Inhibition de la croissance tumorale en ciblant une molécule impliquée dans le système immunitaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Les souris dont la tumeur greffée atteint le volume limite fixé sont mises à mort avant le terme de l'étude. 5 120 souris femelles vont être utilisées, 4 770 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 350 d'un niveau sévère, toutes tuées. Greffées sous la peau ou dans la mamelle avec des cellules de mélanome, de fibrosarcome ou de cancer mammaire, colorectal, pancréatique, pulmonaire ou du col de l'utérus, elles reçoivent chimiothérapie et immunothérapies deux à trois fois par semaine pendant soixante jours au plus, avec des prélèvements de sang dans la joue deux fois par semaine sur cinq semaines. Le porteur annonce un partage des avancées en congrès et par dépôts de brevets, et n'attend aucun effet délétère des injections, la tumeur pouvant en revanche s'ulcérer et gêner la locomotion.
Objectifs
Les avancées en termes d’immunothérapies dans les cas de cancers sont très encourageantes mais une recherche accrue est toujours de mise afin d’une part de découvrir de nouvelles cibles mais également d’améliorer les traitements déjà existants. Ce projet a ainsi pour but d’explorer les actions et les efficacités de la neutralisation de notre nouvelle cible, une chimiokine (petite protéine régulatrice du système immunitaire) et ce dans un contexte de développement tumoral (multiplication des cellules tumorales) chez la souris. Cette molécule est importante pour la migration de certaines cellules immunitaires et tumorales. Il s’agit dans ce projet de comprendre son rôle dans ces mécanismes et de tester l’impact de son blocage sur la progression tumorale à l’aide de souris où le gène a été invalidé ou bien en utilisant des anticorps dirigés contre cette chimiokine afin de bloquer son activité. Pour cela, différents types de modèles cancéreux seront utilisés comme les mélanomes, les fibrosarcomes, les cancers mammaires, colorectaux, pancréatiques, du poumon ou encore du col de l‘utérus. Grâce à ces modèles de développement tumoraux, nous pourrons analyser chez les souris l’impact du blocage de cette cible en synergie (effet cumulé) avec d’autres immunothérapies et chimiothérapies déjà connues en clinique. Ce projet nous permettra également de valider les meilleurs anticorps bloquants possibles qui pourront ainsi devenir des candidats pour de futurs essais cliniques antitumoraux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but principal de comprendre le mécanisme d’action de notre cible et de valider la preuve de concept de son inhibition pour induire des effets antitumoraux. Plusieurs bénéfices seront alors apportés par l’avancement de ce projet. L’utilisation de modèles où le gène de la cible a été invalidé (supprimé) d’une part et d’outil (sous forme d’anticorps) inhibant (bloquant) la cible d’autre part vont permettre de confirmer l’implication de la cible dans des mécanismes de développements tumoraux. Les différents protocoles de traitements testés, détermineront les conditions optimales d’utilisation des outils afin d’arrêter la croissance tumorale. Les études de suivi de la cible en présence ou absence d’anticorps expliqueront les cinétiques d’action de ces différentes molécules. Toutes ces approches sont indispensables pour pouvoir amener ces technologies dans des essais précliniques réglementaires puis des essais cliniques chez l’Homme. Enfin, la cible identifiée est possiblement impliquée dans les mécanismes de résistance à certaines thérapies existantes. Son inhibition pourrait permettre à certains patients de mieux répondre à certains traitements d’oncologie. Dans une période à moyen terme, un partage de nos avancées avec la communauté scientifique est prévu via des congrès et/ou des dépôts de brevets.
Procédures
L’ensemble des animaux de ce projet seront greffés avec des cellules tumorales une fois en injection sous-cutanée (SC) sur animal vigile (15 secondes/souris avec contention) ou en injection intra-mammaire (IM) pour le modèle de cancer du sein sur animal anesthésié (5 minutes/souris comprenant l’anesthésie). Les animaux subiront ensuite une injection de chimiothérapie (en intrapéritonéale (IP) : 10 secondes ou en intraveineuse (IV) dans certains cas rares : 3 minutes) suivis des traitements par les immunothérapies (en IP dans la plupart des cas : 10 secondes, en injection SC : 10 secondes, ou en injection IV dans certains cas : 3 minutes), cela 2 à 3 fois par semaine pendant 60 jours au maximum. Certains animaux recevront en plus un traitement par les anticorps cibles 2 à 3 fois par semaine (en IP dans la plupart des cas : 10 secondes, en injection SC : 10 secondes, ou en injection IV dans certains cas rares : 3 minutes). Des prélèvements sanguins pourront être réalisés sur animal vigile à la veine mandibulaire soit 2 fois par semaine sur maximum 5 semaines, soit en gestes répétés sur 24h. La durée de chaque prélèvement est estimée à 1 minute.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont ceux inhérents à la croissance des tumeurs chez la souris avec un problème de locomotion possible au-delà d'un certain volume ou une ulcération de la tumeur pouvant entrainer une altération marquée de l’état général de l’animal si elle évolue trop rapidement. Grâce aux résultats des précédents projets, il n’est pas attendu d’effet délétère sur l’état clinique de l’animal avec les injections de chimiothérapie et immunothérapie.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, soit parce que l’étude est arrivée à son terme (60 ou 120 jours), soit parce que les animaux ont atteint le point limite de volume tumoral ou tout autre point limite listé, soit avant pour prélever la tumeur et les organes immunitaires périphériques afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués (à l’aide de technique d’histologie, de cytométrie ou encore de biologie moléculaire).
Remplacement
Comme il s’agit du suivi de croissance tumorale, il n’existe pas de méthode alternative à ces expériences in vivo. Ces preuves de concept et ces études de mécanismes d’action ne peuvent s’établir que sur de véritables modèles précliniques dans un contexte de tumeur solide similaire à celui que l’on trouve chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui a démarré par des études bibliographiques, suivies d’études In Vitro approfondies ayant permis d’affiner et de réduire efficacement les pistes de recherches. Cependant, compte tenu des avancées actuelles, à ce stade du projet, il n’est pas possible de substituer l’animal par un modèle in vitro pour continuer ces recherches. Ce dernier ne peut pas retranscrire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules tumorales pour tester nos traitements antitumoraux.
Réduction
L’analyse statistique permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, est réalisée en collaboration avec une unité de biométrie, spécialisée dans les études de biostatistique. En amont la détermination du nombre d’animaux nécessaire et suffisant est réalisé en prenant comme critère principal la croissance tumorale. Ce calcul permet d’établir qu'un effectif de 10 souris est suffisant. L’étude de l’efficacité anti-tumorale induit ensuite deux types d’analyse : - modélisation de la croissance tumorale (en fonction du nombre de jours post-greffe) et comparaison entre les deux groupes de traitement en utilisant un modèle linéaire mixte. -analyse de survie
Raffinement
Les animaux seront hébergés en environnement contrôlé en portoirs de cages à couvercle filtrant. La nourriture et l'eau de boisson sont fournies ad libitum. Un système d’enrichissement adapté à la souris est mis en place afin de réduire le stress des animaux. Il comporte la présence dans chaque cage d’un dôme en cellulose, de briques Aspen et de carré de cellulose afin que les animaux établissent un nid végétal. Des souris femelles sont utilisées dans nos protocoles expérimentaux car elles présentent un système immunitaire plus développé que les individus mâles, facilitant les mises en évidence d’efficacité pro-immunitaire et anti-cancéreux. Tout au long du déroulement des expériences de croissance tumorale, une observation systématique de l’état clinique des animaux et notamment de l’évolution de la taille des tumeurs est réalisée par du personnel formé et compétent. Les conditions d’utilisation sont encadrées par la règlementation en vigueur et ont pour but de réduire le stress, l’inconfort et la douleur que l’animal pourrait ressentir. Une habituation des animaux sera mise en place en ce qui concerne la contention manuelle (immobilisation de l’animal par l’expérimentateur pour pouvoir l’injecter sans risque) et le placement dans les tunnels de contention (en vue des injections intraveineuses). Ces habituations seront effectuées en amont du début des études et des injections afin de diminuer le stress de l’animal. L’état des animaux sera surveillé quotidiennement pour vérifier l’aspect de la tumeur ou l’apparition de signes cliniques. Dans les conditions expérimentales définies (limite du volume tumoral), il n’est pas attendu que les animaux souffrent de problèmes locomoteurs, cependant si de telles observations venaient à être faites, de la nourriture humidifiée serait disposée en fond de cage afin de faciliter l’accès à l’alimentation».
Choix des espèces
La souris immunocompétente de type C57Bl/6 constitue un modèle expérimental de référence. Ces souris dont le système immunitaire est fonctionnel sont greffées avec des cellules tumorales murines de même fond génétique. Ce modèle a déjà été utilisé dans des précédents projets et est bien maitrisé par les équipes de recherche. Nous avons un recul important sur le comportement et les caractéristiques de ce modèle. Les souris seront au stade de développement adulte et âgées de 6 à 12 semaines afin d’avoir des animaux d’âge mûr avec un système immunitaire complètement fonctionnel et permettant une prise tumorale optimale.
Evaluation de l’effet de candidats médicaments dans un modèle mimant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
Rats : 3151
Le choix de l'espèce et du modèle dépend des demandes des clients : 3 151 souris et 3 151 rats, soit 6 302 animaux non-humains, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement des ovaires, du cerveau, du tissu adipeux et de l'utérus. Le syndrome des ovaires polykystiques est induit par létrozole ou par exposition hormonale avant la naissance, avec régime gras jusqu'à dix semaines, ovariectomie de trente minutes, frottis vaginaux quotidiens et administrations deux fois par jour. Les nouveau-nés mâles, écartés du protocole, sont réorientés vers l'apprentissage de gestes techniques. Le porteur écrit qu'aucun test statistique n'a servi à dimensionner les groupes, fixés à huit animaux par comparaison avec des publications.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets de candidats médicaments dans un modèle mimant le syndrome des ovaires polykystiques (SOPK) chez le rongeur.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints du syndrome des ovaires polykystiques. En effet, actuellement, les traitements utilisés sont uniquement symptomatiques et l’évaluation de candidats médicaments traitant la pathologie dans son ensemble (origine du dysfonctionnement hormonal) serait bénéfique.
Procédures
Les animaux pourront recevoir des traitements de candidats médicaments et de létrozole par différentes voies d’administration pendant maximum 10 semaines de façon biquotidienne pour les voies per os, sous-cutanée et intrapéritonéale et de façon quotidienne pour les voies intraveineuse et intramusculaire. Pour le modèle hormonale, les femelles gestantes recevront des traitements hormonaux pendant 3-5 jours par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale. Les administrations étant réalisées par du personnel expert, ces gestes dureront de 30 sec à 1 min environ. Les nouveau-nés ne seront manipuler qu’au moment du sevrage pour pouvoir différencier les mâles des femelles. Les animaux seront pesés régulièrement et pourront être mis sous régime gras type « high fat » pendant maximum 10 semaines, subir une ovariectomie selon le protocole expérimental (environ 30 minutes de chirurgie). Des frottis vaginaux seront réalisés afin de connaître le cycle oestral des animaux, au maximum un frottis quotidien. Il faut environ 30 sec pour faire un frottis par animal. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours de l’étude avec de petits volumes (1 goutte pour le glucomètre pour les analyses de tolérance au glucose ou à l’insuline prélevée à la queue de l’animal) ou des volumes un peu plus importants pour les études de pharmacocinétique (queue ou rétro-orbital ou submandibulaire…). Un prélèvement sanguin de petit volume durera environ 30 sec 1 minute. La fréquence et le volume dépendront des demandes. Cependant, les prélèvements seront effectués en concertation avec le responsable éthique de l’entreprise et en total respect de la réglementation internationale et européenne. Un prélèvement sanguin terminal plus important sera réalisé sous anesthésie ou sédation (environ 1 min pour prélever le volume terminal). Des tissus (ovaires, cerveau, tissu adipeux, utérus...) seront prélevés à la fin de l’expérimentation.
Impact sur les animaux
Les contentions et administrations de substances répétées pourront générer du stress chez les animaux. De plus, certaines étapes du protocole pourront entraîner une douleur légère ou modérée (au point d’injection de l’aiguille, lors des chirurgies d’implantation de pellets ou d’ovariectomie). Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possibles, il nous est, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux dues aux candidats médicaments.
Devenir
A l’issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés car des prélèvements tissulaires post-mortem seront réalisés.
Remplacement
Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement du syndrome des ovaires polykystiques. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En effet, aucun de ces modèles ne peuvent mimer le dysfonctionnement hormonal de cette pathologie en tenant compte des différents organes intervenants et des multiples hormones, sachant que le paramètre hormonal est primordial pour cette pathologie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.
Réduction
Nous avons établi une stratégie d’expérimentation nous permettant, dans la mesure du possible, de mesurer la valeur basale de chaque animal pour les paramètres sanguins (l’animal est son propre contrôle). Cette stratégie permet donc de réduire sensiblement le nombre d’animaux par groupe. Ce modèle étant nouveau pour nous, une ou deux études pilotes pour mettre au point le modèle seront nécessaires dans un premier temps (test sur un nombre restreint d’animaux). Aucun test statistique pour déterminer la taille des lots n’a été fait mais en considérant la variabilité interindividuelle des animaux (et en accord avec ce qui a déjà été publié par des équipes scientifiques et leurs résultats obtenus) nous conduit à dimensionner les groupes de traitement avec des effectifs de 8 animaux par groupe afin d’envisager des différences statistiquement significatives entre les groupes de traitement. Ce projet nécessite l’utilisation de femelles gestantes et seuls les nouveau-nés femelles seront gardés pour la suite des procédures expérimentales. Les nouveau-nés mâles pourront être utilisés pour d’autres dap (formation aux gestes techniques par exemple), permettant ainsi de diminuer l’utilisation du nombre d’animaux. Ce projet étant nouveau, il nous semble que 3 études par an soit une estimation raisonnable par rapport à nos autres modèles et aux demandes de nos clients.
Raffinement
En accord avec la règle de raffinement, les procédures chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale avec maintien de la température corporelle via l’utilisation de plaque chauffante thermo-régulée. Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Pour chaque intervention chirurgicale, les animaux sédatés seront placés sur des plaques chauffantes thermorégulées afin d’éviter toute hypothermie et recevront un analgésique (type buprénorphine) afin de limiter la douleur post-opératoire et un gel ophtalmique sera utilisé. Après chaque intervention chirurgicale, une attention particulière sera apportée sur le réveil des animaux et l’absence d’agressivité vis-à-vis de leurs congénères. Nous avons établi des points d’intervention afin de limiter la douleur à son minimum : • Addition d’Aspen brick, de carré de coton, de tunnels et d’igloos en cas de bagarres entre animaux et séparation du dominant pendant quelques jours si nécessaire, • Mesure du poids des animaux régulièrement, • Arrêt des traitements en cas de perte de poids ≥ 20% du poids initial. Nous avons établi des critères qui mettront fin à l'expérimentation si nécessaire : • Altérations des fonctions normales (impossibilité d’uriner, de se nourrir, de s’alimenter, se mouvoir…), • Présence d’une souffrance/douleur (vocalisation, perte d’appétit, piloérection, prostration…), • Perte de poids ≥ 20% du poids initial sur 72h, Si l’état général de l’animal ne s’améliore pas et qu’aucune solution ne peut être apportée, ce dernier serait euthanasié.
Choix des espèces
Selon le mécanisme d’action et la cible du candidat médicament, le rat et/ou la souris pourront être utilisés. Le choix du modèle utilisé sera dépendant des demandes clients car les modèles SOPK induits par le létrozole ou par exposition hormonale prénatale sont bien décrits dans la littérature chez les deux espèces. Le SOPK débutant à l’adolescence lors de la puberté, ce modèle pourra être induit sur des animaux adultes ou prépubères (3 semaines) pour le modèle létrozole. De ce fait, nous utiliserons des animaux âgés d’au moins 3 semaines (animaux livrés avec leur mère car le sevrage ne sera pas terminé). Pour le modèle d’exposition prénatale aux hormones, nous utiliserons des femelles gestantes de 2-3 mois et les nouveau-nés femelles âgés de 21 jours minimum.
Évaluation d’ anticorps thérapeutiques comme traitement dans les maladies hémorragiques dont l’hémophilie A
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Hémophiles sévères par déficit en facteur VIII, et modifiées pour produire une protéine humaine des plaquettes, 455 souris vont être utilisées, 410 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 45 sous anesthésie sans réveil. Toutes sont tuées, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent pas survivre à la procédure. La queue est sectionnée sous anesthésie et le saignement suivi pendant quinze minutes, et la circulation sanguine de l'intestin est interrompue chirurgicalement jusqu'à une heure, pour vérifier si des fragments d'anticorps arrêtent l'hémorragie. Les nuisances déclarées se limitent à la douleur des injections et aux bagarres entre mâles, sans un mot sur ces deux modèles hémorragiques.
Objectifs
Pour notre projet, nous avons obtenu une lignée de souris hémophiles. L’hémophilie est une maladie génétique caractérisée par des hémorragies dues à un déficit en facteur VIII. Le facteur VIII est en effet nécessaire à la coagulation du sang. Ces souris hémophiles produisent aussi une protéine humaine présente uniquement dans les plaquettes. Les plaquettes sont des cellules sanguines qui ont aussi un rôle essentiel dans la coagulation du sang. Nous voulons tester dans ces souris de nouvelles molécules thérapeutiques, des fragments d'anticorps, qui ciblent une protéine anticoagulante également présente dans les plaquettes. Nous utiliserons les souris afin de voir si ces nouvelles molécules thérapeutiques se fixent bien aux plaquettes et améliorent le traitement de l'hémophilie. Si ces essais sont positifs chez les souris, nous pourrons envisager des essais chez les patients hémophiles.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels pour l'hémophilie ont une courte durée d'action, obligeant les patients à se traiter très fréquemment, ce qui est contraignant. Certains nouveaux traitements durent plus longtemps, mais nécessitent encore des injections régulières. Un autre traitement utilise un anticorps imitant le facteur VIII, mais présente des risques lors d'hémorragies ou de chirurgies. En ciblant notre protéine anticoagulante d'interêt (c’est-à-dire la protéine anticoagulante que nous étudions) dans les plaquettes, nous espérons utiliser la longue durée de vie des plaquettes pour réduire la fréquence des traitements et améliorer la qualité de vie des patients.
Procédures
L’injection des molécules thérapeutiques pour traiter les souris se fait par voie intraveineuse sur animaux anesthésiés. L’accès veineux est necéssaire pour obtenir un traitement efficace et consiste en une seule injection d’une durée inférieure à 30 secondes. Des prélèvements de sang veineux sur animaux anesthésiés seront effectués pour permettent de vérifier la présence des molécules thérapeutiques dans le sang : 1 à 3 prélèvements d’une durée inférieure à 30 secondes puis euthanasie des animaux. Une section de la queue sur animaux anesthésiés permettra de vérifier que les molécules thérapeutiques permettent l’arrêt du saignement de la queue : une seule section et suivi du saignement pendant 15 minutes puis euthanasie des animaux. Un modele chirurgical d’interruption de la circulation sanguine au niveau intestinal sur animaux anesthésiés pendant 1h maximum puis euthanasie des animaux permettra de vérifier l’impact des molécules thérapeutiques sur la circulation sanguine.
Impact sur les animaux
Les souris étant hémophiles, une bagarre entre mâle peut exceptionnellement conduire à une hémorragie. Les injections et les prélèvements peuvent induite une douleur légère de courte durée.
Devenir
Toutes les souris utilisées dans les procédures seront euthanasiées sous anesthésie en fin d’expérience. L’euthanasie est nécessaire car les souris ne peuvent pas survivre après la procédure.
Remplacement
Le projet fera appel à un modèle expérimental chez la souris. En effet, seule une approche expérimentale in vivo permet de rendre compte de la complexité des systèmes biologiques (notamment les mécanismes de production des proteines circulant dans le sang). Aucun système in vitro actuel ne permet de déterminer la durée d'action de molécules dans le sang et leur effet sur la coagulation.
Réduction
Le nombre de répétitions des expériences sera défini de manière rationnelle. Si une expérience donne des résultats statistiquement significatifs pertinents, elle ne sera pas répétée. Les organes principaux des souris euthanasiées en fin d’expérience seront conservés. Ainsi, aucune expérience supplémentaire ne devra être faite si des questions nouvelles surviennent. Un total maximum de 455 animaux est prévu pour ce projet.
Raffinement
Les souris seront hébergées en accord avec les lois d’éthique françaises. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation et adaptées avec le personnel de l’animalerie. Les animaux disposent de nourriture et de l’eau ad libitum. L’environnement est enrichi par ajout de coton, de kraft et/ou de tunnels en carton pour améliorer les conditions de vie et éviter au maximum les bagarres entre animaux, qui pouraient conduire à une hémorragie. Les souris seront hébergées avec un maximum de 5 souris d'une même fratrie par cage, habituée à vivre ensemble, pour limiter le risque de bagarre. Les animaux seront contrôlés quotidiennement pour évaluer et réduire au maximum tout risque de douleur. Tout geste (injection/ prélèvement) susceptible d'entraîner une douleur/ souffrance sera réalisé sous anesthésie gazeuse et analgésie. Des points limites ont été définis et les animaux malades seront soignés ou euthanasiés.
Choix des espèces
L'utilisation de souris pour nos expériences est essentielle car elles permettent des études précises avec un grand nombre d'individus du même âge et du même génotype. Les souris déficientes en facteur VIII sont un bon modèle pour l'hémophilie sévère. Nous avons l'intention de fusionner des petites molécules qui vont se lier à une protéine anticoagulante avec d'autres molécules qui vont se lier aux plaquettes qui sont des cellules sanguines indispensables à la formation d’un caillot sanguin . Comme cette protéine n'est pas naturellement présente chez les souris, nous utilisons des souris génétiquement modifiées pour l'exprimer. Ce modèle de souris est crucial pour prouver l'efficacité de notre approche avant de passer à des essais chez l'homme et de demander des financements. Nous utiliserons des souris adultes de 8 à 14 semaines, stade ou les systèmes physiologiques sont matures.
Etudes de l’effet d’un thérapeutique potentiel dans un modèle d’hémorragie sous-arachnoïdienne chez le rat.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
Du sang est injecté sous les méninges de rats anesthésiés pour reproduire une hémorragie cérébrale, avec pose d'une mini-pompe sous la peau du dos et d'une canule dans le ventricule cérébral droit, trente-cinq à quarante-cinq minutes de chirurgie. 112 rats vont être utilisés dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur annonce des céphalées, des douleurs faciales et oculaires et des troubles de la vision, qui "peuvent se compliquer et mener à une perte de conscience de l'animal voire à un coma". Au quatorzième jour, tous les rats sont tués pour prélèvement du sang et du cerveau après fixation des tissus.
Objectifs
Le but de l'expérience est de déterminer si la molécule à tester peut réduire l'inflammation et la cicatrisation à l'intérieur et autour du cerveau après une hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) afin (1) d'améliorer le drainage glymphatique (système d'évacuation des fluides dans le cerveau) et (2) de réduire le développement de l'hydrocéphalie (augmentation de la pression cérébrale et élargissement des ventricules cérébraux) chez le rat Sprague Dawley.
Bénéfices attendus
L'hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) est un type d'accident vasculaire cérébral causé par un saignement dans l'espace sous-arachnoïdien situé entre le cerveau et les méninges. Les lésions cérébrales précoces consécutives à une HSA sont responsables d'une grande partie des handicaps à long terme chez les patients atteints d'HSA. En outre, ils sont plus susceptibles de souffrir de troubles neurodégénératifs et cérébrovasculaires plus tard dans leur vie. Les mécanismes des lésions cérébrales précoces comprennent l'inflammation, la mort cellulaire, l'accumulation de liquide cérébral et la rupture de la barrière hémato-encéphalique. Les traitements actuels sont chirurgicaux et empêchent les saignements ou réduisent la pression cérébrale (insertion d'une dérivation pour drainer le liquide du cerveau), il est donc nécessaire de développer des thérapeutiques alternatifs pour cibler les mécanismes de lésions cérébrales précoces de l'HSA. Cette étude pourrait mettre en évidence un effet via un thérapeutique sur la réduction de l'inflammation et la cicatrisation à l'intérieur et autour du cerveau après une hémorragie sous-arachnoïdienne (HSA) afin (1) d'améliorer le drainage glymphatique (système d'évacuation des fluides dans le cerveau) et (2) de réduire le développement de l'hydrocéphalie (augmentation de la pression cérébrale et élargissement des ventricules cérébraux). Cela permettrait ainsi de développer une stratégie thérapeutique moins lourde des hémorragies sous-arachnoïdiennes car sans intervention chirurgicale ni dispositif implanté à subir par le patient.
Procédures
Les animaux réaliseront un test comportemental (répété à J-1, J+1, J+7 et J+14 post chirurgie) visant à quantifier et à observer des différences (et donc d’observer une récupération fonctionnelle ou pas) entre les différents groupes sur des déficits sensoti-moteurs induits par le modèle de chirurgie d’hémorragie sous-arachnoïdienne. Un prélèvement de sang au niveau de la queue sera réalisé ces mêmes jours. A J0, ils seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête afin de pouvoir injecter du sang sous les méninges, simulant ainsi une hémorragie sous arachnoïdienne. Une pose de cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour récupérer le sang à injecter. Cette chirurgie sera suivie de la pose d’une mini-pompe osmotique en sous-cutané dans le dos ainsi que de la pose d’une canule par stéréotaxie dans le ventricule cérébral droit. Une injection sous-cutanée de sérum physiologique sera réalisée pour contrer la déshydratation subie suite à l’anesthésie et à l’acte chirurgical. Cette phase de chirurgie prendra entre 35 et 45 minutes. A J1 et J14, les animaux anesthésiés seront placés au sein d’un IRM pour imagerie. Cette phase d’imagerie sera réalisée en 10 minutes. A J1, une analgésie complémentaire sera réalisée après le 1er test comportemental et en fin de journée. A J14, Une injection d’un traceur fluorescent sous les méninges sera réalisée. Pour se faire le même protocole que pour l’injection de sang sera réalisé (aucune pose de cathéter ne sera nécessaire pendant cette étape). Enfin, à la fin du projet a J14, les animaux seront mis à mort. Un prélèvement de sang sera réalisé avant fixation des tissus puis prélèvement.
Impact sur les animaux
Suite au modèle d’hémorragie méningée, les rats pourront présenter des déficits neurologiques (moteurs et cognitifs) susceptibles d'induire des céphalées, des douleurs faciales et occulaires ainsi que potentiellement des troubles de la vision, accompagnées donc d’un stress de l’animal. Ces symptômes peuvent se compliquer et mener à une perte de conscience de l’animal voire à un coma. À cette fin, une surveillance sera mise en place pour contrôler la douleur et le stress afin d'adapter la couverture analgésique. Une coupelle de granulés humidifiés pour offrir une meilleure transition vers l’alimentation solide sera disposée dans la cage suite à la chirurgie.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement de sang et du cerveau post fixation pour analyse.
Remplacement
Les alternatives n’utilisant pas d’animaux ne peuvent être utilisées en raison de la complexité clinique de l'HSA et des interactions des systèmes du corps intervenant, y compris les systèmes immunitaire et nerveux, qui ne peuvent pas tous être modélisés actuellement dans des modèles de culture cellulaire ou informatiques. La voie des fluides cérébraux, en particulier, est étroitement régulée pour maintenir la pression cérébrale, les fluides étant produits par les plexus choroïdes et évacués par le système glymphatique dans une autre partie du cerveau, c'est pourquoi la structure entière du cerveau dans une cavité fermée (crâne) est nécessaire pour évaluer la dynamique des fluides et le système glymphatique.
Réduction
Les données de la littérature ainsi qu’une étude de puissance statistique en amont permettent de nous assurer que nous utiliserons le nombre minimal d'animaux pour pouvoir conclure d’un effet ou non de nos stratégies thérapeutiques. D’un point de vue statistique, nous avons déterminé que le nombre idéal d’animaux par groupe est de 12. En effet, ce nombre est reconnu pour réduire au maximum le nombre d’individus, tout en conservant la pertinence scientifique et la significativité statistique.
Raffinement
Les rats seront 2 par cage, isolés de tous bruits extérieurs, avec plusieurs enrichissements (sizzle-dri kraft, alpha-dri et bûchette de peuplier), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Pendant les phases chirurgicales, chaque animal sera anesthésié et aura une couverture analgésique. L’anesthésie générale sera maintenue jusqu’au réveil. La température corporelle de l’animal est maintenue grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée. Une injection sous-cutanée de sérum physiologie sera réalisée après la chirurgie. La surveillance des animaux sera accrue pendant les premières heures de réveil. A J1, un analgésique sera administré en début et fin de journée. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si en période postopératoire, nous constaterons un dépassement des points limites précédemment fixés, l’animal sera soit soigné jusqu’à amélioration ou mis à mort. Une surveillance stricte des rats sera réalisée pendant les jours suivant l’opération : pesée des animaux et contrôle des points limites (2 fois par jour). Avant la mise à mort, les animaux seront mis sous anesthésie générale.
Choix des espèces
L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature font que le rat (Rattus norvegicus) est un modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, le rat est une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ce qui permettra une analyse comparative et critique des résultats obtenus. De plus, les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes alternatives pertinentes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Les animaux utilisés seront âgés de 3 mois soit un poids d’environ 500g pour les mâles et 300g pour les femelles. Nous effectuerons notre modèle sur des adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec la majorité des données déjà disponibles sur les modèles d’HSA.
Prélèvement de sérum sur un modèle murin d’arthrite
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
800 souris porteuses par modification génétique d'une inflammation des articulations vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour une collecte terminale de sang. L'arthrite s'exprime de la sixième à la dix-septième semaine de vie, avec un pic vers huit à dix semaines, et chaque souris subit trois prélèvements de sang dans la joue en étant éveillée, contenue trois minutes. Le sérum obtenu part vers un autre laboratoire, pour déclencher la même maladie chez d'autres souris. Le porteur présente la répétition des prélèvements sur les mêmes individus comme une contribution à la réduction du nombre d'animaux non-humains utilisés.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de prélever du sang sur une souche transgénique de souris qui présente une inflammation marquée des articulations et d’en extraire des molécules de l’inflammation pour pouvoir le fournir au scientifique. Le scientifique a pour objectif d’utiliser ces molécules pour déclencher la même maladie chez d’autres souris mais dont l’évolution et la réponse aux traitements se rapprochent plus de ce qui se passe chez l’homme, afin de mieux comprendre la maladie et de trouver de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
Ce modèle est un des modèles les plus pertinents et stables pour l'induction d’une inflammation marquée des articulations chez la souris afin de pouvoir l’étudier par la suite. Comprendre cette maladie articulaire, comment elle apparaît, quels sont les mécanismes associés permet de mieux apprendre à la soigner et d’identifier notamment de nouveaux traitements, véritable enjeu de santé publique (5 % des maladies humaines sont d’origine articulaire).
Procédures
Chaque souris exprimera l’arthrite de ses 6 semaines à ses 17 semaines d’âge, avec un pic d’expression des symptômes à 8/10 semaines. Chaque souris sera pesée (entre 3 et 6 fois) et subira 3 prélèvements sanguins submandibulaires en étant vigile (durée, 3 minutes), les prélèvements étant espacés d’au moins 2 semaines. Enfin les souris seront euthanasiées au CO2, puis un prélèvement cardiaque sera réalisé en post-mortem.
Impact sur les animaux
Douleur et stress associés à l’expression du phénotype d’arthrite, stress lié à la pesée. Douleur et stress lié au prélèvement sanguin répété et à la contention.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour collecte terminale de sang.
Remplacement
Il n’existe pas à ce jour de méthode in vitro permettant de produire un sérum contenant les molécules inflammatoires d’intérêt pour étudier le modèle en question.
Réduction
Afin de pouvoir obtenir le modèle d’arthrite induit, un volume assez conséquent de sang est nécessaire. Par des prélèvements de sang répétés, cela permet la réduction du nombre d’animaux prélevés pour le volume attendu. De plus, la répétition des prélèvements permet une concentration optimale des molécules et par conséquent l’utilisation d’un volume minimal pour induire la pathologie, contribuant à l’utilisation d’un nombre minimal d’animaux pour obtenir ce sérum.
Raffinement
Les cages sont enrichies avec du matériel de nidification. Pour améliorer le confort de ces souris, le niveau de litière est augmenté pour faciliter l’accès à la nourriture, et de l’aliment mouillé est déposé dans la cage. Les souris sont manipulées avec des méthodes limitant le stress (creux de la main, manipulation par le corps). Lors des contentions, un matelas à poils épais est utilisé pour que cette surface molle réduise l’impact de la contention sur les articulations. La voie submandibulaire, nécessitant une contention par la peau du dos, est celle qui exerce le moins de pression sur les articulations en permettant d’obtenir le volume souhaité. Chaque prélèvement est suivi d’une réhydratation sous-cutanée de NaCL 0,9% d’un volume équivalent au volume prélevé.De plus, seuls les techniciens ayant un niveau de maitrise élevé du prélèvement submandibulaire sont autorisés à réaliser ces prélèvements. Lors du transfert vers le laboratoire d’analyse pour le prélèvement terminal, l’enrichissement et le nid sont transférés dans la boite de transport, et le temps de transfert de ces animaux fragiles est planifié et organisé à l’avance pour réduire le temps et les nuisances associées au transport.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est particulièrement adaptée lors de la création de modèles transgéniques par sa reproduction rapide, et l’étendue et la maitrise des méthodes de manipulation génétiques validées chez cette espèce. Dans le cas de ce modèle d’arthrite, le fait qu’il s’exprime chez un animal léger de petite taille permet de réduire la pression et la douleur sur les articulations. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte de 6 semaines à 17 semaines, car c’est pendant cette période que s’exprime l’arthrite permettant de voir l’inflammation dans le sang, les molécules de l’inflammation étant ce que le scientifique souhaite prélever pour son étude.
Confirmation de l’influence d’une protéine de l’horloge biologique circadienne sur la fonction cardiaque.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Pour vérifier chez l'animal vivant qu'un gène de l'horloge biologique commande les flux d'ions du cœur, 18 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Chacune reçoit un capteur implanté sous la peau au cours d'une chirurgie de vingt minutes, capteur qui reste en place onze à douze jours, durée pendant laquelle le porteur reconnaît un inconfort permanent et des bagarres entre animaux le temps de la cicatrisation. Six injections dans l'abdomen complètent le protocole. Les 60 000 morts subites cardiaques annuelles en France servent à situer l'enjeu, la protéine étudiée n'étant présentée comme cible thérapeutique possible qu'à plus long terme.
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Parmi elles, l’insuffisance cardiaque a un pronostic grave, avec plus de 75% des hommes et plus de 50% des femmes décédant 5 ans après le diagnostic, la mort subite cardiaque restant la cause majeure des décès. La mort subite est due à des arythmies, c’est-à-dire des anomalies dans le rythme des battements cardiaques. Il est aujourd’hui connu que ces arythmies mortelles sont plus fréquentes à certains moments de la journée, particulièrement le matin au moment du réveil, et à un moindre degré dans la soirée. En revanche, on ne comprend pas complètement pourquoi ce sont ces moments en particulier. Même si l’activité du cerveau et d’autres variations d’hormones sont impliquées dans ces rythmes de la journée, un mécanisme moléculaire au niveau des cellules cardiaques, l’horloge biologique, pourrait également être impliqué. En effet, bon nombre de fonctions biologiques et de maladies, incluant l’activité électrique cardiaque, suivent une horloge biologique journalière interne. Ce système est double : il y a une horloge principale centrale située dans le cerveau, et des horloges présentes dans presque tous les tissus et cellules de l’organisme, dont le cœur. Le fonctionnement de ces horloges repose sur l’expression locale de gènes « horloge » selon un rythme régulier, d’environ 24h. Nous avons prouvé in vitro qu’un des gènes de cette horloge cardiaque serait le dernier maillon qui contrôle les variations des flux d’ions des cellules du cœur. Ces flux d’ions sont essentiels à la fonction cardiaque et leurs perturbations engendrent les arythmies. Nous avons mis en évidence ce nouveau lien entre l’horloge journalière et la fonction cardiaque au niveau cellulaire et le but de ce projet est confirmer cela in vivo.
Bénéfices attendus
De nombreuses fonctions du corps (sommeil, température, fréquence cardiaque...) sont régulées selon un rythme de 24h. Les battements cardiaques sont notamment rythmés par nos phases d’activité et de repos, elles-mêmes commandées par une horloge biologique. Cette horloge repose sur l’expression de gènes « horloge » dans le cerveau et les cellules cardiaques. De même, les maladies cardiovasculaires sont plus fréquentes à certains moments de la journée : les morts subites cardiaques sont dues à des anomalies des battements cardiaques et sont plus nombreuses au moment du réveil. Ces morts subites cardiaques touchent environ 60 000 personnes par an en France et sont encore incomprises. Nous avons mis en évidence dans des études in vitro et ex-vivo un gène qui serait le médiateur final contrôlant les variations journalières des flux d’ions dans les cellules du cœur. La confirmation in vivo de ce rôle offrirait non seulement une meilleure compréhension du contrôle selon le rythme journalier du rythme cardiaque normal et mais aussi des pathologies qui découlent de sa dérégulation, comme les morts subites. A plus long terme, cette protéine pourrait être une nouvelle protéine clé à la fois pour le diagnostic prédictif des morts subites et comme nouvelle cible thérapeutique dans le champ des maladies cardiaques mais pas seulement.
Procédures
Tous les animaux vont être implantés sous la peau avec un capteur qui permet de mesurer et transmettre l’activité électrique cardiaque ; c’est une opération chirurgicale d’environ 20 minutes; le capteur reste en place environ 11 à 12 jours. Des mesures par télémétrie sont ensuite effectuées pendant 24h sans isoler les animaux. Tous les animaux recevront 6 injections intra-péritonéales d’un agent pharmacologique ou de son véhicule; chaque injection dure moins de 5 secondes.
Impact sur les animaux
La chirurgie pour l’implantation de capteurs peut entrainer une douleur dues aux sutures ainsi qu'un inconfort de l'animal. La douleur suite à l’intervention chirurgicale peut durer quelques jours jusqu’à cicatrisation complète. L’inconfort dû au capteur est présent tout le temps d’implantation c’est-à-dire 11 jours (1 semaine de repos après implantation, 3 jours de traitement et 24h d’enregistrement). Pendant la phase de cicatrisation, on observe parfois des comportement d’agressivité entre animaux. Les injections intrapéritonéales avant l'enregistrement du rythme cardiaque peuvent induire un stress léger chez l'animal, dû à la contention, de très courte durée.
Devenir
A la fin de la préocédure, tous les animaux sont euthanasiés car nous avons besoin de prélever les organes pour des analyses de biologie moléculaire.
Remplacement
Cette étude est un complément à une étude in vitro sur cellules très poussée, qui a permis d’identifier un nouvel acteur de l’horloge biologique dans le cœur. Néanmoins, au vu du niveau de complexité et de la spécialisation des cellules cardiaques, aucun système cellulaire (lignées, organoïdes, organes bio-artificiels ou organs-on-a-chip) ne permet de récapituler totalement la fonction et le dysfonctionnement cardiaque. Les modélisations par ordinateur ne sont pas non plus suffisantes pour mimer une telle complexité. Le cœur est un organe complexe, composé anatomiquement de plusieurs compartiments et physiologiquement de plusieurs tissus spécialisés. En complément des études déjà réalisées in vitro, il est indispensable d’étudier le cœur intégré à l’organisme. La souris est un bon modèle car les gènes étudiés sont conservés
Réduction
Une planification à l’aide de logiciels de statistiques nous a permis de déterminer le nombre d’animaux minimum nécessaires pour obtenir des résultats fiables. En fin d’expérimentation, les animaux seront euthanasiés et des expériences de biologie moléculaire seront effectuées afin d’optimiser les ressources à notre disposition.
Raffinement
Les animaux élevés au sein de l’animalerie seront pris en charge et observés de leur naissance à leur euthanasie. Les cages des animaux seront enrichies et les animaux seront suivis par un personnel spécifiquement formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles, dans une pièce où les paramètres environnementaux (Température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne et de pesées régulières en fonction des procédures. Une grille de score a été définie, évaluant les paramètres suivants: apparence, comportement naturel, hydratation, signes cliniques et comportement provoqué. Des points limites, en fonction du score obtenu selon cette grille, ont été décidés, menant à l’administration d’analgésie supplémentaire ou à l’euthanasie. Toutes les procédures impliquant une chirurgie sur l'animal seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et analgésiques.
Choix des espèces
La souris constitue un bon modèle cardiovasculaire car c’est un mammifère possédant un cœur à 4 cavités et une physiologie semblable à l’être humain. De plus, les gènes horloge sont hautement conservés entre tous les mammifères. Enfin, cette espèce est la plus couramment utilisée comme modèle d'étude de la fonction cardiovasculaire. Ainsi, ces animaux représentent un bon modèle sur le plan physiologique et génétique. Nous souhaitons étudier des animaux adultes, avec un cœur complètement développé, donc d’environ 8 semaines.
Etude de la plasticité homéostatique corticale associée aux douleurs neuropathiques de la face
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumis à une ligature du nerf situé sous l'orbite, sous anesthésie générale, 400 rats sont ensuite testés tous les deux jours pendant soixante jours pour mesurer leur hypersensibilité de la face. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et tous les rats sont tués, une partie après une trachéotomie, une canulation de la carotide et de la jugulaire et une craniotomie menées sans réveil. Le projet vise à décrire la réorganisation du cortex somato-sensoriel dans une névralgie du trijumeau. Le porteur écrit que les résultats "ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mis à part le développement d'une allodynie faciale", allodynie qui est précisément la douleur que la ligature sert à produire.
Objectifs
Les douleurs neuropathiques faciales issues d'atteintes nerveuses périphériques se révèlent très difficiles à soulager et/ou guérir lorsqu'elle mettent en jeu une sensibilisation centrale, c'est à dire une modification du fonctionnement du système nerveux central induisant des douleurs spontannées (en l'absence de stimulus) ou suite à des stimuli non douloureux (caresses, brossage de dents...). Cela peut se produire dans le cadre de compression de nerfs faciaux comme observé dans la névralgie du trijumeau. Le but de ce projet est d'étudier la mise en place de la sensibilisation centrale dans le cortex somato-sensoriel primaire dans un modèle murin de neuropathie faciale.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes de sensibilisation corticale impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont : • Injections intra-péritonéales (
Impact sur les animaux
Utilisant un modèle de douleur neuropathique, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse lors d'une stimulation tactile. Les résultats obtenus ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mis à part le développement d'une allodynie faciale suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse immunohistochimique.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. Il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux aussi bien central que périphérique (fibres afférentes). Des études comportementales chez l’animal vivant sont donc nécessaires pour mettre en évidence l’installation d’une l’allodynie mécanique après ligature du nerf infra-orbitaire. Cependant, en parralèle de cette étude expériementale, une étude computationnelle basée sur les résultats expériementaux afin de modéliser les modifications corticales associées à la mise en place de la douleur neuropathique. Nous espérons que dans le futur, un tel modèle permettra de tester des hypothèses in silico afin de permettre de remplacer certaines expérimentations.
Réduction
Le nombre d’animaux a été établi par l'utilisation de tests statistiques préalables et en tenant comptee des divers risques liés aux différentes approches expérimentales (mauvaises injections, problème d’habituation lors des études comportementales, difficultés d'enregistrements). Ce nombre sera susceptible de changer si au cours de l’expérience nous observons une différence significative avant d’atteindre le nombre maximal d’animaux autorisés. Pour la partie comportement (A), consistant à valider que la ligature du nerf infra-orbitaire induit une allodynie faciale, nous allons utiliser 10 animaux par groupe (témoins mâle, ligature mâle, témoins femelle, ligature femelle). Pour les parties patch-clamp), nous allons utiliser 15 animaux par groupe (témoins mâle, ligature mâle, témoins femelle, ligature femelle) et par mesure effectuée. Pour la partie patch-clamp axonale ex vivo, nous allons utiliser 30 animaux par groupe (témoins mâle, ligature mâle, témoins femelle, ligature femelle). Nous avons prévu plus d'animaux pour ces expériences car les enregistrements axonaux étant très complexes, le taux de succès est plus faible que pour les autres enregistrements. Pour la partie enregistrements électrophysiologiques in vivo, nous allons utiliser 15 animaux par groupe (témoins mâle, ligature mâle, témoins femelle, ligature femelle).
Raffinement
Préalablement à toutes les études, les animaux sont (i) hébergés dans des cages à environnement enrichi (tunnel pour grignotage, enrichissement social) dans notre animalerie, pendant une semaine, et (ii) soumis à des séances d’habituation, pendant 4 jours, afin de diminuer le stress lié au nouvel environnement et à la manipulation par l’expérimentateur. Pour les injections, les rats sont préalablement anesthésiés. L’anesthésie adéquate des animaux est confirmée par l’absence de réflexe de retrait de la patte en réponse à un pincement de la patte postérieure. De plus, après la ligature du nerf infraorbitaire, le suivi post-opératoire, avec un examen minutieux de la zone ligaturée, est poursuivie dans les jours suivants. L'état général de l'animal est surveillé tous les jours avec contrôle du poids. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Le poids est mesuré quotidiennement. La nourriture sera humidifiée pour faciliter son absorption. Si la perte de poids excède 20% du poids initial, les animaux seront mis à mort. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.
Choix des espèces
La souche Sprague-Dawley est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années. C’est par ailleurs un bon modèle pour les études comportementales. Les animaux utilisés seront des rats adultes, par comparaison avec les autres données de la littérature.
Etude des effets de 25 à 100 composés sur le traitement du psoriasis chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Quatorze applications d'un agent chimique sur le dos rasé, en quinze jours : 1 200 des 1 400 souris de ce projet développent un psoriasis expérimental, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue. Inflammation, œdème et desquamation s'installent, et le nombre de grattages est compté pendant dix minutes le dernier jour, avant un prélèvement de sang terminal sous anesthésie. L'objet est de classer 25 à 100 composés candidats en dermatologie, à la suite d'un projet qui en avait évalué 45, dont 5 sont passés en essais cliniques. Le porteur retient cette souche parce qu'elle exprime après induction les biomarqueurs et les comportements attendus, et des souris de six à huit semaines conformément à la littérature.
Objectifs
Les recherches que nous menons dans le domaine de la Dermatologie contribuent à développer de nouveaux produits permettant le traitement de pathologies telles que l’inflammation cutanée, la cicatrisation, la dermatite atopique et le psoriasis. L’objectif de ce projet d’une durée de 5 ans est d’étudier les effets de 25 à 100 nouveaux composés, composés naturels ou non, modifiés chimiquement ou non, sur le traitement de psoriasis expérimental induit chez la souris, afin de sélectionner les plus efficaces pour un développement en clinique chez l’Homme. Ce nouveau projet fait suite à un précédent projet qui nous a permis, sur 5 ans également, d’évaluer les effets de 45 composés, 5 de ces 45 composés étant actuellement en phase d’essais cliniques chez l’Homme. Ces nouveaux composés à évaluer seront administrés, après induction chimique du psoriasis, par application cutanée ou par voie orale pendant 7 jours consécutifs, à 1 seule ou 4 doses, et leurs effets seront comparés à ceux d’une référence pharmaceutique utilisée chez l’Homme qui sera choisie en fonction de la classe pharmacologique des composés à évaluer et de la voie de traitement envisagée. Un suivi régulier du poids des animaux, du scorage de la sévérité de du psoriasis et de l’utilisation de l’enrichissement seront effectués tout au long de l’expérimentation. Les effets des composés seront évalués au niveau comportemental après le dernier traitement effectué. Après cette évaluation comportementale, un prélèvement sanguin sera effectué sous anesthésie générale pour le dosage de biomarqueurs sanguins, puis les animaux seront euthanasiés afin de réaliser un prélèvement cutané pour la réalisation d’analyses biologiques.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de nouveaux composés en cours de développement sur le traitement du psoriasis, et de sélectionner ceux ayant montré la plus grande efficacité pour leur évaluation chez l’Homme. L’évaluation des effets de ces composés se fera par des observations régulières avec scorage de différents paramètres pour suivre l’évolution de la sévérité du psoriasis, par l’évolution pondérale des animaux, le score d’utilisation de l’enrichissement mis à disposition des animaux et une évaluation comportementale permettant de caractériser les effets de ces composés, notamment sur le nombre de grattages effectués par les animaux. Le dosage de biomarqueurs circulants à partir d’un prélèvement sanguin effectué à la fin des traitements, et des analyses biologiques de prélèvements cutanés effectués au large de la région d’induction du psoriasis permettront également de caractériser les effets de ces composés. Les données issues de ce projet sont d’un intérêt majeur pour déterminer les effets biologiques sur le traitement du psoriasis de ces nouveaux composés in vivo dans un modèle préclinique avant d’envisager des études cliniques chez l’Homme. Un précédent projet réalisé sur 5 ans a permis d’évaluer les effets de 45 composés, 5 de ces 45 composés étant actuellement en phase d’essais cliniques chez l’Homme. Compte-tenu de l’augmentation constante de l’incidence du psoriasis dans la population européenne et mondiale, le développement de nouveaux composés présente un enjeu socio-économique certain afin de développer des traitements efficaces contre cette pathologie chez l’Homme.
Procédures
Le rasage du dos de l’ensemble des 1400 souris nécessaires à la réalisation de ce projet sera effectué sous anesthésie générale afin de ne pas léser le tissu cutané. Il sera réalisé une seule fois en 1 minute environ pour chaque souris. 1200 des 1400 souris seront soumises à l’induction de psoriasis par application cutanée répétée d’un agent chimique inducteur de cette pathologie chez la souris. Ces applications, au nombre de 14 au total par souris sur les 15 jours de l’expérimentation, seront effectuées 1 minute environ sur souris vigiles. La totalité des 1400 souris sera traitée avec les composés à évaluer, les composés pharmaceutiques de référence ou un véhicule neutre (placebo), par application cutanée ou par administration orale. Les traitements seront effectués quotidiennement pendant 7 jours au cours des 7 derniers jours de l’étude, en 1 minute environ pour chaque souris, sur souris vigiles. Une évaluation du comportement de l’ensemble des 1400 souris sera réalisée 24 heures après le dernier traitement effectué afin de caractériser les effets des traitements sur la sphère comportementale au travers de différents paramètres dont le nombre et la durée des grattages et l’activité exploratoire des souris. Ce test sera effectué 1 seule fois pendant 10 minutes, sur souris vigiles. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sur la totalité des 1400 souris placées sous anesthésie générale avant leur euthanasie pour le dosage de biomarqueurs circulants.
Impact sur les animaux
L’induction de psoriasis, pathologie inflammatoire, effectuée après rasage préalable du dos effectué sous anesthésie, va engendrer chez la souris une douleur légère à modérée au cours des 2 semaines d’induction de cette pathologie par applications cutanées d’un agent chimique inducteur, en raison du développement d’une inflammation, d’un œdème, et de desquamation cutanée au niveau de la région d’application de l’agent chimique inducteur de cette pathologie. Une légère perte de poids transitoire est attendue uniquement au cours des premiers jours d’induction du psoriasis. Les pesées répétées au cours de l’expérimentation engendreront une gêne très limitée dans le temps, ne nécessitant que quelques secondes pour être effectuées. Le traitement quotidien des souris par application cutanée ou par voie orale avec les composés à évaluer au cours de la dernière semaine d’étude va induire un stress passager, quelques minutes quotidiennement, et la réalisation de l’évaluation comportementale effectuée le dernier jour de l’étude, nécessitant de placer les souris individuellement pendant 10 minutes dans le dispositif expérimental utilisé, va engendrer un stress modéré pendant ces 10 minutes de test. Le prélèvement de sang terminal, effectué immédiatement avant l’euthanasie des animaux en une minute environ, sera réalisé sous anesthésie générale profonde.
Devenir
A l’issue de l’unique procédure expérimentale permettant l’induction de psoriasis puis le traitement et le suivi de celle-ci et l’évaluation comportementale, les souris seront euthanasiées. Un prélèvement cutané sera réalisé au large de la zone d’induction du psoriasis pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser les effets des traitements effectués sur la réparation du tissu cutané.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Le modèle de psoriasis nécessitant une durée de plusieurs jours pour son induction et une période de traitement sur plusieurs jours également, il n’est donc pas possible d’utiliser de modèle in vitro (culture de cellules cutanées) ou ex vivo (explants cutanés) qui ne pourraient pas être maintenus dans un état physiologique pendant toute cette durée. De plus, l’évaluation du psoriasis induit se faisant par observation macroscopique de différents paramètres au niveau du tissu cutané, il n’est pas possible de faire ce type d’étude in vitro ou ex vivo qui ne tiendrait pas compte des effets sur la réponse immunitaire via la circulation sanguine ne pouvant être reproduite sur de tels modèles in vitro ou ex vivo.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet et permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé à partir des résultats des nombreuses études précédemment menées par notre laboratoire sur ce modèle expérimental de psoriasis ayant montré des effets "forts" de traitements en première intention sur le score de sévérité de psoriasis et les paramètres comportementaux évalués à la fin des expérimentations. L'utilisation d'un logiciel adapté a permis de définir pour chacune des 2 modalités expérimentales envisagées, que pour 7 groupes expérimentaux, un effectif total de 56 animaux est nécessaire, soit 8 animaux par groupe expérimental. A l’issue des expérimentations, une analyse statistique de l’ensemble des données générées sera réalisée pour comparer les résultats entre les différents groupes expérimentaux.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction du psoriasis. Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, un scorage de la sévérité du psoriasis et de l’utilisation de l’enrichissement seront effectués une fois par semaine avant traitement puis quotidiennement pendant le maintien de l’induction du psoriasis et la période de traitement. Leur poids sera mesuré 3 fois par semaine au cours de la période d’induction du psoriasis avant traitement puis quotidiennement pendant le maintien de l’induction du psoriasis et la période de traitement. Les souris seront hébergées par 2 dans des cages adaptées à leur taille, avec des bâtonnets de coton placés dans leur cage comme enrichissement (2 par souris) pour assurer leur bien-être et permettant également de définir un score d’utilisation de l’enrichissement. Elles seront placées en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie), et aussi pour évaluer l’influence des traitements sur leur activité (chronopharmacologie). Si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal atteint ou de 15% entre 2 pesées est observée, ou si des signes de toxicité des traitements, d’ulcération cutanée ou des modifications du comportement des animaux sont observés, ceux-ci seront euthanasiés dans des conditions éthiques.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire des pathologies cutanées représentatives des pathologies cutanées à traiter chez l’Homme. La souche de souris utilisée est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études dans le domaine de la Dermatologie et plus spécifiquement sur le psoriasis. Suite à l’induction de cette pathologie elle exprime en effet différents biomarqueurs d’intérêt et paramètres comportementaux, permettant ainsi une bonne transposition des résultats obtenus. Les animaux seront de jeunes souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur le psoriasis (généralement 6 à 8 semaines), et de souris utilisées lors d’études précédentes menées dans notre laboratoire selon le même protocole expérimental et ayant donné des résultats représentatifs, reproductibles et significatifs.
Maintien d’élevage de souris génétiquement modifiées avec phénotype dommageable Rag2KOxTgOT-I et Rag2KOxTgOT-II
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Immunodéficientes par construction et porteuses d'un seul type de lymphocyte, les souris de ces deux lignées peuvent développer diarrhées, poils souillés et baisse d'activité. 1 918 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées, pour maintenir l'élevage des lignées. À dix jours de vie, chaque souriceau subit un prélèvement de poils avec bulbe sur le ventre pour génotypage. Cent vingt géniteurs sont tués après six mois d'accouplement et 1 798 autres pour prélèvement d'organes ou pour "renouvellement des stocks à minima", formule qui recouvre la mise à mort d'animaux dont aucune expérience n'a l'usage.
Objectifs
Les lignées murines élevées dans ce projet sont des souris immunodéficientes qui possèdent un seul type de lymphocyte. Ces lymphocytes sont des cellules essentielles dans la réponse immunitaire contre les virus et les cancers. Du fait de leur immunodéficience, ces souris peuvent présenter un phénotype dommageable nécessitant un projet d’élevage spécifique avec suivi renforcé et respectueux du bien-être animal.
Bénéfices attendus
Les souris de ce projet possèdent un seul type de lymphocyte. Cette particularité est essentielle et très utilisée dans les études in vivo sur la réponse immunitaire contre les virus et les cancers.
Procédures
Un prélèvement de poils (avec bulbe) pour génotypage sera réalisé sur la partie ventrale de la souris à 10 jours post naissance. Une fois adulte, les souris seront utilisées pour relancer des accouplements ou seront mises à mort pour prélèvement ou mises à mort pour renouvellement des stocks à minima.
Impact sur les animaux
Il se peut qu’en raison de leur immunodéficience, les souris de ce projet présentent un phénotype dommageable caractérisé par une susceptibilité accrue aux agents pathogènes caractérisées par l’apparition de signes cliniques d’infection (diarrhée, poils souillés, activité réduite).
Devenir
A la fin de la procédure 1, il y aura un total de 1918 souris mises à mort Les géniteurs seront mis à mort au bout de 6 mois d’accouplement. Soit pour un accouplement tous les 3 mois = 60 géniteurs par souche (sur la totalité du projet) soit 120 animaux. Les autres animaux seront mis à mort pour prélèvement d’organes et transfert adoptif ou pour renouvellement des stocks à minima. Soit 1918-120 = 1798 souris pour l’ensemble du projet.
Remplacement
Ce projet décrit l’élevage de souris génétiquement modifié en condition de maintien à minima pour une lignée à phénotype dommageable. Les cellules issues des organes de ces souris seront utilisées dans les études in vivo sur la réponse immunitaire contre les virus et les cancers. Elles ne peuvent être substituées par un autre modèle.
Réduction
Ces souris sont utilisées en très faible nombre pour les projets expérimentaux in vivo. Aussi, nous maintiendrons un élevage à minima sur la base de 2 accouplements en trio (1 male avec 2 femelles par accouplement). Ces derniers seront renouvelés toutes les 26 semaines et un écart de 13 semaines entre la date de démarrage des 2 accouplements sera respecté afin de garantir un niveau de production stable tout au long du projet. Nous utiliserons autant les males que les femelles comme souris donneuse dans les études in vivo. Les géniteurs pour le renouvellement des accouplements seront sélectionnés parmi les descendants des accouplements précédents.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, ils seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Les souris seront hébergées dans des conditions optimales afin d’éviter toutes contaminations par des pathogènes et seront surveillés quotidiennement. L’apparition de signes cliniques n’est plus constatée depuis le respect de ces conditions d’hébergement strictes. Néanmoins, en cas d’apparition de symptômes, nous demanderons l’avis de notre vétérinaire référent et apporterons des enrichissements alimentaires et d’hébergement.
Choix des espèces
Ces animaux seront utilisés comme souris donneuses lors d’études in vivo. L’incompatibilité inter-espèce justifie l’utilisation de souris comme modèle. Des souris âgées de 6 à 12 semaines seront utilisées car elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires. Les géniteurs pour le renouvellement des accouplements seront sélectionnés parmi les individus âgés de 6-8 semaines au moment du début de l’accouplement.
Evaluation de l’efficacité de nouveaux traitements dans des modèles neurotoxique de la maladie de Parkinson
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
Une neurotoxine injectée dans le cerveau, une heure d'intervention, puis vingt et un jours d'injections du traitement de référence qui déclenche des mouvements involontaires anormaux : 2 050 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués et leurs cerveaux prélevés. Les rotations et les stéréotypies ainsi provoquées irritent la peau au frottement de la litière, ce que le porteur compte limiter par une litière en cellulose. Le projet relève d'une activité de service préclinique pour des tiers, et les bénéfices annoncés tiennent en deux phrases, l'identification de "nouveaux outils thérapeutiques". Les mesures du comportement moteur durent jusqu'à trois heures et se répètent deux à quatre fois, sans qu'aucune précision soit donnée sur leur contenu.
Objectifs
La maladie de Parkinson se définit par un dysfonctionnement du système nerveux. Elle touche un nombre important de personnes dans le monde. L'origine de cette maladie est encore mal comprise et les traitements actuels visant à soulager les symptômes ne sont pas optimaux. Ils permettent l'amélioration des symptômes moteurs de la maladie de Parkinson mais s'accompagne toutefois d'effets secondaires délétères caractérisés par des mouvements involontaires anormaux chez 90% des patients. Le développement de nouveaux outils thérapeutiques est donc essentiel. Pour identifier de nouvelles approches thérapeutiques, nous proposons la réalisation de modèles rongeur de la maladie de Parkinson qui permettent d’en reproduire les symptômes, afin d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements et de comprendre leurs mécanismes d’action.
Bénéfices attendus
Les études précliniques permettent d’acquérir les premières connaissances sur le comportement d’un candidat médicament, indispensables avant les essais chez l’homme. Le bénéfice attendu est l’identification de nouveaux outils thérapeutiques.
Procédures
Les animaux vont subir une injection intracérébrale (1 heure), une injection d'un composé utilisé dans le traitement de la maladie de Parkinson (21 jours, durée de l'injection : 30 secondes), une administration de traitement dans le corps (1 à 2 mois/1 min) ou une chirurgie (1 chirurgie/30 min), des prélèvements de sang (1 à 4 fois/5 min) et des mesures du comportement moteur (2 à 4 fois/3 heures).
Impact sur les animaux
L’injection de neurotoxine peut entraîner une perte de poids. Les mouvements involontaires anormaux induits par les injections répétées de traitement de référence de la maladie de Parkinson provoquent des rotations et des stéréotypies pouvant induire des irritations suite aux frottements sur la litière. Les nuisances possibles pour chaque méthode d'administration sont : Per os : il existe un risque faible de fausse route, ce qui peut entraîner des problèmes respiratoires passagers et un risque faible d’irritation à la suite de gavages répétés. Injections sous-cutané et intrapéritonéale : l'injection peut causer une douleur ou une irritation locale au niveau du site d'injection. Intranasal : elle peut provoquer une irritation des muqueuses nasales de l'animal, entraînant un inconfort temporaire. Intradermique : certains animaux peuvent développer des réactions cutanées locales. L’administration du traitement par injection stéréotaxique ou intrathécale pourra entrainer des douleurs postopératoires qui devraient durer 2 jours en moyenne. La chirurgie entraine également un léger risque d’hémorragie ou d’infection au niveau du site opératoire.
Devenir
A l’issu de la procédure, les animaux seront mis à mort et les cerveaux prélevés pour des analyses histologiques.
Remplacement
Ce projet s’inscrit dans le cadre de notre activité préclinique de service. Ce projet recourt à l’utilisation de rats pour plusieurs raisons éthiques : - L’utilisation d’approches neurobiologiques invasives ne peut être faite chez l’homme ce qui rend ainsi inaccessible l’étude directe des processus de causalité neurobiologique dans notre espèce (sauf pour les études invasives). -Dans le cadre des modèles de maladie neurodégénérative, l’objectif est de proposer un modèle animal présentant toutes les caractéristiques (motrice, cognitive) de ces affections. Aucun modèle in vitro ne permet l’étude de telles fonctions. De ce fait, le recours à l’animal pour étudier les manifestations comportementales de la maladie et les mécanismes impliqués dans ces processus apparait comme nécessaire en vue de découvrir de nouvelles approches thérapeutiques.
Réduction
Nos modèles sont générés dans le cadre d’une activité pré-clinique sur des composés thérapeutiques. Une analyse de puissance a été effectuée, permettant de réduire le nombre maximum d'animaux par groupe à 12, pour des résultats statistiques exploitables. Pour chaque animal, un grand nombre de prélèvements post mortem sera réalisé pour maximiser l’utilisation qui peut être faite : les différentes structures cérébrales, la moelle, le liquide céphalorachidien, le sang et les organes. L’utilisation des mâles et des femelles nous permettra de porter une attention particulière au R de réduire dans la règle des 3R.
Raffinement
Avant toute manipulation, nous respecterons une période d'acclimatation des animaux de deux semaines. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux (2 par cage) et ils bénéficieront d’un enrichissement de leur milieu (tunnel, bâton de bois à ronger). Pour les dyskinésies, nous utiliserons une litière en cellulose peu irritante afin d’éviter d’éventuels irritation aux pattes et à la queue. Le confort de l’animal sera pris en compte à tout moment. Leur surveillance est assurée par un suivi visuel journalier (weekend et jours fériés inclus) et une pesée hebdomadaire. Le constat de signes de souffrance entraine une surveillance accrue, avec enregistrement sous forme de fiche de suivi spécifique avec les soins prodigués (isolement, réchauffement, soins médicamenteux, etc.) et l’évolution des signes. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie avec administration d'un analgésique et d'un anesthésique local permettant de réduire la douleur des animaux. Le lendemain de la chirurgie, les animaux reçoivent une injection d'un analgésique. Un suivi post opératoire spécifique de 3 jours est mis en place. Le bien être est scoré via l’observation de différents critères de bien-être. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, des traitements vétérinaires si nécessaire.
Choix des espèces
Le rat est un excellent modèle pour les maladies humaines, car son système nerveux est proche de celui de l’homme. Ce modèle a un intérêt pour la compréhension de la pathologie humaine comme pour la mise au point de traitements thérapeutiques. De plus la dégénérescence dopaminergique par l’injection de neurotoxine est bien établie dans notre équipe et les travaux sur le rat sont largement décrits dans les études des maladies neurodégénératives. La maladie de Parkinson apparait préférentiellement à l’âge adulte, les animaux seront donc utilisés à partir de 5 semaines d’âge. En effet à cet âge on peut considérer que le système nerveux central a atteint sa pleine maturité.
Caractérisation d’un nouveau modèle murin de cardiomyopathie arythmogène d’origine génétique EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une stimulation électrique poussée jusque dans le cœur, sous anesthésie et sans réveil, termine le parcours des souris transférées vers l'animalerie d'expérimentation. 640 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées, les cœurs prélevés pour analyse. Le porteur décrit l'échocardiographie comme une procédure "non invasive et non douloureuse", et indique par ailleurs que la lignée porte un phénotype dommageable pouvant provoquer des troubles du rythme jusqu'au décès. Les reproducteurs en fin de reproduction, les animaux écartés à cause de leur génotype et les hétérozygotes "générés en surplus" sont tués sans entrer dans le projet.
Objectifs
Le projet s’insère dans un contexte de recherche qui a pour but de comprendre les mécanismes à l’origine de pathologies cardiovasculaires afin de pouvoir envisager de nouveaux traitements. Pour cela l’effet de diverses substances ou de protéines mutantes introduites chez des souris normales est étudié et leurs conséquences physiologiques chez l’animal sont mesurées. Ces expériences nécessitent un suivi phénotypique. L’objectif du projet est la caractérisation fonctionnelle d’une mutation humaine dans un gène qui vient d'être découvert comme responsable d'une nouvelle forme de cardiomyopathie associée à des troubles du rythme cardiaque pouvant conduire à des pertes de connaissance et à une mort subite. Le but de ce projet est donc de comprendre les mécanismes sous-jacents impliqués dans les régulations auxquelles participe cette protéine. Ces connaissances seront facilitées en utilisant un modèle in vivo qui garantit la présence des molécules partenaires dans un contexte physiologique.
Bénéfices attendus
L'étude de ce modèle murin nous permettra de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie liée à des troubles du rythme cardiaque atrial et ventriculaire, et de déterminer si les souris développent ou non une cardiopathie associée. A plus long terme, des stratégies thérapeutiques pourront être testées sur ce modèle car ces arythmies peuvent être mortelles chez l'Homme et nous ne disposons pas de traitements efficaces. Du point de vue de l’incidence, c’est certainement une maladie rare, en particulier en Europe où il y a peu de familles consanguines. Quand les résultats de nos recherches seront publiés, d’autres études viendront conforter et compléter nos premiers résultats. Il est probable que des mutations fondatrices existent dans certaines régions du monde, transmises de génération en génération et que seuls les patients homozygotes par descendance soient atteints avec une incidence locale plus élevée et un réel besoin de traitements pour prévenir le développement d'arythmies ventriculaires possiblement léthales.
Procédures
Une biopsie sera réalisée pour génotypage (animal vigile, 1 fois, 1 minute, EU1). Les animaux seront transférés de l’établissement d’élevage vers l’établissement secondaire où seront effectuées les différentes explorations (EU2). Les enregistrements électrocardiographiques avec le système Tunnel sont effectués sur animal vigiles qui sont juste placés dans un tunnel, avec chaque patte positionnée sur une plaque, ce qui permet l’enregistrement de l’électrocardiogramme (4 fois au maximum, 5 min, EU2). L’échocardiographie est enregistrée sur animal anesthésié très légèrement afin de juste les maintenir immobiles. C’est une procédure non invasive et non douloureuse. Les animaux se réveillent juste après l’arrêt de l’anesthésie (4 fois au maximum, 30 min, EU2). Les animaux seront également soumis à une stimulation transoesophagienne pour mettre en évidence et analyser une éventuelle susceptibilité à déclencher une fibrillation atriale (sous anesthésie et analgésie, 3 fois au maximum, 30 min, EU2). Le protocole de stimulation intracardiaque ne sera fait qu’une seule fois (acte unique, sous anesthésie et analgésie, durée 40 min, EU2), car c’est une procédure terminale, sans réveil, avant euthanasie. Les souris subissent cette procédure chirurgicale afin d’évaluer la susceptibilité des modèles murins aux arythmies ventriculaires.
Impact sur les animaux
Les nuisances découlant des procédures sont 1) l’utilisation de lignées transgéniques qui nécessite l’identification génétique des souris réalisée par une biopsie, ce qui peut être une cause de stress et de douleur légère de courte durée, 2) ce projet consiste à phénotyper une nouvelle lignée murine, le phénotype dommageable des animaux pourrait entrainer des troubles du rythme cardiaque pouvant provoquer le décès dans les cas les plus graves, 3) le stress lié au transport des animaux de l'animalerie d'élevage à l'animalerie d'expérimentation, 4) le stress lié aux diverses manipulations pour les administrations ou durant le suivi, 5) douleur légère de courte durée au point d'injection, 6) lors de certains actes sous anesthésie gazeuse, une baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire.
Devenir
Tous les reproducteurs en fin de période de reproduction ou exclus du fait de leur génotype ne pouvant être inclus dans le projet, ainsi que les hétérozygotes générés en surplus seront euthanasiés. Tous les animaux transférés pour l'expérimentation seront euthanasiés à la fin de la procédure chirurgicale et les cœurs seront prélevés pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Les maladies cardiaques d’origine génétique sont difficiles à modéliser dans des systèmes ex vivo ou en culture cellulaire. Les cardiomyocytes sont des cellules qui n’existent pas en lignées. Nous disposons de protocoles d’établissement de cardiomyocytes issus d’iPS (des cellules pluripotentes capables de donner tous les types cellulaires de l’organisme) et utilisons également ce modèle, mais ils présentent des inconvénients comme une immaturité et la présence de plusieurs types cellulaires. Ces cellules ne permettent pas de remplacer le recours aux animaux en particulier pour les analyses physiopathologiques nécessitant l’intégration de signaux neuro-humoraux et mécaniques comme pour les pathologies cardiaques.
Réduction
640 animaux au maximum seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Une étude pilote sera effectuée afin de définir précisément les âges optimaux pour réaliser les analyses. A la fin des études expérimentales, des organes seront prélevés sur tous les animaux afin de maximiser les informations analysables. Un isolement et une étude des cardiomyocytes isolés seront également réalisés. Ce modèle cellulaire ex vivo permettra de tester l’effet de composés pharmacologiques pour tenter de corriger des anomalies à l’origine des dysfonctionnements cardiaques, plutôt que de tester directement in vivo l’effet de ces composés afin de réduire le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. En élevage, une surveillance accrue sera réalisée lors des prélèvements de tissu pour génotypage : une compression de la zone d'incision sera effectuée pour stopper les petits saignements, le regroupement et la prise en charge des souriceaux par la mère seront vérifiés. Le transport entre les deux EU est réalisé sans changement de cage pour limiter le stress des animaux. Les cages sont délicatement placées dans un sac kraft et sur un chariot. Le transfert est réalisé par un tunnel sous terrain sans passage par l'extérieur. La durée du trajet est de 5 minutes. Le projet a également été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. La douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés (anesthésie, analgésie...) ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris pour les raisons générales suivantes : 1) la mutation d'intérêt a été introduite chez cette espèce 2) le développement et la physiologie sont bien connus. 3) le fonctionnement du système cardiovasculaire est proche de celui de l’Homme (échocardiographie, ECG). 4) de nombreux modèles physiopathologiques sont disponibles et caractérisés. Les animaux seront utilisés entre 7 et 14 jours de vie pour réaliser une biopsie, entre 2 et 6 mois pour la reproduction et entre 15 jours et 8 mois de vie pour le suivi (poids, fonction cardiaque)
Evaluation d’agonistes inverses du GPER dans la douleur cancéreuse
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Toutes mises à mort au motif que leur souffrance est jugée irréversible, 152 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Cent quatre d'entre elles subissent une chirurgie d'implantation de cellules cancéreuses, puis des mesures de bioluminescence sous anesthésie deux fois par semaine pendant trois semaines. Toutes reçoivent l'anticancéreux qui provoque la neuropathie, dont la douleur est ensuite évaluée en appliquant des filaments sur la patte, au test de von Frey. Le porteur situe le débouché du projet sur le marché du cancer du sein triple négatif et annonce un dépôt de brevet avant tout passage chez l'être humain.
Objectifs
Le cancer du sein triple négatif présente un taux de survie à 5 ans de 77% qui chute à 11% si métastases. Les douleurs associées à ce type de cancer sont de deux types : les douleurs neuropathiques périphériques induites par la chimiothérapie et les douleurs métastatiques. Nous avons montré que le récepteur GPER (pour G protein-coupled estrogen receptor), était impliqué dans le cancer et la douleur. Sur la base de ces résultats, nous émettons l’hypothèse que des molécules modulant le récepteur GPER pourraient améliorer le cancer triple négatif et les douleurs associées. Pour ceci, de telles molécules seront synthétisées. Après plusieurs étapes de screening in vitro, les meilleurs ligands (10 molécules maximum) seront alors évalués par nos soins (objet de cette procédure APAFIS) sur la douleur neuropathique induite par les chimiothérapies grâce à l’utilisation d’un modèle murin. Le ligand présentant la meilleure efficacité sera alors évalué sur : (1) le développement de la tumeur, (2) la douleur neuropathique induite par les chimiothérapies et (3) la douleur métastasique grâce à l’utilisation de modèles murins. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Le produit attendu est un nouvel antalgique et antitumoral permettant de lutter contre la progression tumorale ainsi que les symptômes neuropathiques, tels que les douleurs induites par certaines chimiothérapies, mais aussi prévenant (lorsqu’il sera co-administré avec les chimiothérapies) l’apparition de neuropathies pour lesquelles il n’existe aucun traitement efficace. L’utilisation d’animaux est indispensable dans ce contexte d’interaction entre système nerveux, tumeur, dissémination sanguine et système immunitaire. Ces travaux compileront les bases nécessaires au dépôt de brevet de molécule dans le but de passer ensuite à des études chez l’Homme. Le marché visé est principalement celui des cancers du sein triple négatif, permettant d’améliorer non seulement le pronostic vital de nombreuses patientes, mais aussi leur qualité de vie.
Procédures
*L’ensemble des animaux subiront des injections pour administrer l’anticancéreux responsable de la mise en place du modèle et des composés à tester. La piqure d'aiguille pour l’injection est réalisée en quelque secondes sur animal vigil. *L’application de filaments au niveau de la patte de l’animal vigile pendant quelques secondes sera réalisée afin d’évaluer la douleur. *104 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale pour l'implantation des cellules cancéreuses qui durera environ 5 minutes par animal. *La mesure de la bioluminescence (durée : 5 min par animal) sera réalisée 2 fois par semaines pendant 3 semaines sous anesthésie générale. *Toutes les interventions sont réalisées à l’établissement utilisateur EU1 à l’exception de la mesure de la bioluminescence qui sera effectuée à l’EU2.
Impact sur les animaux
L’induction de la neuropathie chimio-induite (CIPN) ainsi que de tumeur chez l’animal seront des nuisances à part entière et irréversibles, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN ainsi que les métastases osseuses seront associées à des désordres douloureux qui seront évalués dans le cadre du projet. Elle sera aussi responsable d’une diminution du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement. Une application de quelques secondes de filament au cours du test de von Frey est susceptible d’induire chez l’animal une douleur légère.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort puisque la souffrance de l’animal est irréversible.
Remplacement
Plusieurs étapes de screening réalisées en amont des expériences demandés dans cette procédure seront effectués afin de réduire le nombre de molécules à évaluer et donc le nombre d’animaux. En effet, l’ensemble des molécules designées ou synthétisées subiront : - un screening in silico des dérivés (seules les molécules se fixant sur le GPER seront retenues) - un screening in vitro des dérivés (seules les molécules présentant une action agoniste inverse sur le GPER et une action antiproliférative sur cellules TNBC seront retenues). S'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux. Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN et de métastases osseuses n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. S'agissant d'étude sur la croissance tumorale, un screening des composés et une étude de l’interaction de ces composés avec le paclitaxel in vitro sera réalisé préalablement au passage chez l’animal. Ces approches alternatives ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux. En effet, les modèles animaux vivant sont, dans les derniers stades d’études, nécessaire pour explorer et évaluer l’effet antitumoral, que ce soit la dissémination de métastases dans la circulation sanguine, mais aussi l’impact du système immunitaire, par le biais d’imagerie. Ce type d'étude sur modèle animal de métastases osseuses est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.
Réduction
*Ces travaux seront précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les molécules les plus prometteuses à des doses adaptées. *Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. *De plus le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. *La PROCEDURE 1 est une étape de GoNoGo, c’est-à-dire que si les résultats de celle-ci sont négatifs (pas d’effet antalgique de chaque composés) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées. *Toutes les procédures seront réalisées sur des groupes randomisés avec un groupe témoins négatif (recevant du véhicule ou une chirurgie factice), et menées en aveugle. *L’ensemble des résultats, y compris négatifs, feront l’objet d’une publication afin d’éviter la reproduction d’expérience.
Raffinement
Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (température, hygrométrie, luminosité). Le nombre d’animaux est adapté à la taille de la cage et en adéquation avec la règlementation . De plus, le milieu est enrichi par du matériel de nidification (coton), un abri (dôme carton) et des matériaux à ronger (bois tendre). L’hébergement en groupe est maintenu pour le bien-être animal. Une surveillance des conflits sera réalisée. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Les expérimentateurs sont tous titulaires du niveau « concepteur et réalisateur de projet » ainsi que de la formation de chirurgie sur rongeurs. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. De plus, le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs utilisent dès que possible la technique du cupping pour limiter l’anxiété des souris lors du transfert des animaux. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum. Le transport des animaux entre l’animalerie (EU1) et le centre d’imagerie (EU2), s’effectuera en voiture. Les animaux seront hébergés dans des boites opaques avec couvercle filtrant. Un document de transport (avis/accord du vétérinaire) accompagnera les animaux. Le transport sera conditionné à l’état des animaux et les conditions climatiques.
Choix des espèces
La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur les CIPN et la croissance tumorale. D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie et le développement tumoral. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.