Rongeurs
Rôle de la phospholipase A2 sécrétée de groupe 5 dans la neuroinflammation
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 860 souris vont être utilisées, celles qui reçoivent une injection dans les ventricules cérébraux, geste de trente minutes, étant tuées dans les dix-huit heures qui suivent. Le niveau de souffrance déclaré est léger pour 180 d'entre elles et modéré pour les 3 680 autres, et 340 animaux subissent une biopsie de la queue à huit jours. Le projet cherche ce que fait dans le cerveau une enzyme dont aucune fonction cérébrale n'est connue, et le porteur annonce qu'un résultat prometteur ouvrirait sur un projet "plus ambitieux" avec des souris déficientes ciblées. 180 reproducteurs restent en vie à l'animalerie, tous les autres sont tués à la fin de chaque procédure pour prélever le cerveau.
Objectifs
Les phospholipases A2 sécrétées (sPLA2) sont des enzymes qui coupent les lipides des membranes cellulaires et produisent ainsi des molécules impliquées dans l'inflammation. Le génome humain possède 11 gènes codant pour onze formes de sPLA2. Les sPLA2 sont impliquées dans un grand nombre de processus biologiques sans que leurs rôles ne soient clairement définis. De plus, elles constituent une cible thérapeutique de par leur rôle central de régulation de l'inflammation. La sPLA2G5 (sPLA2 de groupe 5) est principalement présente dans le cœur, les muscles squelettiques et certaines cellules immunitaires. Son activité a été impliquée dans divers processus physiologiques et pathologiques. L'une des principales fonctions de la sPLA2G5 est de réguler l'inflammation. Elle promeut la production de molécules pro-inflammatoires à partir des lipides membranaires. La sPLA2G5 a aussi été impliquée dans divers processus cardiovasculaires. Elle régule également le tonus vasculaire, et contribue au développement de l'athérosclérose et de l'infarctus du myocarde. Enfin, la sPLA2G5 a été impliquée dans certains processus métaboliques, tels que la résistance à l'insuline et la régulation de la glycémie. Toutes ses fonctions ont été découvertes dans des organes périphériques, mais à l'heure actuelle rien n'est connu quant à sa présence et ses fonctions dans le cerveau. Une récente étude a montré que dans le cerveau de souris, elle n'est présente que dans 2 régions cérébrales particulières: les plexus choroïdes, qui forment une barrière entre le sang et le liquide cérébrospinal et l'éminence médiane, située autour du 3eme ventricule cérébral servant aussi de barrière entre le sang et le cerveau pour laisser passer certaines molécules et cellules selon les conditions physiopathologiques. Le projet que nous souhaitons mener consiste à étudier le rôle de la sPLA2G5, située dans ces régions bien particulières du cerveau de souris, dans les processus neuroinflammatoires. Si son implication est vérifiée, nous étudierons le potentiel d'un inhibiteur pharmacologique, le varespladib, sur ces phénomènes.
Bénéfices attendus
Il est important de mener des recherches approfondies pour comprendre le rôle encore totalement inconnu de la sPLA2G5 dans le cerveau et en particulier dans les processus neuroinflammatoires. La neuroinflammation est un phénomène pathophysiologique commun à un grand nombre de pathologies du système nerveux, telles que la maladie d'Alzheimer, la sclérose en plaques, la maladie de Parkinson et l'accident vasculaire cérébral. La sPLA2G5 est une enzyme impliquée dans la régulation de l'inflammation, mais son rôle dans le cerveau reste largement méconnu. De manière intéressante, son expression dans le cerveau de souris est très localisée à deux types d'interface entre le sang et le cerveau que sont notamment les plexus choroides et l'éminence médiane de l'hypothalamus. De plus, ses rôles connus en périphérie suggèrent son implication dans la perméabilité des barrières et dans le recrutement de cellules immunes, phénomène caractéristique de la neuroinflammation. Comprendre comment la sPLA2G5 contribue aux processus neuroinflammatoires aiderait à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies. Si les données obtenues lors de ce projet sont prometteuses, elles donneront suite à un projet plus ambitieux utilisant des souris déficientes en sPL2G5 spécifiquement dans les zones cérébrales d'intérêt.
Procédures
Sur la totalité des animaux, 340 (180 progéniteurs et 160 animaux inclus dans les procédures) subiront à l'âge de 8 jours une biopsie caudale (5 secondes par animal). Les souris subiront 1 à 2 injections intrapéritonéales (5 secondes chacune) et/ou intracérébroventriculaires (30 minutes chacune). Les prélèvements de liquide cérébrospinal dureront 5 minutes maximum chacun. Les chirurgies terminales en vue du prélèvement de cerveau dureront 20 minutes chacune.
Impact sur les animaux
Les nuisances animales concerneront essentiellement les animaux subissant les injections intracérébroventriculaires. Toutefois, toutes les précautions seront prises pour assurer l'absence de douleur des animaux en pré et post-opératoire, le bon maintien de leur température corporelle ainsi que l'asepsie durant la chirurgie. Les animaux seront surveillés attentivement dans leur phase de réveil, qui intervient très rapidement après arrêt de l'anesthésie gazeuse. Les autres nuisances éventuelles feront suite aux injections de l'agent inflammatoire qui provoqueront une réaction inflammatoire. Cela pourra induire une légère fièvre, une perte d’activité locomotrice et d’appétit, mais elles seront faibles et limitées dans le temps car la dose injectée sera modérée et les souris seront mises à mort à des temps courts après l'injection. Les souris seront mises à mort dans les 18h suivant les injections. Les souris déficientes pour la sPLA2G5 ne présentent pas de phénotype particulier. La molécule varespladib n'induit pas d'effet seconfaire néfaste, quel que soit son mode d'administration.
Devenir
A l'exception des 180 animaux progéniteurs enrolés dans la procédure 9 qui seront maintenus en vie et gardés à l'animalerie, tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Notre projet se base sur des données de transcriptomique spatiale disponibles en open-access qui nous ont permis de constater l'expression ciblée et spécifique de la sPLA2G5 dans certaines zones cérébrales. Si certaines de ces fonctions sont connues en périphérie (coeur, poumons...), rien n'est encore connu à ce jour sur ses fonctions dans le cerveau, et en particulier sur son rôle dans les processus neuroinflammatoires. Ces questions ne peuvent trouver de réponse qu’en étudiant la physiologie un organisme vivant entier et la souris est un modèle de choix.
Réduction
Nous utiliserons des mâles et des femelles qui seront randomisés dans les groupes d’étude, soit une perte minimale due au genre pour les souris déficientes en sPLA2G5 qui seront obtenues au laboratoire. Le nombre minimum d’animaux nécessaires dans chaque groupe a été calculé par un calcul de puissance statistique afin de déterminer la taille d’effectif la plus juste en tenant compte des conditions expérimentales. Le calcul renvoie à des effectifs de 3 à 6 souris par groupe minimum, selon les analyses réalisées par la suite.
Raffinement
Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (cachette, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Les animaux seront scorés sur plusieurs critères, comme le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement comme précisé dans les procédures expérimentales. Les injections intrapéritonéales seront réalisées par un expérimentateur maîtrisant la technique. Les injections intracérébroventriculaires seront également effectuées par un expérimentateur habitué à cette procédure. Nous veillerons pour chaque procédure le nécessitant à la bonne anesthésie et antalgie des animaux par l'utilisation selon les cas d'une anesthésie générale gazeuse ou chimique et/ou d'une anesthésie locale. En cas de nécessité, un analgésique pourra administré en post-opératoire suite aux injections intracérébroventriculaires.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix pour caractériser les fonctions des phospholipases A2 sécrétées. En effet, à ce jour, 12 sPLA2s ont été identifiées chez la souris, dont la sPLA2G5. De manière intéressante, des données de transcriptomique spatiale du cerveau de souris ont montré l'expression de cette sPLA2 localisée à des régions très spécifiques du cerveau, comme chez l'Humain. Les souris déficientes pour le gène de sPLA2G5 nous permettront de tester notre hypothèse de l'implication de cette enzyme dans les processus neuroinflammatoires, en modulant notamment la composition du liquide cérébrospinal et le recrutement de cellules immunes périphériques. Des études de transcriptomique indiquent que l'expression génique de la sPLA2G5 ne varie pas significativement chez la souris en fonction de l'âge. De ce fait, nous utiliserons des souris jeunes adultes de 8 à 10 semaines.
Etude physiopathologique et évaluation du ciblage de la sénescence cellulaire dans deux modèles mini-invasifs de dégénérescence discale post-traumatique chez le rat
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
2 640 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une aiguille est enfoncée dans un disque intervertébral du dos ou de la queue pour y créer une lésion, opération de dix à quinze minutes, suivie trois semaines plus tard chez certains d'une seconde injection dans le disque abîmé, pour tester des molécules ciblant les cellules sénescentes. Le porteur décrit une douleur discale pouvant conduire l'animal à la prostration, à l'isolement et à l'arrêt du toilettage social, et une douleur nerveuse liée au passage de l'aiguille le long des racines spinales. Il conclut qu'il est "inévitable" de travailler sur des animaux et que le recours aux rongeurs est "nécessaire", les explants de disque de queue de bœuf restant réservés à l'étude de la diffusion des molécules.
Objectifs
La lombalgie chronique constitue la principale cause d’années de vie vécues en situation de handicap et affecte plus de 600 millions de patients dans le monde. Si elle peut avoir plusieurs causes, la Dégénérescence du Disque Intervertébral (DDIV) en représente le contributeur majeur. La physiopathologie de la DDIV associe la mort cellulaire, l'inflammation et la dégradation de la matrice extracellulaire, mais n'est pas encore totalement comprise. Bien qu'il existe des traitements symptomatiques pour limiter la douleur, il n'y a actuellement aucune stratégie thérapeutique permettant de freiner les mécanismes dégénératifs et d'atténuer l'inflammation à l'origine de la maladie. Parmi les acteurs centraux de l'apparition et de la progression de la DDIV, un mécanisme de survie aberrante des cellules discales, appelé « sénescence », semble directement impliqué et pourrait représenter une cible thérapeutique pertinente. L’objectif premier de cette étude est de mieux comprendre la physiopathologie de la DDIV en examinant la présence et l’activité des cellules sénescentes dans et autour du disque intervertébral, au cours du développement de la DDIV post-traumatique chez le rat, que ce soit dans le dos ou sur la queue. Le second objectif est d’évaluer la pertinence thérapeutique d’un ciblage spécifique de ces cellules sénescentes (élimination ou modulation). Ces deux modèles de dégénérescence discale post-traumatique sont induits chirurgicalement de manière mini-invasive afin de choisir le modèle avec les lésions les plus reproductibles et la dégénérescence la plus proche de la physiopathologie humaine, tout en limitant le risque de dommages liés à la procédure. Par la suite, des thérapies innovantes visant les cellules sénescentes, appelées 'sénothérapies' seront évaluées contre la DDIV du rat. Ces thérapies seront soit administrées à l’ensemble du corps, soit localement, dans le disque malade, à l’aide de gels injectables. L'évaluation se fera sur le modèle jugé le plus approprié, soit dans le bas du dos, soit dans la région de la queue.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de comparer les deux modèles dégénérescence discale post-traumatiques mini-invasifs décrits chez le rat et d’évaluer l’expression de cibles thérapeutiques au cours du développement de la pathologie. La prise en charge des patients atteints de dégénérescence discale reste insuffisante, ne traitant que les symptômes, ce projet permettra également de réaliser une preuve de concept avant les essais cliniques, pour évaluer l'efficacité de thérapies innovantes contre la DDIV post-traumatique chez le rat. Ces thérapies seront distribuées sous formes libres à l'échelle du corps entier ou bien transportées dans des gels injectables afin d’être administrées localement dans le disque malade. Ce traitement adapté pour la clinique pourra à terme être proposé pour des essais cliniques vétérinaires chez le chien malade, puis des essais en clinique humaine.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à une chirurgie d’environ 10-15 minutes consistant à introduire une aiguille dans l’espace intervertébral afin de créer une lésion dans des disques intervertébraux au niveau dorsal ou dans la queue de l’animal. Certains animaux entrant dans un protocole de test de molécules thérapeutiques seront 3 semaines plus tard soumis à une deuxième intervention: soit à une seconde chirurgie mini-invasive unique d’environ 10-15 minutes permettant l'injection intra-discale de molécules thérapeutiques à effet prolongé ; soit à une injection systémique unique intra-péritonéale de quelques secondes de molécules thérapeutiques.
Impact sur les animaux
Des nuisances modérées pour les animaux sont à attendre des procédures mises en place dans ce projet. Lors du développement de la dégénérescence, de la douleur discale peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer dans un état de prostration, diminuer son activité, s’isoler des autres animaux dans la cage et cesser les interactions, par exemple le toilettage social. L'intervention mini-invasive et percutanée minimise les risques d'infection au niveau des points de piqûre les rendant très peu probables. De plus, une douleur secondaire d’origine nerveuse (neuropathie), due au passage de l’aiguille le long des racines des nerfs spinaux pourrait être observée, n'allant pas au delà de 5 jours suivant la procédure dans le bas du dos de l'animal.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter les tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques, cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Cette étude prend en considération la règle des 3R. Les expérimentations in vitro ne permettent pas à l’heure actuelle de mimer les interactions complexes intervenant entre les différents acteurs tissulaires du disque intervertébral (noyaux pulpeux, anneau fibreux, plaques cartilagineuse, os vertébral…) et du système vasculaire. Il est ainsi inévitable de travailler sur des systèmes biologiques complexes représentés par les animaux afin de mieux étudier les mécanismes mis en jeu lors du développement de la maladie discale. Le recours aux rongeurs est ici nécessaire afin de valider le potentiel thérapeutique de nouvelles biothérapies. Il n’existe pas, pour le moment, de solution de remplacement in vitro complet, ni de modèles invertébrés.
Réduction
Dans le but de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, les potentielles biothérapies seront testées et sélectionnées pour leur efficacité en amont, in vitro, sur les différents types cellulaires du disque intervertébral. Un modèle ex vivo d’explants de disque entier de queue de bœuf sera également utilisé pour étudier la biodistribution des biothérapies dans le tissu spécifique du disque intervertébral. In fine, uniquement les biothérapies les plus prometteuses seront utilisées dans cette étude in vivo. Le nombre d’animaux par groupe est réduit au strict minimum. Ce nombre, fixé ici à 10 animaux par groupe expérimental, est calculé par un test reconnu de puissance statistique, afin de s’assurer de pouvoir conclure sur une différence significative entre les groupes expérimentaux si celle-ci à un sens biologique dans le contexte spécifique de la maladie discale.
Raffinement
Les rats seront hébergés à raison de 3 rats par cage avec de l’enrichissement physique (tubes en carton) pour stimuler leurs comportements naturels. Les animaux seront maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. De façon générale, un suivi hebdomadaire des rats permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi postopératoire et du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 5 premiers jours pour s’assurer de la bonne cicatrisation et de l'absence de douleur, puis une fois par semaine. Lors des interventions chirurgicales, les animaux seront sous couverture anesthésique et analgésique adaptées, en pré- et post-opératoire. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, et la phase de réveil seront effectuées sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle.
Choix des espèces
Le rat est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les études pré-cliniques, car de nombreux outils de laboratoires sont développés et optimisés pour cette espèce. Dans le cas de la dégénérescence discale, plusieurs modèles animaux post-traumatiques ont été développés, le rat restant la plus décrite dans la littérature internationale pour l’étude de cette maladie, devant la souris, le lapin et la brebis. Le rat présentant le double avantage de présenter une taille de disques intervertébraux compatible avec une injection intra-discale et une voie d’abord accessible à l’échelle expérimentale, sans le recours à de gros animaux. Notre protocole débutera chez des rats arrivés à maturité squelettique et âgés de 12 semaines minimum. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de la dégénérescence discale est possible et documentée dans des études précédentes.
Etude des mécanismes physiologiques d’adaptation à la survie périnatale dans un modèle murin invalidé pour deux gènes.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Séparés de leur mère dès la naissance, des souriceaux nouveau-nés sont laissés seuls six à vingt-quatre heures, puis tués pour prélever leur sang et leurs tissus. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les femelles gestantes tuées pour recueillir les embryons comprises. L'objet déclaré est de comprendre l'adaptation métabolique qui suit la naissance chez des souris privées de deux gènes, alors que 40 à 50 % des souriceaux mutants meurent déjà avant le sevrage, et le porteur anticipe que l'isolement et l'hypoglycémie, qu'il nomme "souffrance métabolique", peuvent conduire à la mort. Un écart de 5 °C de température corporelle après huit heures d'observation sert de seuil de mise à mort anticipée.
Objectifs
Dans le cadre de cette demande, nous souhaitons disséquer les conséquences physiologiques de la perte de fonctions de deux gènes in vivo, en utilisant la souris comme modèle. Ces gènes, retrouvés uniquement chez les mammifères placentaires, sont exprimés exclusivement dans le cerveau, avec une expression marquée dans les neurones. Chez l'humain, le locus où sont hébergés ces gènes est lié à des anomalies génétiques entraînant une maladie rare. Ce syndrome se caractérise par un tableau clinique complexe avec par ailleurs des défauts au moment de la naissance. C’est pour cela que nous souhaitons comprendre l’effet de l’invalidation de ces gènes sur l’adaptation métabolique/physiologique qui survient durant la période autour de la naissance.
Bénéfices attendus
De nature fondamentale, les expériences proposées sont susceptibles d’avoir des retombées dans le domaine biomédical puisque les données cliniques les plus récentes indiquent que la perte d’expression des gènes que nous étudions est causalement reliée à la physiopathologie d’un syndrome humain rare. A plus long terme, nos souris invalidées pour nos gènes d’intérêts, pourraient donc représenter de nouveaux modèles pré-cliniques de cette maladie.
Procédures
Après la naissance par délivrance naturelle ou par césarienne, les souriceaux seront séparés de la mère et mis à mort pour collecter du sang et des tissus soit directement après la séparation soit au bout de 6h et 24h.
Impact sur les animaux
Le phénotype de cette lignée est que les souriceaux KO-SNORD115/116 sont de plus petite taille et présentent une mortalité périnatale avec une pénétrance incomplète, avec 40-50% des souriceaux mutant qui décèdent avant le sevrage, dont environ 60% dans les 48 heures suivant la mise-bas. Dans ce projet, lors de la séparation prolongée avec la mère, nous anticipons que l’isolement et la «souffrance métabolique» (hypoglycémie) chez les nouveaux nès constitueront indéniablement un stress, pouvant conduire jusqu’à la mort. Pour limiter ce stress, nous avons décider ne pas dépasser 24h de séparation.
Devenir
Les femelles gestantes seront mises à mort pour recueillir les embryons. En fin d'expérience, les embryons et les nouveau-nés seront mis à mort. Des tissus pourront être collectés pour des analyses métaboliques/moléculaires/histologiques.
Remplacement
Nous comptons explorer la fonction biologique de nos deux gènes d'intérêts. Ces gènes, retrouvés uniquement chez les mammifères placentaires, sont exprimés uniquement dans le cerveau, avec une expression marquée dans les neurones post-mitotiques. A ce jour, il n’existe donc malheureusement pas de modèles alternatifs crédibles permettant d’aborder la fonction de ces deux gènes de manière intégrée, et ce notamment lorsqu'il s'agit d'études métaboliques visant à décrire les mécanismes mis en jeu au cours de la naissance chez les mammifères placentaires.
Réduction
D’après des expériences antérieures et celles rencontrées dans la littérature scientifique, 15 animaux par groupe est le nombre minimum nécessaire pour réaliser des analyses statistiques adaptées et mettre en évidence des différences statistiquement significatives.
Raffinement
Des mesures seront prises pour réduire au maximum les nuisances. Les souriceaux seront placés individuellement avec un peu du nid réalisé par la mère et de la litière pour garder la stimulation olfactive. Du nursing sera réalisé avec un coton tige pour que les petits soient délicatement stimulés sur les flancs pour rappeler le comportement de la mère. Nous veillerons à ne pas dépasser 24h de séparation avec la mère. En fonction de la mortalité observée, que l’on peut attendre plus grande chez nos mutants, on pourrait être amené à réduire le temps d’observation en se fixant comme seuil temps pour lequel 50% des souriceaux mutants sont morts. Au bout de 8h d’observation, si la température des petits montre un écart de 5°C par rapport à la température mesurée au départ, alors nous anticiperons qu’ils ne passeront pas la nuit et ils seront mis à mort avant la fin de l’expérience.
Choix des espèces
Tous les modèles animaux de la pathologie décrits à ce jour sont réalisés chez la souris. C’est donc le modèle murin de choix de référence dans notre domaine de recherche qui, non seulement permet d’établir des comparaisons avec les données de la littérature, mais aussi de réduire le nombre de souris en évitant de répéter des expériences inutiles déjà publiées. L'objectif est d'étudier les mécanismes physiologiques d’adaptation à la surive périnatale, donc l’étude portera sur des souriceaux obtenus après la mie bas par délivrance naturelle ou bien par césarienne.
Développement et évaluation de l’effet thérapeutique de cellules immunitaires modifiées pour l’immunothérapie dans des modèles de tumeurs solides chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
- Système nerveux
Des cellules tumorales sont injectées dans le cerveau de souris anesthésiées, un dispositif intracérébral est posé au cours de la même chirurgie, puis les traitements arrivent une semaine plus tard directement dans le cerveau, sur animal éveillé. 7 969 souris vont être utilisées, 7 744 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour des analyses post-mortem. Suivent deux à trois séances d'imagerie par semaine sous anesthésie, trois ponctions de liquide céphalorachidien de trente minutes et des prises de sang tous les quinze jours, tandis qu'un autre groupe reçoit les cellules tumorales dans les deux yeux. Le porteur écrit que la tumeur oculaire fera baisser la vision sans conséquence pour les animaux, la vue n'étant pas leur organe sensoriel dominant, et greffe les deux yeux pour diviser par deux le nombre de souris.
Objectifs
Le système immunitaire est l’ensemble des éléments du corps qui surveillent et détruisent les cellules anormales. Malheureusement les cellules cancéreuses arrivent souvent à passer outre ce système. L’immunothérapie a été développée ces dernières années afin de réactiver le système immunitaire contre les tumeurs et de très bons résultats cliniques ont été rapportés. En utilisant une technique appelée thérapie cellulaire adoptive, nous permettons à certaines cellules du système immunitaire de reconnaitre spécifiquement la tumeur. Elles sont ensuite perfusées chez les patients cancéreux dans le but de reconnaître, de cibler et de détruire les cellules tumorales. L'immunothérapie cellulaire a montré récemment des résultats extrêmement prometteurs en utilisant des cellules modifiées et particulièrement dans le cas des cancers hématologiques (certains lymphomes et leucémies). Cependant, des résultats moins encourageants ont été observés dans certains cancers. Dans ce projet, nous allons génétiquement modifier les cellules immunitaires afin de les rendre plus efficaces et élargir leur utilisation à d’autres cancers. Les expériences proposées vont permettre d’identifier de nouveaux mécanismes anti-tumoraux et de nouvelles méthodes de traitement qui seront directement applicables dans le domaine d’immunothérapie des cancers.
Bénéfices attendus
De façon générale, la thérapie cellulaire adoptive correspond à l’expansion in vitro de cellules qui reconnaissent spécifiquement les tumeurs avant leur réinjection chez les patients. Ce nouveau type de stratégie thérapeutique anti-cancéreuse a montré des résultats prometteurs dans les essais cliniques récents mais des améliorations doivent encore être apportées pour notamment augmenter l'activité et la persistance des cellules immunitaires modifiées en évitant les effets indésirables tels l'épuisement (rendant les cellules insensibles à une activation ultérieure) Dans notre laboratoire, nous avons identifié un gène agissant comme un régulateur clé de la différenciation et formation de la mémoire immunologique de ces cellules. Nous avons observé que des cellules modifiées où ce gène a été génétiquement désactivé, sont beaucoup plus efficaces pour éradiquer des cellules tumorales dans un modèle de leucémie aigüe. Dans ce projet, nous souhaitons étudier les bénéfices de ces modifications, dans des modèles de tumeurs solides. Dans un premier temps, nous travaillerons sur des tumeurs associées à un mauvais pronostic chez les patients : comme le lymphome cérébral primitif (LCP) et le glioblastome. Les cellules modifiées que nous allons développer dans cette étude représentent une option thérapeutique intéressante pour ces patients mais des travaux précliniques restent nécessaires. Le projet permettra de faire des avancées majeures dans le domaine de la thérapie cellulaire adoptive dans le but d’améliorer le pronostic des patients atteints par ces cancers.
Procédures
Dans un premier groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectés dans le cerveau des animaux anesthésiés (durée anesthésie 30min). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Dans un second groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral sera installé (durée de l’anesthésie environ 1h30). Une semaine après l’intervention, les souris vigiles recevront des traitements directement dans le cerveau grâce au dispositif intracérébral (injection unique – durée du geste 5 min) Dans un troisième groupe d’animaux, des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau des animaux anesthésiés. Au cours de cette chirurgie, un dispositif intracérébral relié à une pompe sous-cutanée implantée au niveau du dos de l’animal seront installés (durée de l’anesthésie environ 1h30). Ces animaux seront ensuite traités par voie intraveineuse (injection unique sur animal vigile – durée du geste inf à 20sec) Les trois groupes d’animaux seront suivis par imagerie à raison de 2 à 3 imageries/semaine. Les imageries seront réalisées sur animaux anesthésiés et dureront environ 15 min. De plus, nous prélèverons du liquide céphalorachidien sous anesthésie générale (3 prélèvements à au moins deux semaines d’intervalle, durée du geste 30 min) ainsi que du sang sur animal vigile (1prélèvement toutes les deux semaines, durée du geste inférieur à 20sec) Concernant les greffes intraoculaires de cellules tumorales, les cellules seront injectées dans le vitré, sous anesthésie générale et avec antalgie adaptée. La procédure dure entre 10 et 15 minutes par œil. L’évaluation de la croissance tumorale sera réalisée de façon non invasive, soit par examen ophtalmologique (ophtalmoscopie indirecte ou par photographie du fond d’œil, quotidiennement pendant 3 jours après la greffe puis 1 fois par semaine, durée de l’examen 15 min) soit par bioluminescence (2 fois par semaine, durée de l’examen 15 min), sous anesthésie. Le traitement sera délivré 1 fois par voie intraveineuse sur animal vigile (durée du geste inf à 20 sec), ou par injection intravitréenne sur animaux anesthésiés ((durée 15 min). L’évaluation de la réponse au traitement sera réalisée de façon identique à l’évaluation de la croissance des cellules tumorales greffées.
Impact sur les animaux
Les animaux greffés avec des cellules tumorales au niveau du cerveau vont développer des tumeurs. Les souris peuvent perdre du poids dans les jours qui suivent la chirurgie et/ ou présenter, dans de rares cas, des troubles moteurs (comportement rotatoire et/ou troubles de l’équilibre). Le traitement des souris par voie intraveineuse provoque uniquement la douleur de l’aiguille utilisée pour l’injection. Dans certains cas, des dermatites peuvent se développer 3 semaines après l’injection provoquant une perte de poils à long terme. Le traitement des souris par voie intracérébrale peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2-3 jours. Le prélèvement sanguin provoque la douleur de l’aiguille et dans de rares cas une perte de poids de l’animal. Le prélèvement de liquide céphalo-rachidien peut provoquer des douleurs ainsi qu’une légère perte de poids durant 2 jours. Les animaux greffés au niveau de l’œil développeront une tumeur dont la croissance n’est pas douloureuse mais qui entrainera une baisse de la vision. Cette baisse de la vision n’aura pas de conséquence sur les animaux (sociabilisation, alimentation), ni sur le poids de l’animal, la vue n’étant pas l’organe sensoriel prédominant chez les rongeurs. Dans de rares cas, des réactions inflammatoires ou infectieuses pourront être observées suite à la greffe ou l’administration de traitements
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Ce projet découle de résultats obtenus in vitro à l'aide de lignées cellulaires en culture. En résumé, on a découvert que certaines modifications comme l’inactivation d’un gène spécifique induit une survie prolongée de certaines cellules immunitaires, appelés les lymphocytes T. L’association de plusieurs modifications génétiques sur ces cellules devrait améliorer l’effet antitumoral des cellules modifiées. D’autre part, un grand nombre d’études ont montré l’effet délétère de certains messagers, appelés cytokines, sur le système immunitaire . Le fait de bloquer certains de ces messagers, en ajoutant des inhibiteurs de cytokines au traitement, devrait améliorer, in vivo, l’effet antitumoral des cellules modifiées. Pour valider cette hypothèse, le modèle animal est nécessaire. En effet, après la validation in vitro des bénéfices de ces traitements par différents types de cellules, il est nécessaire de les évaluer dans un système plus physiologique avant d'envisager une application clinique chez l'homme en thérapie cellulaire. A ce stade, l’utilisation d’animaux est indispensable pour valider les mécanismes de régulation et d’action de ces traitements, ainsi que la toxicité éventuelle de cette thérapie cellulaire.
Réduction
Le nombre de souris par groupe est de 10 afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante, car de notre expérience, il y a toujours une certaine hétérogénéité entre souris. Ce nombre d’animaux tient compte de la nécessité d'utiliser le moins de souris possible et de pouvoir effectuer des statistiques fiables pour valider les effets biologiques observés. Pour finir, le suivi de croissance tumorale et évaluation de la réponse au traitement se fait in vivo, par imagerie de façon longitudinale et répétée, ce qui évite de devoir prévoir des animaux pour différents time points précis. Les deux yeux sont greffés afin de diminuer par deux le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Pour limiter le stress des animaux, un délai minimal de 7 jours est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Toutes les expérimentations sont réalisées sur tapis chauffant, et le réveil est réalisé sur tapis chauffant ou sous lampe chauffante. Pour les animaux ayant subis une chirurgie cérébrale ou une injection intraoculaire des soins pré et post-opératoires sont appliqués pour prévenir et/ou gérer la douleur. Un supplément alimentaire hydratant est mis à disposition dans les cages jusqu’au rétablissement complet de la souris (récupération du poids, absence de signes extérieurs de souffrance, absence de troubles moteurs). Pour limiter les effets secondaires dus à l’injection des cellules modifiées, comme les dermatites, nous étudierons l’effet de la délétion d’un gène potentiellement responsable de ces effets secondaires. Ces animaux sont surveillés quotidiennement pour évaluer leur état général et deux à trois fois par semaine pour mesurer la taille de la tumeur afin d'appliquer les points limites décrits dans une grille bien définie. Cette grille de score permet d’évaluer, de façon objective et spécifique, l’état global de l’animal (poids, état physique général, comportement moteur). Elle est adaptée à chaque type de procédure. En cas d’atteinte d’un point-limite tel que décrit dans la grille de score, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche en immunologie anti-cancéreuse car la connaissance complète du génome murin permet d'utiliser de nombreux outils bien caractérisés, dont les souris génétiquement modifiées pour des protéines spécifiques d’intérêt ainsi qu’un grand nombre de modèles de tumeurs transplantées.
Développement d’un traitement pour la déficience en acide lipase lysosomale par thérapie génique in vivo utilisant des lentivirus.
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
Les souris utilisées sont dépourvues de lipase acide lysosomale, une déficience qui réduit leur espérance de vie à huit ou dix mois et provoque une thrombocytose. 1 500 d'entre elles vont être utilisées, 1 300 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 200 un niveau modéré. À six jours, une partie subit une biopsie de la queue, puis viennent les injections de vecteurs lentiviraux et des prises de sang qui peuvent provoquer des plaies oculaires, les nouveau-nés étant traités dès deux jours de vie. Toutes sont tuées pour vérifier si l'accumulation de graisse dans le foie a été corrigée, un traitement en une seule injection étant annoncé pour les patients dans cinq à dix ans.
Objectifs
Le déficit en lipase acide lysosomale (LAL) est une maladie génétique rare due à des mutations dans le gène LAL réduisant la production de la protéine LAL, nécessaire à la dégradation des graisses. Ainsi, le déficit en LAL provoque une accumulation toxique de graisses dans les organes, notamment le foie. La gravité de l'affection dépend de la quantité de protéine fonctionnelle. La forme la plus sévère de la maladie, appelée maladie de Wolman, qui se caractérise par l'absence totale de l’enzyme entraîne une mort précoce à l'âge de 3 à 8 mois. En revanche, dans sa forme la moins sévère (maladie de stockage des esters de cholestérol, CESD), les patients présentent peu de symptômes visibles, et la maladie peut toucher aussi bien les enfants que les adultes. Le traitement standard de la déficience en LAL consiste en l’injection hebdomadaire, tout au long de la vie du patient, d’une enzyme LAL de remplacement (Sebelipase alpha ®). Ce traitement, non curatif, reste coûteux et est limité par le développement, au fil du temps, de réponse immunitaire dirigés contre l'enzyme de remplacement. Au vu des succès de la thérapie génique, l'ajout du gène sain (sans mutation) LAL dans les cellules du foie du patient pourrait représenter un traitement à long terme. En effet, les cellules modifiées produiraient l'enzyme manquante dans l'organe le plus affecté, empêchant ainsi l'accumulation de graisses liée à la maladie. Pour ce projet, nous utiliserons différents vecteurs lentiviraux modifiés pour introduire le gène manquant de l'enzyme LAL (LV-LAL) dans les cellules du foie, cible privilégiée de nos virus. Afin de couvrir tous les stades de la maladie, nous prévoyons de traiter à la fois des souris adultes et des souriceaux agées de 2 jours mimimant la déficience en LAL (LAL KO). Cette approche pourrait offrir un traitement curatif en une seule injection aux patients atteints de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à développer une thérapie génique curative pour la déficience en LAL (lipase acide lysosomale), une maladie rare et souvent fatale. Grâce à l'utilisation de modèles animaux et de vecteurs viraux innovants, nous espérons corriger efficacement le défaut enzymatique responsable de cette pathologie. Si les résultats obtenus sont positifs, cette approche pourrait offrir une solution thérapeutique durable pour les patients atteints de cette maladie dans les 5-10 prochaines années. Dans le cas où les résultats ne seraient pas concluants, ils fourniront néanmoins des données importantes pour mieux comprendre la biologie de la maladie et les mécanismes d'action de la thérapie génique. Ces résultats seront partagés avec la communauté scientifique à travers des publications dans des revues spécialisées, contribuant ainsi à l'avancement des connaissances dans ce domaine et à l'amélioration des futures stratégies thérapeutiques.
Procédures
Les souris subiront une biopsie de queue faite à 6 jours après la naissance. Les animaux subiront les interventions suivantes : injection de vecteurs viraux et prélèvement de sang. Ces prélèvements sont des procédures rapides, et ne devrais pas prendre plus de 10 min par souris.
Impact sur les animaux
Les souris LAL KO ont une espérance de vie réduite (8 à 10 mois) et souffrent de thrombocytose. La biopsie de queue, l'administration des vecteurs ou les prises de sang peuvent induire de la douleur, du stress et/ou une perte de poids. Les prises de sang peuvent également entraîner des plaies oculaires. La douleur et le stress devraient durer une dizaine de minutes, tandis que la perte de poids et les plaies oculaires devraient être transitoires et se résorber en 24 à 48 heures.
Devenir
Les souris issues des procédures seront euthanasiées afin d'évaluer la correction du phénotype, à savoir l'accumulation de gras, après traitement par thérapie génique.
Remplacement
Nous développons une stratégie curative de la déficience en lipase acide lysosomale par thérapie génique et basée sur l'administration de vecteurs viraux lentiviraux modifiés pour introduire le gène sain de l'enzyme LAL dans les cellules du foie, cible privilégiée de nos virus. Divers vecteurs viraux ont été préalablement testés au laboratoire sur des cellules hépatiques et cutanées de patients. Ces essais ont révélé que certains vecteurs pouvaient produire un niveau suffisant d'enzyme pour corriger l'accumulation de graisses dans les cellules de patients. Néanmoins, ces tests ne permettent pas d’étudier la distribution de nos vecteurs ni leur effet thérapeutique sur tous les organes ou encore de confirmer leur innocuité. Pour cela, nous devons avoir recours à l’utilisation d’animaux sur un modèle de souris représentatif de la déficience en lipase acide lysosomale. De plus, le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation de corps étrangers (vecteur viraux) à l’organisme pour véhiculer le gène sain jusqu’aux cellules à traiter. Pour apporter le gène de l’enzyme lipase acide lysosomale jusqu’aux cellules du foie, nous utilisons des virus modifiés. L’organisme est entraîné à lutter naturellement contre les virus et ce mécanisme de défense est à ce jour impossible à recréer en laboratoire.
Réduction
Afin de déterminer le nombre nécessaire de souris dans nos groupes expérimentaux, nous cherchons à comparer la quantité de lipides dans le foie entre les souris déficientes en lipase acide lysosomale et celles ayant reçu le traitement. Pour cela, nous avons utilisé un test stastistique et selon ces calculs, il faudrait inclure 8 souris déficientes en lipase acide lysosomale et 4 souris saines par groupe d'études.
Raffinement
Les souris déficientes en lipase acide lysosomale sont plus petites que les souris saines, mais n'ont pas de problèmes de motricité ou de douleur, donc aucune condition particulière d’hébergement n'est nécessaire. Lors de la réalisation des procédures expérimentales, l’état général des souris (apparence, posture, comportement, etc.) et leur poids seront surveillés une fois par semaine pendant toute la durée des procédures. En cas de plaies, un traitement local sera appliqué, et si les plaies ne cicatrisent pas en une semaine, les souris seront euthanasiées.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris déficientes en lipase acide lysosomale car ce modèle mine l’accumulation de lipides observés chez les patients. Afin d’étudier la correction de la maladie, les animaux seront injectés dans les 2 jours après la naissance pour mimer des conditions de traitement de patient pédiatrique et à 7-10-semaines pour mimer le traitement d’adulte.
Impact du déficit en fusion mitochondriale sur la fonction vasculaire lors de l’hypertension artérielle
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Surveillées chaque jour pendant vingt-huit jours et notées deux fois par semaine sur une grille de douleur, 336 souris portent sur le dos une mini-pompe qui leur délivre de l'angiotensine II. Elles vont toutes être tuées pour prélever leurs tissus vasculaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'implantation dure une quinzaine de minutes sous anesthésie, et le porteur indique que la pompe peut limiter certains mouvements et que les points de suture peuvent s'infecter ou sauter. Le bénéfice annoncé se limite à compléter des expériences déjà commencées pour qu'un article sur la fusion mitochondriale puisse être publié.
Objectifs
Le maintien de la pression artérielle normale est dépendant de l’équilibre entre le débit cardiaque et la résistance vasculaire. Lors de la pathologie d’hypertension artérielle, le débit cardiaque reste normal. C’est la résistance vasculaire, due à un remodelage des artères, qui augmente et induit ainsi une élévation de la pression artérielle. Lors de l’hypertension, il est observé une augmentation du stress oxydatif en grande partie d’origine mitochondrial. Celui-ci a un impact délétère sur toutes les composantes du vaisseau. Ce stress oxydatif contribue au remodelage vasculaire et donc à l’hypertension. Les mitochondries sont capables de fusionner entre elles ou de se séparer. L’équilibre entre fusion et fission est essentiel au bon fonctionnement des cellules. Moins de fusion entraîne une diminution de la fonction mitochondriale. Il nous paraît donc essentiel d’étudier l’impact de ce déficit sur la fonction vasculaire lors de l’hypertension artérielle, pathologie dans laquelle les mitochondries jouent un rôle important.
Bénéfices attendus
Nos premiers résultats montrent l’implication de la fusion mitochondriale dans la fonction vasculaire lors de l’hypertension arterielle. Nous devons compléter plusieurs expériences pour qu’un article décrivant cette implication puisse être publié.
Procédures
- Pose d’une mini-pompe d’angiotensine II en sous-cutanée sous anesthésie générale : ce geste est réalisé une fois par animal, couplée à une analgésie. La durée d’intervention est d’environ 15 minutes. 336 animaux concernés.
Impact sur les animaux
A la suite de la chirurgie et jusqu’à la fin du protocole (28 jours), l’animal a une mini-pompe implantée sur le dos qui peut limiter très légèrement certains mouvements. Une douleur post-chirurgicale n’est pas attendue car l’intervention est peu invasive. Cependant, l’animal est surveillé jusqu’à la fin du protocole (28 jours) pour dépister une éventuelle douleur. Enfin, une petite infection des points de suture pourrait survenir ou que des points sautent, les animaux étant plusieurs par cage.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour récupérer les tissus vasculaires sur lesquels nous allons mener des expériences.
Remplacement
Aucune alternative à l’utilisation d’animaux vivants ne permet d’étudier la fonction vaculaire dans un contexte physiologique et encore moins pathologique. Le modèle prévu est un modèle standard bien documenté dont l’impact sur l’animal est bien maîtrisé.
Réduction
Le nombre d’animaux pour les expériences a été précisément défini à l’aide d’un outil informatique pour avoir assez de puissance statistique lors de l’étude. Des tests statistiques adaptés sont utilisés.
Raffinement
La pose des pompes osmotiques est un acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale et analgésie. La réponse nociceptive des animaux sera régulièrement testée en cours d’intervention. Les éventuelles modifications du rythme cardiaque et respiratoire seront observées pour ajuster au mieux l’anesthésie pendant l’intervention chirurgicale. Durant les 28 jours de cinétique, les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter une éventuelle réaction cutanée ou une gêne. Même si elle n’est pas attendue, la douleur de l’animal sera évaluée 2 fois par semaine selon une grille d’évaluation de la douleur.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées représentent des outils spécifiques dans la plupart des domaines de la recherche médicale. La souris est un excellent modèle pour la maladie humaine, l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme et peuvent être modifier pour se rapprocher au mieux de la pathologie recherchée. L’ensemble des souris utilisées seront des souris adultes âgées entre 3 et 6 mois, âge qui permet de standardiser le poids de l’animal et la taille des vaisseaux.
Exposition précoce au stress chronique et chimique : impact sur la santé respiratoire
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système respiratoire
Des femelles gestantes sont enfermées chaque jour dans une machine à enfumer, placées le matin dans un espace restreint, puis laissées le soir sur une litière humide en cage inclinée, le cycle lumineux étant inversé le week-end. 480 souris, 120 femelles et 360 souriceaux, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, les petits étant exposés à la fumée de cigarette jusqu'à leur trentième jour de vie. Le porteur affirme que les femelles "tolèrent bien" cette exposition, "sans nuisance particulière", tout en anticipant que le stress chronique quotidien peut conduire à un cannibalisme maternel. Toutes sont tuées à la fin de la procédure, pour prélever notamment les poumons et mesurer les effets des deux expositions.
Objectifs
L'objectif de notre projet est d'évaluer les interactions entre les expositions au stress chronique maternel et au tabagisme pendant les premières années de vie et leurs conséquences sur la santé respiratoire de l'enfant/de la progéniture. L'approche expérimentale qui fait l'objet de la présente demande vient compléter une approche épidémiologique réalisée sur une cohorte mère-enfant, avec pour objectif général d'identifier les mécanismes biologiques sous-tendant les interactions entre stress chronique et chimique. Le volet expérimental du projet va nous permettre de comprendre à quel(s) stade(s) du développement pulmonaire cette interaction exerce son effet, grâce aux analyses fonctionnelles et moléculaires qui seront réalisées sur les prélèvements pulmonaires notamment.
Bénéfices attendus
Ce projet explore la relation entre l'exposition aux polluants, en particulier le tabac, et la vulnérabilité induite par le stress sur la santé respiratoire. Il se concentre sur un problème majeur de santé publique qui a été peu exploré jusqu'à présent : comment l'exposition précoce à un événement stressant de la vie rend les individus plus susceptibles de développer des troubles respiratoires après une exposition à des polluants environnementaux tels que le tabac. L'identification de biomarqueurs enrichira la construction d'AOPs (adverse outcome pathways) et donc, au-delà de la science fondamentale, renforcera le panel d'outils de régulation dans ce domaine. Ces biomarqueurs seront aussi recherchés chez les patients, ce qui devrait conduire à terme à de fortes implications en santé publique grâce à l'approche pluri- et transdisciplinaire du projet dans son ensemble (volets épidémiologique et expérimental).
Procédures
Les femelles gestantes seront exposées à la fumée de cigarettes quotidiennement, selon une procédure non douloureuse (cage placée dans une machine à enfumer), et/ou à différents stress chroniques. Ainsi, un évènement de stress léger sera appliqué le matin (femelle placée dans un environnement restreint), ainsi que le soir (litière humide, cage inclinée). Les week-ends, seule une inversion du cycle de lumière (30 min de lumière toutes les 3 h) sera appliquée. La descendance sera exposée quotidiennement à la fumée de cigarette jusqu'au 30è jour de vie. Elle sera soumise à des mesures longitudinales non invasives de fonction pulmonaire sur animaux vigiles durant 1h à plusieurs stades de leur vie (Pléthysmographie).
Impact sur les animaux
D’après nos résultats antérieurs, les souris femelles exposées aux polluants au cours de la gestation tolèrent bien une telle exposition, sans nuisance particulière. Leur descendance ne présente pas de létalité excessive ou d’anomalies évidentes de développement, les souriceaux grandissent normalement jusqu’à l’âge adulte. L’exposition des femelles au stress chronique chaque jour pendant la gestation pourrait induire un stress pouvant conduire à un cannibalisme maternel. Dans le cadre de ce projet, une attention particulière sera portée à la croissance dès les premiers jours de vie afin de détecter des troubles éventuels. La mesure de la fonction pulmonaire par pléthysmographie corps entier est non invasive, elle est réalisée sur animaux vigiles et libres de mouvement, elle n’induit pas d’effets indésirables.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d'étudier les effets de l'exposition aux différents stress (chronique et/ou chimique).
Remplacement
L'objectif de notre projet est d'évaluer les interactions entre les expositions au stress chronique maternel et au tabagisme pendant les premières années de vie et leurs conséquences sur la santé respiratoire de l'enfant/de la progéniture. De cette co-exposition résulte une complexité impossible à modéliser de manière bioinformatique ou par technique de culture cellulaire. Nous souhaitons ensuite mesurer les conséquences de cette exposition périnatale sur la physiologie et la fonction pulmonaires de la descendance jusqu’à l’âge adulte, que nous ne sommes pas en mesure de modéliser par des méthodes alternatives à l’heure actuelle. Notre étude sur modèle murin nous permettra justement de modéliser des expositions maternelles humaines bien plus complexes, pour lesquelles nous avons encore peu de données.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet est de 480 animaux (360 souriceaux + 120 femelles gestantes). Ce nombre a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données historiques du laboratoire, du nombre moyen le plus bas de naissances par portée, et de données (publiées ou non), nous permettant de réaliser des calculs statistiques permettant de définir le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un effet statistiquement significatif et pour déterminer des points d'arrêt d'expérimentation. Il tient aussi compte du nombre d'études estimées, des variations inter individus et de la robustesse des mesures. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’effet ou non d’une condition expérimentale. Précédemment au laboratoire nous avons harmonisé les procédures afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le choix des points temporels d’analyses a été conservé par rapport aux études précédentes du laboratoire. Ainsi, les résultats précédemment obtenus au laboratoire sur les effets de l’exposition à la fumée de cigarette et/ou sur la période du développement pulmonaire pourront être comparés. En fonction du calendrier des expériences et de la réussite des accouplements, le nombre d'animaux utilisés pourra être revu à la baisse.
Raffinement
Les expérimentations seront réalisées conformément aux règles éthiques visant à respecter le bien être animal, c’est-à-dire dans un environnement contrôlé (stabulation dans des enceintes autonomes d'animalerie). Ces conditions expérimentales offrent de plus l’avantage de minimiser l’impact de stress non contrôlés sur les paramètres mesurés. Plus spécifiquement, pour la réalisation du protocole de stress, les animaux seront stabulés dans des enceintes autonomes. Ces enceintes permettent d'éviter aux animaux d'être dérangés par le bruit extérieur (source de stress que nous ne pourrions contrôler dans un projet qui s'intéresse à l'effet d'événement stressant). Au cours de nos travaux antérieurs portant sur les femelles gestantes, nous avons mis au point un protocole permettant de minimiser le stress (non souhaité), notamment en les enrichissant fortement par l'ajout de refuges en carton, de carrés de cellulose et de lanière de papier. Après le sevrage, les souris de la descendance bénéficieront des mêmes conditions d’enrichissement, et seront hébergées en groupes sociaux, pour réduire leur stress et favoriser leur bien-être. L'exposition à la fumée de cigarettes se fait en placant directement les cages dans la machine à enfumer Teague, ce qui permet de ne pas avoir à changer les animaux de cages. Les animaux seront sous observation quotidienne pendant toute la durée du protocole, et l’évaluation permanente de l’état général des souris permettra de respecter le bien-être animal et d’appliquer la mise à mort rapide à l’atteinte d’un point limite.
Choix des espèces
Le modèle murin a été choisi dans notre projet pour plusieurs raisons. La souris est le modèle le plus utilisé en toxicologie, la littérature à son sujet est donc abondante. Par ailleurs, nous maitrisons l'ensemble des techniques nécessaires à l'expérimentation. Les analyses seront réalisées à J21 (stade tardif de l'alvéolisation), J30 (jeune adulte) et J60 (adulte, maturité pulmonaire atteinte).
Association chimiothérapie, hormonothérapie et radiothérapie dans le traitement des cancers de la prostate avec peu de métastases
- Recherche appliquée
- Cancers
Pour tester chez la souris une association de deux médicaments et d'une radiothérapie contre le cancer de la prostate peu métastatique, 700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des prélèvements terminaux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune peut subir une chirurgie de vingt minutes pour l'injection de cellules tumorales dans la prostate, quatre séances de radiothérapie, une injection dans l'abdomen toutes les deux semaines, quatre administrations orales par semaine et un prélèvement de sang hebdomadaire pendant huit semaines. Les effets annoncés vont de la douleur au site d'injection à l'infection, en passant par la gêne provoquée par la tumeur et la perte de poids. Une grille de score fixe le moment où l'état est jugé trop dégradé, et les souris sont alors mises à mort, décision que le porteur place après l'adaptation de l'hébergement et les soins.
Objectifs
Le cancer de la prostate est le cancer le plus commun chez l’homme. C’est le cancer dont l’incidence augmente le plus, ce qui se traduit par le fait qu’environ un homme sur huit sera atteint d’un cancer de la prostate au cours de sa vie avec une forme métastatique de la maladie. En dehors de la radiothérapie qui peut être efficace dans le traitement des formes localisées et des métastases osseuses, différents traitements médicamenteux ont également été approuvés en première ligne. Si l’autorisation de ces nouvelles thérapies représente une avancée majeure dans le traitement de ces cancers, le problème de leur utilisation en combinaison avec la radiothérapie, reste entier. En laboratoire, notre équipe a étudié et comparé l’efficacité d’une association de 2 médicaments avec la radiothérapie sur des cellules cancéreuses. Nous avons réalisé différents tests qui nous ont permis d’identifier une combinaison de médicaments et un schéma de traitements efficaces. Nous souhaitons maintenant déterminer si l’association identifiée lors de ces études en laboratoire, pourrait être utilisable et efficace dans un modèle animal de cancer de prostate présentant un faible nombre de métastases.
Bénéfices attendus
Ce projet à caractère translationnel adresse la question de l’optimisation des combinaisons de 2 médicaments et la radiothérapie dans le traitement des cancers de prostate à peu de métastases et résistants à la castration. Malgré les essais cliniques en cours il n’existe en effet aucune méthode préclinique rationnelle et standardisée permettant de déterminer à priori les combinaisons qui seront les plus efficaces et les ratios de doses les plus pertinents à utiliser. Les résultats attendus de notre approche préclinique permettront de valider la combinaison de cette triple association la plus efficace. Cela permettra d’envisager la mise en place d’essais prospectifs et de nouvelles stratégies de prise en charge des cancers de prostate avec peu de métastases avec une possible adaptation des standards de traitement actuels.
Procédures
Les gestes réalisés sont : 1 injection intra-péritonéale toutes les 2 semaines pendant 8 semaines (2 minutes par souris) 1 radiothérapie 1 toutes les 2 semaines pendant 8 semaines (6 minutes par souris) 4 administrations per os par semaine pendant 8 semaines (2 minutes par souris) 1 injection sous-cutanée unique (2 minutes par souris) 1 prélèvement sanguin par semaine pendant 8 semaine Chirurgie pour 1 injection unique intra-prostatique (20 minutes par souris)
Impact sur les animaux
Effets indésirables direct : - Douleur associée à une injection de cellules en sous-cutanée ou intra-prostatique - Douleur suite au prélèvement sanguin sur la veine caudale - Infection au site d’injection - Complication suite à la chirurgie pour l’injection intra-prostatique Effets indésirables indirects conséquence des produits injectés : - Croissance tumorale et gêne engendrée par la tumeur - Perte de poids. Les nuisances qui pourront être engendrées par la croissance tumorale chez ces animaux seront parfaitement surveillées et maîtrisées afin de limiter toute souffrance.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de réaliser des prélèvements terminaux.
Remplacement
Ils n’existent pas de modèles in vitro et in silico reproduisant la complexité du milieu tumoral et permettant de déterminer l'efficacité thérapeutique de cette tri-thérapie.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au maximum basé sur les données de la littérature pour des expériences similaires. Nous réaliserons une étude préliminaire de toxicité afin de réduire le nombre d’animaux. Concernant l’approche statistique, chaque lot d’animaux comprendra 10 animaux afin de réaliser les tests statistiques pertinents sur un effectif suffisant.
Raffinement
Les souris feront l'objet d'une surveillance quotidienne y compris les week-ends et jours fériés. Le suivi de la croissance tumorale ainsi que du poids des animaux. Dans le cas où un animal présente un signe de souffrance, différentes décisions peuvent être prises comme l’adaptation des conditions d’hébergement, l’application de soins ou l’euthanasie. Les animaux seront euthanasiés si leur état général est fortement altéré ou si les points limites sont atteints. Une grille de scoring ayant été établi, tous les soins nécessaires pour apaiser le stress ou la douleur seront mis en place, jusqu’à l’euthanasie si besoin.
Choix des espèces
L’espèce choisie pour cette étude est la souris car elle est l’espèce qui est le mieux défini génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence sont nombreuses. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines, âge de maturité sexuelle.
Etude des effets rénaux de la protéine Claudine-10b chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Un score sur quatre critères, chacun noté de 0 à 3, décide de la mise à mort anticipée : trois sur un seul critère ou six au total y suffisent. 160 souris vont être utilisées, la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'autre moitié anesthésiée et tuée sans réveil, avec exérèse des deux reins. Quatre-vingts d'entre elles passent dix jours en cage à métabolisme individuelle, quarante avec un régime appauvri en sel, ce qui peut entraîner perte de poids, angoisse et lésions de la peau des pattes par station prolongée sur la grille. Le syndrome rénal humain visé reste incurable et le porteur présente son travail comme "un préalable sur le chemin" d'un futur traitement.
Objectifs
Une maladie humaine, appelée syndrome HELIX (Hypohidrose, anomalies Electrolytiques, Hypolacrymie, Ichtyose, Xérostomie) est caractérisée par une perte urinaire de chlorure de sodium et une insuffisance rénale progressive. Cette maladie est due à une anomalie de la protéine d'intérêt, située une partie spécifique du rein. Normalement, la présence de cette protéine permet de conserver le sodium évitant sa fuite dans l'urine. Actuellement, cette maladie est incurable. Un modèle murin de la maladie, obtenu par inactivation de la protéine d'intérêt, a été créé mais la caractérisation du modèle a été incompléte et les propriétés de la partie du rein exprimant ou n’exprimant pas le gène d'intérêt n’ont pas été définies. Nos objectifs sont donc - de déterminer si l’inactivation complète du gène d'intérêt (codant pour la protéine d'intérêt) entraine une fuite rénale de chlorure de sodium chez la souris et une réaction hormonale adaptative sous la forme d'une augmentation de production d'aldostérone- de quantifier la facilité avec laquelle le sodium peut passer entre les cellules du rein, en présence et en absence de la protéine d'intérêt, ainsi que les conséquences de l'absence de la protéine d'intérêt sur le fonctionnement des cellules du rein.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de déterminer le rôle de la protéine d'intérêt dans le fonctionnement du rein des mammifères terrestres. Plus généralement, cette étude apportera des éléments permettant de mieux comprendre les mécanismes de transport du sodium dans divers épithéliums. Cette étape est un préalable sur le chemin devant permettre de développer un traitement efficace du syndrome HELIX et de prévenir les complications délétères (insuffisance rénale et troubles métaboliques). Le projet permettra 1. de connaitre précisément l'impact de l'inactivation de la protéine d'intérêt sur la capacité à maintenir normales les valeurs des elctrolytes dans le sang 2. de comprendre l'adaptation du rein à la perte de fonction de la protéine d'intérêt, et de comprendre les conséquences sur l'organisme dans son ensemble.
Procédures
Voici la liste des interventions réalisées chez les animaux. Quatre vingt (80) animaux sont soumis à un hébergement en cage à métabolisme individuelle pendant 10 jours non consécutifs pour recueil d'urine (80 animaux, 10 jours répartis en 4 jours, puis 2 jours, puis 4 jours) ; parmi ceux-ci, 40 sont soumis à un régime appauvri en chlorure de sodium (NaCl) (4 jours, 40 animaux). Les 80 animaux subissent un prélèvement sanguin, unique par ponction veineuse chez l'animal vigile (80 animaux, 2 minutes). Finalement tous les animaux du projet subissent une anesthésie et analgésie terminale par injection intrapéritonéale pour exérèse des 2 reins (160 animaux, 1 minute).
Impact sur les animaux
Les effets ci-dessous ne sont pas tous attendus mais ils sont possibles. L'hébergement en cage à métabolisme peut induire les effets indésirables suivants : perte de poids transitoire, toujours inférieure dans notre expérience à 10 pour cent du poids initial, angoisse et intolérance à l'hébergement en cage à métabolisme, lésions de la peau des pattes par station prolongée sur la grille de la cage. Le prélèvement sanguin peut induite les effets indésirables suivants : saignement, douleur lors de la ponction transcutanée. L'anesthésie peut, rarement, induire les effets indésirables suivants : réaction allergique à l'anesthésie, défaillance circulatoire ou respiratoire, douleur lors de la ponction transcutanée.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés selon une méthode réglementaire, avant le prélèvement de tissus et analyse ultérieure.
Remplacement
La complexité des déterminants des transports ioniques à travers les épithéliums et de leurs conséquences systémiques est telle que le remplacement n'est pas possible puisqu'il s'agit d'étudier les conséquences d'une mutation génétique sur un organisme entier, avec toute sa complexité et ses capacités d'adaptation. Il n'y a pas d'alternative à cette étude, les modèles cellulaires existant ne permettant pas de rendre compte de la complexité du fonctionnement de l'organisme intact.
Réduction
Cent soixante (160) animaux seront utilisés dans cette étude. Le nombre d’animaux par groupe est déterminé de façon à assurer des observations fiables et utilisables. Les mesures réalisées dans la domaine de l'homéostasie tiennent compte de l'état de l'art de manière à avoir la meilleure performance des mesures réalisées et réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux par groupe a été calculé en tenant compte de la variabilité des paramètres d’intérêt en fonction des conditions expérimentales; les nombres d'animaux nécessaires ont été déterminés en s’appuyant sur un calcul de puissance ; les comparaisons des résultats entre les groupes se feront grâce à des tests statistiques validés.
Raffinement
Toutes les procédures le nécessitant seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Par procédure le nécessitant, est définie toute procédure générant une douleur ou une souffrance supérieure à une piqure transcutanée par une aiguille. Dans la mesure du possible, en fonction des contraintes des procédures, les animaux bénéficient d’un environnement enrichi (l’environnement est enrichi par des tunnels en carton et/ou des abris en plastique, et des boules de ouate) et leur souffrance est prise en compte et atténuée au maximum. Des points limites (changement du poids corporel, apparence physique, comportement, saignement) ont été définis et les animaux font l'objet d'une surveillance au cours des différentes procédures exposées dans la demande. Entre leur sevrage et leur entrée en procédure, les animaux sont hébergés en zone Expérimentation Souris, selon les procédures de cette zone : la stabulation des animaux est conventionnelle. Les animaux reçoivent une alimentation définie ad libitum ainsi que l'eau par abreuvement automatique. Des périodes d'hébergement en cage à métabolisme étant nécessaires à l'étude, une période d'acclimatation de 4 jours est prévue. Les deux périodes expérimentales en cage à métabolisme sont définies au plus court, et sont séparées l'une de l'autre. Des points limites ont été définis. Nous avons mis en place un score prenant en compte 4 critères. Chaque item est noté de 0 à 3. Un score de 3 pour un item et/ou un score de 6 pour la somme des items justifie l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
Le modèle d'inactivation génique de la protéine d'intérêt a été développé chez la souris. Les animaux sont utilisés à partir de l'âge de 8-9 semaines. Les animaux ont alors terminé leur phase de croissance rapide et sont considérés comme matures. Leur taille permet la réalisation des manoeuvres expérimentales.
Etude des agonistes des récepteurs B-adrénergiques dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
Une molécule irritante instillée dans le rectum sous anesthésie, ou une bactérie pathogène administrée par gavage, déclenchent chez elles une inflammation intestinale : 110 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever le colon. La moitié relève d'un niveau de souffrance modéré, l'autre d'un niveau sévère, avec prostration, saignements rectaux, diarrhée prolongée et perte de poids pouvant dépasser 20 % du poids initial. L'objet déclaré est de vérifier chez la souris un effet anti-inflammatoire déjà observé sur des macrophages en culture. Sur la réduction du nombre d'animaux, le porteur promet une planification minutieuse et des évaluations régulières de ses pratiques, sans donner d'effectif par groupe ni de calcul.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont des pathologies chroniques entrecoupées de période de phase aigüe. A l’heure actuelle, seule la phase aigüe est prise en charge sans pour autant induire un effet curatif. En effet, les traitements proposés jusqu’à présent, visent surtout à améliorer le bien-être du patient. Par ailleurs, le traitement le plus répandu (qui est basé sur l’utilisation des corticoïdes) ne peut pas être utilisé chez l’enfant. Enfin, les MICI peuvent au bout d’un certain temps, entraîner la survenue du cancer colorectal Il est donc important de mettre en place des traitements qui peuvent agir sur la phase chronique et sur la phase aigüe et capables de prévenir la survenue d’une phase aigüe. Dans ce contexte d’inflammation chronique de l’intestin, qui est une véritable gêne pour le patient, nous voulons voir si les ligands des récepteurs du stress peuvent permettre la diminution de cette inflammation. En effet, nous avons réussi à montrer dans les modèles in vitro et grâce à l’analyse de différents marqueurs, basé sur des lignées primaires de macrophages, qu’un traitement par ces ligands permettait une modification du phénotype des macrophages primaires d’un type pro-inflammatoire vers un type anti-inflammatoire et pourrait à ce titre avoir un effet anti-inflammatoire global. Notre projet vise à confirmer l’effet anti-inflammatoire des ligands des récepteurs du stress dans un modèle murin d’inflammation intestinale aigüe et au cours de la phase chronique de la maladie pour répondre au besoin de traiter les patients en phase chronique de la maladie. L’ensemble de ces résultats nous permettra de déterminer si les ligands des récepteurs du stress ont des effets bénéfiques in vivo dans un contexte inflammatoire.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de mettre en évidence l’intérêt thérapeutique d’une stimulation des récepteurs du stress pour la prise en charge des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Nous pourrons également évaluer si les traitements présentes des effets toxiques et définir les doses de traitement qui pourront ensuite servir à des études de toxicité ou de disponibilité.
Procédures
La procédure expérimental 1 nécessite l’anesthésie des souris pour l’injection intrarectale. L’anesthésie gazeuse sera pratique une seule fois (au moment de l’induction de l’inflammation) et durera 5 min maximum. La pesée quotidienne des souris durera moins d’1 minute et les injections intrapéritonéales prévues tous les 2 jours dureront également moins d’1 minute. La procédure expérimentale 2 nécessite un gavage des animaux. Ce geste technique durera moins d’1 minute. Les pesées (quotidiennes) et les injections intrapéritonéales (tous les 2 jours) dureront moins d’1 minute.
Impact sur les animaux
Nous supposons que la procédure expérimentale classée sévère engendrera de la douleur chez les animaux et de la diarrhée. Nous pouvons nous attendre à avoir des animaux prostrés, peu mobiles, des saignements rectaux, une diarrhée prolongée, ou une perte de poids supérieure à 20% du poids initial. Concernant le modèle expérimental chronique, classé en procédure modérée, nous supposons que l’infection des souris par un pathogène puisse induire des selles molles voir des diarrhées et une perte de poids mais aucune autre souffrance. La littérature ne rapporte pas de saignements rectaux dans ce modèle et nous ne nous attendons pas à en retrouver.
Devenir
Les animaux devront tous être mis à mort afin de pouvoir collecter le colon.
Remplacement
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) sont des pathologies chroniques entrecoupées de période de phase aigüe. A l’heure actuelle, seule la phase aigüe est prise en charge sans pour autant induire un effet curatif. En effet, les traitements proposés jusqu’à présent, visent surtout à améliorer le bien-être du patient. Par ailleurs, le traitement le plus répandu (qui est basé sur l’utilisation des corticoïdes) ne peut pas être utilisé chez l’enfant. Enfin, les MICI peuvent au bout d’un certain temps, entraîner la survenue du cancer colorectal Il est donc important de mettre en place des traitements qui peuvent agir sur la phase chronique et sur la phase aigüe et capables de prévenir la survenue d’une phase aigüe. Dans ce contexte d’inflammation chronique de l’intestin, qui est une véritable gêne pour le patient, nous voulons voir si des molécules qui reconnaissent les récepteurs de stress peuvent permettre la diminution de cette inflammation. En effet, nous avons réussi à montrer dans les modèles in vitro et grâce à l’analyse de différents marqueurs, basé sur des lignées primaires de macrophages, qu’un traitement par ces molécules permettait une modification de la réponse inflammatoire et pourrait à ce titre avoir un effet anti-inflammatoire global. Notre projet vise à confirmer l’effet anti-inflammatoire de ces molécules ciblant les récepteurs du stress dans un modèle murin d’inflammation intestinale aigüe et au cours de la phase chronique de la maladie pour répondre au besoin de traiter les patients en phase chronique de la maladie. L’ensemble de ces résultats nous permettra de déterminer si ces molécules ont des effets bénéfiques in vivo dans un contexte inflammatoire.
Réduction
Notre projet s'engage à réduire autant que possible l'utilisation d'animaux dans l'expérimentation à des fins de recherche, tout en garantissant des normes élevées de bien-être animal et d'intégrité scientifique. Le développement des modèles in vivo est fondé sur des recherches scientifiques approfondies et un protocole expérimental bien défini. Avant de commencer toute expérience, nous réaliserons une planification minutieuse pour nous assurer que chaque animal est utilisé de manière pertinente. Enfin, nous évaluerons régulièrement nos protocoles et pratiques pour identifier de nouvelles opportunités de réduction et d'amélioration.
Raffinement
Les souris disposeront d’une phase d’habituation à la manipulation par les expérimentateurs pour réduire leur appréhension. Les souris seront examinées tous les jours pour surveiller leur inconfort (contrôle des fèces, isolement du groupe, absence de toilettage). Par ailleurs, les injections intrarectales se feront sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane pour limiter le stress sur un tapis chauffant pour limiter la perte de chaleur durant l’anesthésie. Les animaux seront hébergés à raison de 6-10 souris par cage en présence d’éléments nécessaires à la fabrication d’un nid. De la nourriture et de l’eau seront ajoutés dans la cage pour prévenir le manque de mobilité possible de certains animaux. Également, des points limites spécifiques de chaque modèle seront appliqués.
Choix des espèces
L’étude du rôle des ligands du récepteur de stress β3 dans la prévention de l’inflammation intestinale in vivo nécessite l’utilisation de modèles murins, dont les similarités des caractéristiques cliniques et histo-pathologiques avec l’homme permettent l’extrapolation à l’homme. C’est donc une approche validée par la communauté scientifique dans notre domaine d’étude. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines correspondant à un stade de développement adulte, stade auquel le système digestif murin est bien en place afin d’étudier le potentiel anti-inflammatoire des agonistes des récepteurs. Le modèle murin induit de MICI, obtenu par l’utilisation de molécules chimiques irritantes en intrarectal est très utilisé car il est relativement simple à mettre en œuvre et car dès le début, la durée et la sévérité de l’inflammation sont contrôlables. Le modèle murin d’infection du tractus gastro-intestinal par une bactérie pathogène de la souris est un modèle de référence pour l’étude de l’inflammation chronique et est très documenté dans la littérature. Enfin, les quantités de ligands du récepteur de stress utilisées chez la souris sont faibles et permettent de diminuer les coûts tout en obtenant des résultats pertinents.
Différences sexuelles dans l’inflammation cutanée de la face induite par le CFA chez le rat mâle et femelle
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Injection sous la peau de la face d'un adjuvant qui déclenche une inflammation douloureuse, puis quatre jours de contentions au chiffon, jusqu'à trois par jour, le temps de photographier les grimaces : 12 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur retient six mâles et six femelles et se sert du côté non enflammé de leur face comme témoin, pour comparer expressions faciales et lésions selon le sexe. Il écrit ne pratiquer aucun test comportemental afin de limiter le stress lié à l'injection, et affirme que les résultats obtenus jusqu'ici ne montrent pas d'effets indésirables. Au quatrième jour, les rats sont profondément anesthésiés et mis à mort pour prélever les tissus.
Objectifs
Ce projet comporte deux objectifs : 1) Évaluer les différences sexuelles dans les expressions faciales et dans la lésion inflammatoire de la peau, avant et après l'induction de l'inflammation ; et 2) Évaluer les différences histologiques suite à l'induction d'un modèle de douleur inflammatoire au niveau de la peau de la face chez le mâle et la femelle.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mieux comprendre le dimorphisme sexuel dans l'inflammation et d'améliorer sa mesure au laboratoire. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche préclinique s'intéressant aux douleurs chroniques.
Procédures
Les animaux recevront une injection sous-cutanée sous anesthésie générale (durée < 5 minutes). De brèves contentions à l'aide d'un chiffon seront réalisées (quelques secondes) pendant 4 jours, avec un maximum de 3 contentions par jour. Nous ne ferons pas des manipulations autres que celles necessaires pour prendre la face en photo (pas de test de comportement). Le jour 4, ils recevront une injection intrapéritonéale d'un mélange anesthésique (durée de l'intervention < 1 minute ; durée de l’anesthésie = terminale). Les injections sont effectuées par du personnel compétent, conformément aux bonnes pratiques de l'expérimentation animale.
Impact sur les animaux
Utilisant un modèle de douleur infammatoire, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse de la region injectée. Afin de diminuer le stress lié à cette injection, nous ne ferons pas des manipulations autres que celles necessaires pour prendre la face en photo (pas de test de comportement). Les résultats obtenus jusqu'à present ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux.
Devenir
A la fin de la procedure, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus afin de réaliser une analyse histologique.
Remplacement
L’intégration de la douleur suite à l'induction de l'inflammation implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. D’après nos connaissances il n’existe à ce jour aucune méthode de remplacement capable d’intégrer tous ces éléments. C’est pourquoi, il est nécessaire de réaliser notre étude sur animal entier.
Réduction
Le nombre de 6 rats /sexe est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif en sachant que nous utilison le cote de la face sans inflammation comme temoin. Egalment, afin de limiter le nombre d'animaux, l'etude observationel (photographique) et histologique est realisé sur les memes animaux.
Raffinement
Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé. L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 1 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée après une période d’adaptation. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation et seront mis à mort.
Choix des espèces
Le rat adulte est un des modèles les plus couramment utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Les différents types de douleur inflammatoire sont majoritaires chez les adultes.
Etude des fluctuations de la fréquence cardiaque dans le contrôle des émotions
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
2 660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec pour certaines une chirurgie de deux heures pour implanter un émetteur de télémétrie et une autre d'une heure quarante-cinq pour poser une fibre optique dans le cerveau. Ces implants peuvent provoquer des douleurs pendant et après l'opération, et les souris opérées sont ensuite isolées. Viennent les tests comportementaux, dont un test aversif par groupe, sur quatre jours et jusqu'à une heure par séance, pour mesurer comment la fréquence cardiaque module la réponse à un signal de danger. L'effectif est justifié par "un logiciel statistique" et par l'expertise des deux équipes, sans qu'aucun chiffre de calcul ne soit donné pour ces 2 660 animaux.
Objectifs
Les parties centrales et périphériques du système nerveux autonome jouent un rôle clé dans la modulation de la fréquence cardiaque, cette dernière fluctuant en fonction de l’état émotionnel. Ainsi, des études cliniques suggèrent qu’une fréquence cardiaque augmentée (tachycardie) est fréquemment associée à des niveaux d’anxiété élevés. Cependant, nous ne disposons que de très peu d’information sur les mécanismes neuronaux sous-tendant la communication cœur-cerveau et la manière dont celle-ci influence les réponses comportementales associées à des signaux prédictifs de situations dangereuses ou « menaçantes ». Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant la communication cœur-cerveau, ce qui constitue une première étape importante pour le développement d’approches alternatives pour le traitement de troubles anxieux généralisés. La réalisation de ce projet nécessite l'utilisation de souris mâles et femelles non génétiquement modifiées ainsi que de différentes lignées de souris transgéniques ayant une fréquence cardiaque augmentée (tachycardie) ou diminuée (bradycardie) afin de déterminer l’impact de la modulation de la fréquence cardiaque dans le contrôle des émotions.
Bénéfices attendus
A ce jour, les études visant à étudier l’impact de l’altération transitoire ou persistante de la fréquence cardiaque sur le traitement de stimuli prédictifs de menaces restent très parcellaires. De plus, la plupart des études ont été réalisées sur les mâles, alors que le dimorphisme sexuel cardiaque n’est plus à démontrer. Il est donc nécessaire de prendre en compte l’existence de ce dimorphisme sexuel cardiaque dans l’étude de l’impact de la fréquence cardiaque sur l’influence des réponses comportementales associées à des signaux prédictifs de situations « dangereuses ». Cette étude va nous permettre à la fois de mieux comprendre certains des mécanismes qui sous-tendent l’apparition de troubles anxieux, mais aussi de proposer de nouvelles approches thérapeutiques se basant sur une régulation de la fréquence cardiaque pour contrôler des réponses émotionnelles associées à des stimuli aversifs.
Procédures
La procédure prévoit : - Des injections intrapéritonéales (une injection par jour de comportement, 30secondes) - Des tests comportementaux dont certains sont aversifs : durée 45min à 1h sur 4jours (1 seul test aversif par groupe de souris) - Des actes chirurgicaux : implantation de transmetteurs pour la télémétrie (2h) ainsi que la mise en place de fibre optique dans des régions précises du cerveau (1h45)
Impact sur les animaux
La procédure prévoit actes chirurgicaux avec pose d’implants pouvant entrainer des douleurs per et post-opératoires (interventions modérées). Il sera aussi effectué des tests comportementaux pouvant entrainer un stress léger chez l’animal (interventions légères) Enfin la manipulation des animaux peut entrainer une gêne chez ces derniers (interventions légères).
Devenir
A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tissus pour analyses cellulaires et moléculaires de nos différentes lignées
Remplacement
Notre projet repose sur la caractérisation des mécanismes neuronaux et moléculaires associés à la fois aux modifications de la fréquence cardiaque et aux comportements adoptés face à des situations de danger/menace. Nous ne pouvons donc pas valider notre étude sur des modèles in vitro, l'utilisation d'animaux demeure la seule option à ce jour. La souris est l'organisme modèle le plus pertinent pour cela. En effet la bibliographie disponible montre que les souris fournissent un excellent modèle pour étudier à la fois la fréquence cardiaque et les réseaux neuronaux.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé grâce à la fois à un logiciel statistique et à l’expertise acquise par les deux équipes. Cela permet d’allier réduction du nombre d’animaux et validité statistique des expériences. Les souris vont suivre consécutivement différents tests afin de diminuer à la fois le nombre d’animaux utilisé et d’obtenir un suivi longitudinal de l’étude
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe dans des environnements enrichis (paille en carton, igloo ou maison en carton). Les souris seront isolées suites aux différents actes chirurgicaux. Afin de diminuer le stress, les souris seront manipulées quotidiennement par les expérimentateurs avant chaque procédure expérimentale. Un suivi régulier sera appliqué dès le début de nos expériences. Une grille de score avec des points limites sera mise en place dès l’apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies. Si l’animal atteint un des points limites il sera euthanasié. Cependant si l’animal montre des signes de « faiblesse » : la fréquence d’observation des animaux sera augmentée et un traitement adapté à la situation sera administré (désinfectant ou analgésique). Si aucune amélioration du bien être de l’animal n’est observé il sera alors ensuite euthanasié
Choix des espèces
Les souris fournissent des excellents modèles pour l'étude des réseaux neuronaux et des changements de fréquence cardiaque à la fois chez les mâles et les femelles. Nous disposons aujourd'hui de nombreux modèles murins transgéniques qui nous permettront d'atteindre les objectifs de notre projet. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes d’un point de vue médical. Nos études seront réalisées avec des souris adultes (entre 8 semaines et 24 semaines), ce qui permettra de travailler sur une système cérébral stable, mature, qui n'évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs semaines