Rongeurs

Des constricteurs posés autour des carotides pour réduire peu à peu le débit sanguin du cerveau, une pompe implantée sous la peau pour élever la pression artérielle : 894 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont génotypés à dix jours par tatouage des phalanges, et les adultes passent cinq jours d'apprentissage d'une tâche avant une injection rétro-orbitaire de traceur et un prélèvement de liquide céphalo-rachidien. Le porteur qualifie l'hypertension et la baisse de flux sanguin qu'il provoque de pathologies "asymptomatiques", tout en listant comme complications possibles des accidents cérébro-vasculaires reconnaissables au déplacement en cercle et des infarctus cardiaques laissant l'animal prostré. Toutes sont tuées à la fin des trois procédures pour prélever leurs organes.

Objectifs

La découverte de barrières biologiques, telles que la barrière hémato-encéphalique (BHE), la barrière hémato-encéphalique (BCSFB) a montré comment le cerveau est séparé et protégé du reste du corps. La première barrière, BHE, est une structure spécialisée formée de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales, qui tapissent les capillaires cérébraux. Cette barrière est cruciale pour maintenir le microenvironnement cérébral en contrôlant l’entrée et la sortie de diverses substances. Le plexus choroïde est une autre structure critique du système vasculaire du cerveau, responsable de la formation de la barrière hémato-céphalorachidienne (BCSFB). Le plexus choroïde est constitué d'une couche de cellules épithéliales qui tapissent les ventricules du cerveau et produisent le liquide céphalo-rachidien (LCR). Elle se retrouve à l’interface entre le liquide cérébro-spinal et le cerveau. Ces barrières sont des composants essentiels des mécanismes de protection du cerveau, assurant un environnement contrôlé pour la fonction neuronale et protégeant contre les agressions toxiques. Lorsque cette intégrité est altérée, la fonction de barrière est compromise, ce qui peut initier des problèmes de dégénérescence neuronale. On parle alors de démence vasculaire. Ainsi, il est important de comprendre les mécanismes cellulaires régulant les fonctions physiologiques de la barrière hémato-encéphalique. Ce projet utilisera des modèles murins de souris mutées génétiquement pour des cibles régulant la fonction de la barrière hémato-encéphalique. Nous analyserons l’impact de cette délétion sur la formation postnatale de ces plexus, en physiologie et en pathologie (modèle de rétinopathie induite). Chez l’adulte, nous développerons des modèles pathologiques chez la souris créant soit (1) une hypertension modérée par une diffusion continue d'un vasoconstricteur puissant soit (2) une hypoperfusion graduelle du cerveau.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies neurodégenératives présentant des démences vasculaires augmente constamment avec le vieillissement de la population. La combinaison de modèles murins génétiques et de modèles pathologiques permet d’accroître cette connaissance. Ce projet élucidera les mécanismes moléculaires par lesquels le gène Mcc régule les voies de signalisation Wnt dépendante dans les cellules endothéliales et maintient l'intégrité de la barrière sang-cerveaux. Comprendre ces processus est crucial pour développer des thérapies ciblées contre les troubles neurologiques impliquant un dysfonctionnement de la barrière.

Procédures

Nous analyserons le développement des plexus vasculaires chez le souriceaux chez des animaux modifiés génétiquement et nous développerons 2 modèles pathologiques chez la souris adulte afin de créer (1) un stress d’hypertension systémique (2) un stress d’hypo perfusion cérébrale. Nous analyserons les conséquences sur les troubles de comportement (en analysant la mémoire et les fonctions exécutives à l'aide de test de déplacement), et l’apparition des marqueurs de dégénérescences neuronales et vasculaires. Le modèle de développement néonatal : Nombre d’animaux : 384. Modèle d’hypertension artérielle systémique et trouble cognitif : Nombre d’animaux : 240. Les animaux auront une implantation en sous cutanée de pompe diffusant un agent hypertenseur sous anesthésie gaseuse (durée 10 min) puis 3 semaines après lils seront évalués pour chaque jour pour l’apprentissage d’une tache pendant 5 jours (durée 37,5 min répartie sur 5 jours). Puis 1 semaine après une analyse de la permeabilité cérébrale sera faite sous anesthésie avant de traceur moléculaire en retroorbitaire (1 min) et/ou le prélèvement de liquide céphalo rachidien (5 minutes) sous anesthésie gaseuse avec euthanasie des animaux. Modèle d’hypo perfusion cérébrale : Nombre d’animaux : 270. Les souris adultes (2 mois) auront une implantation de constricteurs autour des carotides sous anesthésie gazeuse (durée 10 min) puis 3 semaines après ils seront analysés chaque jour pour l’apprentissage d’une tache pendant 5 jours (durée 37,5 min répartie sur 5 jours). Puis 1 semaine après une analyse de la permeabilité cérébrale sera faite sous anesthésie avant de traceur moléculaire en retro orbitaire (1 min) et/ou le prélèvement de liquide céphalo rachidien (5 minutes) sous anesthésie gazeuse . Tous les animaux inclus ont été génotypés à 10 jours après la naissance par une méthode de tatouage sur les phalanges.

Impact sur les animaux

Le modèle post natal : nos données préliminaires montrent que la délétion précoce du gène Mcc dans le lit vasculaire n’induit pas de retard de croissance. Mais les altérations du comportement pourront apparaître entrainant un arrêt de l’expérience : immobilité, arrêt de l’allaitement, exclusion du nid par la mère. Chez l'adulte, les pathologies d'hypertension artérielle générée et de baisse de flux sanguin sont des pathologies asymptomatiques. Les complications aigûes pourront être des accidents cérébro vasculaires (l'animal montre des changements de mobilité, souvent déplacement en cercle) ou des infarctus cardiaques (animal reste prostré peu vigile). Les manifestation aigues du comportement pourront apparaître entrainant un arrêt de l’expérience. Le génotypage par tatouage induit une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des 3 procédures dans le but de prélever leurs organes sur lesquels nous ferons des analyses post mortem.

Remplacement

Ce projet sera réalisé en utilisant des modèles murins qui reproduisent des lésions neuropathologiques avec atteintes des barrières vasculaires du cerveau décrites dans les maladies neurovasculaires, ainsi que les signes cliniques associés à ces maladies, comme les déficits d’apprentissage et de mémoire. L'intégrité vasculaire dépend d'interactions multiples entre différents types cellulaires. Il est encore très difficile d'appréhender in vitro les interactions entre le tissu environnant et les réseaux tridimentionnels des vaisseaux et les altérations du phénotype vasculaire sur la fonction d'un organe (notamment le cerveau). L'expérimentation in vivo en association avec l'utilisation de souris transgéniques délétées spécifiquement dans certain tissu (endothélium...) permet de différencier l'action spécifique de chaque type cellulaire dans le tissu et fournit des informations de mécanismes physiopathologiques impossible à obtenir in vitro. Le recours à un être vivant, mammifère, présentant des caractéristiques partagées avec l'homme est donc nécessaire et les rongeurs représentent un modèle de choix pour réaliser des modèles transgéniques de knockout de gènes d'intérêt. Pour réduire le nombre des animaux sacrifiés, aucune expérience déjà publiée n'est reproduite et lorsque cela est possible les études conceptuelles sont réalisées in vitro sur des cellules en culture avant d'être testé in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à partir des expériences préliminaires qui ont permis d’identifier le nombre minimum d’animaux à utiliser par groupe pour permettre une analyse des résultats statistiquement significative. Pour réduire le nombre d'animaux, les animaux seront inclus dans plusieurs protocoles expérimentaux (tests de comportement, puis analyse de la permeabilite puis euthanasie pour analyse histologique).

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions limitant au maximum le stress et la douleur. Ils sont élevés en groupe dans des cages ventilées maintenant une atmosphère saine avec libre accès à l’eau et à la nourriture. Des jouets/ tubes en carton sont mis à disposition des animaux dans leur cage pour enrichir leur environnement, leur permettre de ronger et de se cacher. Les litières sont dépoussiérées et additionnés de cubes de coton leur permettant de construire des nids. Les opérations chirurgicales (implantation de pompe, ajout de constricteurs, injection en retro orbital de traceurs) sont réalisées sous anesthésie gazeuse et en présence d’un antalgique. Les animaux sont surveillés par la visite quotidienne du zootechnicien. En cas de problème de santé des animaux, l'expérimentateur est immédiatement alerté.

Choix des espèces

La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont le système vasculaire est très similaire à celui de l'homme. C'est actuellement la seule espèce de mammifère dont le génome peut être modifié en routine pour créer des modèles de maladies humaines. Des modèles d'hypertension artérielle et de modification du flux sanguin ont été développés et validés chez la souris, montrant leur utilité pour étudier les altérations cognitives et neuronales. Nous prévoyons d'utiliser : Des souriceaux, car la formation des nouveaux vaisseaux se produit dans les organes jusqu'à environ 4 semaines après la naissance. Des souris adultes, âgées de 6 à 8 semaines et pesant entre 24 et 29 grammes, car leur réseau vasculaire est complètement développé, notamment dans le cerveau.

Comprendre pourquoi les cancers du sein hormonodépendants résistent aux anti-œstrogènes passe ici par des souris génétiquement modifiées que l'on fait allaiter pour déclencher un oncogène. 3 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles développent des tumeurs mammaires en vieillissant, subissent une ablation des ovaires de vingt minutes, la pose puis le retrait d'un implant sous-cutané, ou jusqu'à seize injections en huit semaines. L'effectif se déduit d'un empilement de conditions, 420 souris pour suivre la cinétique tumorale et 2 880 pour croiser six traitements, deux génotypes et quatre points de prélèvement.

Objectifs

Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent et le plus mortel chez la femme dans le monde. Ce cancer se caractérise par une forte hétérogénéité. En effet, il possède de nombreux sous-types moléculaires dont le sous type luminal (sous type le plus récurrent) caractérisé par l’expression du récepteur aux estrogènes et le récepteur aux progestérones. Ce dernier est traité par hormonothérapie à l’aide d’anti-œstrogènes. Cependant il existe peu de modèles murins de cancer du sein qui récapitulent ce sous type moléculaire. Ainsi nous avons créé un modèle qui se base sur l’expression d’un oncogène spécifiquement dans les glandes mammaires après la lactation. Cet oncogène est le plus fréquemment altéré dans les cancers. Ce modèle nous permet d’étudier les résistances aux traitements anti œstrogènes car en effet malgré l’efficacité de ce traitement, les patients développent des résistances à ce traitement au cours du temps. L’objectif est donc de caractériser ce modèle pour trouver de potentielles autres cibles thérapeutiques et étudier l’effet des anti-œstrogènes sur la progression tumorale afin de mieux comprendre les résistances à ce traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'effectuer l'analyse des nouvelles cibles thérapeutiques sur un modèle du cancer du sein hormonaux dépendants et d’étudier les mécanismes de résistance des traitements anti oestrogéniques.

Procédures

Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées dont les mutations seront induites expérimentalement par la lactation. Ainsi nos souris seront mises en accouplement puis seront laissées en vieillissement où elles développeront des cancers du sein. Pour étudier l’impact du traitement anti oestrogénique dans notre modèle, les animaux recevront également un traitement anti-oestrogénique en sous cutanée jusqu'à 2 fois par semaines pendant 8 semaines (3 minutes pour chaque injection soit 3*2*8 = 48minutes) ou par un implant sous cutanée jusqu'à 90 jours (10 minutes pour l'insertion et 10 minutes pour le retrait de l'implant) et une ablation des ovaires (20 minutes). L'ablation des ovaires et la mise en place de l'implant sera réalisée en même temps sous sédation totale.

Impact sur les animaux

La mutation du gène oncogène induit la croissance tumorale dans les glandes mammaires de l’animal. Les injections par voie sous cutanée induisent une douleur de classe légère. Les implants ont été déjà utilisé dans de nombreuses publications chez la souris sans observation d'effets secondaires et la castration est réalisée en routine au laboratoire ce qui se rapporche de l'ovariectomie et ne pose pas de problèmes de majeur. Ces procédures seront réalisées par des personnes agrémentées et aguerries. Les effets secondaires post chirurgicaux sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie post-opératoire systématique. Une infection post-opératoire peut survenir dans de très rares cas. En cas de mauvaise ligature des artères, une hémorragie peut avoir lieu. Cette complication est très rare et facilement visible du fait du gonflement important de la zone et d'effets secondaires généraux sur l'animal. Une réouverture des points est également possible en cas d'arrachement des points par la souris.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure. Notre but est de mener des analyses sur plusieurs tissus (tumeurs et organes distants) prélevés après la mise à mort de chaque animal.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique, la complexité cellulaire et l’hétérogénéité impliquées dans la formation de tumeurs. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Plusieurs types d’analyses seront menées. Afin d'avoir un nombre suffisant d'animaux pour effectuer des analyses statistiques, nous aurons besoin de : -10 souris par groupe pour les analyses moléculaires. -10 souris par groupe pour les études histologiques . - 10 souris par groupe pour les analyses des populations cellulaires. Ainsi, 30 souris seront utilisées pour chaque groupe, chaque traitement et chaque temps étudié. Pour étudier l'évolution des tumeurs mammaires dans notre modèle, nous aurons besoin de 420 souris : 2 génotypes ( avec ou sans tumeurs), 7 points de cinétique (7 phases différentes de la tumeur); et pour l'analyse des traitements anti oestrogéniques dans notre modèle murin, nous aurons besoin de 2880 souris : 2 génotypes( avec ou sans tumeurs), 6 traitements (différents types d'anti-oesotrègéniques et leur contrôles) , 2 point de cinétique du début du traitement (avant et au moment de l'apparition des tumeurs) et 2 points de cinétique de sacrifice post traitement (court terme et long terme) et 2 chirurgies (avec ou sans ovariectomie).

Raffinement

Durant la durée de l'étude, les souris seront hébergées en groupes sociaux dans des cages agrémentées disposant d’un enrichissement adapté (carrés de coton pour la fabrication des nids ainsi que des tunnels ou maisonnette et des bâtons de bois à ronger). Après injection en sous cutanée, une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d’injection pour éliminer tout risque d’infection (rougeur ou présence de pus au site d’injection). On procèdera à l'anesthésie gazeuse des souris, et après l'induction, une analgésie en injection intrapéritonéale sera faite. En post-opératoire, un anti inflammatoire systématique par injection sous cutanée sera faite. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. En cas de signe de douleur, de l'analgésie supplémentaire sera administrée jusqu'à 3 fois par jour. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage. Par ailleurs, les animaux ovariectomisés et les animaux sham seront séparés: une cage sham versus une cage ovariectomisé par exemple pour éviter tout risque de domination. En cas de signe de douleur (dos voute, un pelage hérissé ou inactivité après stimulation, l'animal sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Dans le cas d’induction de tumeurs l'inconfort sera évalué en fonction du niveau de douleur observé (score de 0 à 3) et sera géré si besoin en prenant les mesures appropriées. Spécifiquement, si posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif (score 2), l’animal sera retiré de l'étude et mis à mort. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine dès l’apparition de tumeurs afin de suivre son évolution. Si une perte de poids supérieure à 20% est observée sur une période d’une semaine l’animal sera mis à mort.

Choix des espèces

Ce modèle récapitule de manière fidèle le cancer du sein hormono-dépendant chez la femme qui est un sous type très fréquent de cancer du sein chez la femme. Etant donné que le but de l'étude est d'évaluer l'impact du traitement anti-oestrogénique sur ces tumeurs, nous allons étudier l'effet systémique de ces traitements sur la souris femelle ce qui est impossible en utilisant les systèmes in vitro.

3 552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un carcinogène par injection puis trois cycles d'une molécule dans l'eau de boisson pour déclencher des tumeurs de l'intestin et du colon, six injections d'anticorps, un gavage de glucose suivi de cinq prises de sang en deux heures, et pour une partie d'entre elles seize semaines de régime gras. Le porteur écrit que la compréhension de ces mécanismes "pourrait conduire" à de nouvelles approches thérapeutiques, alors que les tumeurs poussent sans pouvoir être mesurées du vivant de l'animal. Une perte de plus de 20 % du poids initial déclenche la mise à mort, et le volume des tumeurs n'est mesuré qu'après.

Objectifs

La lutte contre les cancers gastro-intestinaux est un enjeu majeur de santé publique. Malgré certaines améliorations en matière de dépistage et thérapie, l'incidence, la prévalence et la mortalité des cancers du colon restent élevées dans les pays développés. En particulier, le pronostic des patients atteints de cancer colorectal (CCR) métastatique reste mauvais, avec un taux de survie de 10 pourcents à 5 ans, en raison de l'inefficacité des traitements actuels. Il est donc urgent de développer des traitements plus efficaces pour les patients atteints de cette maladie. Dans le CCR, un rôle clé des réponses immunitaires a été démontré dans la croissance de la tumeur et ce rôle est notamment influencée par les macrophages, des cellules immunitaires innées. Ce projet propose de s’appuyer sur l’étude de tumeurs colorectales murines afin (1) de caractériser les différentes populations de macrophages présentes dans la tumeur et en périphérie, (2) de déterminer le rôle fonctionnel de ces macrophages dans la réponse anti-tumorale et (3) d’étudier l’impact de différents traitements et conditions sur cette réponse. Notamment, nous nous intéresserons à l’influence de l’obésité (induite à l’aide de régimes alimentaires spéciaux) et l’influence d'un traitement sur la réponse innée dans le CCR. L’obésité est connue comme étant un facteur de risque de développement du CCR et reprogramme les macrophages intestinaux vers un phénotype pro-tumoral. Nous chercherons donc à caractériser l’impact de l’obésité sur l’efficacité d'un traitement via l’action des macrophages. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances sur l’implication des cellules myéloïdes dans les cancers primaires de l’intestin pour ainsi contribuer à long terme à améliorer la prise en charge et/ou le diagnostic des patients en clinique.

Bénéfices attendus

En 2023, en France métropolitaine, l'incidence du cancer colorectal était de plus de 47 000 nouveaux cas par an. Même si la mortalité (taux standardisé) par cancer colorectal est en baisse depuis les années 1990, celui-ci demeure la deuxième cause de décès par cancer tous sexes confondus. Nous proposons ici de caractériser au niveau moléculaire et cellulaire le mécanisme de surveillance immunitaire des cellules myéloïdes dans un modèle tumoral de cancer colorectal ainsi que de déterminer l’influence de l'obésité et d'un traitement sur cette réponse immunitaire innée. Ainsi, nous obtiendrons une compréhension intégrée du système immunitaire intestinal et colonique dans des conditions normales et pathologiques. La compréhension des mécanismes qui régulent les premières phases de l'immunité innée lors de la progression tumorale pourrait conduire à de nouvelles approches thérapeutiques pour prévenir ou améliorer l'espérance de vie des patients.

Procédures

Les souris seront soumises à : 1. un régime alimentaire riche en gras (animal vigil, tous les jours pendant 16 semaines), 2. un traitement pour induire des tumeurs intestinales et colorectales consistant en une injection intra-péritonéale (une fois par animal vigil, durée de quelques secondes) suivi de 3 cycles d’une semaine d’administration de traitement dans l’eau de boisson (chaque cycle est suivi d'au moins une semaine de repos sans traitement), 3. des traitements par injection d’anticorps en intra-péritonéal (6 fois par animal vigil, durée de quelques secondes), 4. un gavage oral de glucose (une fois par animal vigil, durée de quelques secondes) accompagné de prélèvements sanguins sur animal vigil (5 petits prélèvements successifs sur une période de 2 heures, durée de quelques secondes par prélèvement) afin d’évaluer la capacité à réguler la glycémie après 4 semaines de régime gras, 5. des injections intrapéritonéales de molécule permettant l’induction des modèles génétiquement modifiés (animal vigil, durée de quelques secondes par injection, 2-3 injections par semaine pendant un maximum de 16 semaines), 6. un gavage oral d'un agent permettant l’induction des modèles génétiquement modifiés (5 fois par animal vigil, durée de quelques secondes), 7. une euthanasie par une méthode réglementaire (durée de quelques secondes). Tous les prélèvements tissulaires se feront suite à l’euthanasie des animaux.

Impact sur les animaux

Notre projet propose d’étudier les cellules myéloïdes infiltrant la tumeur et nécessite donc d’induire le développement de tumeurs chez les souris via des modèles induits chimiquement (par deux molécules de traitement) ou via l’utilisation du modèle murin génétique. La première molécule est un carcinogène connu et son administration promeut le développement de tumeurs. L’administration de la seconde molécule peut lui entraîner une perte de poids. La localisation des tumeurs pourrait impacter la mobilité des animaux, leur alimentation, leur pelage et leur comportement. Dans le phénotype du modèle murin génétique, les effets indésirables pouvant survenir chez les animaux sont majoritairement liés à l'apparition spontanée de tumeurs intestinales. Les animaux vont alors subir le développement d'une ou plusieurs tumeurs pouvant amener à la dégradation de la condition physique, du stress, des douleurs. Les injections de molécules par voie intra-péritonéale pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les gavages pourront induire une irritation de courte durée de l'œsophage. Les manipulations des animaux pourront également induire un stress de courte durée. Par ailleurs, dans le cadre de ce projet, certaines souris seront soumises à un régime enrichi en graisses. Ce régime entraîne une prise de poids qui sera étroitement surveillée tout au long de l’étude pouvant altérer la mobilité. Pour les explorations métaboliques, certaines procédures telles que la mise à jeun des animaux pendant quelques heures, le gavage de glucose et les prélèvements sanguins peuvent entraîner des périodes de stress et d’inconfort temporaires pour les animaux.

Devenir

Afin de répondre aux questions et enjeux scientifiques soulevés au cours de notre projet expérimental, des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem et impliquent donc l'euthanasie de l'ensemble des animaux.

Remplacement

Actuellement, il n’existe pas de substitut non animal capable de reproduire avec précision les mécanismes complexes impliqués dans la genèse du cancer colorectal (CCR) et les réponses immunitaires associées. Parmi les différentes espèces, la souris s’avère être la plus appropriée pour étudier cette pathologie. De plus, l’utilisation du modèle murin est nécessaire pour explorer la pathologie au sein d’un organisme complet, ce qui ne peut être fidèlement reproduit en se basant uniquement sur des cultures de cellules isolées.

Réduction

En prenant en considération les publications antérieures, notre expérience dans le domaine et en utilisant une méthodologie de calcul de la taille des échantillons basée sur un test de puissance, notre estimation est de 12 souris par groupe. Le nombre de souris nécessaires à l’expérimentation a été déterminé en tenant compte d’une réduction maximale du nombre d’individus tout en garantissant une significativité statistique des résultats. Lorsque cela sera possible et afin de limiter le nombre total de souris utilisées, nous essaierons de mettre en commun des souris contrôles pour l’étude de différents modèles murins. Le nombre total d’animaux prévu est de 3552 souris.

Raffinement

Le bien-être animal sera une priorité constante tout au long du projet afin de minimiser la douleur et le stress. Les animaux seront hébergés dans des cages ventilées et de taille réglementaire contenant des éléments d’enrichissement (lanières de papier kraft et bâton en bois). La température et l’hygrométrie seront contrôlées et monitorées, le cycle jour-nuit sera réglé de manière automatique. Le change de la litière et de la nourriture se fera une fois par semaine minimum. Une période d’acclimatation d’une semaine précédera les expérimentations. L’accès à l’eau et à la nourriture sera mis à disposition ad libitum. Une vérification visuelle quotidienne de l’état général des souris est effectuée par le personnel animalier. Tout signe d’inconfort, de détresse ou de comportement anormal (agressivité subite, inactivité, vocalisation, mutilation, isolement, diminution de l’appétit) ainsi que toute modification physique (pelage ébouriffé, dos courbé, perte excessive de poils) sera étroitement surveillée et entraînera un isolement si nécessaire. Les critères absolus d’inconfort (état de choc, léthargie, inconscience, immobilité, forte hypothermie, difficultés respiratoires), qui ne sont pas censés être déclenchés par la procédure utilisée, mèneront à l’euthanasie immédiate de l’animal conformément aux directives éthiques. Une grille de suivi sera mise en place avec une pesée hebdomadaire des animaux et deux pesées lors de chaque de cycle de traitement. Une perte de poids de plus de 20 pourcents du poids initial à l’initiation du traitement des animaux sera considérée comme point limite. Dans le cadre de la tumorigenèse intestinale, la tumeur ne pourra pas être mesurée au cours de l’expérimentation mais le volume tumoral sera mesuré après l'euthanasie afin de contrôler la pousse tumorale.

Choix des espèces

L'objectif de ce projet est d'explorer le rôle des macrophages dans la pathogénèse et l’évolution du cancer colorectal (CCR) ainsi que d’identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. La souris a été sélectionnée comme modèle expérimental en raison de sa capacité à reproduire de manière précise les mécanismes impliqués dans le développement du CCR. Plus particulièrement, elle est capable d’intégrer les réponses immunitaires observées chez les êtres humains. En outre, la souris est un modèle bien établi pour l’étude du CCR et permet également d’utiliser un certain nombre de lignées transgéniques générées au préalable. Nous utiliserons des animaux âgés de 8 à 12 semaines à leur entrée dans les procédures. Nos études requièrent que les animaux aient un métabolisme et un système immunitaire matures.

Mesurer si des lymphocytes régulateurs atténuent la douleur passe ici par la stimulation répétée des pattes de souris au chaud, au froid et à la pression. 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cinq tests comportementaux sont menés à une heure d'intervalle, avant puis sept jours après l'administration de tamoxifène par injections quotidiennes ou par gavage, avec contention de quelques secondes pour le test d'immersion de la patte. Le retrait de la patte est décrit comme le signe d'une douleur modérée, et les animaux sont tués pour prélever leur cerveau et leurs nerfs, d'autres organes étant stockés pour des études ultérieures.

Objectifs

Il a récemment été montré que les lymphocytes T régulateurs (ou Treg) étaient impliqués dans la modulation de la douleur en particulier inflammatoire, sans pour autant en décrire complètement le mécanisme. Or il a également été montré que ces Treg expriment le gène de production de la pro-enképhaline (Penk). Cette molécule étant un précurseur du peptide opioïde, l’enképhaline, l’effet antinociceptif médié par les Treg pourrait donc provenir de cette voie opioïdergique. Ainsi l’objectif du projet est de tester différentes modalités douloureuses (chaud, froid, mécanique) ou non douloureuses (touché et proprioception) chez la souris exprimant ou non la pro-enképhaline dans les lymphocytes T régulateurs. Cela permettra ainsi de démontrer un potentiel effet antalgique directement médié par les lymphocytes Treg et donc le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre le potentiel effet antalgique des lymphocytes T régulateurs via la voie des pro-enképhalines. A moyen terme, ces manipulations permettront de comprendre si cela est modifié dans différentes pathologies ce qui pourrait expliquer certains types de douleur. Enfin cela permettrait à long terme, si les résultats sont concluants, de développer de nouvelles stratégies pour réactiver cette voie opioïdergique médié par le système immunitaire afin que les patients puissent ne pas développer de douleur chronique.

Procédures

Une mesure de la sensibilité nociceptive et non nociceptive cutanée au niveau de la patte (mécanique et thermique) sera faite chez tous les animaux, après une période d'acclimatation de 7 jours. 5 tests comportementaux seront réalisés avec un intervalle d’au moins une heure entre les tests. Ces stimulations durent au maximum 3 secondes pour les mécaniques et 20 secondes pour les thermiques. Ces tests comportementaux seront réalisés pendant une journée avant, puis 7 jours après, injection de tamoxifen. Administration de tamoxifen : 5 injections intrapéritonéales avec 1 injection par jour ou administration unique par gavage oral. A la fin des tests comportementaux, tous les animaux seront euthanasiés et perfusés et leurs tissus nerveux périphérique et central sera collecté pour analyse histologique et électrophysiologique.

Impact sur les animaux

Les stimulations mécaniques et thermique induisent un retrait de la patte signe d’une douleur modérée. L’animal peut échapper à cette stimulation puisqu’il n’est pas en contention à l’exception du test d’immersion de la patte où la contention est très temporaire (quelques secondes). La piqure d'aiguille ou le gavage pour l’injection de tamoxifen entraîne une douleur légère de courte durée.

Devenir

La procédure ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, elle se termine par des études immunohistochimiques qui nécessitent de prélever le cerveau ainsi que d'autres organes pouvant servir à d'autres études : les animaux seront donc mis à mort à la fin de la procédure.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est nécessaire de réaliser ces études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. Cette étude ne peut se faire que chez des souris permettant de supprimer génétiquement l'expression de la Penk spécifiquement dans les Treg.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Dix animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Par ailleurs pour rendre compte des mécanismes (quantité de Treg sexe-dépendant) sans doute différents chez l'homme et la femme (hormones différentes), nous avons besoin de réaliser l'étude à la fois chez les mâles et les femelles. Une fois les animaux euthanasiés, un maximum d'organes sera prélevé et stocké afin d'être utilisés pour ce projet ou pour d'autres études. Cela évitera d'euthanasier de nouveaux animaux pour ces autres études.

Raffinement

Les animaux seront reproduits au sein de notre animalerie. Dans ce but, le laboratoire est titulaire d'un agrément d'utilisation d'organismes génétiquement modifiés en milieu confiné à des fins de recherche, de développement et d'enseignement. Les animaux sont stabulés dans des cages individuelles contenant un groupe de males ou de femelles et situés dans des portoirs ventilés, thermorégulés avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière gégulier. Nous utiliserons une pièce réservée pour la stabulation de souris transgéniques avec un cycle de lumière inversé. Les animaux seront hébergés en milieu enrichi (social et environnemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les cages seront enrichies au minimum à l'aide coton et de tunnels. L'enrichissement pourra être supplémenté par des plateformes ou des roues d'exercice si des comportements agressifs sont observés. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein du laboratoire ayant une expérience reconnu dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des procédures décrites dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal. Les animaux seront suivis quotidiennement par les membres utilisateurs du projet.

Choix des espèces

La souche C57BL6 est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales dans le domaine de la douleur. Le choix de développer ce modèle chez la souris permettra d'utiliser des animaux génétiquement modifiés pour des cibles impliqués dans le projet, ce qui peut être plus difficilement réalisé chez une autre espèce. Les animaux seront âgés de 8-10 semaines afin que les souris soient considérées comme adultes et ayant atteint leur maturité cérébrale et un système sensoriel et locomoteur mature, en cohérence avec les données rapportées dans nos précédentes publications et d’une manière générale dans la littérature chez la souris dans ce domaine des neurosciences.

Opérées du cerveau pendant quatre heures au plus pour une injection, et pour 110 d'entre elles l'implantation de dispositifs d'enregistrement et de stimulation, des souris sont ensuite tuées sous anesthésie au cours d'une seconde chirurgie, sans réveil. 197 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour vérifier la position des implants et analyser leur cerveau. Isolées en cage individuelle pendant environ quatre mois pour protéger leurs implants, les souris implantées passent jusqu'à trois mois de tests quotidiens de deux heures, à chercher des miettes de céréales au chocolat pendant que des zones de leur cerveau sont stimulées par la lumière. Ces tests ne sont pas décrits plus avant. L'objectif est de décrire les connexions entre cervelet et hippocampe impliquées dans l'orientation spatiale. Le porteur parle d'une "légère restriction alimentaire", destinée à leur faire ressentir la faim, et décrit ailleurs une ration réduite "à quelques grammes afin de provoquer une légère perte de poids".

Objectifs

Le cervelet a été classiquement considéré comme une structure impliquée dans le contrôle, la synchronisation et l'apprentissage des habiletés motrices. Cependant, un ensemble de preuves récentes ont également mis en évidence son rôle dans les processus cognitifs par ses interconnexions avec les régions du cerveau impliquées dans la cognition, notamment l'hippocampe. L'hippocampe est consideré comme le siége de la navigation, une fonction fondamentale qui permet aux individus de se repérer dans l'environnement et de la mémoire spatiale, la composante de la mémoire responsable de l'enregistrement des informations sur notre environnement et notre orientation. Des études menées sur des souris ont révélé que le cervelet est crucial pour l'activité neuronale de l'hippocampe et l'efficacité des comportements de navigation. Cependant, les voies reliant le cervelet à l'hippocampe et les mécanismes sous-jacents restent inconnues. Notre projet vise à caractériser les projections cérébelleuses vers l'hippocampe, tant sur le plan anatomique que physiologique, chez des souris au comportement libre.

Bénéfices attendus

Les fonctions cognitives, telles que la navigation et la mémoire spatiale, sont des processus complexes qui impliquent l'intégration d'informations provenant de différentes régions du cerveau. L'étude des connexions entre ces régions permet d’appréhender non seulement les bases neuronales de ces processus, mais contribue également aux domaines plus vastes des neurosciences et de la psychologie cognitive. Elle fournit une base pour développer et tester des théories sur la façon dont le cerveau traite les informations et décide du comportement. La navigation et la mémoire spatiale sont souvent altérées dans divers troubles neurologiques et psychologiques, tels que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et la schizophrénie. Comprendre les circuits neuronaux en conditions normales, peut aider à détecter et à comprendre les altérations et les dysfonctionnements cérébraux qui surviennent dans ces conditions pathologiques. En étudiant les interactions entre le cervelet et l’hippocampe, ce projet permettra donc de mieux comprendre le réseau cérébral qui soutient la navigation et la mémoire spatiale en conditions normales, avec des applications potentielles dans les pathologies associées.

Procédures

Dans cette étude, deux groupes d'animaux suivront des interventions spécifiques - Premier groupe (87 animaux) : Ces animaux subiront une chirurgie au niveau du cerveau, avec une injection de solution, sous anesthésie et analgésie. La procédure durera au maximum 4 heures. Après un délai d’un mois maximum, ces animaux seront de nouveau anesthésiés et euthanasiés lors d'une chirurgie, sans être réveillés. Cette méthode permet d’éviter toute souffrance en fin d’expérience. - Deuxième groupe (110 animaux) : Ces animaux passeront également par une chirurgie au niveau du cerveau, avec une injection de solution et l’implantation de dispositifs, sous anesthésie et analgésie. Cette intervention durera au maximum 4 heures. Après une semaine de récupération, ils participeront à des séances d’exploration comportementale dans une arène, à l’état éveillé, pendant 60 minutes maximum par jour pendant deux semaines. Ensuite, des tests comportementaux seront réalisés pendant 120 minutes maximum par jour, sur une période de 3 mois. Ces tests incluront l'observation de leur comportement et l’enregistrement de l’activité cérébrale, combinés à l’utilisation d’une technique appelée optogénétique (qui permet de stimuler des zones précises du cerveau grâce à la lumière). Pour motiver les animaux à explorer leur environnement (dans lequel sont éparpillées des céréales au chocolat), une légère restriction alimentaire sera appliquée certains jours de test. À la fin de l'étude, ils seront euthanasiés de la même manière que le premier groupe, sous anesthésie, lors d'une chirurgie, sans être réveillés.

Impact sur les animaux

Dans cette étude, certains effets indésirables peuvent survenir pour les animaux à différents moments du processus : Premièrement, les effets liés aux chirurgies : Les interventions chirurgicales, comme celles réalisées au niveau du cerveau, peuvent provoquer des effets indésirables tels que la perte de poids, une baisse de la température corporelle, de la déshydratation, ainsi que des douleurs ou un inconfort. Deuxièmement, le stress dû à l'hébergement en cage individuelle : Après les chirurgies, les animaux seront hébergés dans des cages individuelles pour protéger les implants fragiles placés lors des chirurgies. Bien que ces cages permettent des contacts visuels, auditifs et olfactifs entre eux, les souris sont des animaux qui vivent habituellement en groupe. Cette séparation peut donc provoquer un certain stress ou de l'angoisse, car elles se retrouvent privées de la compagnie de leurs congénères. Troisièmement les effets liés aux tests comportementaux : Pendant les tests comportementaux, les animaux seront récompensés avec de la nourriture. Afin d'augmenter leur motivation à réaliser ces tests, une légère restriction alimentaire sera mise en place avant les séances, afin qu'ils ressentent une sensation de faim. Bien que cette restriction soit légère, elle peut causer une forme de stress temporaire chez les animaux.

Devenir

L'euthanasie de l'ensemble des animaux est requise. Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem afin d'identifier les projections cérébrales d'intérêts, de valider l'emplacement exact de fibre optique d’optrode, et d’éléctrode dans le cerveau de l'animal, ainsi que de réaliser des tests immunologiques.

Remplacement

L’étude des bases neurales qui sous-tendent les capacités de navigation requiert de manière indispensable l’utilisation d’animaux capables de telles performances de manière à en étudier les mécanismes sous-jacents. Étant donné que les études in vitro et les animaux invertébrés ne permettent pas l'investigation de comportements complexes, le rongeur demeure donc l'espèce la plus appropriée. La souris est un animal explorateur, ce qui se prête parfaitement à notre sujet de recherche. Ainsi, des travaux précédents de l’équipe ont montré la validité de ce modele animal dans l’étude de la navigation spatiale.

Réduction

Le projet impliquera un total de 197 animaux. Ce nombre est inspiré du nombre d’animaux utilisé dans des travaux précédents de l’équipe et réduit au maximum pour nous permettre de générer des données statistiques solides. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Ce projet utilisera des implants permettant des enregistrements électrophysiologiques simultanés d'une grande population de neurones localisés dans différentes structures cérébrales, permettant de collecter des données en plus grande quantité par souris, réduisant ainsi le nombre total d'animaux requis. L’analyse des données électrophysiologiques et comportementales s’effectuera avec des tests statistiques en ajustant des modèles à effets mixtes généralisés avec des effets aléatoires imbriqués pour tenir compte de la variabilité entre les souris ou les sessions au sein des souris.

Raffinement

À leur arrivée dans l’animalerie les animaux ont une periode d’adaptation d’au moins 5 jours. Ils sont ensuite manipulés et surveillés quotidiennement par les mêmes experimentateurs et les procédures nécessaires seront mises en place pour garantir leur bien-être (Grille de scoring). Les souris subissant une chirurgie seront anesthésiées par inhalation d’un gaz anesthesiant et receveront une injection d'analgésique et d'un anesthésique local au lieu de l’incision chirurgicale. De plus, un anesthésique local sous forme de créme est appliqué au niveau des oreilles où les barres sont fixées. Les souris sont placées sur un tapis chauffant et une solution physiologique est injectée au debut et à la fin de l’intervention afin d’éviter une hypothermie et une déshydratation. Afin d’éliminer tout risque d’inflammation et de douleur post opératoire, les souris recevront à la fin de la chirurgie et pendant 48 heures une injection d’anti-inflammatoire non stéroïdien. Pour éviter tout risque de déterioration de l'implant des souris par leurs congénères après la chirurgie les animaux seront isolés pendant environ 4 mois. Néanmoins pendant cette période un nid végétal ainsi qu’un jouet d'exploration (cube, tunnel ou abri) est placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux plus d’enrichissement. De plus, les cages utilisées sont transparentes, fermées par une grille et placées les unes à côté des autres dans la pièce de stabulation. Ainsi les informations visuelles, auditives et les odeurs peuvent circuler entre les souris. Pour obtenir un comportement optimal, nous régulons la quantité de nourriture disponible pour les animaux durant les jours d’enregistrement (environ 3 mois) afin qu’ils soient plus motivés pour trouver les miettes de céréales au chocolat qui sont disposées aléatoirement dans l’environnement. Nous diminuons donc la quantité de nourriture d’ad libitum à quelques grammes afin de provoquer une légère perte de poids. Les souris sont pesées chaque jour et nous surveillons que leur perte de poids ne soit pas excessive. Pendant le weekend les souris ont de la nourriture ad libitum ce qui leur permet de retrouver leur poids de référence.

Choix des espèces

La souris est le modèle traditionnellement utilisé au laboratoire. Nous disposons donc de tout le matériel réglementaire et nécessaire à son hébergement. Il s’agit d’un mammifère explorateur, qui est le plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants en termes de performance de navigation qui est notre sujet de recherche. L'équipe a développé de nombreux tests de comportement pour cet animal au cours de travaux antérieurs, parmi lesquels ceux qui servent de fondement à nos hypothèses de travail. Le projet porte sur l'étude des réseaux neuronaux à l'âge adulte. Comme les procédures d'enregistrement électrophysiologique combinées à l'optogénétique prennent plusieurs semaines, elles ne peuvent être effectuées que sur un cerveau dont le développement est stable. Nous utiliserons des souris âgées de 3 à 8 mois maximum.