Rongeurs

240 souris passent toute leur adolescence sous régime obésogène, douze semaines à partir du sevrage, avant que leur humeur soit évaluée. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 195 d'entre elles et modéré pour 45, et toutes sont tuées pour le prélèvement du cerveau. À l'obésité induite s'ajoutent un gavage quotidien de probiotiques pendant deux semaines, des injections dans l'abdomen et, pour une partie des animaux, une chirurgie d'une heure destinée à insérer une fibre dans le cerveau. Le porteur annonce à plus long terme des stratégies nutritionnelles ou pharmacologiques pour les personnes dépressives, quand l'état dépressif est ici provoqué chez les souris par le régime qu'on leur impose.

Objectifs

Le thème général du projet concerne l’étude de la physiopathologie des troubles de l’humeur et de l’amélioration potentielle des symptômes par l’apport de probiotiques. Nous nous intéressons particulièrement aux effets de l’inflammation dans l’apparition des troubles dépressifs, induits par la consommation chronique d’une alimentation déséquilibrée. En effet, la consommation chronique d'un régime alimentaire obésogène contribue à générer une inflammation dite "de bas bruit" qui va médier un certain nombre de processus conduisant à la perturbation du fonctionnement des systèmes de neurotransmission monoaminergiques qui peuvent sous-tendre le développement des troubles de l'humeur, jusqu'à la dépression. Si certains effets de l'inflammation dans ces phénomènes sont aujourd'hui décrits, les mécanismes neurochimiques précis mis en jeu ne sont pas encore totalement élucidés. En particulier, leur implication dans le déficit de réponse aux antidépresseurs, dont la proportion est largement plus présente chez les patients dépressifs présentant une inflammation chronique, est peu étudiée et reste à démontrer. Le travail chez le rongeur, ici la souris, est complémentaire des travaux cliniques qui sont par ailleurs menés dans notre équipe, car il nous permet un contrôle des conditions expérimentales très précis et permet également de procéder à des analyses moléculaires et pharmacologiques au niveau de structures cérébrales bien identifiées. Dans ce projet, nous nous intéressons précisément au rôle d'une voie enzymatique potentiellement altérée en condition inflammatoire, et qui conduit à la synthèse d'un facteur essentiel au fonctionnement des systèmes de neurotransmisssion monoaminergiques. Nous mesurerons chez des souris soumises chroniquement à un régime alimentaire obésogène, l'apparition de comportements de type dépressif, et étudierons les mécanismes neurochimiques impliqués. Nous étudierons également l'effet bénéfique d'une supplémentation par un probiotique sur ces comportements dépressifs et sur l'efficacité d'un traitement par anti-dépresseur, dont la réponse est réduite chez les sujets obèses.

Bénéfices attendus

Ce travail apportera des données scientifiques utiles pour une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la dépression associée à l’inflammation. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il permettra à plus long terme de développer de nouvelles stratégies nutritionnelles et/ou pharmacologiques pour améliorer la réponse thérapeutique et la prise en charge des individus atteints de troubles de l’humeur, en particulier lorsque ces derniers sont associés à un contexte inflammatoire.

Procédures

Les souris seront exposées chroniquement à un régime obésogène induisant une prise de poids. Elles recevront une administration quotidienne pendant 2 semaines de probiotiques par gavage et des injections intra-péritonéales seront réalisées, nécessitant une légère contention de courte durée. Des chirurgies stéréotaxiques seront réalisées sous anesthésie générale afin d'insérer une fibre intracérébrale (environ 60 minutes, 1 fois). Les souris seront soumises à des tests comportementaux.

Impact sur les animaux

La prise de poids induite par l'exposition chronique au régime hyperlipidique et les désordres métaboliques associés pourront être cause de nuisance pour les souris. Un comportement anxieux et/ou de type dépressif (modèlisé ici) est attendu chez les souris soumises au régime hyperlipidique.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les cerveaux et réaliser des analyses biochimiques.

Remplacement

L'objectif général du projet est de mieux comprendre chez l'animal les mécanismes mis en jeu dans le développement des troubles de l'humeur en condition inflammatoire. Un second objectif est de tester l'effet de l’apport en probiotiques favorisant la synthèse de BH4 sur les altérations comportementales associées à l’inflammation. Dans ce contexte de recherche, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés à l'étude des troubles de l'humeur reste une nécessité expérimentale afin d'appréhender la réalité physiologique de nos résultats. La recherche d'alternatives dans des bases de données démontre que les solutions de rechange ne sont pas à ce jour disponibles ou applicables.

Réduction

Lorsque cela est possible, les mêmes souris seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Ceci permettre de réduire au maximum le nombre de souris nécessaire à l'étude. Aucun dupliqua du travail proposé n'est aujourd'hui identifié. Le nombre d'animaux utilisé est calculé afin d'avoir des tests statistiques robustes évitant la répétition des expériences.

Raffinement

En concertation avec la structure Bien-Etre du laboratoire, nous avons défini les meilleures conditions d'hébergement possibles ainsi que les points limites et les points d'arrêt précoces et adaptés. Les souris seront ainsi hébergées par 5, avec présence de différents enrichissements, surveillance quotidienne et soins apportés rapidement si nécessaire. Les protocoles réalisés sur les animaux sont au préalables soumis puis approuvés par l'équipe en charge de l'animalerie afin d'assurer les bonnes conditions d'expérimentation. Pour les procédures invasives et/ou susceptibles de générer une douleur, les soins pré- et pos-opératoires sont appliqués, l'anesthésie, l'analgésie et l'euthanasie sont mises en place de façon appropriée par des expérimentateurs formés et expérimentés.

Choix des espèces

Le modèle utilisé dans ce projet est la souris. C’est un animal sur lequel les traitements nutritionnels et les évaluations comportementales sont faciles à conduire et maitrisés au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille (faciles à manipuler) et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l’animalerie de l’unité. Les animaux sont mis sous régime obésogène au sevrage, pendant 12 semaines. Ceci correspond à une exposition chronique débutant à l'adolescence ,stade particulièrement sensible aux effets néfastes de ce régime sur les sphères émotionnelles et cognitives. Les différents test comportementaux et analyses sont alors réalisés à l'issue de cette période d'exposition, correspondant au stade adulte, récapitulant le modèle d'obésité clinique chez la personne adulte.

Opérées à la cuisse droite pour provoquer une douleur chronique d'environ dix semaines, les souris passent jusqu'à 24 tests comportementaux en six semaines. 8 560 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, après une biopsie de génotypage à l'âge de cinq à sept jours, et une partie reçoit des antidépresseurs ou des anticonvulsivants dans l'eau de boisson ou par gavage. Le porteur écrit qu'elles "ressentiront une douleur modérée qui ne peut pas être soulagée, car c'est le sujet de la recherche", affirme que les points limites existent "pour garantir leur bien-être", et ne précise pas quels tests mesurent cette douleur. Les souris sans le génotype recherché sont tuées, les autres à l'issue de chaque procédure, le porteur les décrivant comme des "animaux non naïfs qui ne peuvent être réutilisés".

Objectifs

Ce projet de recherche vise à améliorer les traitements contre la douleur neuropathique, une douleur causée par des lésions ou des maladies du système nerveux, touchant environ 6 % de la population en France. Actuellement, certains antidépresseurs et anticonvulsivants sont les meilleures options disponibles, mais ils ne fonctionnent pas pour tout le monde et ont de nombreux effets secondaires. De plus, on comprend mal comment ces médicaments soulagent la douleur neuropathique. Comprendre comment ces médicaments fonctionnent est essentiel pour améliorer les traitements actuels et en développer de nouveaux, plus ciblés. Ce projet vise à mieux comprendre les mécanismes par lesquels les antidépresseurs et les anticonvulsivants soulagent la douleur neuropathique. Nos recherches ont déjà montré que ces traitements ont un effet anti-inflammatoire et influencent le système circadien, qui régule nos cycles biologiques. Nous voulons maintenant explorer plus en détail ces cibles pour améliorer les traitements de la douleur neuropathique.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche vise à améliorer les traitements contre la douleur neuropathique. Nous pensons que les résultats de ce projet pourraient non seulement améliorer les traitements actuels en permettant une meilleure utilisation clinique grâce à une meilleure compréhension de leur fonctionnement, mais aussi aider à développer de nouveaux traitements plus ciblés et avec moins d'effets secondaires que ceux existants.

Procédures

Les animaux subiront une biopsie unique sur animal vigil à l'âge de 5 à 7 jours afin de réaliser leur génotypage. Les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale induisant une douleur chronique pendant environ 10 semaines. La chirurgie, réalisée au niveau de la cuisse droite, durera environ 5 minutes sous anesthésie générale. Certains animaux subiront une injection au niveau thoracique sous anesthésie générale, d’autres animaux subirons des injections intrapéritonéales (vigile) répétées pendant 1 semaine à raison d’1 injection par jour. Une partie des animaux recevra un traitement (soit administré pendant 3 semaines dans leur eau de boisson, soit par gavage vigile une unique fois). De plus, les animaux seront soumis à plusieurs tests comportementaux afin de vérifier l'efficacité des traitements étudiés sur la douleur neuropathique d'une durée de 3 à 10 minutes chacun (avec un maximum de 24 tests par animal sur une période de 6 semaines), avec un intervalle minimum de 24 heures entre chaque test. Certains animaux subiront une chirurgie terminale pour prélèvement d'organes.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux ressentiront une douleur modérée qui ne peut pas être soulagée, car c'est le sujet de la recherche. Après la chirurgie neuropathique, ils auront des difficultés à se déplacer pendant 48 à 72 heures. Certains animaux recevront des injections dans la région lombaire. Tous les animaux subiront une série de tests comportementaux pour évaluer la douleur, où ils peuvent retirer leur patte si nécessaire. Les animaux recevront des traitements d’antidépresseurs ou d'anticonvulsivants, soit en dose unique, soit en traitement prolongé. Pour les doses uniques, les animaux seront habitués à une légère contention avant un gavage effectué par une personne formée. Pour les traitements prolongés, les médicaments seront mélangés à l'eau de boisson, une méthode non invasive. Les biberons seront pesés régulièrement pour surveiller la quantité de liquide consommée par les animaux.

Devenir

Les animaux ayant le génotype recherché continuent vers l'ensemble du projet et ceux n'ayant pas le génotype attendu sont mis à mort. A l’issu de chaque procédure, les animaux seront mis à mort car ce sont des animaux non naïfs qui ne peuvent être réutilisés dans des projets ultérieurs

Remplacement

Pour notre étude, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in silico. Pour analyser l'effet des antidépresseurs ou des anticonvulsivants sur la douleur chronique et les réactions émotionnelles, nous devons observer le comportement des animaux vivants.

Réduction

Nous essayons de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tout en obtenant des résultats scientifiques fiables. D'après les études et la variabilité individuelle, chaque groupe expérimental comprendra au maximum 12 souris mâles et 12 femelles. Un calcul statistique a été fait pour s'assurer que nos résultats seront valides. Les animaux passeront par plusieurs tests comportementaux pour réduire leur nombre. Les analyses statistiques finales seront réalisées pour confirmer la validité de nos résultats.

Raffinement

Les animaux sont logés par groupes de 4 ou 5 pour répondre à leurs besoins sociaux. Nous mettons du coton dans les cages pour qu'ils puissent faire des nids et des barreaux en bois pour qu'ils puissent ronger, ce qui réduit l'agressivité. Les animaux sont observés quotidiennement pour détecter tout signe de stress ou d'inconfort. Pendant les chirurgies, des anesthésies sont toujours utilisées et un suivi post-chirurgical est effectué. Des points limites sont mises en place pour garantir leur bien-être. Si de nouvelles méthodes moins stressantes ou douloureuses sont découvertes, nous les intégrerons à nos procédures.

Choix des espèces

Le modèle d’animal neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris (travaux antérieurs de notre équipe). En outre, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles, facilitant ainsi l’étude génétique des mécanismes. Pour le génotypage, les souriceaux seront utilisés avant d'avoir 10 jours car la minéralisation des os de la queue ainsi que le développement de la vascularisation ne sont pas encore complets, ce qui minimise la souffrance des petits. Pour toutes les autres procédures, étant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques matures, des animaux adultes seront utilisés (arrivée des animaux à 8 semaines lorsqu’ils sont jeunes adultes puis début des procédures à partir de 10 semaines).

Six vecteurs viraux, trois doses, une injection dès la naissance et jusqu'à quatre séries de tests de force et d'activité par souris : 2 390 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, celles qui n'ont pas le génotype recherché étant tuées avant le sevrage et les autres à la fin de chaque procédure. Le projet cherche un vecteur de thérapie génique contre un syndrome myasthénique congénital lié au gène COLQ, après une étude où, écrit le porteur, un vecteur non optimisé "a provoqué une toxicité inattendue". Les tests comprennent des mesures d'activité d'une heure trente, de force d'agrippement, de coordination et de fatigabilité musculaire, et quatre prises de sang sous anesthésie. Les souris mutantes, privées de collagène Q, développent une faiblesse musculaire généralisée, et le porteur dit avoir choisi l'espèce parce qu'elle offre "le plus petit modèle animal" présentant les signes de la maladie.

Objectifs

Le syndrome myasthénique congénital est une maladie rare d’origine génétique, ayant une incidence estimée à 1 personne sur 250 000. Elle présente des caractéristiques cliniques et génétiques hétérogènes, puisque différents gènes déficients peuvent être individuellement associés à ce type de pathologie. Ces gènes sont impliqués dans le bon fonctionnement des jonctions neuromusculaires, qui est la structure permettant la transmission de l’information nerveuse vers les muscles et donc la contraction musculaire. L’un des syndromes myasthéniques congénitaux est associé à des mutations dans le gène COLQ, pour collagène Q. Les patients souffrent de faiblesse musculaire sévère, de fatigue, de scoliose importante, d’insuffisance respiratoire et ont une espérance de vie réduite. Pour le moment, il n’existe pas de traitement curatif mais uniquement des traitements symptomatiques. Le but du projet est de concevoir une approche de thérapie génique innovante pour le syndrome myasthénique congénital lié à ColQ, consistant à l’introduction du gène sain dans les cellules à l’aide de vecteurs. Pour cela, nous disposons d’un modèle murin déficient en ColQ qui reproduit les symptômes observés chez l’Homme. Dans une étude précédente, nous avons administré un vecteur viral non optimisé, porteur du gène sain COLQ, pour une première preuve de concept à un stade post-symptomatique et qui a provoqué une toxicité inattendue. Nous souhaitons, dans ce projet, traiter les animaux avec un vecteur viral que l’on optimisera pour une meilleure spécificité et efficacité pour le transfert du gène COLQ et son expression en protéine essentiellement dans le muscle squelettique, en tenant compte des résultats obtenus précédemment dans l’équipe. Nous avons sélectionné à partir d’études sur cellules en culture, 6 vecteurs différents. Le phénotype des souris traitées avec ces vecteurs à différentes doses sera analysé jusqu’à 3 mois ou 1 an, en évaluant l’état général des souris, la force musculaire et globale, l’état des jonctions neuromusculaires et la structure des fibres musculaires.

Bénéfices attendus

Grâce à l’étude de différents vecteurs, à différentes doses, ce projet pourrait permettre d’identifier chez la souris, un vecteur efficace pour traiter à une dose la plus faible possible le syndrome myasthénique congénital liée à l’absence de collagène Q, tout en réduisant le risque de toxicité. Ce vecteur optimisé pourra être utilisé pour le développement préclinique et clinique d’un candidat médicament pour cette pathologie mais pourra également être utilisé pour traiter d’autres syndromes myasthéniques congénitaux, en changeant uniquement le gène responsable de la pathologie.

Procédures

Injection des traitements : injection unique, environ 2min par souris. Mesure de l’activité des animaux : 1h30, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Mesure de la force d’agrippement : 2min, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Test de coordination et de force musculaire : 10min, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Test de fatigabilité musculaire : 5min, 3 ou 4 fois par souris en fonction de l’âge de la souris à l’euthanasie. Mesure de la force globale : 1 fois 10min par souris. Prélèvements de sang sur animaux vivants anesthésiés : 4 fois, environ 5 min par souris.

Impact sur les animaux

Les nuisances que ce modèle peut rencontrer sont liées au fait qu’il n’exprime pas la protéine collagène Q. Les animaux malades développeront des troubles du comportement moteur liés à une faiblesse musculaire généralisée. Suite aux traitements, dans le cas d’une injection à dose suboptimale, les nuisances seront liées à celles du modèle. Les injections intraveineuses ou les prélèvements sanguins provoquent une douleur légère équivalente au seuil de douleur lié à l’introduction d’une aiguille sous bonne pratique vétérinaire. L’animal subira, au cours des évaluations fonctionnelles, un stress lié à la manipulation. Rarement, certains animaux pourront souffrir de blessures des griffes/doigts ou de petites plaies suite aux tests de force.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés avant sevrage s’ils ne possèdent pas le génotype nécessaire pour être inclus dans les études. Le reste des animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de pouvoir prélever les tissus qui nous permettront de déterminer l’efficacité des traitements.

Remplacement

Dans ce projet, une présélection de vecteurs a été réalisée en mesurant l’efficacité de ces vecteurs à délivrer le gène thérapeutique dans les cellules musculaires, et à produire la protéine d’intérêt. Cependant, ces modèles en laboratoire ne nous permettent pas d'observer comment le vecteur se répartit dans tout le corps ni d'étudier les effets thérapeutiques, car ils ne peuvent pas simuler les problèmes de fonctionnement des muscles, comme la perte de force. Pour évaluer l’efficacité et la spécificité d’un vecteur administré dans l’ensemble du corps, l’utilisation d’animaux est indispensable. Notre modèle de souris reproduit la pathologie musculaire avec fidélité, ce qui nous permet de mesurer dans le temps et de façon prédictive de la clinique (c’est-à-dire chez l’Homme) l’efficacité des traitements sur l’ensemble des muscles squelettiques et la distribution du vecteur dans les différents tissus pour analyser leur spécificité. Ils permettent d’étudier les défauts liés à la fonction du muscle et de la jonction neuromusculaire ou encore les niveaux de biomarqueurs dans le sang.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été défini à partir de tests statistiques permettant de déterminer le nombre minimal d’animaux pour observer des différences entre un animal sain et un animal traité. En amont de cette étude expérimentale sur des modèles animaux, nous avons sélectionné grâce à des études sur cellules les 6 meilleurs vecteurs viraux capables d’exprimer fortement la protéine COLQ dans les cellules musculaires. La première étape de ce projet nous permettra d’évaluer l’efficacité de ces 6 vecteurs à 3 doses différentes pour cibler l’ensemble des muscles et traiter la pathologie à moyen terme, sur 3 mois. Les 2 meilleurs candidats seront sélectionnés afin de déterminer la dose thérapeutique optimale sur une période de 1 an. Dans l’étude à 3 mois, nous procèderons par étape, en injectant en premier les animaux avec la plus forte dose de vecteurs. Si des animaux injectés avec une certaine dose d’un vecteur donné montrent des signes d’absence d’efficacité, nous n’injecterons pas les doses plus faibles pour ce vecteur. Si un des vecteurs injectés dans l’étude à 3 mois a un effet thérapeutique nettement supérieur aux autres, l’étude de dose à un an se fera uniquement avec ce vecteur. La toxicité d’un médicament est évaluée avec la dose thérapeutique optimale sur des animaux sains. Dans cette étude, des animaux sains seront injectés avec les 3 doses de ce vecteur car la portée est entièrement injectée à la naissance. Par conséquent, nous utiliserons ces animaux pour l’étude de toxicité, au lieu d’injecter ultérieurement de nouvelles portées lorsque nous serons capables de déterminer la dose thérapeutique optimale. Nous réduisons ainsi le nombre total d’animaux utilisés.

Raffinement

D’une façon générale, toutes les mesures possibles permettant d’améliorer les conditions de vie des animaux seront prises. Les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies à l’aide de coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. S’il s’avère qu’un seul animal se retrouve dans une cage, au sevrage, puisqu’il est le seul à devoir être suivi sur la période d’étude, un animal compagnon sera ajouté pour éviter l’isolement. Pour éviter des bagarres entre mâles, le compagnon sera un frère de la même portée si possible. Sinon un autre mâle du même âge sera ajouté dès le sevrage, ce qui réduira les risques. Après sevrage, les souris mutantes traitées ou non seront observées quotidiennement avec attention et des mesures de poids seront effectuées 2 fois par semaine. Avant sevrage, la fréquence est réduite à une fois par semaine pour limiter les manipulations et donc le stress pour la portée et la mère. Un aliment hydratant et nourrissant sera appliqué dès constatation que les animaux éprouvent des difficultés à se mouvoir. Des points limites adaptés ont été mis en place afin d’éviter toute souffrance animale. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale pour limiter le stress de l’animal lié à l’acte et assurer son immobilité.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies comme animaux modèles car ces animaux ont pu être modifiés génétiquement afin de présenter la délétion du gène ColQ (pour collagène Q), responsable d’un syndrome myasthénique congénital, ce qui en font le plus petit modèle animal présentant les signes cliniques et pathologiques caractéristiques de cette maladie. Afin de favoriser l’expression de la protéine COLQ le plus tôt possible et de ralentir la progression de la maladie, les animaux seront traités dès la naissance, sachant que les animaux malades présentent des signes de la pathologie dès les premiers jours de vie. Les animaux seront suivis sur une période de 3 mois ou de 1 an, pour déterminer l’efficacité des traitements à moyen et long terme.

Biopsiées à la queue entre sept et dix jours de vie pour établir leur génotype, une partie des 803 souris subit ensuite jusqu'à six prises de sang, puis une chirurgie d'une heure pour implanter une sonde dans la tête. Ces souris-là vivent seules jusqu'à leur mort, sept mois au plus, le temps de trois ponctions de liquide céphalorachidien de quatre heures chacune réalisées sur animal éveillé. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance léger pour 185 d'entre elles et modéré pour 618. Deux des trois lignées génétiquement modifiées développent des crises d'épilepsie ou une paralysie des pattes arrière, et toutes les souris finissent tuées pour que leur cerveau soit prélevé, y compris les reproductrices et celles qui ne portent pas la modification recherchée.

Objectifs

Il existe une demande croissante pour utiliser des biomarqueurs (substances ou signes mesurables dans le corps qui peuvent indiquer la présence d’une maladie) pour comprendre et identifier les maladies comme la maladie d'Alzheimer. Ces biomarqueurs aident à voir comment la maladie évolue, comment les gens réagissent aux traitements et ce qui se passe dans le cerveau. Mais certains de ces tests sont compliqués et coûteux, comme les prélèvements de liquide céphalorachidien (LCR) ou l’imagerie du cerveau. On essaie donc de trouver des façons plus simples, comme des tests sanguins, pour diagnostiquer Alzheimer. Cependant, on ne sait pas encore très bien comment certains de ces biomarqueurs dans le sang ou le liquide céphalorachidien sont liés aux problèmes dans le cerveau lui-même. Comprendre cela est important, surtout maintenant que les essais de médicaments se font de plus en plus tôt, avant même que les symptômes n'apparaissent. Ce projet vise à examiner de près ces signes dans le sang et le liquide céphalorachidien chez des souris modèles de la maladie d’Alzheimer pour mieux comprendre la maladie et sa progression.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre de mieux comprendre comment les biomarqueurs (substances ou signes mesurable dans le corps qui peuvent indiquer la présence d’une maladie) dans le sang et le liquide céphalorachidien (LCR) évoluent lorsque quelqu'un a la maladie d'Alzheimer et le lien entre ces changements et la façon dont la maladie se développe dans le cerveau, notamment en termes d’atteintes tissulaires cérébrales caractéristiques de la maladie. La contribution de ce projet pour la compréhension des mécanismes de la maladie pourrait ainsi aider à trouver de nouveaux traitements pour la ralentir. Ce projet pourrait également permettre d’identifier de nouveaux biomarqueurs dans le sang et le LCR afin d’aider au diagnostic précoce de la maladie, ce qui aurait un bénéfice réel pour les personnes à haut risque notamment, qui pourraient alors bénéficier d’un traitement avant même qu'ils aient des symptômes.

Procédures

Pour connaitre le patrimoine génétique de nos animaux génétiquement modifiés un prélèvement d’un fragment de l’extrémité de la queue sera réalisé à l’âge de 7 à 10 jours, une fois par animal, durée inférieure à 1 minute. Pour une partie des animaux 6 prélèvements de sang maximum seront réalisés par animal avec un minimum de 2 mois de récupération entre chaque prélèvement, durée inférieure à 3 minutes par animal. Il y aura deux méthodes pour prélever le liquide céphalorachidien (LCR) : -Pour une partie des animaux, une sonde sera implantée au niveau de la tête de l’animal au cours d’une procédure chirurgicale sous anesthésie et analgésie adaptées (une fois par animal, durée : 1h). Ces animaux sont ensuite hébergés seuls pendant 7 mois maximum au cours desquels des prélèvements de LCR seront réalisés sur animal vigile : 3 maximum avec un minimum d’1 mois de récupération entre chaque prélèvement et durée de la collecte environ 4h. -Une autre partie des animaux sera anesthésiée, puis le LCR sera prélevé au cours d’une procédure chirurgicale (une fois par animal, durée 30 minutes), les animaux sont ensuite euthanasiés par une méthode réglementaire. 2 des lignées génétiquement modifiées utilisées dans le projet présentent un phénotype dommageable au cours du développement de la pathologie. Concrètement, des problèmes moteurs dans les pattes-arrières peuvent survenir à partir de 9 mois d’âge pour une des lignées. Les animaux de la deuxième lignée pourront présenter des crises d’épilepsie occasionnelles. En fin de procédure l’ensemble des animaux sera euthanasié par une méthode réglementaire.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir une légère et brève douleur lors du prélèvement d'échantillons pour connaitre leur patrimoine génétique. Pendant le prélèvement des échantillons de sang, l'animal est maintenu en contention ce qui peut générer un stress passager. Lors du prélèvement l’animal pourra ressentir une légère douleur et un inconfort de courte durée. À la suite du prélèvement il existe un risque rare d’hémorragie et/ou d’hématome. L'anesthésie générale utilisée pour la procédure chirurgicale et pour le prélèvement de liquide céphalorachidien peut entraîner une hypothermie et des problèmes cardiovasculaire et respiratoire. Après la chirurgie les animaux pourront ressentir une douleur et un inconfort. Un risque rare de complications existe en post-chirurgie telles que infections ou problèmes de cicatrisations. La canule de dialyse implantée pourra induire une gêne pour l’animal due à l’encombrement qu’elle génère. Après la chirurgie, les souris seront hébergées seules, s’agissant d’animaux grégaires cela pourra générer un stress. Elles seront isolées jusqu’à la fin de leur vie (pendant 7 mois maximum). Les souris des lignées génétiquement modifiées utilisées dans le projet peuvent avoir des problèmes de santé qui raccourcissent leur durée de vie, comme des crises d'épilepsie occasionnelles ou des difficultés de mouvement pouvant aller jusqu’à une paralysie, surtout au niveau des pattes arrière. Ceci pourra générer un stress pour les animaux et des pertes de poids.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales afin de collecter leur cerveau pour réaliser des analyses. Les animaux reproducteurs et les animaux non porteurs du patrimoine génétique d’intérêt seront euthanasiés par une méthode réglementaire car ils ne pourront pas être replacés ou réutilisés du fait de leurs modifications génétiques spécifiques.

Remplacement

Pour le déroulement de ce projet, il est essentiel d'utiliser des modèles animaux car nous nous concentrons sur le diagnostic et le pronostic de la maladie d’Alzheimer. Nous étudions un processus vraiment complexe qui ne dépend pas seulement des mécanismes de base de la maladie, mais aussi de la diffusion de protéines dans les fluides corporels (sang et liquide céphalorachidien). Dans d'autres modèles tels que les cellules, nous ne pouvons pas étudier la libération et la détection de ces molécules dans le corps.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum sans compromettre les objectifs scientifiques et statistiques du projet. Ce nombre a été calculé sur la base d'études précédemment élaborées et publiées et de notre expérience. Ainsi nous avons défini qu’il nous faudrait des groupes de 10 à 30 souris en fonction du type de prélèvement (sang ou liquide céphalorachidien). Afin de prendre en compte un pourcentage de perte au cours des procédures, nous prévoyons plus d’animaux que ce nombre minimal. Bien entendu nous adapterons notre production et le nombre d’animaux inclus en procédure afin de n’utiliser que le nombre strictement nécessaire (très probablement inférieur à ce qui est prévu ici). Nous estimons que nous utiliserons sur la durée du projet 803 animaux maximum. Lors de la procédure d’élevage nous piloterons la production de souris pour obtenir le nombre strictement nécessaire d’animaux pour nos lots expérimentaux. Pour l’évaluation des biomarqueurs, pour l’ensemble des lignées, nous utiliserons des femelles et des mâles afin d’optimiser l’utilisation des animaux produits et permettre une meilleure transposition de nos résultats. Nous réaliserons une partie de nos prélèvements de liquide céphalorachidien (LCR) à plusieurs reprises sur un même animal nous permettant d’une part de réduire la variabilité inter-individuelle et d’autre part d’éviter l’euthanasie de l’animal après le prélèvement, ce qui réduit le nombre d’animaux nécessaires à nos analyses.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Les méthodes et le traitement des animaux lors des expériences et dans l'animalerie visent à assurer leur bien-être maximal avec le moins de contraintes possible. Les conditions de vie, les soins et les procédures expérimentales sont conçus pour minimiser toute douleur ou souffrance. Les animaux seront observés quotidiennement, toute anomalie sera suivie et tracée en lien avec la structure chargée du bien-être animal (SBEA). Des points limites sont définis et seront respectés pour éviter toute souffrance animale. Lors du prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux la portée complète sera apportée dans une pièce dédiée, au calme, dans leur cage d’origine avec la mère. Nous utiliserons du matériel adapté pour le prélèvement, désinfecté entre chaque animal afin d’éviter tout risque de contamination croisée ou infection. Le prélèvement sera limité à la taille la plus petite possible et réalisé sur de jeunes animaux. Les souriceaux seront surveillés immédiatement après le geste puis 20 minutes après environ pour s’assurer de l’absence de saignement et la bonne prise en charge par leur mère. Pour les souris de phénotypes dommageables, nous ferons des observations régulières pour les détecter. En élevage nous utiliserons seulement des mâles transgéniques pour favoriser la bonne prise en charge des petits par leur mère. En cas de signes de difficultés motrices nous mettrons en place un soutien nutritionnel. Pour les souris qui seront hébergées seules, nous fournirons un enrichissement supplémentaire tel que des maisonnettes, bâtonnet de bois à ronger, papier kraft, etc. La procédure chirurgicale sera réalisée avec une anesthésie et une analgésie adaptées. La température de l’animal sera maintenue durant toute la durée de l’anesthésie à l’aide d’un tapis chauffant et d’une chambre de réveil chauffée pour éviter toute hypothermie. Nous mettrons en place une surveillance accrue en post-opératoire et un soutien nutritionnel si nécessaire. De plus, si la canule de dialyse présente une gêne pour l’animal pour l’accès à la nourriture, nous retirerons la grille de croquettes et mettrons l’aliment à disposition directement dans la cage.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur la souris car il existe de nombreux modèles génétiquement modifiés déjà caractérisés, parmi eux nous avons choisi de travailler avec 3 modèles de maladie d'Alzheimer qui présentent un intérêt pour ce projet. Pour l’étude des niveaux de biomarqueurs nous réaliserons des prélèvements de l’âge d’1.5 mois jusqu’à l’âge de 18 mois afin de suivre leur évolution au cours de la progression de la pathologie.