Rongeurs

Tués à la fin de chaque session de formation, faute de pouvoir être affectés à un autre projet, 600 souris et 300 rats subissent des gestes techniques d'apprentissage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit au maximum deux gestes parmi injection intraveineuse caudale, injection intrapéritonéale, injection sous-cutanée, prélèvement submandibulaire et gavage, ce dernier étant le seul pratiqué sans anesthésie. Le porteur écrit lui-même que les animaux pourront être impactés par des gestes hésitants, voire brusques, et que leur stress ne pourra pas être évité dans un premier temps. L'effectif est calé sur le nombre de personnes à former, quatre sessions de trente personnes par an pendant cinq ans, et le porteur précise qu'aucune approche statistique n'a été réalisée.

Objectifs

Les objectifs de ce projet de formation sont multiples : avoir une première approche de la réalisation des travaux pratiques de fin de formation de niveau applicateur, uniformiser les pratiques afin d'être le plus reproductible possible et raffiner les techniques pour fournir une qualité optimale dans les résultats expérimentaux sur rats et souris. Cette formation réglementaire pratique est intégrée/fait suite à une formation théorique pour les personnes de niveau applicateur.

Bénéfices attendus

Les bénéfices du projet sont multiples : première approche des gestes techniques classiques, sensibilisation sur les bonnes pratiques, raffiner les techniques en optimisant le matériel utilisé, les manipulations et harmonisation des savoir-faire afin d'être reproductible. Ce projet s'inscrit dans une démarche court terme : formation directe du personnel, moyen terme : réalisation des gestes techniques dans le cadre scientifique.

Procédures

Les gestes techniques réalisés seront les suivants : prélèvement/injection intraveineuse caudale, injection intrapéritonéale, injection sous-cutanée, prélèvement submandibulaire et gavage. Ces gestes seront réalisés sous anesthésie générale (sauf pour le gavage). Deux gestes techniques maximum seront faits sur un animal. Les collaborateurs ne pourront effectuer l'intégralité des gestes. Pour les rats, le binôme se mettra d'accord pour la réalisation des 2 gestes techniques. Si l’injection intraveineuse en veine caudale seule était souhaitée, elle serait faite par une seule des deux personnes du binôme. Seule l’injection intraveineuse en veine caudale sera un geste unique sur un animal. Chaque geste durera moins d’1 minute.

Impact sur les animaux

Comme tout geste technique non maitrisé en phase de de découverte ou d'apprentissage, il est évident que les animaux pourront être impactés par des gestes techniques hésitants, voire brusques. En effet, le stress des animaux ne pourra pas être évité dans un premier temps notamment à cause de la manipulation en cours d'apprentissage de la personne concernée (travail de préhension et contention). Ceci entrainera principalement des douleurs légères de courte durée et du stress.

Devenir

A la fin de chaque session de formation, les animaux seront euthanasiés, ne pouvant pas être utilisés pour un autre projet.

Remplacement

L'objectif de ce projet est de permettre aux personnes ayant déjà participé à la partie théorique du niveau applicateur, de mettre en pratique les connaissances acquises. Des alternatives à l’utilisation d’animaux vivants ont été envisagées : travaux pratiques intéractifs, utilisation de poupées pour imiter la taille de l'animal, etc. Dans le cadre de la première approche des gestes techniques, il est nécessaire d'assurer une formation complémentaire technique et de suivi sur animal vivant. En effet, certains gestes techniques tels que les gavages ou les injections nécessitent l'utilisation d'animaux vivants afin d'avoir la dextérité et la sensibilité du geste (fausse route, injection/prélèvement non maitrisé, etc.).

Réduction

Dans le cadre de la mise en place de ce projet, le nombre d'animaux aura été réduit au maximum. Le nombre d’animaux utilisés est estimé en fonction du besoin d’un nombre de personnes à former. Il est pris en compte d’éviter l'effet cumulatif des gestes techniques, en limitant le nombre de geste par animal par binôme. Il est calculé l'utilisation d'1 souris pour 1 personne formée et d'1 rat pour 2 personnes formées. Il est prévu 4 sessions de formation de 30 personnes par an, soit 600 personnes au total sur les 5 ans. Au total, 900 animaux seront utilisés (150 rats femelles, 150 rats mâles, 300 souris femelles et 300 souris mâles). Les espèces et les sexes à utiliser et à observer seront répartis au sein des différents binômes d'une session de formation. Il est à noter que pour les animaux destinés à ce projet, il sera envisagé de récupérer les animaux destinés à la mise à mort car ils ne répondent pas aux critères voulus (trop vieux) pour la vente ou l’utilisation dans d’autres projets. Cela permettrait également d'éviter de produire des animaux destinés à de la formation interne. Aucune approche statistique n’a été réalisée.

Raffinement

Etant dans le cadre d'une formation interne, toutes les précautions seront prises pour permettre de limiter le stress ou la douleur liée à l'apprentissage du geste technique : travail de contention préalable, réalisation de la majorité des gestes sous anesthésie, utilisation de canules souples, diminution de la taille de l'aiguille quand cela est possible. Un travail en amont sera fait avec les personnes sur la contention des animaux. L'observation sera continue pendant les gestes techniques pour détecter précocément tous signes de douleur, souffrance ou mal-être qui nécessiteraient une sortie de la procédure.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces les plus couramment utilisées dans la recherche scientifique française. Il est nécessaire que la formation effectuée se fasse sur les mêmes espèces. Aucune souche ne sera privilégiée afin de permettre aux opérateurs d'être opérationnels sur l'intégralité des demandes et contraintes techniques. Les animaux utilisés seront des animaux de réformes (souche, âge, poids non vendables) afin d'avoir un panel plus large d'animaux sans les produire spécifiquement pour la formation.

Une colite est provoquée chimiquement chez 1 962 souris, qui peuvent alors perdre du poids, saigner dans les selles et par le rectum, et développer un prolapsus anal. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à l'issue. Le porteur qualifie pourtant les produits administrés de "non toxiques et non irritants" et annonce comme seule nuisance attendue une gêne de courte durée au point d'injection, avant de décrire une inflammation de l'ensemble du tractus intestinal. Les souris sont mises à mort après un prélèvement sanguin terminal, pour des analyses portant sur le rôle des fibroblastes dans les structures lymphoïdes du côlon.

Objectifs

Le côlon est un organe formé d’une monocouche de cellules dites épithéliales qui s’invaginent de façon à former des cryptes. Ces cryptes participent à l’absorption et à la digestion. Cette barrière physique (les cellules épithéliales) est constamment en contact avec des agents extérieurs : microorganismes provenant du microbiote ou du bol alimentaire par exemple. Ainsi, le côlon est protégé par de nombreuses structures lymphoïdes : ce sont des agrégats de cellules immunitaires situés entre les cryptes du côlon. Ces cellules immunitaires, principalement des lymphocytes (d’où le terme de structure lymphoïde), sont présentes pour à la fois tolérer le microbiote mais également déclencher la défense immunitaire en cas d’infection par un agent pathogène par exemple. Au niveau architectural, les structures lymphoïdes sont formées d’un réseau de cellules hautement contractiles appelées fibroblastes, entre lesquelles naviguent les cellules immunitaires. Lors d’une réaction immunitaire, les structures lymphoïdes augmentent leur volume afin de recruter plus de cellules immunitaires et augmenter la puissance et la vitesse de réponse à l’inflammation. Ce phénomène est régulé par le réseau de fibroblastes de la structure lymphoïde, qui se contracte ou se relaxe pour modifier le volume de la structure. Les fibroblastes jouent donc un rôle important dans le fonctionnement de la réponse immunitaire locale via les structures lymphoïdes. Cependant, aucune étude n’a été réalisée au niveau des structures lymphoïdes du côlon, alors que cet organe est constamment mis à l’épreuve par l’environnement extérieur (via le microbiote notamment). Dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (ou MICI), le côlon est dans un état inflammatoire important. Cette inflammation chronique du tissu peut être due à une dérégulation du système immunitaire dans le côlon. Chez les patients atteints de MICI, il existe un risque plus élevé de développer un cancer colorectal. Notre projet vise à caractériser le rôle des fibroblastes dans les structures lymphoïdes dans l’homéostasie (c'est-à-dire en conditions physiologiques, en l'absence d'inflammation), l’inflammation du côlon, et le cancer colorectal

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre à court terme d’étudier le rôle de la contractilité des fibroblastes dans la régulation des structures lymphoïdes décrites ici dans l’inflammation du côlon. Il va ainsi permettre d’améliorer les connaissances sur les interactions entre les cellules immunitaires et les cellules épithéliales de la muqueuse intestinale en contexte inflammatoire chronique. A long terme, il pourrait permettre de mieux comprendre le rôle des SLT dans l’inflammation colique pré-cancéreuse et de mettre en évidence un nouveau mécanisme de cancérogenèse dans le côlon. Ceci pourrait participer à l’élaboration de nouveaux traitements des MICI ainsi que du cancer colorectal.

Procédures

Dans un premier lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Au moins 24h après, un second produit sera administré aux animaux vigiles (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Enfin, les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement sanguin terminal (durée du geste 5 min). Dans un deuxième lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Ces animaux seront ensuite répartis en 3 groupes, un premier groupe reçevra un second traitement sur 8 jours en continu puis auront une période convalescence de 0 à 60 jours. Le deuxième groupe recevra le même second traitement mais sur 3 cycles de 5 à 8 jours avec 7 jours de repos entre chaque cycle puis une convalescence de 7 à 60 jours. Enfin le troisième groupe recevra un autre traitement à raison d’une fois par semaine sur 4 semaines (durée du geste inf à 10 sec). 2h avant la mise à mort, une partie de chacun des groupes, recevra un dernier traitement (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Enfin, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement sanguin terminal (durée du geste 5 min). Dans un troisième lot, les animaux vigiles recevront un premier traitement à raison d’une administration par jour pendant 5 jours (durée du geste inf à 10 sec). Les animaux auront un second traitement (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). De plus, un autre traitement sur 4 jours à 3 cycles (repos de 4 à 17 jours entre chaque cycle) sera réalisé. Les animaux seront suivis par coloscopie sous aneshtésie (durée du geste 5 min). Enfin, 2h avant la mise à mort, tous les animaux recevront un autre traitement (injection unique – durée du geste inf à 10 sec). Finalement, tous les animaux seront anesthésiés et analgésiés pour un prélèvement sanguin terminal (durée du geste 5 min).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues suite à l’administration de produits non toxiques et non irritants seront celles liées aux administrations elles-mêmes : gêne de courte durée au point d’injection. L’administration de nos traitements peut engendrer une déshydratation et une inflammation de l’ensemble du tractus intestinal. Les animaux utilisés lors des procédures peuvent présenter une perte de poids, des saignements dans les selles et rectaux. Ces effets pourront être observés en cours de traitement et jusqu’à 1 semaine après l’arrêt du traitement. La coloscopie peut engendrer une irritation transitoire du côlon.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Il est nécessaire de réaliser les expériences sur des animaux afin de modéliser (i) le développement des structures lymphoïdes tertiaires dans l’inflammation colique et (ii) le cancer colorectal ainsi que (iii) les interactions entre les différentes populations immunitaires, les fibroblastes et les cellules épithéliales adjacentes. Dans l’état actuel de notre projet, les expériences in vitro ne sont pas adaptées pour étudier les comportements immunitaires dans l’inflammation du côlon et le cancer colorectal (interactions cellulaires multiples et complexes). Il est difficile de reproduire la complexité du système immunitaire et de son interaction avec les cellules épithéliales à l’aide des organoïdes. Cependant, nous envisageons, dans une étape ultérieure, d’utiliser des organoïdes de côlon en co-culture avec des cellules immunitaires afin de répondre à des questionnements plus spécifiques.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est ajusté au plus bas mais compatible avec l’obtention de résultats statistiquement fiables. Tous les animaux, quel que soit leur génotype et leur sexe seront utilisés, ce qui permet d’avoir à la fois des animaux contrôles et des animaux d’intérêts Plusieurs types d'analyses seront effectués sur la même souris. Les tissus extraits seront utilisés pour des expériences multiples afin de réduire le nombre d'animaux utilisés. De plus, les croisements de souris seront optimisés pour produire le nombre d'animaux souhaité de génotype d’intérêt. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique. Tous les animaux seront utilisés pour des analyses post-mortem.

Raffinement

Les animaux seront suivis attentivement : mesure du poids cinq fois par semaine voire quotidienne (week-end inclus) à partir de 20% de perte de poids, surveillance du rectum (présence de prolapsus anal) et des selles (présence de diarrhées), aspect et comportement (signes de détresse), afin de détecter tout signe de souffrance. De plus, de précédentes études ont permis de déterminer les doses optimales de nos traitements afin d’optimiser les résultats obtenus tout en minimisant l’impact sur les animaux. Les gestes douloureux ou invasifs seront réalisés sous anesthésie avec recours aux analgésiques si nécessaire. Une grille de score adaptée aux procédures réalisées est mise en place pour évaluer de manière objective l’état des animaux. En cas de perte de poids, du gel nutritif sera donné en complément de l’alimentation habituelle afin de faciliter la prise alimentaire qui peuvent être causés par la colite spontanée ou chimio-induite. En cas de déshydratation, une injection de soluté réhydratant chaud sera administrée. Le gel nutritif peut être proposé en complément de l’injection. Enfin, l’inflammation du côlon peut être suivie par une méthode non invasive grâce à la recherche de marqueur de l’inflammation dans les selles.

Choix des espèces

La souris de laboratoire est largement utilisée car ce modèle apporte plusieurs avantages : la maîtrise de son élevage qui permet l’obtention rapide de cohortes d’animaux d’un génotype approprié, la relative facilitée de modification génétique. De plus, les bases de données d'expression de la souris, les lignées de souris et les protocoles déjà établis permettraient d'étendre facilement ce projet à l'avenir en utilisant des modèles déjà existants, ou de comparer les résultats du projet à différents ensembles de données provenant d'autres projets. Par ailleurs, la souris est très proche de l'Homme au niveau génétique mais aussi métabolique et immunitaire, c'est donc un excellent modèle d'étude des maladies chroniques du tractus intestinal et du cancer colorectal. De plus, cela nous permet d’étudier le rôle des fibroblastes dans les structures lymphoïdes dans l’inflammation colique et le cancer colorectal. Les souris seront utilisées entre 8 et 16 semaines, afin d’avoir un système immunitaire mature.

Pour chercher des marqueurs d'inflammation dans des cellules cérébrales issues de patients atteints de troubles psychiatriques, 480 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nouveau-nées, elles reçoivent une injection intracrânienne de cellules humaines sous anesthésie, puis, adultes, une substance inflammatoire qui provoque un état fébrile et une baisse d'activité, avant une chirurgie terminale. Toutes sont tuées pour que leur cerveau soit prélevé et analysé. Aucun calcul n'est donné pour justifier ce nombre de 480, le porteur indiquant seulement que les effectifs ont été déterminés et que des tests statistiques adaptés seront utilisés.

Objectifs

Les traitements actuels des maladies psychiatriques sont peu efficaces et ont des effets secondaires lourds pour la majorité des patients donc de nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires. Une augmentation de l’inflammation est observée chez les patients et semble impliquée dans l’apparition de certains symptômes, comme le suicide. Néanmoins, le rôle de l’inflammation dans le cerveau est encore peu étudié dans le cadre de ces pathologies. Dans ce contexte, ce projet vise à une meilleure connaissance de la réponse à l’inflammation des cellules dérivées de patients greffées chez la souris pour la recherche de marqueurs et de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance des processus inflammatoires des cellules du cerveau humaines dans le cadre de pathologies psychiatriques avec l’objectif de trouver de nouvelles cibles et approches thérapeutiques pour les malades.

Procédures

Injection intracrânienne sous analgésie et anesthésie, une fois, 5-10 minutes ; injection intrapéritonéale : une ou deux fois, 30 secondes ; injection sous-cutanée : une fois, 30 secondes ; administration d’une substance inflammatoire : une fois, 24 heures; chirurgie terminale sous analgésie et anesthésie profonde, une fois, 5 minutes.

Impact sur les animaux

Injection intracrânienne : douleur modérée et stress ; injections intrapéritonéale et sous-cutanée: douleur légère et stress de courte durée ; administration de substance inflammatoire : état fébrile et baisse d’activité de courte durée

Devenir

A la fin de la Procédure tous les animaux sont mis à mort pour prélèvement et analyse du cerveau.

Remplacement

Des études in vitro ont été effectués et ont montré que les cellules des patients sont dans un état inflammatoire. Néanmoins, il manque encore une technologie capable de remplacer l’environnement cérébrale dans sa globalité, qui est nécessaire pour le développement à maturité de certains types cellulaires, dont celles utilisées dans ce projet. Pour cette raison, l’utilisation du modèle animal est nécessaire.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes sociaux dans un environnement enrichi avec eau et nourriture ad libitum. Les procédures chirurgicales sont de courte durée et effectuées sous analgésie et anesthésie. Une grille est mise en place avec des points limite stricts et spécifiques au projet.

Choix des espèces

La souris a été choisie car des modèles immunodéficientes permettant la survie et intégration des cellules humaines dans le cerveau existent. Les animaux seront utilisés pour les greffes au stade nouveau-né pour permettre la maturation des cellules greffés et analysés au stade adulte (3 mois).

8 694 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit une injection d'antigènes puis une prise de sang tous les sept jours, et une partie d'entre elles est irradiée pour que son système immunitaire soit reconstitué à partir de moelle osseuse prélevée sur des souris donneuses. Le porteur situe la douleur du côté de cette irradiation, des injections de cellules et des biopsies de génotypage, et décrit l'épisode d'auto-immunité observé dans certains cas comme sans effet sur le bien-être de l'animal. Il indique par ailleurs que sept souris par groupe suffisent à obtenir des résultats concluants et que chaque expérience sera répétée trois fois, sans expliquer comment on parvient de là à 8 694 animaux.

Objectifs

L'aide entre lymphocytes B et T est une partie indispensable dans notre système immunitaire pour la génération d'anticorps de haute affinité qui nous protègent contre les infections. Nos travaux précédents montrent que la régulation des ARNs dans les lymphocytes B et T est essentielle pour développer cette protection immunitaire. Donc, avec l'utilisation de modèles de souris, notre projet vise à découvrir de nouveaux mécanismes moléculaires qui contrôlent l'amplitude et l'extension des réponses immunitaires pour le développement de futures thérapies vaccinales. Plus précisément, les objectifs spécifiques de notre projet sont : 1 - Comprendre les interactions des lymphocytes T et B dans un contexte physiologique après immunisation, et 2 - Étudier l’importance de la régulation des ARNs par les protéines de liaison à l'ARN dans les mécanismes d’activation du système immune.

Bénéfices attendus

Nous avons sélectionné des modèles de souris pour évaluer l'importance des mécanismes qui régulent des ARNs tels que l'épissage, la traduction et la dégradation de l'ARNm. Le rôle de ces mécanismes dans le bon fonctionnement des lymphocytes B et T est peu exploré mais essentiel comme nous l'avons récemment rapporté. Nos études apportent des connaissances importantes sur la biologie des ARNm et le fonctionnement des lymphocytes B et T pour une meilleure optimisation des stratégies de vaccination basées sur l'ARN.

Procédures

Toutes les souris (contrôle et déficient en une protéine régulatrice de l'ARN) seront vaccinées avec des antigènes modèles par injection intrapéritonéale ou sous-cutanée. Une prise de sang sera réalisée tous les 7 jours pour surveiller la réponse immunitaire. Les organes seront collectés après l'euthanasie. Certaines souris seront irradiées pour reconstituer leur système immunitaire avec des cellules de moelle osseuse provenant de souris donneuses. Dans d’autres cas, des lymphocytes B et/ou T avec des récepteurs de cellules T ou de cellules B spécifiques seront transférés à des souris hôtes avant la vaccination et évaluation du système immunitaire. Avant d'effectuer une procédure, le génotypage de tous les animaux sera déterminé par PCR après prélèvement d'une biopsie tissulaire.

Impact sur les animaux

La vaccination avec des antigènes émulsionnés dans un adjuvant n'a aucune conséquence dans nos modèles des souris. La souffrance et la douleur dans nos procédures sont principalement associées à l'irradiation de souris pour la reconstitution de cellules immunitaires, à l'injection de cellules ou d'antigènes et à des prélèvements de sang ou d’une biopsie tissulaire. Nous avons observé le développement d'un épisode d'auto-immunité léger dans certains cas mais il n'affecte pas la vie ou le bien-être de l'animal. Cet épisode disparaîtra au bout de 3 semaines, après la génération de nouvelles cellules T régulatrices fonctionnelles.

Devenir

Dans ce projet, tous les animaux seront euthanasiés en fin d’étude afin de prélever les organes nécessaires aux analyses.

Remplacement

Aucune alternative à l'utilisation de souris n'est disponible. Les réponses immunitaires contre les agents pathogènes sont des mécanismes complexes qui ne peuvent être modélisés in vitro. Les souris ont un système immunitaire similaire à celui des humains. Dans la mesure du possible, nous remplacerons les souris avec des cultures cellulaires in vitro, mais ces cultures ne retranscrivent pas la physiologie du système immunitaire.

Réduction

Les directrices ARRIVE et du Comité d'éthique sont suivies pour garantir le bien-être animal et la collecte de données de haute qualité avec un nombre minimum d'animaux. La stratégie d'élevage produit des souris tests et contrôles. Les souris seront sevrées en fonction du sexe, mais pas du génotype. Le nombre minimal d'animaux dans chaque expérience est déterminé en utilisant des calculs de puissance statistiques. En général, nous aurons besoin de 7 souris par groupe pour l’obtention de résultats statistique concluants. Nous répéterons chaque expérience 3 fois pour tester la reproductibilité.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien-être animal. Les animaux seront suivis au minimum 3 fois par semaine dès l’initiation du modèle. Les utilisateurs ont reçu une formation spécialisée officiel que leur permettant le raffinement des procédures. Un animal sera euthanasié s’il présente un des points limites d’arrêt de la procédure que nous aurons définis pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces points limites sont associés à une reconstitution défectueuse du système immunitaire mais pas à la vaccination avec des antigènes modèles (qui sont asymptomatiques). Des zootechniciens compétents assureront également le suivi du bien-être des animaux et des signes cliniques, et nous signaleront tout incident tel que l’amaigrissement, la déshydratation, une posture prostrée, des poils hérissés et/ou une absence de toilettage.

Choix des espèces

La dynamique des réponses immunitaires observées chez la souris est similaire à celle observée chez l'homme. En outre, il est connu que les mécanismes moléculaires régulés par de telles protéines de liaison à l'ARN sont les mêmes chez la souris et chez l'homme. Ainsi, ces modèles de souris nous permettront d’identifier les mécanismes responsables d’une réponse immunitaire efficace dans un contexte physiologique de maladies immunitaires et de pathologies inflammatoires. Pour ces raisons, nous avons généré de nouvelles souris transgéniques knock-out pour étudier le rôle des protéines de liaison à l'ARN impliquées dans l'épissage, la maturation et la traduction de l'ARN dans la réponse immunitaire. Les procédures 1, 2 et 4 seront effectuées sur des souris âgées de 6 à 20 semaines présentant un système immunitaire mature mais non vieillissant. Le transfert de cellules B et T afin de reconstituer ces compartiments immunitaires (procédure 3) peut être réalisé chez les jeunes souris et après sevrage (3 semaines) pour favoriser l'expansion des lymphocytes innés.

1 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Nourries d'un régime enrichi en cholestérol et en acide biliaire pour provoquer des calculs biliaires, elles reçoivent les composés testés une à deux fois par jour, par la bouche, sous la peau, dans l'abdomen ou dans la veine sous anesthésie, subissent huit prises de sang, parfois après quatre heures de jeûne, et passent 20 heures isolées sur grille en cage à métabolisme après 4, 8, 12 et 16 semaines de traitement. Le porteur reconnaît que la répétition des traitements "génère un stress chronique", pour des études qui doivent "valider ou non" des candidats contre les calculs et leurs complications au foie et à l'intestin. Une partie des souris porte une mutation, Mdr2 ko +/-, qui les prive d'un transporteur de phospholipides, et il dit la choisir pour "exacerber l'effet du régime lithogénique" et étudier des stades "plus avancés et plus sévères de la maladie".

Objectifs

La formation de calculs biliaires peut entrainer des dysfonctions biliaires, hépatiques et intestinales importantes, notamment une cholestase menant à une cholangite sclérosante et une inflammation sévère du foie qui peut elle-même entrainer un hépatocarcinome ou autrement appelé cancer du foie. Le but de ce projet est de modéliser ces dysfonctions en provoquant la formation de calculs biliaires et ainsi pouvoir tester l’efficacité de candidats médicaments.

Bénéfices attendus

Ces études permettront de valider ou non des traitements limitants le développement de calculs biliaires et donc l’apparition des complications hépatiques et intestinales associées.

Procédures

Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles : orale, sous-cutanée et intrapéritonéale sur animal vigile et intraveineuse sur animal anesthésié. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile. 8 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 4h maximum avant le prélèvement. Après 4, 8, 12 et 16 semaines de traitement, nous mesurerons divers paramètres urinaires et fécaux (récolte pendant 20h par l’intermédiaire de cages à métabolisme).

Impact sur les animaux

1) La mise sous régime lithogénique, enrichi en cholestérol et en acide biliaire, va accentuer la formation de calculs biliaires, notamment chez les souris Mdr2 ko +/-. 2)Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3) Les mises à jeun (4h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress. 4)Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 20h.

Devenir

Tous les animaux (1800 souris) seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno-marquages et expression de gènes, paramètres métaboliques...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développés pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions associées à la formation de calculs biliaires notamment au niveau du foie et de l’intestin ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie et de sa résolution seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude. Une analyse statistique permettra d'utiliser le nombre minimal d'animaux tout en assurant la robustesse des résultats.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux. L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une rougeur ou plaies cutanées, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Une grille de score spécifique est mise en place, si l'état de l'animal ne s'améliore pas, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront.

Choix des espèces

La souris wild-type développe des calculs biliaires sous régime lithogénique entrainant des complications hépatiques et intestinales de façon modérée. La souris Mdr2 ko +/- (FVB.129P2-Abcb4tm1Bor/J heterozygous) est une souris génétiquement modifiée. Elle est dépourvue de transporteurs de phospholipides, ce qui engendre une accumulation de phospholipides dans le foie et une accumulation d’acides biliaires dans la circulation sanguine et dans la bile. En utilisant ce modèle génétiquement modifié et prône à développer des calculs biliaires, cela nous permet d’exacerber l’effet du régime lithogénique et donc d’étudier des stades plus avancés et plus sévères de la maladie. Les animaux sont mis sous régime à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à l’âge de maturité sexuelle.

Une injection intrapéritonéale de quelques secondes, avec la souche RH de Toxoplasma gondii, dix souris par semaine. 2 600 souris vont être utilisées, toutes tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, exploitées comme culture vivante du parasite. Les toxoplasmes ainsi multipliés alimentent un test de lyse employé par un laboratoire expert pour dater une infection chez la femme enceinte ou le nouveau-né. Le porteur écrit que cette souche tue une souris en moins de quinze jours quels que soient le mode et la voie d'inoculation, et affirme dans le même temps que les animaux sont tués "bien avant que les points limites ne soient atteints".

Objectifs

La toxoplasmose est une maladie parasitaire humaine et animale cosmopolite due à Toxoplasma gondii. Généralement bénigne, elle peut être grave pour le foetus en cas d'infection de la mère pendant la grossesse et chez les patients immunodéprimés. Le diagnostic de l’infection toxoplasmique est donc essentiellement réalisé chez les femmes enceintes (dépistage systématique) et chez les nouveaux-nés en cas de suspicion de toxoplasmose congénitale. En effet, en France, il existe un programme officiel de prévention et de dépistage de la toxoplasmose congénitale. Le diagnostic est aussi pratiqué chez des sujets suspects de toxoplasmose oculaire ou présentant des signes cliniques pour la différencier d’autres infections, chez des sujets immunodéprimés (SIDA, transplantés d’organes solides, greffés de moelle osseuse ...), chez les patients en état de coma dépassé pour le don d’organes. La sérologie (recherche d’anticorps sécifiques dans le sérum des patients) représente la base du diagnostic de la toxoplasmose. De nombreuses techniques commerciales automatiées sont actuellement disponibles, cependant leur fiabilié est variable. Le biologiste est donc souvent confronté à des difficultés d’interprétation des résultats et dans ces cas une investigation complémentaire effectuée par un laboratoire expert est indispensable pour confirmer ou infirmer les résultats. Par exemple, chez la femme enceinte, c’est des conclusions de l’analyse sé́rologique que dé́coule toute la conduite à tenir à la fois chez la maman pendant la grossesse et chez le bébé après la naissance. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est de maintenir la production de tachyzoîtes vivants de Toxoplasma gondii in vivo chez la souris dont nous avons besoin pour réaliser le test de Lyse des toxoplasmes qui reste la technique de référence et qui représente un outil diagnostique précieux, extrêmement sensible et spécifique, pour mesurer les taux d’anticorps de façon plus précise.

Bénéfices attendus

Les laboratoires polyvalents utilisent pour le diagnostic sérologique de la toxoplasmose des techniques dites de 1ère ligne dont la fiabilité est très variable. Ainsi, pour les dossiers complexes, le biologiste fait appel à un laboratoire expert de la toxoplasmose qui dispose de techniques dites de confirmation et qui a l’expertise de l’interprétation des résultats. C’est dans ce contexte que nous réalisons le Test de Lyse des toxoplasmes qui associé à d’autres techniques diagnostiques complémentaires nous permet en général de conclure dès le premier sérum. Nous sommes ainsi capables de différencier une infection récente d’une infection ancienne (30% des femmes enceintes), de déterminer précisément la date de l’infection, de dépister une réactivation de la maladie chez l’immunodéprimé, de dépister une transmission passive d’anticorps par une transfusion, de confirmer l’immunité d’une patiente en cas de valeur limite ce qui permet d’éviter jusqu’à 10% des suivis de grossesse inutiles. La datation précise de la primoinfection chez la femme enceinte est indispensable puisqu’à partir de la 18ème semaine d’aménorrhée et au moins 4 semaines après la date supposée de la contamination, une amniocentèse sera pratiquée pour faire le diagnostic avant la naissance de la toxoplasmose congénitale. Un traitement précoce maternel antiparasitaire dans les 4 semaines suivant la contamination réduit le risque de lésions intracrâniennes. Le test de lyse est également utilisé pour le diagnostic après la naissance de la toxoplasmose congénitale, réalisé par la surveillance sérologique du nourrisson durant la première année de vie, en raison de sa grande sensibilité et du faible volume de sérum nécessaire pour sa réalisation. Dès que la toxoplasmose congénitale est prouvée, l’enfant est traité pendant 1 ans et suivi cliniquement jusqu’à l’adolescence. Chez l’immunodéprimé, un diagnostic précoce de réactivation ou de primo-infection est important car la maladie est constamment mortelle en l’absence de traitement adapté.

Procédures

Les animaux vigiles subissent une injection intrapéritonéale qui dure quelques secondes.

Impact sur les animaux

L' injection intra-péritonéale peut engendrer une légère douleur au niveau du site d'injection. Les différentes contentions peuvent être source de stress pour les souris.

Devenir

La souche RH de type I de Toxoplasma gondii est caractérisée par une virulence importante chez la souris. Quels que soient le mode et la voie d’inoculation, une souris infectée par un parasite meurt en moins de 15 jours. C’est pourquoi, à l'issue de la procédure, tous les animaux sont euthanasiés bien avant que les points limites ne soient atteints.

Remplacement

Le Test de Lyse réalisé́ à partir de tachyzoîtes cultivés in vitro n’offre pas les mêmes performances diagnostiques avec notamment une perte importante de sensibilité (faux négatifs). Ceci est en partie expliqué par une perte rapide de virulence de la souche entretenue in vitro et une diminution de la taille des tachyzoïtes lors du passage en culture cellulaire. Il n'existe donc pas à l'heure actuelle d'alternative à la méthode in vivo pour la production de toxoplasmes vivants. Nous ne sommes pas pour le moment en mesure de remplacer les expériences in vivo.

Réduction

Afin de restreindre le nombre d'animaux utilisés, nous avons amélioré notre démarche diagnostique pour réserver le Test de Lyse aux seuls sérums pour lesquels il est jugé comme absolument indispensable à l’obtention de résultats fiables et à la prise en charge des patients. Le Test de Lyse ne sera donc réalisé qu’une seule fois par semaine. Nous avons alors optimisé le protocole d’entretien du parasite in vivo pour éviter toute répétition inutile et ainsi réduire le nombre d'animaux à 10 par semaine alors qu’il en fallait 15 lors de la précédente demande d'autorisation de projet.

Raffinement

Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte depuis leur naissance jusqu'à leur mort. Ils sont hébergés par groupe de 5 individus et jamais isolés dans des cages ventilées de manière à maîtriser l’environnement sanitaire. Leur environnement est enrichi avec des cabanes. Les animaux seront suivis quotidiennement par du personnel qualifié et une grille de points limites adaptés sera mise en place. Si certains signes d’inconfort ou de souffrance apparaissent, les animaux bénéficieront d'une surveillance accrue, d'un enrichissement supplémentaire (nid végétal) et de nourriture humidifiée au sol et si leur état ne s'améliore pas au bout de 24h, ils seront mis à mort. Cependant si les étapes de la procédure et les temps de prélèvement sont respectés, les points limites ne seront que très rarement atteints.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour la culture de T. gondii. C'est en effet le plus petit mammifère utilisable en animalerie de classe 2 permettant le développement des tachyzoites. A noter que la souris est un hôte intermédiaire habituel de ce parasite. Les animaux sont utilisés au stade « jeunes adultes » entre 8 et 13 semaines pour avoir une taille compatible avec la manipulation expérimentale.

Une partie des souris porte la mutation responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne, développe une faiblesse musculaire vers quatre mois et sera gardée trois mois de plus dans cet état. 936 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs muscles. Les autres courent, trois jours d'habituation sur tapis roulant de quinze à vingt minutes, puis une heure de course intense, avec des chocs électriques légers pour les relancer dès qu'elles s'arrêtent. Le porteur écrit qu'il tue avant l'apparition du phénotype les mâles porteurs de la mutation qu'il n'utilisera pas, et qu'aucun animal ne sera réutilisé, replacé ni adopté.

Objectifs

L'exercice physique peut provoquer des dommages musculaires, par exemple une déchirure ou une rupture de la structure contractile du muscle. Les cellules doivent alors réparer correctement ces dommages pour rétablir la fonction musculaire. Si elles ne le font pas, elles risquent de provoquer des lésions beaucoup plus importantes, voire des pathologies. D'autre part, une réparation efficace de ces lésions est la base de la construction du muscle par la pratique du sport. Nous avons précédemment découvert un gène particulièrement exprimé en cas de lésions musculaires. Notre étude préliminaire sur des cellules en culture suggère que l'inhibition de ce gène pourrait augmenter la réparation musculaire. Dans ce projet, nous examinerons donc le rôle de ce gène dans la réparation du muscle chez des souris vivantes. En outre, nous examinerons si la perte de ce gène (et donc l'augmentation de la réparation) peut être utilisée comme thérapie pour la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD).

Bénéfices attendus

Si notre hypothèse s'avère correcte, il deviendrait nécessaire de développer un inhibiteur de ce gène pour favoriser la régénération du muscle et pour soigner la dystrophie musculaire de Duchenne ou contribuer à son traitement.

Procédures

1. Le programme d’exercice réalisé par les animaux est un modèle d’activité physique intense. Il s’agit d’une procédure qui induit des lésions musculaires pouvant provoquer un niveau d’inconfort musculaire important passager. Cet exercice est réalisé une seule fois, il comprend 3 jours de 15 à 20 min de course d’habituation sur tapis roulant suivi d’un jour de course de 60 min comparable à un exercice physique intense. L’animal reçoit des chocs électriques légers et brefs pour le motiver à courir s’il s’arrête. Si l’animal ne court pas pendant plus de 5 secondes le test est arrêté. 2.Les souris mâles porteurs de la mutation de la dystrophie musculaire de Duchenne présentent un phénotype de faiblesse musculaire léger à partir de l’âge de 4 mois. Ces animaux seront gardés durant 3 mois après l’apparition de ce phénotype.

Impact sur les animaux

Le programme d’exercice est une procédure semblable à une activité physique intense qui induit des lésions musculaires pouvant provoquer un niveau d’inconfort musculaire important passager. Les souris porteuses de la mutation responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne présentent un phénotype de faiblesse musculaire à partir de l’âge de 4 mois. Cependant, la délétion de notre gène d'intérêt dans les muscles devrait réduire ce phénotype.

Devenir

Pour parvenir à des conclusions scientifiques solides avec le nombre minimal d'animaux utilisés, nous collecterons les biopsies musculaires de tous les animaux à la fin de chaque procédure. Par conséquent, nous ne réutiliserons pas, ne remplaçons pas et ne ferons pas adopter les animaux.

Remplacement

Des données préliminaires concernant le gène d'intérêt étudié ont été obtenues en culture cellulaire avec une expérience simulant un exercice physique. Cependant, pour prouver sa fonction réelle dans une situation complexe in vivo, nous devons utiliser des modèles animaux. De plus, la DMD ne peut pas être facilement modélisée in vitro avec les technologies actuelles. Puisque nous voulons valider le potentiel de ce gène en tant que cible médicamenteuse, ces expériences sur les animaux sont nécessaires.

Réduction

Nous collecterons tous les tissus musculaires et les échantillons de sang pertinents de chaque souris, ce qui réduira considérablement le nombre de souris utilisées. La puissance statistique a été utilisée pour calculer le nombre de souris nécessaire afin de déterminer si une différence statistiquement significative existe entre 2 ou plusieurs groupes. Nous avons 3 types d’analyses qui seront composées de 5 animaux pour 6 temps différents. Ces temps d’analyses ont été choisis pour les 2 procédures du projet en fonction de résultats obtenus dans une étude in vitro dans notre équipe ainsi que des études publiées par la communauté scientifique. Si au cours du projet certains de ces temps ne présentent pas de modification significative d’expression des gènes analysés pour le groupe d’animaux du 1er type d’analyse (expression des gènes), alors nous ne ferons pas les groupes d’animaux destinés aux 2 autres types d’analyses ce qui diviserait le nombre d’animaux par 3 sur les temps d’observation concernés.

Raffinement

Pour générer nos souris d’expérience nous utiliserons des mâles porteurs de la mutation responsable de la dystrophie musculaire de Duchenne que nous euthanasierons avant l’apparition du phénotype dommageable. Nous garderons les mâles porteurs de la mutation et de la DMD que pour les expériences de ce projet. Si les animaux venaient à présenter des troubles musculaires comme des difficultés à se déplacer avant la fin de l’expérience, nous leur mettrions alors de la nourriture en gel dans la litière de la cage. Les prélèvements de sang nécessaire au dosage de la créatine kinase qui est un indicateur de lésions tissulaires seront effectués au niveau du sinus retro-orbital sous anesthésie gazeuse. Les animaux seront mis à mort par élongation cervicale avant leur réveil pour éviter toute douleur dû à la technique de prélèvement.

Choix des espèces

Le programme d’exercice utilisé, modélisant une activité physique intense, est bien établi chez la souris. Nous utiliserons des souris jeunes adultes ou adultes (à partir de l’âge de 8 semaines) pour cet exercice car la maturation musculaire doit être achevée. De même, le modèle de souris pour l'étude de la DMD est un modèle bien établi et largement utilisé pour la recherche sur la dystrophie musculaire. Nous observons les souris de ce modèle et délétée pour notre gène d'intérêt longitudinalement à différents âges afin de suivre les modifications d’expression de nombreux gènes exprimés en son absence. Nous pourrons ainsi mettre en corrélation ces modifications avec la mesure de la créatine kinase qui est un indicateur de lésions tissulaires et surtout avec l’éventuelle disparition attendue des phénotypes de la DMD (de 1 mois à 12 mois maximum) à 6 âges différents : 3 avant l’apparition du phénotype et 3 après son apparition. Si le phénotype apparaît à 4 mois comme nous l’attendons, nous prélèverons les échantillons aux âges de 1, 2, 3, 4, 5 et 6 mois, sinon les 3 derniers âges de prélèvement seront décalés à l’apparition du phénotype au maximum à 10, 11 et 12 mois.