Rongeurs
Etude de la cicatrisation cutanée au cours du diabète et de l’effet de l’application d’un substitut cutané chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
Une partie des souris utilisées est immunodéprimée, donc plus exposée aux infections, alors que le protocole leur inflige des plaies ouvertes. 1 592 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles suivent un régime gras et sucré pour devenir prédiabétiques, subissent une plaie d'excision ou deux plaies de pression de trois heures chacune sous anesthésie, un débridement, la greffe d'un substitut cutané humain et des tests répétés de tolérance au glucose avec incision de la queue, chacune finissant isolée en cage individuelle pour que ses plaies ne soient pas aggravées. Le porteur attend de cette durée d'expérimentation des signes excessifs d'agressivité, des griffures, de l'apathie ou de la prostration, et la mise à mort intervient pour prélever la peau totale du dos.
Objectifs
Ce projet est un projet de recherche fondamentale sur la compréhension de l’intégration de cellules humaines dans la problématique des plaies chroniques non cicatrisantes afin de déterminer la contribution des cellules du donneur versus hôte dans la régénération tissulaire. Les plaies chroniques sont des plaies de pression qui apparaissent chez les patients diabétiques, qui persistent dans le temps, ne cicatrisent pas et mettent la survie ou la qualité de vie du patient à risque pouvant entraîner de graves complications voire un décès. La thérapie locale des ulcères du pied repose principalement sur le débridement de la plaie et la protection des plaies à l’aide de pansements mais la cicatrisation reste longue et peut échouer. Il y a une urgente nécessité à trouver de nouveaux traitements et augmenter la compréhension du défaut de cicatrisation. Les études d’efficacités des pansements et peaux artificielles incluant des cellules sont principalement effectuées sur des animaux sains avec quelques études sur des animaux pathologiques et exclusivement réalisées sur des plaies aigues de type coupure. Toutefois, la peau d’un patient diabétique ou d’un sujet sain sont différentes, de même qu’une plaie liée à la gravité par application de la pression du corps est très différente d’une coupure. L’objectif de ce projet est de caractériser le rôle d’une peau artificielle humaine dans l’amélioration significative de la durée et de la qualité de la cicatrisation de la peau après coupure et application de pression chez des souris non et pré- diabétiques, mâles et femelles.
Bénéfices attendus
La compréhension des mécanismes de contribution des cellules du donneur versus hôte dans la formation du nouveau tissu permettra, à terme, de proposer des pistes de traitement adaptées aux défauts de cicatrisation qui peuvent affecter les patients diabétiques et améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Les souris seront soumises à un régime hypercalorique riche en graisse et sucre, associé ou non à des injections (x5, 3sec/injection – 20 sec/ contention) afin d’induire un pré-diabète. Sous anesthésie générale, les souris seront soumises à une plaie d’excision (1 en 1 min) ou deux plaies de pression (2x 3h), associé ou non à la greffe d’un substitut cutané. Il existe une répétition d’anesthésie gazeuse pour l’induction des plaies de pression, le débridement des plaies (10min) et le suivi des plaies par photo (5min). La détermination du temps de régime hypercalorique nécessaire pour induire un prédiabète nécessite la répétition de tests de tolérance au glucose et de tests de sensibilité à l’insuline. Les tests de tolérance au glucose ou de sensibilité à l’insuline nécessitent une seule incision (2 sec) de la queue pour chaque test. Pour les souris poilues, une crème dépilatoire VEET sera utilisée (appliquez 30 sec et bien rincé à l’eau claire avec compresse stérile)
Impact sur les animaux
Les souris immunodéprimées sont sujettes à plus d’infection. La génération de la plaie et le débridement peuvent engendrer une douleur. La durée des expérimentations peut engendrer des signes excessifs d’agressivité et l’apparition d’irritations ou de griffures cutanées ou l’apparition d’apathie, de prostration ou d’immobilité. La mise en cage isolée des souris pour préserver les plaies induites et ne pas avoir de sur-blessure peut engendrer une perte d’interaction, palliée par un enrichissement du milieu des cages. Une douleur transitoire peut être associé aux injections répétées.
Devenir
Mise à mort en fin d’expérimentations et prélèvement des tissus. MODIFICATION du 16/04/2024 : mises à mort par la méthode réglementaire pour prélèvements de peau totale du dos. Pour les souris avec plaie, mise à mort par injection d’euthasol ou induction en cage à CO².
Remplacement
La cicatrisation est un processus naturel qui permet à la peau de se refermer. Souhaitant étudier les défauts de cicatrisation liés au diabète (régime enrichi en sucre/gras), et l’effet de la pose d’un substitut cutané sur les blessures, notre projet requiert une approche intégrée qui n’est rendue possible que par l’utilisation du modèle souris. Aucune méthode alternative ne peut se substituer à l’utilisation des animaux. Ce projet de recherche fait suite à des résultats cellulaires obtenus et des travaux in vitro se poursuivent en parallèle.
Réduction
Le nombre total de souris prévues pour ce projet est de 1592 incluant les 2 sexes, la réalisation d’expérimentation se fera par salves. Nous prévoyons de valoriser au maximum les animaux utilisés, en constituant des banques de matériel biologique qui pourront être utilisées pour répondre à d'autres questions sur ces mêmes modèles. Les animaux ayant été utilisés pour la première partie du projet et répondant à nos attentes pourront être réutilisés pour la suite du projet, dans un objectif de réduction du nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les souris seront suivies avec un soin particulier, elles seront observées tous les jours et pesées 1 fois par semaine. Les points limites sont clairement définis, afin de détecter précocement tout signe de souffrance. Des croquettes mouillées au sol et/ ou gel nutritifs pourront être ajouté à la cage si les souris présentent une difficulté à se déplacer et/ ou se mettre debout ou si il n’y a pas de prise de poids. Toutes les anesthésies seront gazeuses Des analgésiques seront administrés 30 min avant l’acte chirurgical, puis 6-8h après et enfin 24h après l’acte chirurgical. L’hébergement et les instruments utilisés sont stériles, et les cages sont chauffées après les chirurgies via des pads chauffants disposés sous les cages, pour aider le réveil des animaux. Une fois les animaux isolés seul par cage, il y a l’ajout d’une maison carton comme nouvel enrichissement.
Choix des espèces
Les modèles murins, bien que présentant certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier l’intégrité fonctionnelle de la peau. Cette espèce possède une physiologie et une organisation cutanée proche de celle de l'Homme et permet d'étudier l’induction des plaies et les processus de cicatrisation, tout en complétant l'analyse jusqu'aux étages cellulaires et moléculaires. Nous utiliserons des souris âgées minimum de 3 semaines pour débuter les régimes hypercaloriques et pour que les souris soient sexuellement matures au moment de l’induction des plaies. Excepté pour les souris NSG qui auront 6 semaines d’âge au moment de la greffe de peau humaine.
Etude des conséquences du diabète sur la réactivité vasculaire chez la souris 1/2
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris engagées dans la procédure sont gavées et pesées chaque jour pendant 42 jours, après une biopsie de la queue et un transfert entre deux établissements. 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Le modèle repose sur des animaux rendus diabétiques et obèses, qui peuvent développer une cardiopathie et des irritations cutanées, et qui urinent assez pour imposer de limiter les cages à deux individus et de les changer plus souvent. Quarante souris seulement entrent dans la procédure et voient leurs organes prélevés, les autres, dépourvues de la mutation recherchée, étant tuées sans y avoir été soumises.
Objectifs
Le diabète est la quatrième cause de décès dans la majorité des pays développés, notamment par suite de maladies cardiaques et d'accident vasculaire cérébral. Dans ces pays, le diabète est aussi la principale cause de cécité, d'amputation des membres inférieurs et d'insuffisance rénale. La dysfonction endothéliale est un marqueur précoce du développement de la pathologie métabolique et du risque cardiovasculaire. Cette dysfonction doit par conséquent être évaluée tôt dans l’histoire naturelle du diabète. Les stimuli à l’origine des lésions des vaisseaux sanguins induites au cours du diabète ne sont pas complètement connus. L'objectif principal est d'identifier si la modulation pharmacologique de certains mécanismes d'atteinte délétère des vaisseaux sanguins permettrait de limiter les lésions des vaisseaux sanguins au cours du diabète. Le projet se déroulera sur 2 établissements utilisateurs, EU1 qui élèvera les animaux et EU2 qui fera les analyses fonctionnelles sur les vaisseaux sanguins.
Bénéfices attendus
A terme ce projet conduira à une meilleure compréhension de la progression de la dysfonction endothéliale dans le diabète et pourrait permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement des complications vasculaires du diabète.
Procédures
Biopsie à la queue (EU1, 1 fois 10 secondes), préhensions quotidiennes et gavage (EU1 et EU2, 42 fois 1 minute), pesées quotidiennes (EU1 et EU2, 42 fois 30 secondes).
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à l'expérimentation: inconfort lié à la préhension des animaux, inconfort lié au gavage. Effet indésirable lié au modèle de diabète et d'obésité: cardiopathie, irritation cutanée.
Devenir
Tous les animaux du projet seront mis à mort. Les 40 utilisés dans la procédure verront leurs organes prélevés pour analyse. Les animaux qui n'ont pas la mutation d'intérêt seront également mis à mort.
Remplacement
Nous utilisons différentes approches pour analyser les mécanismes de l'atteinte vasculaire liés au diabète incluant les cultures cellulaires (in vitro). Ici nous étudions les propriétés de vasoconstriction et vasodilatation des artères en réponse à différents signaux moléculaires et mécaniques. Ces propriétés des vaisseaux sont essentielles pour assurer le bon fonctionnement des organes. Elles dépendent des différents types cellulaires qui composent les artères et également des molécules sécrétées par différets organes de l'organisme. La culture cellulaire ne peut pas reproduire la complexité des mécanismes mis en jeu au cours du diabète comme les interactions entre les vaisseaux et le système immunitaire ou les interactions entre organes. Il n'existe pas de modèle de remplacement in vitro ou in silico à l'heure actuelle pour ces raisons.
Réduction
Le nombre d'animaux est calculé sur la base d’un plan expérimental stéréotypé permettant d’obtenir la puissance statistique nécessaire à l’obtention de conclusions biologiquement pertinentes. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait sur un logiciel en ligne et donnait 8 animaux par groupe requis. 2 animaux de plus sont prévus par groupe pour pallier aux risques du modèle expérimental et des analyses post-mortem. Le schéma d'accouplement est optimisé pour permettre d'obtenir le meilleur rendemeent possible d'animaux d'intérêt.
Raffinement
Les animaux seront élevés en cages enrichies et surveillés au cours des procédures pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques pouvant indiquer une souffrance ou un mal-être. Les souris diabétiques urinent beaucoup. Pour cette raison, le nombre d'animaux diabétique par cage est limité à 2 et les cages sont changées plus fréquemment et dès que nécessaire. En cas d’apparition de signes cliniques, ou à la fin de la procédure, les animaux sont mis à mort.
Choix des espèces
La souris est un modèle permettant de réaliser des expériences de physiopathologie de mammifère. De plus, le modèle de diabète utilisé au cours de ce projet est établi et validé par la communauté scientifique. animaux utilisés du sevrage (identification) à l'âge adulte. Les reproducteurs pourront être utilisés jusqu'à 1 an de vie. Les souris d'intérêt sont gavés de 6 à 12 semaines de vie.
Formation et validation de la méthode de prélèvement de liquide synoviale et d’administration intra-articulaire chez le rat et le chien pour une application dans des études de toxicologie réglementaire
- Formation professionnelle
Chiens : 10
40 rats et 10 chiens vont être utilisés dans ce projet, les rats opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, les chiens réutilisés ensuite dans d'autres procédures. Chaque chien peut subir quatre prélèvements de liquide synovial au genou, deux par articulation, plus deux injections intra-articulaires par genou, le tout sous anesthésie, avec un risque de gonflement, de douleur articulaire et d'infection. L'objectif déclaré est de former le personnel à ces gestes pour des études de toxicologie réglementaire préalables à la mise sur le marché de médicaments et de dispositifs médicaux. Le porteur ajoute que l'apprentissage sur ces deux espèces permet de transposer les compétences aux primates non humains, dont l'utilisation à des fins de seule formation n'est pas réglementaire.
Objectifs
L’établissement utilisateur est spécialisé dans la recherche pré-clinique et effectue des études de toxicologie et pharmacologies réglementaires (Bonnes Pratiques de Laboratoire, textes ICH M3(R2) et ICH S3A) indispensables à la mise sur le marché de médicaments, vaccins, dispositifs médicaux, thérapies, etc. Ce type d’études requièrent une qualification au poste et aux gestes techniques réalisés, afin de garantir la qualité des résultats et la validité des études, un objectif synergique des exigences 3Rs. Pour que ces études soient menées par du personnel qualifié, la formation initiale et continue du personnel aux nombreuses techniques de prélèvements et d’administration est primordiale. Ce projet a pour objectif de valider la faisabilité de l’administration intra-articulaire et du prélèvement de liquide synoviale chez le rat, ainsi que former le personnel à ces deux actes chez le chien afin de pouvoir l’effectuer dans le cadre d’étude de toxicologie et de pharmacologie réglementaire.
Bénéfices attendus
Ce projet assure la validation de l’injection intra-articulaire et du prélèvement de liquide synoviale chez le rat et la formation pratique à ces 2 gestes chez le chiens pour personnel concepteur et/ou réalisateur de procédures expérimentales afin de garantir la maitrise des gestes techniques nécessaires à la qualité des données expérimentales (précision, reproductibilité) et les respects des exigences 3Rs de réduction (liées à la qualité des études) et de raffinement (impact minimum des gestes techniques sur le bien-être des animaux : en particulier stress, anxiété, douleur) dans le cadre d’études pré-cliniques.
Procédures
Dans ce projet, les chiens peuvent être soumis à 4 prélèvement de liquide synovial (2 par articulation du genou), avec au moins 3 jours de repos entre 2 prélèvements et jusqu'à une semaine pour une même articulation. Ces prélèvements se font systématique sous anesthésie. Les rats peuvent être soumis à des prélèvements intra-articulaires terminaux uniquement (sous anesthésie, sans réveil) Chez ces deux espèces, deux injections intra-articulaire sous anesthésie par articulation du genou peuvent être faite avec au moins 1 semaine d'intervalle pour une même articulation et 3 jours entre 2 articulations afin de s'assurer de l'absence d'effets délétères de l'injection.
Impact sur les animaux
L’injection ou le prélèvement de liquide synovial peut entrainer un gonflement, une douleur au niveau de l’articulation, ou encore une infection si les conditions d’asepsie ne sont pas respectées.
Devenir
La procédure est une procédure légère : les animaux peuvent donc être ré-utilisés dans d'autres procédures, afin de réduire le nombre total d'animaux utilisés. Cette re-utilisation se fait sur décision vétérinaire prenant en compte l'ensemble des procédures dans lesquels l'animal a été et va être impliqué.
Remplacement
Il n’existe pas de modèles satisfaisants des articulations des rats et des chiens qui permettraient de ne pas utiliser d’animaux pour pratiquer ces deux gestes. Le recours à l’utilisation d’animaux de formation est donc nécessaire afin de maitriser les bons gestes in-vivo avant la manipulation et la réalisation d’actes sur des animaux d’étude. Cela permet également de suivre l’état clinique de l’animal à postériori de la formation, indiquant la bonne réalisation du geste ou non. L’utilisation de rats euthanasiées dans le cadre d’autres procédures ou une procédure sans réveil seront faites avant le passage à l’animal vivant.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux à commander spécifiquement en vue d’être utilisé pour ce projet, les animaux non euthanasiés ou non utilisés en fin d’étude et les animaux sentinelles seront réutilisés en 1er intention. De plus, afin d’optimiser l’utilisation de chaque animal et de réduire le nombre d’animaux de formation, les deux articulations du grasset pourront être utilisées deux fois chacune, avec au moins 3 jours d’intervalles entre 2 articulations et 1 semaines pour une même articulation afin de s’assurer de l’absence d’effet délétère. Enfin, lorsque cela est possible, les 2 gestes techniques (prélèvement de liquide synoviale et injection intra-articulaire) seront réalisés sur la même articulation, réduisant le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Tout lot de rats ou tout chien inclus dans ce projet fait l’objet d’un examen et d’une approbation du service vétérinaire afin de s’assurer du bon état de santé de chaque individu et, si besoin, d’exclure du projet ceux jugés inaptes à une utilisation en formation. Une traçabilité des animaux utilisés en formation est assurée, comme pour toute autre utilisation, et enregistrée comme toute autre utilisation des animaux sur le site, ce qui en permet le suivi et l’analyse en réunion SBEA. Chaque animal utilisé possède une fiche individuelle sur laquelle est documentée, à chaque utilisation, le(s) type(s) de gestes techniques pratiqué(s) en précisant les volumes d’administration et de prélèvement, les produits administrés, etc), ainsi que l’identification du collaborateur en formation et du tuteur présent lors de la session. Ces fiches individuelles sont consultables par le service vétérinaire et la SBEA dans le cadre du suivi de l'utilisation des animaux en formation. La ré-utilisation d’animaux issus d’autres procédures expérimentales de gravité réelle ‘’légère’’ ou ‘’modérée’’ permet l’utilisation d’animaux habitués à la contention et à la réalisation des gestes techniques, ce qui contribue à une diminution du stress de l’animal avant sédation. Enfin, le passage à la réalisation d’un geste technique sur l’animal vivant peut d’abord se faire sans réveil (pour les rats), afin de s’assurer de la bonne maitrise du geste et réduire au maximum le risque d’apparition de nuisances au réveil de l’animal. Les animaux sont hébergés collectivement. Cependant, un isolement pourra être effectué pendant 24h suivant la réalisation des gestes techniques afin de mieux observer l’apparition d’effets délétères. Cet isolement ne sera que physique, et fera l’objet d’enrichissement supplémentaires (ajout d'un jeux/objet supplémentaire non présent au quotidien dans les box d’hébergement, ainsi que des friandises cachées dans des copeaux propres). Tous les animaux hébergés dans l’établissement font l’objet d’un suivi quotidien. Les chiens font l’objet de sessions régulières d’habituation aux manipulations et contentions effectuées dans le cadre des études pré-cliniques, encadrées par un programme de training mis en place et suivi par la SBEA.
Choix des espèces
Ce projet est préliminaire à la réalisation d’études de toxicologie réglementaires (ICH M3(R2) et ICH S3A) in vivo chez le rat et le chien, il est donc important que le personnel soit formé sur ce type d’espèces. De plus, l’apprentissage de gestes techniques sur ces espèces permet ensuite de transposer les compétences acquises à d’autres espèces comme les primates non humains qui sont essentiels dans la recherche biomédicale mais dont l’utilisation dans un cadre de formation uniquement n’est pas règlementaire. L’âge des animaux utilisés dans la formation sera proche de l’âge des animaux lors des études. Pour les Rongeurs, à partir de 8 semaines, et pour les chiens à partir de 6 mois.
Étude fonctionnelle de protéines associées à l’ADN au cours de la reproduction
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système urogénital
Toute femelle présentant des signes de mise-bas anormale est immédiatement mise à mort, comme tout animal dont le score de bien-être ne s'améliore pas après 48 heures ou qui perd plus de 20 % de son poids. 476 souris vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance légère, toutes tuées à l'issue. 120 femelles reçoivent deux injections intrapéritonéales espacées de 48 heures pour déclencher une sur-ovulation, puis sont mises à mort entre 12 heures et 4 jours plus tard, dans une étude sur des variantes d'histones propres aux cellules reproductrices. Les autres sont tuées au titre de l'entretien de la colonie, parce que leur génotype ne sert pas au projet ou qu'elles ont dépassé douze mois, le porteur présentant cette mise à mort comme un moyen de leur éviter les complications de santé liées à l'âge.
Objectifs
L’information génétique transmise par les gamètes est compactée en fibre de chromatine dont l’unité de base se compose de protéines appelées histones. Les cellules reproductrices présentent la particularité́ d’utiliser des variantes d’histones qui ne sont pas trouvées dans les tissus somatiques et sont uniques à chaque espèce. Ces variantes sont parfois induites de manière aberrante dans des cancers humains. Que ce soit au cours de la reproduction ou dans un contexte pathologique, les fonctions de ces histones restent, à ce jour, peu connues. Ces histones se trouvant exclusivement sur le chromosome X des mammifères, l’étude de leurs fonctions in vivo nécessite une approche en modèles murins. Il existe des modèles de souris mutantes déficitaires pour ces histones et des travaux antérieurs ont montré que les mâles mutants présentaient une sous-fertilité et que 10 % des embryons succombaient in utero post-implantation. Ce projet, a pour but d’identifier les conséquences de la perte de ces histones sur la structure de la chromatine des cellules reproductrices ainsi que leurs rôles au cours du développement embryonnaire précoce. Enfin, il n’existe pas d’anticorps permettant de purifier ces histones dans leurs contextes natifs, et ce projet propose de produire de nouveaux modèles de souris permettant de les identifier in vivo. Dans son ensemble, ce projet permettra de comprendre de nouveaux mécanismes mis en jeu lors de la reproduction. L’identification des fonctions de ces variantes d’histones ouvrira de nouvelles pistes thérapeutiques aussi bien ciblant certains cancers que combattant des infertilités.
Bénéfices attendus
Les modèles murins de ce projet ont pour but d’identifier de nouveaux processus contribuant à l’hérédité durant la reproduction. Ils présentent donc un bénéfice pour la compréhension fondamentale de ce processus. Les histones étudiées étant aussi présentes chez l’homme, ce projet contribuera à notre compréhension de la fertilité humaine. Enfin, ces variantes étaient induites de manière ectopique dans de nombreux cancers, leur caractérisation fonctionnelle ouvrira la voie vers de nouvelles routes thérapeutiques.
Procédures
Un groupe d’animaux est soumis à deux injections intra-péritonéales durant chacune moins de 5 secondes et espacées de 48h afin de stimuler l’ovulation.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont : du stress et de l’angoisse de courte durée (moins de 2 minutes), et une douleur légère et transitoire, de quelques secondes, lors des injections intrapéritonéales. Bien qu'aucun phénotype dommageable n’ait été observé sur les lignées existantes, l'établissement des nouvelles lignées pourrait entrainer une baisse transitoire des performances reproductives chez les mâles.
Devenir
Pour la collecte de tissus, les procédures s’effectuent post-mortem. Pour le maintien de la colonie, le sort prévu est l'euthanasie pour les génotypes non-utilisés ainsi que pour les animaux au-delà de 12 mois. Ceci permet de minimiser le stress dû à l'élevage et d'éviter les complications de santé pouvant apparaître avec l’âge. Les 120 femelles soumises à la sur-ovulation sont euthanasiées entre 12h et 4 jours suivant les injections.
Remplacement
L’expression des gènes étudiés est limitée aux cellules reproductrices, y compris chez l’Homme. Actuellement, il n’existe pas de modèle de culture cellulaire de remplacement. Les effets de ces gènes sont mesurables sur l’embryon avant l’implantation, le recours à un mammifère placentaire est donc nécessaire. La souris présente une bonne traçabilité génétique et il existe des approches génétiques déjà établies. Date de recherche de méthodes de remplacement sur base de données : 01/01/2024.
Réduction
La stratégie expérimentale choisie afin de réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet est la suivante : 1) Minimisation de l’élevage par des schémas de croisements qui permettent de générer une partie des animaux contrôles et tests dans la même portée. Les estimations du nombre de cages de croisement prennent aussi en compte une portée moyenne de 8 animaux tous les mois 2) La stratégie expérimentale de collecte de tissus post-mortem permet de prélever plusieurs tissus sur un même individu. Les estimations prennent aussi en compte le fait que plusieurs types de mesures (protéines, ARN, ADN…) peuvent être effectués sur 3 à 5 échantillons de tissus (testicules, épididymes, foie…), ce qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour ce projet.
Raffinement
La stratégie mise en œuvre pour réduire l’angoisse et la douleur induite est la suivante : 1) Utilisation du fond génétique qui présente peu de maladies spontanées et est bien adapté à l’élevage en laboratoire dans un contexte de recherche scientifique. Toutes les souris (maintenance et groupes expérimentaux) seront maintenues dans des cages avec milieu enrichi (matériel de nidification et tunnel de carton). Les lignées mutantes pour les histones étudiées présentent une légère diminution de fertilité, mais pas d’autres phénotypes dommageables à la survie et au confort des animaux en laboratoire. Ces animaux sont suivis de manière journalière. Les phénotypes des animaux produits dans ce projet n’ont pas encore été caractérisés et leur bien-être suivra une procédure d’évaluation accrue (grille d’évaluation sur deux générations) afin de déterminer s’ils présentent un phénotype dommageable. 2) Tous les tests s’effectuent post-mortem sur tissus, cellules ou embryons pré-implantatoires. 3) Afin de minimiser l’angoisse, l’ensemble de nos animaux sera surveillé chaque jour pour détecter tout signe de mal-être. Quatre indicateurs sont utilisés : - Posture et activité exploratoire dans la cage - Comportement naturel - Réponse à des stimuli extérieurs - Anomalie liée à la mise-bas chez les femelles gestantes. Tout individu présentant un signe de mal-être lors de ces surveillances fera l’objet d’une surveillance renforcée pendant 48h (voir point suivant). 4) La surveillance renforcée consiste en un suivi par grille d’évaluation du bien-être pendant 48h. Pour chacun de ces indicateurs, un score est déterminé par vérification visuelle et par manipulation. Un animal présentant un score entre 5 et 9 sera pesé. L’animal sera euthanasié si aucune amélioration du score n’est observée ou s’il présente une perte de poids supérieure à 20 % après 48h. Toute femelle présentant des signes de mise-bas anormale sera immédiatement euthanasiée.
Choix des espèces
Le choix d'utiliser la souris répond aux critères de fertilité́ et de temps de génération requis pour une étude expérimentale en laboratoire. De plus, ces études nécessitent un modèle placentaire possédant tout le complément de gènes présents chez l’homme. Enfin, nous disposons d’outils génétiques chez la souris qui ne sont pas disponibles pour d’autres organismes modèles Pour les croisements ainsi que la collecte de tissus reproductifs matures post-mortem des animaux à maturité sexuelle sont utilisés – c’est à dire après leur sevrage et jusqu'à un an d’âge. Pour les études préimplantatoires, des stades de développement précédant et suivant l’activation du génome zygotique de 0,5 à 4,5 jours post-fécondation sont étudiés.
Evaluation de candidats médicaments dans le modèle d’asthme chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
Sensibilisés par injection une fois par semaine pendant trois semaines, puis enfermés dans des chambres de plexiglas pour respirer le même réactif en aérosol trente minutes, trois fois par semaine pendant trois semaines, 1 200 rats développent un asthme expérimental. Ces procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré à sévère et tous les rats sont tués à l'issue, soumis à un prélèvement terminal de sang, d'organes ou de liquide bronchoalvéolaire. Le porteur décrit des crises de gêne respiratoire, une respiration sifflante et une hyperréactivité bronchique pouvant aller jusqu'à la détresse respiratoire, et prévoit jusqu'à douze heures d'affilée en chambre de pléthysmographie. Les bénéfices annoncés, des médicaments qui amélioreraient la qualité de vie des patients asthmatiques, restent au stade de l'évaluation préclinique, quand l'atteinte respiratoire infligée aux rats, elle, est immédiate.
Objectifs
Affectant des millions de personnes à travers le monde, l'asthme est une affection pulmonaire chronique qui touche les personnes de tous les âges. Elle se manifeste par des crises, caractérisées par des épisodes de gêne respiratoire (essoufflement), de respiration sifflante, de toux sèche ou de sensation d’oppression dans la poitrine. Les crises d'asthme peuvent durer de plusieurs minutes à quelques heures. Entre deux crises, la respiration redevient normale. L’asthme est caractérisé par trois composantes : l’inflammation des bronches, leur hyperréactivité et leur remodelage. Ces trois phénomènes sont intimement liés et s’influencent entre eux. L’inflammation bronchique est liée à l’activité anormale de différentes cellules de l’immunité au niveau du tissu bronchique. Lorsqu’elles sont agressées par une substance chimique ou microbiologique, les cellules de la paroi des bronches (cellules épithéliales bronchiques) déclenchent une réaction de défense qui fait intervenir plusieurs molécules pro-inflammatoires de la famille des cytokines qui vont déclencher différentes cascades réactionnelles locales. L’hyperréactivité bronchique se traduit par la contraction exagérée du muscle lisse des bronches et au rétrécissement des voies respiratoires au contact d’une substance déclenchante. Le remodelage bronchique correspond à l’accumulation d’anomalies au niveau des cellules qui structurent les voies aériennes (hypertrophie, hyperplasie, fibrose). Ce phénomène aboutit à l’épaississement de la paroi des bronches. L’asthme altère considérablement la qualité de vie des patients. Il entraîne des insomnies, une baisse d’activité et un absentéisme à l’école ou au travail. Un asthme mal contrôlé peut conduire à une altération de la fonction respiratoire. En effet, certains patients répondent mal ou pas du tout aux thérapies ciblées et il est donc nécessaire de développer de nouveaux traitements ou des associations médicamenteuses. Dans ce contexte, le présent projet consiste à évaluer l’efficacité de candidats médicaments dans un modèle d’asthme chez le rat.
Bénéfices attendus
Les bénéfices recherchés sont le développement de médicaments destinés à améliorer la qualité de vie des patients asthmatiques. Les modèles précliniques appropriés à l'évaluation de l’asthme sont nécessaires pour comprendre les mécanismes sous-jacents entraînant le développement de la réaction asthmatique chez l’homme. Ces modèles sont nécessaires à la découverte et la mise sur le marché de nouveaux médicaments sûrs et efficaces pour traiter les problématiques de la réaction asthmatique (diminution des symptômes, de la réaction inflammatoire,…) quels qu'en soient l'origine et/ou le mécanisme d'action.
Procédures
Les rats sont sensibilisés une fois par semaine pendant 3 semaines minimum par injection d'un réactif (durée d'environ quelques secondes). Quelques jours après la phase de sensibilisation, les animaux sont placés dans des chambres en plexiglas et reçoivent par aérosol le même réactif (durée : 30 minutes, 3 fois/semaine, pendant 3 semaines). Le traitement avec les candidats médicaments est initié en parallèle des aérosols (administration pendant quelques secondes) de manière chronique (durée maximum de 3 semaines selon le composé, soit 21 administrations). Quelques jours après les challenges, la fonction respiratoire des animaux est évaluée dans des chambres de plethysmographie (maximum 12 heures, incluant la période de stabilisation). A la fin de la procédure, ces animaux seront soumis à des prélèvements de sang, ou de liquide bronchoalvéolaire sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Dans ce projet, l’induction de la pathologie entraine une atteinte de la fonction respiratoire, une réaction inflammatoire et un remodelage pulmonaire. Parmi les symptômes les plus couramment observés dans ce modèle d’asthme, nous retrouvons des crises caractérisées par des épisodes de gêne respiratoire (essoufflement), de respiration sifflante, d’hyperactivité bronchique pouvant aller jusqu’à la détresse respiratoire (dans des cas extrêmes). De plus, un stress lié aux prélèvements et aux administrations répétés peut être ressenti par les animaux.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés en fin de procédure car ils sont soumis à un prélèvement terminal (sang, organes ou liquide bronchoalvéolaire).
Remplacement
De nombreux tests ex vivo (in vitro et in silico) sont réalisés avant les tests sur l'animal. Ceux-ci constituent un point de départ permettant à la fois de sélectionner uniquement les molécules présentant une certaine efficacité, innocuité et d’explorer les détails relatifs au mécanisme d’action de ces dernières. Bien que ces tests permettent une réduction significative du nombre de substances à tester in vivo (et donc du nombre d’animaux), il ne représente pas la complexité du système immunitaire. Les tests/modèles que nous souhaitons développer et valider dans ce projet ne peuvent donc pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur la réaction inflammatoire (respiration sifflante, hyperactivité bronchique, sécrétion de mucus, mesure des taux de cytokines, immunoglobulines...).
Réduction
Les mesures de réduction s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister à utiliser le plus petit nombre d’animaux possible pour chaque étude permettant d'obtenir des données suffisantes pour interpréter les résultats de façon correcte et d’éviter ainsi une répétition inutile des études. Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude sera optimisé de façon à intégrer dans une même expérience la comparaison par rapport à un groupe contrôle négatif et éventuellement à un contrôle positif si cela s'avère pertinent. Dans le contexte d’études cherchant à réverser/diminuer la réaction inflammatoire, nous pouvons observer une variabilité inter-individuelle de réponse pouvant être liée à l’agent allergisant utilisé et à la substance d’essai évaluée. Compte-tenu de la variabilité de réponse connue d'un individu à un autre, 8 rats minimum sont généralement nécessaires pour atteindre une sensibilité correcte du test. De nombreux critères d’évaluation (scores ou valeurs quantitatives telles que suivi du poids corporel, mesure des paramètres respiratoires, dosages des immunoglobulines, cytokines,…) sont intégrés dans ces études. Par ailleurs, des prélèvements terminaux peuvent être ajoutés en fin de procédure pour éviter une répétition inutile de l'étude.
Raffinement
Les mesures de raffinement s'intégrant à la règle des 3Rs vont consister en un suivi des points limites clairement définis et spécifiques pour chaque procédure, permettant de stopper l'étude et/ou d'euthanasier, de façon précoce, tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids). De plus, les animaux sont suivis par le vétérinaire et manipulés fréquemment par des techniciens préalablement formés et attentifs, prêts à agir lorsque les critères d'interruption prédéfinis sont atteints. Par ailleurs, et au quotidien, un enrichissement complet est fourni aux animaux, celui-ci inclut dans leur hébergement : litière, objets de nidification, objets à ronger, présence de congénères (sauf cas contraire imposé par la procédure). Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire et adapté à la condition des animaux (troubles respiratoires), afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance.
Choix des espèces
Le choix de cette espèce est basé sur la bibliographie scientifique. Les rats répondent bien à une variété d'allergènes couramment utilisés pour induire des modèles d'asthme, tel que l'ovalbumine..., permettant l'étude de différents aspects de la maladie. Il existe une vaste base de publications chez le rat dans la recherche sur l'asthme. Cela permet de comparer les résultats de nouvelles études avec des données antérieures, offrant ainsi une continuité et une cohérence dans la recherche. Principalement rongeurs sevrés, après 4 semaines de développement, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique.
Evaluation d’un élément d’essai dans une étude pré-clinique de pharmacocinétique, de pharmacodynamie ou de toxicité
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 1800
Cochons d'Inde : 120
Lapins : 120
Chiens : 240
Furets : 180
Cochons : 120
Les protocoles suivent ici la commande d'un donneur d'ordre, chaque étude fixant l'espèce, les doses et la durée selon le candidat médicament à enregistrer. 1 800 souris, 1 800 rats, 240 chiens, 180 furets, 120 cobayes, 120 lapins et 120 cochons vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Ils reçoivent des administrations une à trois fois par jour pendant un à 91 jours, subissent jusqu'à huit prélèvements sanguins le premier jour pour les non-rongeurs, et parfois une chirurgie de quinze à soixante minutes pour implanter un cathéter ou une micro-pompe. Les animaux ayant reçu une substance toxique ou atteint les points limites sont tués, les autres réutilisés, et c'est le vétérinaire qui décide si un chien ou un furet peut être replacé, selon le nombre et la sévérité des procédures qu'il a déjà subies.
Objectifs
L’objectif du projet est d’étudier la pharmacocinétique, la bio-distribution ou la toxicité de candidat médicaments. Les résultats de ces études sont indispensables pour la mise sur le marché de nouveaux médicaments et pour la réalisation des autres études précliniques dans de bonnes conditions. En maitrisant la pharmacocinétique, il est possible de choisir des doses efficaces qui ne présentent pas ou le moins possible d’effets délétères sur l’animal. L’intérêt sociétale est majeur puisqu’il s’agit de prérequis réglementaires pour l’enregistrement de nouveaux médicaments.
Bénéfices attendus
Les études de pharmacocinétique et de toxicité permettent de cibler les doses du candidat médicament appliquées dans les études de pharmacologie préclinique, de manière à déterminer les temps de pré-traitement, la durée de vie, les doses présentant le plus d'efficacité et le moins d'effets secondaires... Mais aussi à évaluer leur distribution dans, et/ou leur potentielle toxicité sur différents organes. Ils sont donc nécessaires pour 1/réduire le nombre d'animaux utilisés en expérimentation animale en ciblant au mieux les doses et temps de pré-traitement pour les études d'efficacité par exemple dans des modèles de pathologie, et 2/apporter des données pré-cliniques préalables aux études cliniques et à la mise sur le marché des médicaments.
Procédures
Les animaux sont soumis à des administrations d'éléments d'essai par diverses voies, de manière unique (de l'ordre de 1 à 60 secondes) ou répétée à diverses fréquences (1 à 3 fois par jour, pendant 1 à 91 jours), à l'état vigile ou sous anesthésie générale. A l'administration d'un élément d'essai peuvent s'ajouter des prélèvements de fluides biologiques, de manière unique (de l'ordre de quelques secondes à plusieurs minutes par prélèvement) ou répétée à diverses fréquences (1 à 8 fois par jour, sur une durée de 1 jour à plusieurs mois). Ces prélèvements sont réalisés sur animal vigile ou anesthésié. Chez le rongeur, un maximum de 7 prélèvements sanguins peut être réalisé le 1er jour, 1 ou 2 les jours suivants, puis 1 prélèvement par semaine pendant plusieurs semaines ou mois. Chez le non-rongeur, un maximum de 8 prélèvements sanguins peut être réalisé le 1er jour, 2 les quatre jours suivants, puis 1 prélèvement par semaine pendant plusieurs semaines ou mois. Dans le cas d'administrations répétées ou par perfusion, ou de prélèvements sanguins répétés, d'une chirurgie (implantation de cathéter veineux ou autre dispositif de type micro-pompe ou système d'accès vasculaire, ou prélèvement de tissus d'intérêt) peut être pratiquée sur les animaux, quelques jours avant le début des administrations ou des prélèvements, ou en fin d'étude. Ce type de procédure chirugicale dure entre 15 et 60 minutes par animal.
Impact sur les animaux
Quelques nuisances peuvent être causées par certaines procédures: par exemple, un stress provoqué par les administrations, des prélèvements divers ou à l'isolement (le cas échéant), une potentielle douleur post-opératoire (après chirurgie d'implantation de cathéter veineux ou autre dispositif) ou une gêne causée par le volume occupé par un dispositif implanté en sous-cutané.
Devenir
Pour les 7 procédures décrites dans ce projet, tous les animaux, de toute espèce, soumis à un prélèvement terminal et/ou ayant reçu un élément d'essai toxique (atteinte des points limites) ou une substance dont les effets à long terme sont potentiellement néfastes, sont euthanasiés. Les animaux gardés en vie, et potentiellement réutilisés, sont ceux qui ont reçu un traitement dont les effets à long terme sont connus pour être non-néfastes. La réutilisation des animaux (toute espèce) est soumise à l’approbation du vétérinaire, celle-ci est privilégiée pour contribuer à la réduction du nombre d'animaux utilisés en expérimentation animale. La décision de replacer un chien ou un furet est prise par le vétérinaire, en fonction du nombre et de la sévérité des procédures subies par l'animal, et éventuellement de son age.
Remplacement
Les techniques, décrites et validées dans ce projet, sont utilisées dans divers modèles animaux qui ne peuvent pas être remplacés par des méthodes alternatives car ils impliquent l’observation des effets de substances pharmacologiques sur le comportement, la biologie clinique, le système immunitaire, les paramètres physiologiques, le métabolisme ou l’interaction entre différents organes ou systèmes, ou l'étude vise à évaluer la distribution d'une substance pharmacologique dans l'organisme vivant, dans son intégralité. Selon les espèces, le métabolisme est différent. Selon le stade d’avancement du projet ou selon le type de composé, il peut être nécessaire d’effectuer ces études sur les espèces suivantes : rats, souris, cobayes, lapins, chiens, furets, porcs. Ces techniques nécessitent l’utilisation d'animaux de laboratoire et ne peuvent être efficacement remplacées par des méthodes alternatives.
Réduction
Ce projet s'intègre dans un objectif de Réduction du nombre d'animaux utilisé en expérimentation animale. En effet, il permet de sélectionner dans des groupes réduits, les doses et les temps de pré-traitement les plus efficaces (et d'éliminer les doses sub-efficaces et/ou présentant trop d'effets délétères) avant les études pré-cliniques d'efficacité ou de sécurité, permettant, ainsi, de réduire de manière importante le nombre d'animaux utilisé dans d'autres modèles d'études précliniques (modèle de pathologie, tests comportementaux et/ou physiologiques...). Dans le but de réduire le nombre d’animaux, certains animaux peuvent être réutilisés après accord du vétérinaire. Le nombre d'animaux utilisé pour chaque étude est réduit au strict minimum, de manière à permettre une interprétation correcte et objective des résultats, évitant ainsi une répétition des études. Le nombre d’animaux sera déterminé en fonction des procédures secondaires qui seront ensuite réalisées sur les animaux ou selon les lignes directrices de l’OCDE dans le cas des études de toxicité. Ce projet, d’une durée de 3 ans, couvrirait un maximum de 36 études chez le rat, 18 chez la souris, 6 chez le cobaye, 9 chez le furet, 6 chez le lapin, 12 chez le chien et 6 chez le porc, en considérant qu’une étude correspond à une procédure expérimentale. De plus, la formation du personnel technique permettra de réduire au minimum le nombre d’animaux utilisé (limitation du nombre d’animaux surnuméraires et de l'euthanasie prématurée des animaux).
Raffinement
Dans le cadre du projet, les mesures de raffinement qui s'intègrent dans la règle des 3Rs, vont consister en un suivi des points limites permettant de sacrifier précocement tout animal présentant des signes de douleur, de souffrance ou d'angoisse (incluant une surveillance de l'aspect général, un suivi de poids, l'état d'hydratation, les tremblements, la respiration, etc...), ainsi qu'en une limitation de l'effectif au strict nécessaire. De plus, les animaux sont manipulés fréquemment par des techniciens formés et attentifs et suivis par le vétérinaire. Il est également mis en place un enrichissement complet dans leur hébergement, sous la forme de litière, objet de nidification, objet à ronger ou à mastiquer, présence de congénères. Prises dans leur ensemble, ces mesures tendent à limiter la variabilité des données. Lorsque nécessaire, les animaux sont anesthésiés et analgésiés. Le programme d’anesthésie et d’analgésie est défini par un vétérinaire, afin de réduire au maximum toute douleur ou sensation de souffrance. De la même manière, lorsque les protocoles l’exigent, les chirurgies sont raffinées au maximum, en mettant à disposition des animaux, de l’oxygène ou air ambiant à concentration ajustable, des tapis chauffants, des lampes chauffantes et de soins post-opératoires complets. Enfin, lorsque nécessaire (e.g. en cas de prélèvements sanguins importants), une réhydratation des animaux est prévue.
Choix des espèces
La distribution d'une substance ou ses effets sur la biologie clinique chez l'animal de laboratoire sont prédictifs de ce qui peut se produire en clinique. Par ailleurs, l'innocuité d'une substance ainsi que sa cinétique doivent être évaluées chez une espèce rongeur et une espèce non-rongeur (Réf. ICH M3(R2)). Le choix de l’espèce est propre à chaque étude et justifié par le donneur d’ordre, en fonction de la substance à tester, de son mécanisme d’action, de l’éventuelle disponibilité de données préliminaires issues de tests de pharmacocinétique ou d’innocuité, préalablement réalisés, ce peut être aussi en fonction des similitudes avec l’homme concernant des voies métaboliques précises ou un système physiologique cible. Principalement rongeurs (rats, souris, cobayes) sevrés, âge variant entre 3 semaines et 2 ans, conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique (par exemple, lignes directrices OCDE 420). Ces procédures décrites dans ce projet peuvent être utilisées de façon longitudinale sur des rongeurs depuis l'âge de sevrage jusqu'à l'âge adulte. Lapins, furets, chiens et cochons adultes conformément aux données historiques et à la bibliographie scientifique (par exemple, lignes directrices OCDE 409).
Effets d’une absence de microbiote maternel sur le pic de néoglucogenèse intestinale du nouveau-né
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Réformées de l'élevage, 32 souris femelles vont être utilisées dans des procédures classées en souffrance légère, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent un traitement antibiotique pendant 36 jours, par gavage les trois premiers jours puis dans l'eau de boisson, pour supprimer leur microbiote intestinal, et 28 d'entre elles subissent deux prélèvements de sang à la queue. Le porteur annonce seize portées par condition, d'environ sept souriceaux chacune, dont les organes seront prélevés à huit points de mesure répartis sur les vingt et un premiers jours de vie. Ces souriceaux sont mis à mort sans figurer dans l'effectif déclaré de 32, tandis que les mâles reproducteurs sont réutilisés dans l'établissement.
Objectifs
La forte prévalence de l'obésité et du diabète, en particulier chez les enfants, souligne la nécessité de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement de ces pathologies. L'appétit et la dépense énergétique sont régulés par une région particulière du cerveau. Des études antérieures ont montré qu’une modification de l’environnement maternel de façon délétère (régimes déséquilibrés, stress) modifie le développement de cette région du cerveau et contribue aux maladies métaboliques tout au long de la vie. Le microbiote intestinal constitue une communauté complexe et dynamique de bactéries vivant dans le système digestif. Des changements dans la composition ou la fonction du microbiote intestinal ont été associés au développement de maladies métaboliques. Des données récentes suggèrent que le microbiote intestinal maternel influence le métabolisme, le comportement, le développement du cerveau chez la progéniture. Cependant, il reste à déterminer comment le microbiote maternel exerce ces effets sur la descendance. Le microbiote intestinal exerce ses effets en produisant des acides gras à courtes chaines. Chez l’individu adulte, la production des acides gras à courtes chaines par le microbiote exerce des effets anti-obésité et anti-diabète en activant une fonction de l’intestin : la production intestinale de glucose. De façon intéressante, la production intestinale de glucose double au cours des deux premières semaines de vie chez les rongeurs et nos données préliminaires montrent que cette augmentation spécifiquement dans cette période influence le développement du cerveau et protège des maladies métaboliques. L’objectif de cette étude pilote est d’évaluer si l’absence du microbiote maternel perturbe le pic d’induction de la production intestinale de glucose pendant la période périnatale et contribue à un mauvais développement du cerveau et aux maladies métaboliques.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de déterminer si l’absence de microbiote intestinal maternel (induit par un traitement antibiotique) altère le profil périnatal de la production intestinale de glucose. Ces résultats seront une première étape pour comprendre comment l’absence de microbiote maternel exerce ces effets sur la descendance. Si notre hypothèse est vérifiée, un projet plus important nous permettra d’étudier si l’induction constitutive de la production intestinale de glucose peut restaurer les défauts induits par l’altération du microbiote intestinal maternel. Dans l’affirmative, ces résultats offrent des perspectives intéressantes pour améliorer l’alimentation des nourrissons de manière à induire la production intestinale de glucose périnatale.
Procédures
Les 32 femelles suivront un traitement antibiotique de 36 jours par gavage les trois premiers jours (30 secondes) puis via une administration dans l’eau de boisson. Un groupe de 2 femelles subiront un prélèvement de sang à la queue (30 secondes) et 28 femelles subiront deux prélèvement de sang (30 secondes chacun).
Impact sur les animaux
Le traitement aux antibiotiques n’entraine pas de modification du comportement maternel, de perte de poids et de mal-être. Le gavage journalier pourrait présenter une légère irritation de l’œsophage. Les prélèvements sanguins peuvent engendrer une légère douleur de très courte durée au moment de la piqure.
Devenir
Les femelles et les souriceaux issus des croisements seront mises à mort pour prélèvements d’organes. Les mâles utilisés pour la reproduction seront réutilisés dans l’EU.
Remplacement
Cette étude ne peut pas être réalisée sur des cellules ou organoïdes car elle concerne l’influence de l’environnement maternel sur un paramètre d’un descendant. Les connaissances actuelles ne permettent pas de reproduire la complexité de l’environnement maternel sur un modèle cellulaire représentant l’organe du descendant.
Réduction
Le nombre de descendants nécessaires pour observer une variation de la production intestinale de glucose est le paramètre pris en compte pour calculer le nombre d’individus nécessaires. Ce nombre a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des résultats d’études précédentes : soit un maximum de 14 par point de mesure. L’analyse précise de la production intestinale de glucose nécessite d’étudier 8 points de mesure dans les 21 premiers jours. Le nombre de souriceaux par portée est de 7 descendants en moyenne. Il faut donc 2 portées par point de mesure soit 16 portées par condition. Dans cette étude, 2 conditions seront étudiées : mères traitées aux antibiotiques - mères non traitées. Condition traitement : 16 portées = 16 femelles Condition non-traitée : 16 portées = 16 femelles TOTAL 32 femelles Les femelles et les mâles utilisés pour l’obtention des portées sont des souris de réforme d’élevage.
Raffinement
Les femelles du protocole seront acclimatées à l’animalerie avant la mise en place de la procédure. Pour favoriser l’accouplement, le soir précédent l’accouplement, de la litière des mâles sera introduite dans la cage des femelles et vice et versa. Les portées seront équilibrées à 7 bébés par portées en réalisant des adoptions de souriceaux issus de grandes portées par des mères de petites portées. Pour limiter le stress de séparation des nouveau-nés de leur mère en cas d’adoption, l’expérimentateur se frottera les mains avec la litière et les souriceaux à adopter seront déplacés avec de la litière et une partie du nid. Afin d’induire un renforcement positif, la sonde de gavage sera préalablement trempée dans une solution d’eau sucrée pour favoriser la déglutition de l’animal. Pour limiter l’irritation, le gavage sera réalisé avec une sonde de gavage souple. Les comportements anormaux qui doivent nous alerter sont : une souris prostrée, ayant les yeux fermés, n’ayant pas fait sa toilette, ayant une perte de poids suggérant une perte de la portée, une impossibilité à mettre bas. En cas d’observation de ces comportements anormaux et si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, l’animal en question est écarté du protocole et mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Le rôle de la production endogène de glucose par l’intestin pendant la période néonatale a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Nos études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Nous étudions l’importance du microbiote intestinal maternel sur la descendance donc cette étude ne concerne que des femelles adultes âgées de 12 semaines.
Mise en place de modèles tumoraux sous-cutanés dans le cadre d’un atelier d’apprentisage de techniques d’échographie
- Formation professionnelle
Des cellules tumorales sont injectées sous la peau de 60 souris, dont une partie immunodéficiente, dans des procédures classées en souffrance légère. Elles sont ensuite envoyées chez un partenaire qui organise un atelier d'apprentissage de l'échographie, à raison d'un animal par apprenant. Le porteur affirme qu'aucun point limite ne sera atteint et qu'il maîtrise parfaitement la croissance du modèle tumoral. Ce que deviennent ces souris une fois l'atelier terminé n'est pas précisé, aucun animal gardé vivant n'étant par ailleurs déclaré à l'issue du projet.
Objectifs
Dans ce projet, nous allons mettre en place un modèle tumoral sous-cutané afin de fournir des animaux porteurs de tumeurs à un partenaire qui organise un atelier de formation à l'échographie de modèles tumoraux. L'échographie est une technique très intéressante dans l'évaluation de la croissance tumorale en recherche préclinique, notamment sous-cutanée. En effet, elle permet une approche longitudinale moyennant uniquement une anesthésie gazeuse. Malheureusement, cette technique requiert un apprentissage de l'acquisition et de la lecture des signaux échographiques pour obtenir une analyse qui soit pertinente et en phase avec la réalité physiologique de la tumeur. Ce projet vise donc à permettre à des chercheurs de se former sur le modèle Souris afin d'améliorer les expériences réalisées dans le cadre de la recherche de nouveaux médicaments contre le cancer, chez l'Homme.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice de ce projet est de permettre la mise en place d'un atelier d'apprentissage de la technique d'échographie en oncologie sur le modèle souris. Cette compétence est rare et pourtant elle apporte un énorme bénéfice dans l'analyse longitudinale des projets de recherche fondamentale et appliquée dans le domaine de l'oncologie. Nous maitrisons parfaitement le modèle tumoral utilisé et nous pouvons nous assurer de la bonne mise en place de modèles tumoraux et notre partenaire est une référence dans l'analyse échographique et organise cet atelier pour former des chercheurs en oncologie utilisant le modèle Rongeur.
Procédures
Les animaux subiront une injection sous-cutanée qui dure quelques secondes. Si besoin, une anesthésie gazeuse sera pratiquée à ce moment, dont l'effet peut s'étendre sur quelques minutes.
Impact sur les animaux
Sur la durée du projet, nous n'attendons aucune nuisance sur ces animaux, en dehors du stress lié à l'injection. Par ailleurs, nous greffons des cellules tumorales que nous connaissons parfaitement et nous nous sommes assurés que la croissance de ces cellules n'atteigne jamais durant le projet un stade entraînant un risque pour l'animal.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux seront envoyés chez notre partenaire pour la réalisation d'échographies.
Remplacement
Ce projet vise à développer des compétences en analyse par échographie de modèles tumoraux pour améliorer la recherche en oncologie. Seul le modèle animal permet cet usage et la souris est le modèle de référence pour ces études
Réduction
Nous prévoyons d'injecter 10 animaux dans ce protocole afin de permettre un atelier de formation avec 1 animal par apprenant. Le but du projet vise à réduire le nombre d'animaux employés en recherche préclinique en oncologie par la propagation de la compétence d'analyse échographique. En effet, l'approche longitudinale remplace les mises à morts à des stades étagés et permet donc une réduction globale dans ces projets. Amendement: Nous prévoyons pour les 5 sessions supplémentaires de formation de fournir 50 animaux, donc d'injecter 5 lots de 10 souris avec des cellules tumorales.
Raffinement
Les animaux seront injectés par voie sous-cutanée, soit un geste de quelques secondes. Ils seront surveillés quotidiennement et pesés 3 fois par semaine pour s'assurer de leur bien-être. Nous maitrisons parfaitement le modèle tumoral injecté et nous connaissons notamment sa croissance et les éventuelles conséquences sur la santé de l'animal. Nous pouvons affirmer qu'aucun point limite ne sera atteint pour ces animaux en lien avec le modèle tumoral, que ce soit en lien avec la taille de la tumeur ou son état (nécrose par exemple). Amendement: Pour les souris immunodéficientes, une surveillance quotidienne de l'état des animaux sera réalisée, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. De plus nous connaissons et maitrisons parfaitement les modèles tumoraux crées à partir des lignées tumorales injectées.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus utilisée en recherche préclinique en oncologie Nous grefferons des animaux agés de 8 semaines pour lesquels nous avons la meilleure connaissance de la croissance tumorale.
Identité moléculaire des synapses des cellules de Purkinje en développement et adultes
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Anesthésiés puis injectés dans le crâne entre zéro et sept jours de vie, les souriceaux sont remis auprès de leur mère roulés dans la sciure souillée, pour limiter le risque qu'elle les rejette. 1 696 souris, souriceaux et adultes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, l'injection intracérébrale durant vingt à trente minutes selon l'âge. Le porteur indique que la manipulation des souriceaux amène parfois les femelles à rejeter leurs petits, qui sont en général mangés par leur mère sans qu'aucune intervention soit possible. Toutes les souris injectées sont tuées en fin de procédure pour l'électrophysiologie, la biochimie ou l'histologie, et 70 mères sont gardées vivantes pour de nouveaux accouplements.
Objectifs
Dans le système olivo-cérébelleux, la cellule de Purkinje du cervelet reçoit deux types différents de connexions excitatrices. L’activité neuronale régule la formation et le maintien d'un seul de ces deux types de connexions, ce qui fait du réseau olivo-cérébelleux un système d’étude idéal pour analyser les mécanismes moléculaires dépendants de l’activité menant à l’établissement de réseaux neuronaux fonctionnels. Nous proposons d’étudier le rôle de l’activité neuronale dans l’établissement de ce réseau ainsi que dans la régulation des facteurs moléculaires contrôlant sa mise en place.
Bénéfices attendus
Les maladies mentales et neurologiques constituent un réel problème de santé publique puisqu’elles sont la première cause d’invalidité dans le monde. Parmi ces maladies, la schizophrénie et l'autisme touchent chacune environ 1% de la population. Les symptômes associés à ces maladies sont très variés et apparaissent dans l'enfance pour l'autisme, et à la fin de l’adolescence ou chez le jeune adulte pour la schizophrénie. Les patients présentent par exemple des déficits cognitifs (concentration, attention, mémoire de travail…) qui apparaissent dans l’enfance et auraient pour origine des défauts neurodéveloppementaux. Les traitements, qui restent pour l’heure purement symptomatiques, sont la plupart du temps peu efficaces. Il est donc crucial de comprendre l’origine de ces maladies, pour pouvoir ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques. Les synapses, connexions permettant aux neurones de communiquer entre eux, sont indispensables au bon fonctionnement du cerveau. Aujourd’hui, il est très bien établi que des déficits de connectivité neuronale sont présents dans le cortex chez des patients atteints d'autisme ou de schizophrénie. En revanche, en dépit de la présence évidente de déficits cérébelleux chez certains patients, l’implication du cervelet dans ces pathologies reste très peu étudiée. La présente étude nous permettra d’identifier des déficits synaptiques dans le réseau olivo-cérébelleux, suite à la modulation de l’activité neuronale au cours du développement du cervelet et nous aidera à mettre en évidence les protéines synaptiques potentiellement modulées par l’activité neuronale qui pourraient provoquer l’apparition de certaines maladies du cerveau lorsqu’elles sont dérégulées.
Procédures
Injection transcranienne de 0 à 2 jours ou intracérébrale de 3 à 7 jours sur souriceau anesthésié. La durée totale de l'injection est de 20 min. Injection intracérébrale sur souris adulte anesthésiée. La durée totale de l'injection est d'environ 30 min.
Impact sur les animaux
La manipulation des souriceaux peut parfois amener les femelles à rejeter leurs petits qui sont en général mangés par leur mère sans qu'aucune intervention ne soit possible. D'éventuelles douleurs post-opératoires peuvent apparaitre au niveau de la petite incision de la peau réalisée au niveau du crâne. Aucun autre effet indésirable n’a été observé sur ces animaux dans notre précédent projet.
Devenir
Pour les études d’électrophysiologie, de biochimie ou d'histologie, les 1696 animaux injectés (souriceaux et adultes) seront euthanasiés en fin de procédures.
Remplacement
Il est important d’étudier le réseau olivo-cérébelleux dans le contexte du cerveau puisque le cervelet est connecté à d’autres régions du cerveau dont notamment le tronc cérébral mais aussi le cortex qui est déjà connu pour son implication, par exemple, dans l'autisme ou la schizophrénie. Une telle étude nécessite donc d’avoir recourt à des animaux vivants. En effet, il ne serait pas possible d'étudier la connectivité entre différentes régions du cerveau in vitro en culture cellulaire ni même dans des « assembloïdes » associant des organoïdes simulant différentes régions cérébrales grâce à la diversité des cellules qui les composent, les activités cellulaires observées dans ces cultures ou organoïdes cérébraux ne pouvant être assimilées aux processus cognitifs, sensoriels ou moteurs propres au cerveau. Des études in silico sont possibles lorsque l'on étudie des molécules dont les propriétés sont bien décrites dans la littérature scientifique mais ne sont pas possibles dans notre étude qui concerne de nouvelles molécules dont les rôles et mécanismes d'action sont pour l'heure inconnus.
Réduction
Le projet est conçu pour limiter le nombre de souris au minimum dans la limite de ce qui est permis pour obtenir des résultats statistiquement et scientifiquement valides en prenant en compte la nécessité d’avoir plusieurs échantillons et de reproduire les résultats de manière indépendante pour éviter les différences dues à la variabilité biologique (sexe, caractéristiques génétiques…), à la variabilité environnementale (différence liée à la vie avec la mère). Après sevrage des souriceaux, les mères peuvent continuer à être utilisées pour de nouveaux accouplements dans notre animalerie.
Raffinement
Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les méthodes utilisées sont les plus appropriées pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Notamment, des compléments environnementaux (dômes en carton, cotons, baguettes en bois) sont ajoutés afin de permettre à la femelle de créer un meilleur nid, de diminuer tout stress éventuel et d'user ses dents. Lors des injections, les souriceaux sont séparés de la mère pendant maximum 1 heure afin de minimiser le stress de la mère et des souriceaux et les souriceaux sont réchauffés sur un tapis chauffant pour éviter l'hypothermie. Les cages ne sont pas changées pendant la période d’injection pour conserver au maximum les odeurs familières et rouler les souriceaux dans la sciure souillée au moment de les remettre avec leur mère afin d’éviter le rejet des souriceaux par la mère. Les animaux sont surveillés quotidiennement jusqu’à leur euthanasie. Lorsque les souris sont en âge de se nourrir seules, de la poudre de croquette humidifiée est ajoutée dans la cage pour favoriser le nourrissage après l'injection. Les souris reçoivent également une injection intrapéritonéale d'analgésique au début de l'anesthésie pour prévenir toute douleur post-opératoire. Nous utilisons une grille de suivi des animaux, les points limites sont mis en place pour éviter toute douleurs ou mal être des animaux.
Choix des espèces
Les souris sont devenues des modèles de choix pour l’étude des mécanismes moléculaires régulant les grandes fonctions biologiques. En effet, elles permettent l’analyse in vivo de ces mécanismes et des conséquences de leurs perturbations à différents niveaux : comportemental, physiologique et moléculaire. Elles permettent également de créer des modèles d’étude des pathologies humaines. De plus, le court cycle de reproduction chez la souris et sa petite taille permettent de maintenir ces animaux relativement facilement, tout en gardant une espèce assez proche de l’homme en terme de développement. Notre projet concerne non seulement l’étude du développement du système olivo-cérébelleux, qui se déroule principalement après la naissance et nécessite donc de travailler chez le nouveau-né, mais aussi l’étude de son maintien chez l’adulte. Nous réaliserons les injections stéréotaxiques chez le souriceau agé de 0 à 7 jours, moment de la formation des synapses d‘intérêt, ou chez l’adulte de 2 mois, moment où le réseau est mature. Les souris seront ensuite euthanasiées environ 3 semaines après injection, soit environ 30 jours après leur naissance pour les souriceaux (stades auquels la connectivité du réseau est finalisée) et avant leur 3 mois pour les adultes. En effet, 3 semaines sont nécessaires et suffisantes au bon fonctionnement de nos outils moléculaires et à la production d’effets morphologiques ou fonctionnels quantifiables sur les synapses.
Etude de l’interaction entre P53 et Hif1a dans le développement de lésions précancéreuses prostatiques.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
220 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent pendant cinq jours des injections abdominales destinées à faire apparaître des lésions précancéreuses de la prostate, 40 d'entre elles subissent ensuite deux semaines d'injections quotidiennes d'une molécule, et 120 sont castrées chirurgicalement sous anesthésie, une opération de vingt minutes suivie d'un mois de surveillance. Les prostates sont prélevées après la mise à mort. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la cinétique de la transition cancéreuse ni la complexité cellulaire en jeu, ce qui rend selon lui "nécessaire" le recours à l'animal.
Objectifs
Le cancer de la prostate est la 3ème cause de mortalité par cancer chez l'homme. Dès lors qu'il est invasif, il conduit inévitablément au décès du patient par échappement aux traitements. Notre laboratoire s'intéresse aux mécanismes de progréssion des lésions précancéreuses indolores et benignes vers les tumeurs invasives et agressives. Nous avons auparavant identifié un facteur moléculaire qui promeut la plasticité de cellules épithéliales de lésions précancéreuses prostatiques en les protégeant contre la mort cellulaire. En parallèle, nous avons démontré le rôle protecteur d'une autre protéine contre la plasticité de ces cellules. Par ailleurs, les intéractions entre ces deux facteurs ont été décrites dans les systèmes cellulaires dans la littérature et indiquent que les deux facteurs pourraient intéragir pour contrôler l'agressivité des cellules cancéreuses, mais aucune étude in vivo n'a été conduite dans le cas du cancer de la prostate. Dans ce projet, nous voudrions évaluer l'impact de l'inhibition simultanée de ces deux facteurs.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les intéractions entre les facteurs clefs contrôlant la survie, la sénescence et éventuellement l'agressivité des cellules précancéreuses prostatiques, ainsi que leur résistance aux traitements actuels par hormonothérapie. La compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la tumorigénèse ouvre des perspectives thérapeutiques et diagnostiques et ainsi, une meilleure prise en charge des patients.
Procédures
Tous les animaux de ce projet (220) seront sujets à des traitements par des injections au niveau de l'abdomen pendant 5 jours pour induire l'apparition de lésions précancéreuses prostatiques. Cette procédure prend 10 secondes comprenant la préhension de la souris et l'injection en elle-même. Une partie d'animaux sera soumise à un traitement pharmacologique (40) soit avec la molécule active, soit avec son adjuvant. Ces solutions seront également administrées par des injections au niveau de l'abdomen, le traitement durera deux semaines avec les injections quotidiennes. La procédure prendra 10 secondes. Une partie d'animaux subira une intervention chirurgicale (120) - castration, sous une anesthésie accompagnée d'une analgésie efficace. La durée de la chirurgie est estimée à environ 20 minutes par animal, et sera surveillée pendant un mois après chirurgie.
Impact sur les animaux
Les injections répétitives peuvent induire l'irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d'injection. Les lésions précancéreuses restent indolores jusqu'à 5 mois après injection du premier composé, nous ne nous attendons donc pas à une agressivité et donc une douleur. Nous ne nous attendons pas à des effets indésirables suite au second traitement, car le composé a été décrit comme bien toléré dans la littérature et a été utilisé pour des traitements plus longs que ceux prévus dans notre étude. Des effets indésirables liés à l'intervention chirurgicalex sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie post-opératoire systématique. Une infection post-opératoire peut survenir dans de très rares cas.
Devenir
Une fois les procédures terminées, les prostates des animaux seront prélevées pour les analyses ultérieures.
Remplacement
Aucun modèle cellulaire ne récapitule la cinétique de la transition cancéreuse ni la complexité cellulaire impliquée dans l'évolution des lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences dans les modèles animaux pour comprendre ce phénomène et en disséquer les méchanismes moléculaires.
Réduction
Etant donné la variablité inter-individuelle observée dans nos études précédentes, nous avons estimé par une approche statistique que 10 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet de traitement. Ainsi, nous avons prévu les groupes de souris de sorte à avoir 10 souris par analyse effectué pour le groupe expérimental donné. Nous allons profiter des données obtenues précédemment dans le laboratoire sur d'autres modèles murins pour effectuer les comparaisons et reduire le nombre de nouvelles souris utilisées. Amendement: Pour le groupe d'animaux qui subiront une chirurgie, cette intervention peut générer plus de variabilité entre les animaux, nous avons donc estimé que 15 souris par lot étaient suffisantes afin d'observer un effet entre les groupes comparés.
Raffinement
Tout le long des traitements par injections intra-péritonéales, la souris sera surveillée afin de détecter les irritations ou l'inflammation du site d'injection. De plus, les injections seront réalisées en altérnant les côtés d'injection. Les souris seront surveillées quotidiennement, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Elles seront également pésées quotidiennement pendant les traitements. Tout animal en souffrance sans possibilité de soulagement sera sorti de l'étude. Les animaux seront surveillés quotidiennement par le personnel de l'animalerie et/ou les chercheurs. Un enrichissement sera ajouté systématiquement dans les cages. Amendement: Les souris subiront une anesthésie générale et recevront des médicaments antalgiques afin de prévenir l'apparition de douleurs. Elles seront surveillées de manière très rapprochée durant les jours qui suivront la chirurgie. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables.
Choix des espèces
Nos modèles de souris récapitulent de manière fidèle l'apparition et l'évolution des lésions précancéreuses prostatiques chez l'homme. Etant donné que le but de l'étude est d'évaluer l'effet d'un traitement et que le microenvironnement tumoral joue le rôle clé dans l'évolution des lésions, nous sommes dans l'impossibilité d'utiliser les systèmes cellulaires qui ne récapitulent pas la complexité d'un tissu. Seuls les souris mâles adultes seront utilisés pour ce projet car l'induction de lésions précancéreuses doit se faire sur des prostates matures et donc après la puberté.
Etude de la toxicité et efficacité de la radiothérapie et de la radiorésistance dans les tumeurs cérébrales pédiatriques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
Jusqu'à quinze séances de tests comportementaux par semaine et cinq irradiations du crâne par expérience : 9 143 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des cellules ou des fragments de tumeurs cérébrales pédiatriques leur sont greffés sous la peau ou injectés directement dans le cerveau sous anesthésie, avec un suivi par imagerie chaque semaine et des mesures de tumeur au pied à coulisse. Le porteur décrit des tests portant sur la capacité d'apprentissage et la mémoire spatiale, sans préciser lesquels sont employés. Il justifie l'emploi de souriceaux de dix jours par le fait que leur cerveau est alors en plein développement, comme celui des jeunes enfants atteints des cancers étudiés.
Objectifs
Les cancers sont la seconde cause de mortalité chez les enfants âgés de 1 à 15 ans dans les pays industrialisés. Parmi eux, les cancers cérébraux sont la deuxième cause de cancers pédiatriques et la cause majeure de mortalité liée au cancer. La radiothérapie est nécessaire et souvent curative pour traiter les tumeurs cérébrales pédiatriques. Cependant, elle est associée à une forte toxicité sur le cerveau en développement entraînant des effets secondaires dramatiques chez les enfants (défauts neurocognitifs sévères, etc). Chez certains patients, la radiothérapie échoue et des récidives tumorales apparaissent suggérant une forme de radiorésistance de ces tumeurs. Chez les très jeunes enfants, le médulloblastome (MB) et les tumeurs rhabdoïdes et tératoïdes atypiques (AT/RT) sont parmi les cancers cérébraux les plus agressifs. En outre, ils sont souvent associés à une rechute et ce malgré d’intensifs traitements classiques associant chirurgie, chimiothérapie et radiothérapie. Ce projet a pour but d’améliorer les connaissances scientifiques en permettant de mieux comprendre les mécanismes de radiorésistance et de toxicité sur le tissu normal. L’objectif est d’identifier de nouvelles cibles ou modalités thérapeutiques afin d’augmenter l’efficacité de la radiothérapie et de diminuer ses effets secondaires indésirables. De plus, l’étude de l’infiltrat des cellules immunitaire c’est-à-dire l’accumulation de cellules du système immunitaire dans les tumeurs permettra d’identifier les meilleurs traitements d’immunothérapie à combiner à la radiothérapie pour améliorer le contrôle de la tumeur.
Bénéfices attendus
L’étude de l’impact de l’irradiation sur la réponse tumorale dans 2 types de cancer pédiatrique permettra de mieux comprendre les mécanismes associés à la rechute et de diminuer les effets secondaires indésirables. Ce projet a pour but d’identifier de nouvelles modalités thérapeutiques telles que la combinaison de traitements d’irradiation avec de l’immunothérapie ou un traitement par thérapie ciblée. La finalité est donc d’améliorer le traitement de ces cancers tout en diminuant les effets délétères. Les bénéfices directs attendus sont de deux ordres, l'un cognitif pour une meilleure compréhension des mécanismes de résistance et de toxicité et le second, d’ordre sociétal en santé humaine avec le potentiel développement de nouvelles thérapies plus efficaces pour soigner des patients atteints de cancers pédiatriques. Les effets indirects attendus en réduisant les effets secondaires indésirables pourront également avoir un effet sociétal en diminuant les handicaps associés et permettant une meilleure intégration des patients dans la société, mais aussi avoir un impact économique en réduisant la nécessité de soins liés aux effets secondaires. La bonne connaissance de nos modèles nous garantira une qualité au niveau de nos expériences ce qui contribuera à l’enrichissement des connaissances à travers la publication de nos résultats dans des journaux scientifiques.
Procédures
Des fragments de tumeurs seront placés soit en sous-cutanée soit en interscapulaire sous anesthésie gazeuse (1 fois par expérience/ 10 minutes/ souris), Des cellules tumorales seront injectées aux animaux vigiles (1 fois au cours de l’expérience/ 2 minutes/souris) ou des fragments de tumeurs seront greffés aux animaux sous anesthésie (1 fois par expérience/ 10 minutes/souris), Les tumeurs de ces animaux seront ensuite irradiées (soit 3 fois/expérience soit 5 fois/expérience, compter entre 2 et 10 minutes/irradiation/animal). Les animaux seront ensuite suivis, et les tumeurs mesurées à l’aide d’un pied à coulisse (1 à 2 fois par semaine/ 1 minutes/souris). Les animaux vigiles recevront un ou plusieurs traitements soit par injection intrapéritonéale, soit par voie orale. (Environ 1 minutes/souris). Des cellules tumorales seront injectées dans le cerveau sous anesthésie gazeuse (1 fois au cours de l’expérience/ 10 minutes/souris) puis suivi à l’imagerie sous anesthésie (1 fois par semaine/ environ 20 minutes/souris). Le cerveau de ces animaux sera ensuite irradié en préservant les bulbes olfoactifs et la gorge (soit 3 fois/expérience soit 5 fois/expérience, compter entre 2 et 10 minutes/irradiation/animal) – acte réalisé sous anesthésie). Afin d'évaluer la capacité d'apprentissage et la mémoire spatiale de ces animaux, des tests de comportement seront réalisés avec au maximum 15 séances/semaines (chaque séance ayant une durée de moins de 10 minutes par animal). Enfin, des animaux anesthésiés seront irradiés au niveau du cerveau en veillant à préserver les bulbes olfactifs (1 irradiation - durée de l'anesthésie environ 10 minutes). Puis pour évaluer la capacité d'apprentissage et la mémoire spatiale de ces animaux, des tests de comportement seront réalisés avec au maximum 15 séances/semaines (chaque séance ayant une durée de 10 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Des cellules ou des fragments de tumeurs seront implantées chez des souris. Ces souris développeront des tumeurs et pourront recevoir des traitements tel qu’un protocole d’irradiation, un traitement ciblé et/ou une immunothérapie. Suite à la greffe des cellules ou de fragments de tumeurs, une perte de poids peut être observée jusqu’à environ 4 jours post-greffe. Suite à l’irradiation d’une partie du corps de l’animal, une perte de poids pourrait être observée durant 15 jours post-irradiation. Les nuisances attendues lors des administrations d’agents pharmacologiques sont liées à l’administration en elle-même (douleur légère de courte durée suite aux injections, stress de courte durée lié à la contention de l’animal lors des administrations orales) ainsi qu’à la composition du solvant utilisé . Les nuisances attendues lors des tests comportementaux sont liés au stress provoqué par les modifications apportées à l’environnement des animaux : conditions du test, type d’hébergement, expérimentateur.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Concernant l’étude sur le médulloblastome, nous disposons au laboratoire de nombreux modèles : des progéniteurs neuronaux (= progéniteurs des cellules granulaires (GCP)) dissociés et purifiées à partir de cervelet de souriceaux âgées de 3 à 8 jours, des lignées cellulaires sur lesquelles de nombreux résultats prometteurs in vitro ont déjà pu être obtenus. Des expériences préliminaires in vitro sur cellules tumorales sont toujours réalisées en amont de l’approche in vivo chez la souris afin de ne poursuivre qu’avec les axes de recherche les plus solides. De la même façon, tous les composés de thérapies ciblés seront testés in vitro, seul ou en combinaison à l’irradiation et ne seront testés in vivo que ceux pour lesquels les résultats seront prometteurs. Des travaux sont également en cours en ce moment dans notre laboratoire sur l’obtention d’organoïdes de cervelet à partir de cellules humaines souches induites pluripotentes (iPS) ce qui nous permettra dans l’avenir d’augmenter nos approches in vitro et de remplacer une partie des animaux utilisés à des fins expérimentales . Concernant les traitements d’immunothérapie, ils ne peuvent être testés qu’in vivo du fait de la nécessité d’avoir un système immunitaire complet au sein d’un organisme. Enfin, l’étude de la toxicité des nouveaux traitements ou modalités ne peut s’envisager que sur animal. Nous chercherons en particulier à évaluer l’effet de ces traitements sur le tissu sain par des tests de comportement à plus ou moins long terme qui permettent d’étudier les déficits moteurs ou cognitifs semblables à ceux observés chez les patients après radiothérapie. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours (cultures in vitro) l’utilisation du modèle souris reste indispensable pour le présent projet.
Réduction
1-Pour minimiser le nombre d’animaux tout en cherchant à répondre aux objectifs scientifiques, nous aurons recours à des études longitudinales avec l’utilisation de l’imagerie du petit animal (suivi du même animal au cours du temps). Des études pilotes pourront être réalisés pour l’administration d’agent pharmacologique en fonction des données déjà publiées ou non. L’utilisation des patient derived xenograft qui sont des fragments de tumeurs obtenus chez des patients fraichement opérés (PDX) et qui sont maintenues sur animaux vivants est mutualisée avec les autres projets au sein de l’équipe ce qui contribue également à la réduction du nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux estimé dans ce présent projet est un nombre maximum, mais il sera sans doute réduit. 2- Le nombre d’animaux à utiliser a été défini à l’aide d’outils statistiques
Raffinement
Dès que cela n’implique pas de stress ou de l’angoisse supplémentaire, une méthode d’anesthésie sera utilisée pour réaliser le geste technique nécessaire à l’expérimentation. De plus, des méthodes analgésiques seront appliquées avec l’utilisation d’analgésiants locaux ou généraux pendant l’opération et si besoin post-opératoire. Le réveil de l’animal se fera sous lampe chauffante et sera surveillé par l’expérimentateur. Des méthodes sont mises en place durant la chirurgie pour le bien-être de l’animal avec par exemple l’utilisation d’un coussin chauffant, l’utilisation de vaseline pour éviter le dessèchement des yeux, et en post-opératoire en favorisant l’accès à la nourriture molle en déposant au fond de la cage des cupules d’aliment gélifié. Nous habituerons les animaux quelques jours avant la chirurgie à se nourrir à base de ces cupules d’aliments gélifiés pour diminuer encore le stress et l’angoisse. Lorsque cela est possible scientifiquement, nous choisissons la méthode la moins invasive comme par exemple le choix du site d’implantation en sous cutané pour le maintien des PDX contrairement à un maintien qui aurait également pu être fait en orthotopique. L’injection de cellules dans le cerveau exprimant un marqueur permettra de suivre la croissance tumorale par une méthode non invasive d’imagerie. L’imagerie sera réalisée de 1 à 3 fois par semaine et sous anesthésie. Une procédure d’entrainement du personnel permettra de transmettre les gestes techniques de manière sûre aux nouveaux personnels en diminuant ainsi le stress et l’angoisse chez la souris. Les animaux greffés seront observés régulièrement par l’expérimentateur pour le suivi de la croissance tumorale soit par mesure à l’aide d’un pied à coulisse soit par imagerie en fonction du site d’implantation et pour vérifier leur état général de santé. Une grille de score sera mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. Dès atteinte d’un point-limite, l’animal sera mis à mort.
Choix des espèces
La souris est le modèle de prédilection pour les expériences menées en recherche en thérapeutique du cancer, en particulier pour sa parenté physiologique avec l’Homme. Ce modèle est utilisé dans de nombreuses études en cancérologie, notamment pour des expériences de greffes ainsi que l’utilisation de lignées murines génétiquement modifiées. De plus, le modèle murin est un modèle de choix puisque les tumeurs spontanées sont rares et la croissance tumorale induite par greffe est relativement rapide. La majorité des animaux seront utilisés au stade adulte soit à 7 semaines Greffées à l’âge adulte, ce modèle de génération de tumeur est communément utilisé et bien maîtrisé (reproductible). La bonne connaissance de nos modèles sur les souris adultes nous ont conduit à réaliser ces expériences sur adultes pour garantir une bonne reproductibilité et donc une réduction du nombre d’animaux à utiliser. Concernant les greffes en sous-cutanés, les tumeurs seraient rapidement trop volumineuses par rapport à la taille de l’animal si nous la réalisions chez le souriceau. Nous utiliserons également des jeunes souriceaux non sevrés à 2 jours et 9 jours pour comparer l’infiltrat immun en fonction du stade de développement. Pour les tests comportementaux, des jeunes souris de 10 jours seront utilisés car à cette période, le cerveau est en plein développement (prolifération des progéniteurs neuronaux) tout comme l’est celui des jeunes enfants atteints des cancers pédiatriques étudiés.
Etude de l’efficacité de molécules pharmaceutiques dans un modèle d’induction de lésion pulmonaire aiguë par injection intranasale de lipopolysaccharides chez la souris et le rat.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
Rats : 513
847 souris et 513 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une endotoxine bactérienne leur est instillée dans le nez sous anesthésie gazeuse pour provoquer une lésion pulmonaire aiguë avec œdème, puis ils reçoivent par voie orale, une à deux fois par jour, les composés d'une société pharmaceutique, avant un prélèvement sanguin terminal et la mise à mort pour analyse histologique des poumons. Le porteur annonce vingt-cinq études sur ce modèle. Il présente le choix de la voie nasale plutôt que trachéale comme "un raffinement important pour les études sur l'inflammation pulmonaire", la dégradation de la fonction respiratoire provoquée restant selon lui "limitée" parce que ces études durent 24 heures.
Objectifs
La lésion pulmonaire aiguë (ou ALI pour acute lung injury) est une forme d'insuffisance respiratoire, caractérisée par une atteinte pulmonaire inflammatoire diffuse aiguë qui entraîne une augmentation de la perméabilité des capillaires alvéolaires et un œdème pulmonaire non hydrostatique. Le syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA), forme la plus invalidante d’insuffisance respiratoire, représente encore une cause importante de mortalité chez les patients. Nous souhaitons développer un modèle in vivo d’inflammation pulmonaire aigue pour une évaluation de l’efficacité de composés pharmacologiques développés par notre société. Les modèles murins d’infection intranasale par le LPS (une endotoxine) constituent des modèles de choix pour cette pathologie. Cette endotoxine d’origine bactérienne provoque une réponse inflammatoire importante chez les animaux et chez l’Homme. L'administration intranasale du LPS provoque une réponse inflammatoire pulmonaire rapide et locale à court terme. Ce modèle aigu nous permettra de relier l’efficacité à l’exposition pulmonaire de nos composés (pharmacodynamique). La voie d’administration intranasale est également moins invasive que l’injection par voie intratrachéale (avec ou sans chirurgie). Selon la littérature scientifique, la reproductibilité et l’impact sur l’inflammation et les lésions du tissu pulmonaire semblent être comparables entre les deux voies d’administration. Ainsi, le modèle LPS intranasal offre un raffinement important pour les études sur l'inflammation pulmonaire. Ce modèle de lésion pulmonaire aigue se rapproche fortement du phénomène inflammatoire observé chez l’Homme lors d’atteintes pulmonaires aiguës. En termes de mécanisme d’action, la production excessive de molécules du stress oxydatif, induite par l’administration de LPS, joue un rôle déterminant dans le déclenchement et le maintien de la réponse inflammatoire aigüe. Ce modèle constitue donc un modèle de choix pour évaluer nos composés pharmacologiques ciblant le stress oxydatif.
Bénéfices attendus
La lésion pulmonaire aiguë, par son stade aggravé (le syndrome de détresse respiratoire aiguë - SDRA), est un syndrome clinique sévère courant en unité de soins intensifs, qui conduit à une forme d'insuffisance respiratoire, entraînant une mortalité jusqu’à 30 à 40 %. Les résultats attendus dans ce modèle nous permettront d’identifier rapidement les molécules avec le meilleur potentiel thérapeutique. Par ailleurs, les mécanismes inflammatoires impliqués correspondent parfaitement au mode d’action de nos molécules. Cela nous permettra de valider leur action dans ces processus inflammatoires. Ces molécules pourront par la suite être incluses dans le processus de développement pour la mise en place d’essais cliniques chez l’Homme.
Procédures
L’administration intranasale de LPS se fera sous anesthésie gazeuse en moins d'une minute. Une contention légère permettra le traitement par voie orale en 20 secondes, 1 ou 2 fois par jour selon la molécule testée et sa pharmacologie. Un prélèvement de sang terminal sera effectué sous anesthésie gazeuse (moins de 1 minute) avant euthanasie (sans réveil entre les 2 actes).
Impact sur les animaux
Le LPS a pour effet une dégradation de la fonction pulmonaire, malgré tout limitée pour ces études de 24h. La légère contention nécessaire pour le traitement par voie orale, ainsi que l'anesthésie pour le prélèvement sanguin, pourront engendrer un stress.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prelever les tissus pulmonaires afin d'analyser l'évolution de la maladie en histologie.
Remplacement
En amont des tests chez l’animal, les composés sélectionnés sont évalués sur des tests in vitro, permettant d’identifier les composés les plus prometteurs, de comprendre leur mécanisme d’action et d’éliminer les molécules inactives ou pouvant entrainer des nuisances ou effets indésirables chez les animaux (via les tests de toxicologie cellulaire). Pour évaluer l’activité des composés in vivo, il est indispensable de recourir ensuite à l’utilisation de modèles animaux intégrant au mieux la physiopathologie humaine (interactions intercellulaires, inter-organes, inflammation…). Malheureusement, ce genre d’interaction ne peut pas encore être reproduite in vitro et c’est pour cela que ce modèle in vivo est nécessaire. De plus, ce modèle vivo est décrit dans la littérature scientifique et a été validé avec des composés qui ont montré leur efficacité chez l’homme dans des études cliniques.
Réduction
La sélection des composés est faite en utilisant des tests cellulaires ou non cellulaires in vitro. Seules les molécules présentant une activité sur les tests in vitro et ayant des caractéristiques pharmacocinétiques adéquates seront étudiées avec les animaux. Ce modèle a déjà été utilisé par le passé pour développer des molécules au sein de notre laboratoire. Les données obtenues précédemment ont été utilisées dans le but de déterminer le nombre d’animaux maximum nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Des tests statistiques seront utilisés. Nous optimiserons les études pour utiliser le moins de groupes contrôle possible. Ainsi, 25 études seront réalisées dans ce porjet.
Raffinement
Toutes les dispositions nécessaires en matière d’hébergement, d’enrichissement, d’observation et de soins aux animaux sont prises afin d’assurer les meilleures conditions de vie aux animaux. La Structure Chargée du Bien-Être Animal (SBEA) émet ses recommandations en matière de prévention de la douleur, souffrance et détresse des animaux. La voie d’administration intranasale est privilégiée par rapport à l’infection intratrachéale pour éviter une contention forte (injection par otoscope et sonde) ou de la chirurgie. Afin de limiter le stress causé aux animaux, les composés testés seront administrés par voie orale. Cette technique, rapide et nécessitant une contention courte, est bien tolérée par les animaux. La formation du personnel, la taille de la sonde et l’adaptation des volumes administrés permettront de limiter le stress ressentit par l’animal lors du traitement. Après réception, un programme d’enrichissement permet de varier les éléments de la cage afin d’encourager le comportement de rongeur : coton pour la construction de nid, dôme rouge pour se cacher, bois à ronger… La nourriture et l’eau seront en libre accès tout au long de l’étude. Les pièces d’hébergement disposeront d’un cycle lumière obscurité, d’une température et d’une hygrométrie contrôlés en permanence. Les animaux seront monitorés à chaque traitement pour la surveillance de signes cliniques éventuels et vérifier l'absence de souffrance.
Choix des espèces
Les rongeurs sont les espèces dont les manifestations inflammatoires sont les plus connues et se rapprochent le plus de celles de l’Homme dans ce modèle. Comme décrit dans la littérature, la souris est le modèle animal le plus utilisé pour ce modèle de lésion pulmonaire aiguë induit par le LPS. Il est approprié car plusieurs signes physiopathologiques caractéristiques de cette atteinte inflammatoire ont été rapportés dans la littérature scientifique. Nous établirons également le modèle chez le rat si nécessaire, dans le cas de composés ayant une pharmacocinétique plus favorable chez le rat par rapport à la souris. L’implication du stress oxydatif dans ce type de pathologie a été rapporté dans la littérature scientifique via des études in vivo. Basé sur la littérature scientifique et sur notre expérience antérieure sur le modèle, les animaux utilisés seront de jeunes adultes de 8 à 12 semaines d’âge à l’induction de l’inflammation.