Rongeurs

23 295 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectées par Mycobacterium tuberculosis par voie intranasale, elles reçoivent ensuite des composés par gavage, jusqu'à quatre fois par jour, cinq à sept jours par semaine, pendant seize semaines au maximum, et jusqu'à sept prélèvements sanguins caudaux dans une même journée. Le porteur annonce des signes cliniques légers à modérés, perte de poids, prostration, poils hérissés, alopécie, et la mise à mort des souris qui perdent 20 % de leur poids ou présentent au moins trois de ces signes. Ce chiffre de 23 295 animaux couvre, écrit-il, "environ 125 études" de criblage de composés antituberculeux menées pour un consortium.

Objectifs

L'objectif global des institutions de santé et de recherche représentant les forces de lutte contre la tuberculose, est d’identifier de nouveaux traitements innovants et de trouver des solutions de santé plus adaptées pour contrer la menace croissante de la tuberculose. Par conséquence, il existe une demande croissante pour le développement et le criblage des bibliothèques de nouveaux composés antituberculeux, en amenant jusqu’au phases cliniques les combinaisons les plus intéressantes. Les études d'infection bactérienne chez l'animal sont documentées dans la littérature et sont essentielles pour démontrer l'efficacité des composés antibactériens résultants des criblages In Vitro de ces composés. Notre objectif est de sélectionner les nouveaux composés qui présentent une meilleure activité in vitro contre la bactérie Mycobacterium tuberculosis (Mtb) et de les faire évoluer dans la « pipeline » de développement d’antibiotiques dans le cadre des tests précliniques. Le but global est, donc, d’identifier les composés les plus efficaces par une validation préclinique en modèle animal d‘infection par Mtb. La recherche préclinique permet également d'évaluer la pharmacocinétique et la toxicité des nouvelles drogues dans des conditions d'infection bactérienne. Ces modèles permettent aussi de déterminer les combinaisons de composés et de leurs doses optimales, des schémas de traitement et voies d’administration plus adaptées pour la transposition ultérieure sur les essais cliniques chez l’homme. Dans ce projet nous utiliserons la souris infectée par Mtb comme modèles pré-clinique de tuberculose dans le but d’évaluer l’efficacité des combinaisons de nouveaux composés anti-Mtb potentiellement plus efficaces que les combinaisons d’antibiotiques existants. L'évolution de l'infection par Mtb chez la souris peut être aiguë ou phase chronique, chacune ayant un profil pathologique et histologique distincts. La souris est l‘espèce, "gold standard" utilisée pour tester la chimiothérapie contre la tuberculose. De plus, la caractérisation de certaines cibles cellulaires impliquées dans le mécanisme d’action, l’efficacité thérapeutique et prophylactique des nouveaux traitements et des candidats vaccins peut nécessiter l'utilisation de souris transgéniques.

Bénéfices attendus

Ce projet a commencé en juillet 2019, ayant des procédures d'expérimentation animale approuvés par les instances éthiques concernés, et a déjà permis de grandes avancées pour les traitements anti-tuberculose. Le consortium a été créé dans le but d'introduire dans les essais cliniques de nouvelles combinaisons de médicaments antituberculeux afin de réduire de manière significative la durée du traitement de la tuberculose sensible aux médicaments. L'un des axes de travail prioritaires est l'évaluation de l'efficacité de nouvelles combinaisons de médicaments antituberculeux dans des modèles précliniques de tuberculose. De plus, ce projet soutient la recherche de nouvelles molécules afin d’améliorer le traitement de la tuberculose. Ces modèles comprennent des modèles de souris immunocompétentes infectées à la tuberculose. L'analyse des données historiques de ces modèles, ainsi que des données cliniques disponibles, indique l'utilité de ces données précliniques pour prédire le temps relatif de guérison clinique des combinaisons de médicaments antituberculeux. La justification du renouvellement de ce projet s’insère dans l’objectif global, qui vise à choisir les meilleurs composés ayant démontrés une activité anti-tuberculose important in vitro et la continuité de les évaluer en phase préclinique. Il permet également d'évaluer la pharmacocinétique, et la sécurité des nouvelles drogues dans des conditions d'infection bactérienne. Ces modèles permettent aussi de déterminer les combinaisons de composés et de leurs doses optimales, des schémas de traitement et voie d’administration plus adaptées pour la transposition ultérieure sur les essais cliniques chez l’homme. Cette justification a été approuvée par les instances dirigeantes de notre établissement ainsi que par celles de nos partenaires, et repose également sur des données solides issues de la littérature scientifique ainsi que les données collectées par le groupe dans les études précédentes. Ainsi nous contribuerons à fournir des traitements innovants et à trouver des solutions de santé adaptées pour contrer la menace croissante de la tuberculose.

Procédures

Au cours des études de manière générale les gestes techniques suivants sont réalisés au cours des procédures : • Infection (1 fois, 1min) intra-nasale sous anesthesie flash • traitement : Injection de composés : - Si voie orale : gavage de 1 à 4 fois par jour (30s par administration) 5 à 7 jours par semaine pendant 1 à 16 semaines maximum sur animal vigil - Si voie intra-veineuse : de 1 à 2 fois par semaine (vigile ou sous anesthésie, 3min) pendant 8 semaines maximum - Si voie intraperitonéale ou sous cutanée sur animaux vigile : quotidienne (30s), de 1 à 3 fois par semaine pendant 8 semaines maximum - Si voie intra-nasale ou intra trachéale 1à 4 fois par semaine (3min par administration) ou 1 fois tous les 3 ou 4 jours pendant 2 semaines - Intramusculaire 1 fois (2min) sur animaux anesthésié • l’efficacité des traitements est evaluée en mesurant la charge bactérienne dans le poumon ou autre tissu : Mise à mort : anesthésie de l’animal (5 minutes) puis mise à mort (qq secondes) • Prélèvements sanguins : Des prélèvements sanguins pourront être réalisés dans certaines études à la veine caudale (20µl) : 3 à 7 prélèvements maximum par jour sur une journée ; Des prélèvements de sang terminaux peuvent être réalisés par voix intracardiaque transcutanée sous anesthésie (1 fois, 1min).

Impact sur les animaux

Le design d’étude implique les nuisances suivantes pour les animaux : - L’infection qui se fait principalement par administration intranasale sous anesthésie (léger) - Les traitements : qui sont principalement par gavage de 1 à 4 fois par jour sont effectués par des personnes parfaitement formées afin de réaliser un geste précis et rapide afin de limiter la géne. (Acte léger, mais modéré par le cumul) - Manipulation pour pesée 1 à 3 fois par semaine, qui peut entrainer un stress pour les animaux (léger) Manipulation pour Microsampling peut entrainer une gêne et un stress (léger à modéré selon le nombre de prélèvements). Le geste est réalisé le plus rapidement possible afin de limiter les nuissance et en respectant les volumes et fréquences recommandées par le comité éthique. L'infection par la tuberculose chez la souris est rapportée comme indolore. Le développement de la pathologie chez la souris n’engendre pas normalement de signes cliniques. Cependant la réaction inflammatoire et la charge bactérienne au niveau pulmonaire dans la forme aigüe peuvent entrainer une perte de poids, une baisse de l’état générale, une hypoactivité, voire de la prostration, de l’alopécie, poils hérissés, à un certain stade d’avancement de la maladie. Dans nos études, ces signes restent légers à modéré par l’application de Points-limite anticipés adaptés. Si l’infection est contenue, la souris développe une forme chronique, et ne présente aucun symptôme. Dans ce projet, par les connaisances des différents modèles et l’évolution de la maladie (charge bactérienne), les designs sont adaptés afin de limiter les situations où les animaux développent des signes cliniques. De plus, dans les cas rares de modèle ou il y a développement aigue de la maladie, une surveillance renforcée est mise en place dans des potentielles périodes critiques afin de limiter la soufrance des animaux. De plus, comme les traitements peuvent diminuer le développement de la maladie et donc limiter l’apparition de potentielles nuisances chez l’animal, dans certain modèle (aigue) quand le design le permet le groupe non traité ou véhicule n’est pas inclus avec l’objectif de raffinement et reduction).

Devenir

L’évaluation de l’efficacité des composés se fait par l’analyse de la charge bactérienne dans les tissus. La nécessité de prélèvements d’organes en fin d’étude dans le design d’étude ne permet pas de garder les animaux. À la fin de chaque étude, les animaux utilisés seront euthanasiés.

Remplacement

Mise en œuvre des 3R : Les expériences sont conçues dans le respect des règles des 3R, avec les stratégies suivantes de Remplacement : a) Suppression des tests obsolètes ou redondants, comme la détermination de la dose maximale tolérée de produits administrés, puisque la dose choisie pour chacun de ces composés est determiné au préalable dans des modèle in vitro et différents modèles animaux, including PK, y compris la souche de souris, sans observation de signes de toxicité. b) Jusqu'à présent, aucune méthode respectant pleinement les exigences réglementaires des pays destinataires des produits n'a été mise au point pour remplacer complètement l'utilisation d'animaux dans les procédures expérimentales décrites. En effet, les nouveaux médicaments développés peuvent cibler directement le micro-organisme en le tuant en inhibant des cibles essentielles à sa survie ou en diminuant sa virulence ou cibler l’hote afin de favoriser l’élimination du pathogène par le système immunitaire. A ce jour, aucune methode in vitro de remplacement n’a été mise au point afin de mesurer la virulence et l’impact de la réponse immunitaire.

Réduction

Les expériences sont conçues dans le respect des règles des 3R, dont la Réduction. Bien que ces modèles soient largement publiés avec principalement de 4-8 animaux par timepoints en fonction du design et de l’espèce animale. Le schéma expérimental des tests de ce projet a fait l’objet d’une revue par des biostatisticiens afin de calculer au plus juste le nombre d’animaux à utiliser tout en permettant un support au dossier réglementaire CTD (Common Technical Document). Ce qui a confirmé le nombre d’animaux utilisés. De plus, à chaque nouvelle étude, le nombre de timepoints, le nombre de groupe et le nombre d’animaux est adapté en fonction des connaissances sur les modèles et composés testés. Pour les nouveaux produits avec potentiel efficacité anti-Mtb, le développement et la validation d'essais in vitro permet d’identifier les composés le plus actifs et de réduire la quantité de composés à être testés in vivo. Certains designs d’étude permettent d’éviter l’utilisation de groupe témoin non traité et «groupe véhicule» ; ce qui permet encore de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’efficacité des composés n’est comparée qu’au groupe contrôle positif. En fonction du design, avec ce nombre d’animaux, nous pourrions faire environ 125 études toutes procédures confondues.

Raffinement

Enfin, la strátégie 3R utilisé pour le Raffinement pour les expériences : a) Les animaux seront hébergés en groupe dans des cages, au maximum 6 animaux par cage, contenant des dispositifs d’enrichissement, dans des locaux appropriés, conformes aux standards réglementaires et suivis par un personnel spécifiquement formé et compétent. b) Raffinement des manipulations pour limiter le stress des animaux : Les experimentateurs sont formés afin d’appliquer les méthodes dans les conditions les moins contraignantes pour les animaux (préhension (soft handling), gavage rapide par personnes expérimentées). Toute manipulation considérée comme invasive et/ou stressant pour l’animale sera faite sous anesthésie. c) Les signes cliniques seront observés quotidiennement : perte de poids, érection des poils et altération de la posture, isolement, vocalisation lors de la manipulation, positionnement des vibrisses. Si les animaux présentent une perte de poids de jusqu'à 10%’ par rapport à son poids initial, une observation renforcée sera faite et l’apport hydrique en gel ou de nourriture sera ajouté au fond de la cage afin de faciliter l'accès des animaux à l'eau et la nourriture. Si les animaux présentent au moins trois de ces signes, ou une perte de poids jusqu’à 20% l’animal sera sacrifié.

Choix des espèces

L’animal de laboratoire permet de mimer au mieux les caractéristiques de la pathologie chez l’homme. Bien qu'il n'existe pas de véritable réservoir animal pour Mycobacterium tuberculosis, de nombreuses espèces animales sont susceptibles d'être infectées, dont la souris, le lapin et le cochon d'Inde. La souris Mus musculus présente plusieurs avantages comme modèle d’infection par Mtb. Sa facilité de conservation, d'élevage et de reproduction, la vaste collection de souches consanguines représentant une population de clones génétiques, et les outils scientifiques et de santé plus disponibles, adaptés, et transposables à l’homme permettent une analyse solide des données expérimentales. Les souris sont âgées de 4-6 semaines à la livraison, et au moins 6 semaines à l’infection afin d’avoir un système immunitaire mature avec un poids autour de 20 grammes afin de permettre des infections et des traitements homogènes des lots d'animaux. Il s’agit de rongeurs matures et adultes.

L'évaluation porte sur deux molécules fournies par l'industrie, l'une déjà autorisée hors de France et l'autre en essais cliniques, avec l'objectif annoncé d'un passage rapide en clinique. 250 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit dans la veine de la queue des cellules leucémiques prélevées sur des patients, puis jusqu'à neuf prises de sang hebdomadaires et quatre semaines de traitement incorporé aux croquettes, avant qu'une centaine d'entre elles ne serve de receveuse pour une deuxième greffe. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" d'évaluer l'effet des molécules sur les cellules souches leucémiques, ce qui impose selon lui cette greffe secondaire.

Objectifs

Ce projet vise à l’évaluation préclinique d’un nouveau médicament pour le traitement des leucémies aiguës myéloïdes. Les leucémies aigües myéloïdes touchent environ 3 500 personnes chaque année – dont une centaine d’enfants – et constituent un défi majeur pour les médecins. Les taux de survie n’ont que modérément évolué ces vingt dernières années. La prise en charge des patients repose actuellement sur la chimiothérapie, en association avec la greffe de moelle osseuse mais le pronostic global reste mauvais en raison de la fréquence élevée des rechutes. Ces rechutes sont causées par la persistance des cellules souches leucémiques insensibles aux thérapeutiques actuelles. Le développement de nouvelles thérapies permettant de cibler ces cellules est donc un enjeu majeur pour la prise en charge de cette maladie . Ce projet scientifique consiste à évaluer l’efficacité in vivo (sur un modèle murin de la maladie) d’une thérapie ciblant spécifiquement ces cellules. Cette thérapie, basée sur l’administration de deux molécules, a été testée au préalable sur des modèles d’étude in vitro et a montré une très bonne efficacité. Le premier objectif de ce projet est de mettre en place le modèle de leucémie aiguë myéloïde, pour cela des cellules issues de patients atteints de leucémie aiguë myéloïde seront injectées à des souris (modèle murin de leucémie aiguë myéloïde). A l’issue de cette expérience, deux modèles seront sélectionnés. Le deuxième objectif est d’évaluer l’efficacité anti-leucémique, pour cela les deux molécules seront administrées aux deux modèles murins de leucémie aiguë myéloïde. Les deux molécules seront administrées seules ou en association pendant un maximum de 4 semaines contre placebo. Le troisième et dernier objectif est de tester l’efficacité des traitements sur le contingent de cellules souches leucémiques. Pour cela les cellules médullaires issues de souris greffées avec des cellules leucémiques de patients et traitées avec les nouvelles thérapies le traitement de référence de cette maladie ou le placebo (5 bras de traitement) seront réinjectées à de nouvelles souris. Celles-ci ne seront pas traitées et la survenue ou non d’une rechute de la maladie sera monitorée.

Bénéfices attendus

La leucémie aiguë myéloïde est une maladie qui peut survenir à tout âge, mais seulement 25 % des cas sont diagnostiqués avant 25 ans. C'est surtout après 40 ans que la fréquence de la maladie augmente, l'âge moyen au moment du diagnostic étant de 65 ans. Le pronostic est particulièrement défavorable pour les personnes diagnostiquées plus tardivement. Plus âgées et pouvant présenter certains problèmes de santé, elles ne peuvent pas bénéficier d’un traitement intensif (chimiothérapie et greffe de moelle osseuse) qui leur serait défavorable car trop toxique. Le mauvais pronostic de la pathologie est également dû à la fréquence élevée des rechutes, ceci dans tous les groupes d’âge. Ces rechutes sont dues aux cellules souches leucémiques, un sous type de cellules cancéreuses qui est peu sensible à la chimiothérapie conventionnelle et peut donc persister dans l’organisme après traitement, permettant à la maladie de se développer à nouveau après une période de rémission. Le développement de thérapeutiques alternatives moins toxiques et ciblant plus efficacement les cellules souches leucémiques est donc nécessaire. Les deux molécules candidates pour ce projet sont des composés qui, pour le premier a déjà obtenu une autorisation de mise sur le marché dans le monde (hors France) et pour le second, est testé actuellement dans des essais cliniques (sur l’humain) dans différents cancers dont des cancers du sang. Si l’association montre son efficacité dans le modèle murin de leucémie aiguë myéloïde utilisé pour cette étude, ce projet pourra donc rapidement donner lieu à des essais cliniques chez l’humain. Nos expériences pourraient donc participer au développement de nouveaux médicaments pour traiter la leucémie aiguë myéloïde.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - une injection pour chaque animal (animal vigile, contention simple) de cellules leucémiques humaines dans la veine de la queue. Cette intervention ne dure que quelques minutes au maximum en tenant compte du temps de dilatation des veines par la chaleur. - des prélèvements de sang : la prise de greffe sera évaluée sur des prélèvements de sang hebdomadaires qui seront effectués à partir de la huitième semaine post-greffe et ce au maximum jusqu’à 16 semaines, soit 9 prélèvements maximum. Cette intervention dure moins d’une minute. - un traitement par voie orale d’une durée maximale de 4 semaines, les molécules étant incorporées dans les croquettes

Impact sur les animaux

L’injection dans la veine de la queue de la souris et les prélèvements de sang au niveau de la veine faciale engendrent du stress et de la douleur chez la souris. Le développement de la leucémie chez l’animal peut entraîner l’apparition d’un affaiblissement et/ou une perte de poids chez l’animal. Certains des médicaments utilisés (traitement standard de la leucémie aiguë) peuvent diminuer le nombre de globules blancs, le nombre de globules rouges et de plaquettes chez la souris.

Devenir

A l’issue de chaque procédure les animaux seront euthanasiés, le développement de la leucémie ne permettant pas de les garder en vie. Ce développement n’est pas réversible et entrainerait la mort des animaux.

Remplacement

Le projet scientifique porte sur l’évaluation de l’efficacité d’une thérapie ciblée (association de deux molécules candidates) sur un modèle de souris mimant le développement de la leucémie aigüe myéloïde. Il s’agit du modèle in vivo classiquement utilisé pour les leucémies aiguës myéloïdes et plus largement pour les cancers de la moelle osseuse et du sang afin de valider l’étape préclinique. Un modèle in vitro ne peut pas remplacer le modèles in vivo car il ne reproduit pas la caractéristique systémique de cette maladie humaine (qui se traduit par une atteinte de tous les organes qui fabriquent les cellules sanguines). De plus, le maintien d’un modèle in vitro basé sur l’utilisation des cellules de patients se révèle impossible sur la durée, la survie de ces cellules étant limitée dans le temps car n’ayant pas le microenvironnement nécessaire pour leur maintien. Par ailleurs, l’effet de l’environnement des cellules souches leucémiques s’avère fondamental dans le développement des leucémies aiguës myéloïdes, dans l’apparition d’éventuelles résistances et dans l’effet de la leucémie aiguë myéloïde sur l’hématopoïèse normale (processus à l’origine de la production des cellules sanguines). Les effets de cet environnement ne peuvent être pris en compte dans leur globalité que dans un modèle in vivo. Les cellules souches leucémiques représentent une petite fraction des cellules leucémiques, elles sont définies par leur capacité à redonner naissance à la leucémie quand elles sont injectées à des souris, capacité que ne possède pas la majorité des cellules leucémiques. Les cellules souches leucémiques sont à l’origine des rechutes de la maladie observées chez les patients. L’évaluation de l’efficacité des candidats médicaments sur les cellules souches leucémiques n’est donc possible que dans un contexte de greffe secondaire après l’étape de traitement qui a lieu lors de la greffe primaire. Il n’est donc pas possible de mettre en place des méthodes de substitution qui évitent l’emploi de modèles animaux pour ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé à chaque étape (10 souris/condition) est nécessaire étant donné la variabilité de la prise de greffe d'une souris à l'autre, il est suffisant pour exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats de l’expérience et permet d’obtenir un nombre suffisant pour réaliser une analyse statistique fiable. Si la prise de greffe était plus homogène qu’attendu dans la première étape du projet, le nombre d’animaux nécessaire à la seconde étape serait réduit. Lors de la première étape 5 échantillons de cellules leucémiques, issus de 5 patients différents, seront testés soit un total de 50 souris, car toutes les cellules issues de patients ne se greffent pas dans les souris. Lors de la deuxième étape, l’efficacité des molécules candidates sera testée dans 2 des modèles établis à l’étape précédente, sur la base de groupes de 10 souris, cette étape nécessite 100 souris. A l’issue de cette étape, afin d’évaluer l’efficacité des molécules sur les cellules souches leucémiques, une greffe secondaire sera pratiquée, les cellules d’une souris traitée (molécule(s) ou placebo) devant être réinjectées à une autre souris, cette étape nécessite également 100 souris, soit un total de 250 souris pour le projet. Il est indispensable d’évaluer l’efficacité des molécules sur ces cellules souches leucémiques, car elles sont à l’origine des rechutes de la maladie après une période de rémission. Ces cellules souches leucémiques étant définies comme des cellules étant capables de redonner naissance à la maladie après greffe dans des souris, il est nécessaire pour évaluer l’efficacité sur ces cellules souches leucémiques de réaliser une deuxième greffe.

Raffinement

Les différentes procédures envisagées ne nécessitent qu'une simple contention de l'animal car elles sont peu douloureuses, elles ne nécessitent donc pas d'anesthésie locale ou générale. Des éléments d’enrichissement du milieu seront mis à la disposition des souris: coton, litière papier pour la confection de nids. Les traitements seront administrés per os avec les croquettes pour éviter la souffrance liée au gavage. En sus des points de surveillance habituels, dans le cadre de ce projet, seront surveillés une fois par semaine dès le début du projet: les points d'injection, les points de ponction, le bilan sanguin. Des points limites spécifiques à cette expérience ont été définis afin d’éviter toute souffrance chez les animaux.

Choix des espèces

La connaissance approfondie du modèle de souris fait de cette espèce, une espèce de choix dans la réalisation d’une étude préclinique et permet d’obtenir des données reflétant les interactions physiologiques de l’organisme vis à vis des molécules candidates testées dans ce projet. Ce projet a été initié dans le respect de l’éthique et de la sensibilité de l’animal. De nombreux modèles de souris immunodéprimées peuvent accepter les greffes de cellules humaines. Le modèle souris immunodéprimée que nous avons choisi représente le modèle le plus adapté aux transplantations de cellules leucémiques humaines car la greffe ne nécessite pas d'irradiation préalable de l'animal et elle représente le modèle le plus proche de la physiopathologie humaine. Ces animaux ne présenteront pas d’atteintes physiques et/ou comportementales sévères dans le cadre de ce projet car, et bien que ne présentant pas de système immunitaire fonctionnel, ils seront élevés en portoirs ventilés et changés sous hotte. Les animaux utilisés seront des souris adultes entre 6 et 10 semaines en conformité avec les données de la littérature pour ce type de modèle.

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois injections sous-cutanées et trois injections rétro-orbitales sous anesthésie déclenchent chez elles une maladie qui reproduit la sclérose en plaques, avec une paralysie qui commence par la queue et gagne les membres postérieurs, et des douleurs neuropathiques possibles. Les animaux sont pesés et notés trois fois par semaine jusqu'à la perfusion intracardiaque terminale qui permet de prélever leur système nerveux central. Le porteur indique que de nouvelles cibles thérapeutiques pourraient en sortir, et affirme que les interactions entre cellules immunitaires et leur microenvironnement ne peuvent pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Objectifs

La sclérose en plaques est une maladie auto-immune qui affecte le système nerveux central. Une dysfonction du système immunitaire y entraine des lésions qui provoquent des perturbations motrices et sensitives. La prise en charge thérapeutique des patients est à ce jour imparfaite. La maladie est médiée par une population de globules blancs spécifique, et il a été proposé que deux nouvelles protéines d’intérêt sont nécessaires au fonctionnement de ces cellules et donc au développement de la maladie. L’objectif de ce projet est de comprendre à l’échelle cellulaire et moléculaire comment ces protéines interviennent dans la biologie de cette population de cellules pathogéniques. Cette étude se fera en utilisant un modèle de sclérose en plaques chez la souris, pour lequel les protocoles expérimentaux sont bien établis et permettent de reproduire fidèlement les symptômes et les mécanismes de la maladie humaine.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait permettre non seulement de mieux comprendre les mécanismes contribuant au développement de la sclérose en plaques, mais aussi de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutique pour le traitement de cette maladie.

Procédures

-3 injections par voie sous-cutanée sous anesthésie gazeuse isofluorane (2*5 secondes/souris au cours d’une anesthésie de deux minutes au total environ) -3 injections par voie intra-veineuse rétro-orbitale sous anesthésie isofluorane (2*2 secondes/souris au cours d’une anesthésie de deux minutes au total environ) -1 perfusion intra-cardiaque terminale sous analgésie et anesthésie médicamenteuse (3 minutes/souris)

Impact sur les animaux

Les injections permettant l’induction de la maladie peuvent induire une douleur légère (traitée par analgésiques). Les symptômes de la maladie se manifestent par une paralysie progressive, commençant par la queue, puis les membres postérieurs et enfin les membres antérieurs. Dans notre animalerie, la sévérité se limite à la paralysie des membre postérieurs. Comme chez l’homme, la maladie peut être associée à des douleurs neuropathiques. Après avoir atteint le score maximum, les animaux entrent dans une phase de rémission (variable, de partielle à complète). Les scores cliniques et le poids sont évalués trois fois par semaine et nécessitent une contention de quelques secondes, pouvant engendrer un stress léger.

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de prélever le système nerveux central et les ganglions lymphatiques pour analyses.

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences dans un contexte physiologique pertinent, c’est-à-dire chez l’animal. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats.

Raffinement

Certaines procédures peuvent induire une douleur/un stress chez les animaux. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse, via notamment l’anesthésie gazeuse et un antalgique (buprénorphine). Un suivi adapté et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la souffrance des souris. Le comportement, l’éventuelle déshydratation des souris, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience. Un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage. En cas d’altération du bien être ou de perte de poids limitée, de la nourriture liquide et de l’eau gélifiée et des injections de glucose, pourront être utilisés.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation chez la souris est justifié par l’utilisation d’un modèle de sclérose en plaques, le plus utilisé dans la littérature car reflétant la pathologie humaine de façon fidèle, notamment concernant le rôle pathogénique des cellules immunitaires. Les méthodes de scoring et les points limites sont également très bien établis. Les souris seront âgées de 7 à 12 semaines, ce qui correspond à un état de maturité du système immunitaire et reflète la maladie humaine qui se déclare généralement chez de jeunes adultes. L’âge sera homogène dans chaque procédure.

Nourries douze semaines avec un régime riche en graisse additionné de poudre de baies de goji ou de lentilles, 72 souris mâles subissent une prise de sang sous contention à la sixième semaine, un test de tolérance à l'insuline à la neuvième, un gavage de glucose à la dixième et un gavage de mesure de perméabilité intestinale à la onzième. Trois recueils de fèces les isolent chacun une trentaine de minutes, les tests de tolérance deux heures. Le porteur reconnaît un stress social lié à ces isolements et des douleurs possibles lors des prises de sang, du marquage, du gavage et de l'injection intrapéritonéale, puis écrit qu'aucune analgésie n'est prévue dans ce protocole. Toutes sont tuées pour prélever les tissus et mesurer l'effet de la supplémentation, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré.

Objectifs

L’objectif du projet est de mieux comprendre l’impact des conditions de production et des traitements post-récolte sur la qualité nutritionnelle des fruits ou des légumineuses et les conséquences que cela va engendrer en terme de santé métabolique chez la souris. Plusieurs travaux rapportent un effet protecteur des fruits ou des légumineuses vis-à-vis de l’homéostasie glucidique qui semble en partie lié aux polysaccharides, et est très probablement imputable à un effet sur le microbiote. Pour évaluer les effets santé des fruits ou légumineuses et l'impact des conditions de cultures et de traitements post-récolte, nous comparerons des baies de goji cultivées en plein champ ou en serre (effet des condition de productions), consommées fraiches ou séchées (effet du traitement post-récolte). L'effet des conditions de cultures sera également étudié sur des lentilles (légumineuses) cultivées soit en sol riche en bactéries soit en sol pauvre (effet des conditions de culture). Les différentes modalités de fruits ou légumineuses seront lyophilisés puis administrés à des souris males durant 12 semaines, dans le cadre d'une alimentation riche en graisse. Une prise de sang sera réalisée à 6 semaines, ainsi qu'un test de tolérance à l'insuline à la 9eme semaine et un test de tolérance au glucose à la 10eme semaine. Les fèces seront également récoltés et le microbiote des animaux sera analysé. Les données obtenues permettront d'avancer dans la connaissance et l'objectivation de la contruction de la qualité nutritionnelle des productions végétales et de leurs effets sur la santé métabolique.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’impact des conditions de culture (plein champ vs serre, et impact du microbiote du sol) et des traitements post-récolte (frais vs séchés) sur la baie de goji et la lentille et leurs effets sur la santé métabolique des souris et de leur microbiote. Ce projet s’insère dans un projet plus large qui permettra in fine d’améliorer et de mieux caractériser les effets santé de ces aliment dans le cadre de pratiques agricoles plus responsables.

Procédures

Un prélèvement de sang sur animal vigile sera réalisé au début de l'étude et après 6 semaines (2 au total). Pour ce faire les animaux seront mis sous contention durant environ 2 minutes. Un test de tolérance à l'insuline et un test oral de tolérance au glucose seront pratiqués respectivement en 9ième et 10ième semaine. Ces tests necéssitent une mise en contention d'une minute pour réaliser un gavage dans le cas du test de tolérence au glucose, et une injection intrapéritonéale lors du test de tolerance à l'insuline. Le déroulé du test nécessite ensuite une mise en hébergement individuel des animaux de 2 heures afin de suivre l'évolution de leur glycémie. Un test de perméabilité intestinale sera réalisé en semaine 11. Ce test nécessitera une mise en contention d'une minute pour réaliser le gavage avec la solution permettant d'évaluer la perméabilité intestinale. Durant le protocole, 3 recueils de fèces nécessitant d’isoler temporairement (environ 30 minutes) l’animal seront effectués.

Impact sur les animaux

Stress social lié à l'hébergement individuel de l'animal de ses congénères lors du test de tolérance à l'insuline, du test de tolérance au gloucose et du recueil de fecès. Douleurs possibles lors des prises de sang, pour l'identification des animaux, lors du gavage et lors de l'injection intrapéritonéale. Ces nuisances ou effets indésirables sont toutes temporaires et réversibles.

Devenir

Les animaux de cette procédure seront mis à mort afin de prélever les tissus d'interet qui seront ensuite étudiés (expression génique, histologie, dosages protéiques) et de démontrer les effets métaboliques de la supplémentation en poudre de baie de goji ou de lentilles.

Remplacement

L’étude d’une supplémentation en poudre de baie de goji ou de lentilles sur la santé métabolique et le microbiote ne peut s'envisager que dans un modèle in vivo. Il n'existe pas de modèle alternatif à l'heure actuelle permettant d'étudier ces paramètres in vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux (9 par groupes) est le nombre minimum nécessaire pour mettre en évidence des différences significatives entre les groupes, à l'aide d'un test statistique, notamment en ce qui concerne la prise de poids. Deux protocoles indépendants ont été regroupés en un meme protocole afin de limiter le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en cage de 3, et l'environnement sera enrichi par la présence d'un igloo en plastique ou en carton. Les animaux seront manipulés régulièrement pour les habituer à notre contact et ainsi limiter leur stress. Des conflits entre animaux au sein d’une même cage pourraient se produire et engendrer des blessures. Dans ce cas, l’animal blessé sera soigné et placé dans une cage individuelle permettant de garder des contacts visuels, olfactifs et auditifs avec ses congénères jusqu’à rétablissement. Des points limites gradés et précis ont été définis pour chaque acte expérimental. Un arbre décisionnel en focntion des observations faites permettra l'application des points limites et la mise en application de critères d'arret. Aucune analgésie n'est prévue lors de ce protocole.

Choix des espèces

Le modèle souris est un modèle reconnu pour les études portant sur l’obésité et les pathologies associées. Les mécanismes d’adaptation à une alimentation riche en matière grasse chez la souris sont très proches des mécanismes observés chez l’Homme. Les animaux seront âgés de 6 semaines à l’achat et d’environ 7 semaines lors du début du protocole. Ces animaux correspondent donc à de jeunes adultes, afin de ne pas faire intervenir de paramètres confondants tels que le vieillissement.

Du chlorure de fer à 20 % appliqué sur l'artère cérébrale moyenne provoque un accident vasculaire cérébral chez 924 souris, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit un cathéter dans la veine caudale, passe cinq séances d'IRM sous anesthésie entre le jour de l'occlusion et le quatorzième jour, et termine par une ouverture du thorax et de l'abdomen suivie d'une ponction cardiaque. Les molécules testées viennent de partenaires industriels qui financent le projet et attendent, en cas de résultats favorables, un passage en essais cliniques puis une mise sur le marché. Le porteur annonce une batterie de trois tests comportementaux qu'il qualifie d'indolores, répétés à sept dates, sans préciser lesquels.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) ischémique est une pathologie neurologique causée par la formation d’un caillot (thrombus) entraînant l’occlusion partielle ou totale d’une artère cérébrale. Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA ainsi que de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Bénéfices attendus

Actuellement, la prise en charge des patients en phase aigüe de la pathologie repose sur l’administration de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA), capable de dissoudre les thrombi riches en fibrine, associée ou non à la thrombectomie chirurgicale. Cependant, en raison des effets secondaires du tPA et de la difficulté relative de la procédure de thrombectomie, seule une faible proportion des patients (

Procédures

Les 924 animaux de cette demande d’autorisation de projet seront soumis à une chirurgie au niveau de la tête pour appliquer une solution de chlorure de fer à 20% au niveau de l’artère cérébrale moyenne (ACM) pour aboutir à l’occlusion de l’ACM. Cet acte chirurgical, se déroulant à J0, durera 15 à 20 minutes et l’animal restera endormi environ 1 heure. La pose d’un cathéter dans la veine caudale sera nécessaire pour tous les animaux afin d’administrer un ou plusieurs traitements en intraveineux ainsi que les agents de contraste nécessaires à la réalisation de séquences IRM s’intéressant à la neuroinflammation et l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique. La pose de cathéter prendra environ 5 minutes. À J0, J1, J2, J5 et J14, les animaux seront soumis à l'IRM-7T sous anesthésie générale, pour une durée variant de 15 à 45 minutes en fonction des séquences réalisées. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Les animaux passeront également une batterie de test comportementaux indolores visant à tester les déficits et la récupération sensorimotrice au cours du temps, jusque 7 jours avant l’induction de l’AVC pour déterminer l’activité basale, puis à J1, J2, J3, J5, J7, J14 et J21. Chaque animal passera moins de 10 minutes pour chacun des trois tests. Une randomisation sera effectuée pour répartir les animaux en plusieurs sous-groupes expérimentaux, de manière à ce que chaque animal ne participe pas à l'ensemble des jours d'acquisition. Enfin, à la fin du projet, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.

Impact sur les animaux

Le modèle, par définition, reproduit les effets d’un AVC ischémique, à savoir des déficits sensorimoteurs induits par les lésions cérébrales au niveau du cortex somatosensoriel et prémoteur. Les déficits fonctionnels sont considérés comme léger à court et moyen terme dans ce modèle d’AVC, mais peuvent occasionnellement entraîner des pertes d’équilibres et une faiblesse musculaire des membres opposés à la lésion chez l’animal. A long-terme les déficits fonctionnels ne sont plus que légèrement perceptibles. Tout au long de l’étude l’animal peut aisément continuer à s’alimenter, s’abreuver et se fabriquer un nid avec les enrichissements mis à disposition dans la cage.

Devenir

A la fin du projet, tous les animaux seront donc mis à mort permettant le prélèvement du cerveau post fixation pour analyse.

Remplacement

Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC ischémique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.

Réduction

Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées surtout à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 18 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à des erreurs techniques ou à de la mortalité, l’augmentation de l’effectif de 22 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 18 animaux par groupe. Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche. Ainsi, en optimisant le nombre d'animaux utilisés, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris arriveront au laboratoire en groupes sociaux puis seront stabulés à un par cage le temps de l’expérimentation pour éviter les conflits entre les souris et faciliter la phase de récupération post-opératoire. Au sein de chaque cage, les animaux auront accès à divers types d’enrichissements : sizzle-dri kraft, coton et demi-sphère de cellulose ainsi qu’accès illimité à la nourriture et à l’eau. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Les animaux seront pesés 2 fois par semaine au minimum. Pendant l’opération chirurgicale d’AVC ischémique, l’animal sera profondément anesthésié avec de l’isoflurane dans un mélange d’air sous couverture analgésique 15 minutes avant la première incision cutanée. Sur le cadre stéréotaxique, pour limiter les douleurs liées aux barres d’oreilles, une anesthésie locale sera également appliquée. De plus, chaque site d’incision sera précédé d’une tonte du pelage et d’une désinfection. La température corporelle de l’animal sera maintenue à 37.5 ± 0.5°C grâce à un système de couverture chauffante rétrocontrôlée et à une couverture isothermique placée sur le dos de la souris. Le choix de la technique de sutures se portera sur la méthode des points séparés, offrant une plus grande résistance que le surjet par exemple, et limitant le risque pour l’animal de rompre ses points et donc de déhiscence de la plaie. Lors de la phase de réveil, l’anesthésie sera coupée, et le débit d’oxygène sera élevé à 1 L/minute pour permettre une meilleure récupération post-opératoire de la souris au sein de sa cage individuelle. Même si la surveillance des animaux s’effectuera en continue, elle sera accrue pendant les premières heures de réveil. En cas de constatation post-opératoire de dépassement des points limites de souffrance ou de stress fixés en amont de l’étude, l’animal sera mis à mort par dislocation cervicale. Pour cela, une surveillance stricte des souris sera réalisée pendant les jours suivant l’opération chirurgicale.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) occupe une place prépondérante dans la recherche sur les maladies neurodégénératives, particulièrement dans le développement de stratégies thérapeutiques. Cette prééminence découle de divers facteurs comme les homologies vasculaires et génétiques entre l’Homme et la souris, la facilité de manipulation génétique, le coût relativement bas, et la logistique aisée associée à l'élevage et la stabulation de ces rongeurs. Ces caractéristiques (entre autres) font de la souris un modèle animal privilégié pour la recherche préclinique. Dans le contexte spécifique de l'AVC ischémique, l'utilisation de la souris devient incontournable car elle offre la possibilité d'une analyse comparative et critique des résultats avec ceux obtenus dans notre laboratoire et ailleurs, renforçant ainsi la fiabilité des conclusions et leur applicabilité potentielle chez l'Homme. Les animaux utilisés seront âgés d’environ 10 semaines le jour de l’induction de l’AVC pour un poids moyen de 35g. Nous effectuerons notre modèle sur des jeunes adultes afin de pouvoir comparer les données de cette étude avec celles déjà disponible dans notre laboratoire et dans la littérature scientifique du domaine.