Rongeurs

Gavées de prednisone tous les jours pendant un mois ou injectées à la dexaméthasone trois jours de suite, sans anesthésie ni analgésique, 960 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour des analyses moléculaires et histologiques. Trois semaines de nourriture médicamenteuse puis cinq jours d'injections intrapéritonéales servent d'abord à désactiver dans leur muscle deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes. Un test d'agrippement, réalisé une seule fois en trois essais, mesure ce qu'il reste de force musculaire. Le porteur écrit qu'aucun effet secondaire majeur n'avait été observé lors d'études comparables, tout en prévoyant d'exclure les souris ayant perdu plus de 20 % de leur poids en une semaine et en signalant que le gavage répété peut causer des fausses routes et une irritation de la gorge.

Objectifs

Les glucocorticoïdes (cortisol chez l'homme et corticostérone chez la souris) sont des hormones exerçant différents effets chez les mammifères. Elles contribuent en particulier au métabolisme, à la réaction immunitaire et à la réponse au stress. En raison de leurs propriétés anti-inflammatoires, les glucocorticoïdes sont des traitements largement prescrits qui ont révolutionné le domaine de la médecine. En effet, les composés comme la prednisone et la dexaméthasone sont couramment utilisés pour traiter les maladies inflammatoires chroniques telles que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques, l'asthme et certaines myopathies. Néanmoins, leur utilisation prolongée peut entrainer d'importants effets secondaires, comme le diabète de type 2, l'ostéoporose ou l’atrophie musculaire. Les effets des glucocorticoïdes sont relayés par le récepteur des glucocorticoïdes appelé GR. Il est communément admis que GR une fois lié à son hormone est convoyé dans le noyau de la cellule, où il se lie à l’ADN pour activer ses gènes cibles. Il effectue cette tache en coopération avec d’autres protéines qui sont appelées des « corégulateurs ». L'objectif de ce projet est d'identifier le rôle de deux de ces corégulateurs dans l'atrophie musculaire dépendante des glucocorticoïdes en utilisant des souris dans lesquelles ils sont sélectivement supprimés (mutés) dans le muscle squelettique. Le projet sera mené sur deux établissements utilisateurs (ci-après EU1 et 2 par souci de simplicité). Les animaux seront produits et élevés dans l'EU1. La mutation sera induite dans l'EU1 ou dans l'EU2 s'il s'avère que le personnel de l'EU1 n'est pas disponible. Les autres traitements seront réalisés dans l'EU2 afin que nous puissions suivre l’évolution des animaux. En effet, notre équipe travaille sur ces modèles depuis de nombreuses années et peut ainsi anticiper les dommages occasionnés. Par ailleurs, les animaux seront déjà présents dans l'EU2, à laquelle les membres de l'équipe ont accès, afin d’effectuer des tests d'agrippement, évitant ainsi un nouveau stress généré par le transfert. S’il s’avère que les membres de l’équipe ne sont pas disponibles, les traitements pourront être réalisés dans l'EU1 afin de ne pas gâcher de groupe.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces études nous permettra d'identifier le rôle de deux corégulateurs du récepteur des glucocorticoïdes dans le muscle au cours de l'atrophie musculaire provoquée par les glucocorticoïdes. Contrôler l'activité du récepteur des glucocorticoïdes en modulant celle des co-régulateurs ouvrirait de nouvelles perspectives thérapeutiques pour réduire les effets indésirables causés par les traitements prolongés avec ces hormones.

Procédures

Les animaux pour lesquels la mutation doit être induite (groupe 1 et 2) seront traités par le biais d’une nourriture spécifique pendant 3 semaines, puis par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec/ souris). Le groupe 1 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement aigü aux glucocorticoïdes sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre le rôle des deux corégulateurs dans l'atrophie musculaire induite par un traitement prolongé aux glucocorticoïdes sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Le groupe 3 sera injecté une seule fois par jour pendant 3 jours avec le composé ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 4 sera traité avec le composé ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 1 mois. Un test d'agrippement sera réalisé une seule fois en triplicat sur l'ensemble des cohortes à la fin des traitements (30 sec/ souris) .

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues dans ce projet sont toutes maîtrisées par notre équipe et les expérimentateurs prévus sur ce projet. Par ailleurs, le nombre d’injection et la période prévues de traitement ont été définies car on sait qu’aucun effet secondaire majeur n’avait été observé auparavant lors d’études comparables. Néanmoins nous ne pouvons exclure le risque d’infection due au point d’injection qui sera surveillé. Les traitements aux glucocorticoïdes durant de longue période peuvent entrainer une fonte musculaire, c’est pourquoi nous prendrons soin d’exclure les animaux ayant perdu plus de 20% de leur poids corporel en une semaine. De plus, le gavage répété peut conduire à des fausses routes et une irritation de la gorge pouvant impacter la prise alimentaire que nos pesées régulières nous permettrons d’observer rapidement. Le projet cible les muscles squelettiques, c’est pourquoi la démarche de la souris sera examinée afin de s’assurer qu’elle ne présente pas de difficultés à se déplacer (boitement, absence de déplacement, …).

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer les effets des glucocorticoïdes synthétiques (Dex et Prednisone) sur l'atrophie musculaire, le recours à un organisme entier est nécessaire. En effet, même si des myotubes en culture peuvent être utilisés pour modéliser le muscle squelettique et connaitre les effets directs des glucocorticoïdes au niveau moléculaire, ils ne permettent pas de récapituler le microenvironnement musculaire ainsi que les nombreux facteurs et hormones intervenant dans l’homéostasie tissulaire. Ainsi, il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant contribuer à ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle de mutation et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test statistique. De plus, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'analyse d'expression des gènes et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux.

Raffinement

Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage, son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L'injection de dexaméthasone n'est en général pas problématique pour l'animal. Néanmoins, si l'injection est mal effectuée et entraine des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.

Choix des espèces

Les effets des glucocorticoïdes sur un type cellulaire donné impliquent des voies de signalisation complexes ainsi que le microenvironnement cellulaire. Ainsi, l'utilisation de modèles cellulaires reste limitée. La souris présente un intérêt particulier pour l'administration de traitements pharmacologiques du fait de sa facilité de manipulation, mais aussi de la similarité avec l'homme, tant au niveau histologique qu'au niveau du type de réponse aux traitements. Par ailleurs, les techniques de mutagénèses conditionnelles ne sont disponibles que chez les souris et sont validées pour des études physiopathologiques de gènes. Le projet s’intéresse au rôle de GR et deux de ses co-régulateur dans l'atrophie musculaire de l’organisme adulte. Les animaux inductibles seront donc traités au tamoxifène entre 5 et 7 semaines d'âge et étudiés dans les semaines suivant l'injection.

Modifiées pour que le récepteur des glucocorticoïdes puisse être désactivé dans leurs cellules souches musculaires, 1 440 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le génotypage passe par un tatouage au doigt ou l'amputation de la première phalange, sur des souriceaux de 7 à 10 jours. Suivent cinq injections de tamoxifène, une injection de cardiotoxine qui lèse le muscle, puis selon les groupes de la dexaméthasone en intrapéritonéal ou un gavage quotidien de prednisone pendant deux fois sept jours, le porteur précisant qu'aucune anesthésie ni aucun analgésique n'est prévu. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure pour des analyses moléculaires et histologiques, celles qui perdent plus de 20 % de leur poids en une semaine étant sorties de l'étude et tuées.

Objectifs

Les muscles représentent plus de 40 % de la masse corporelle et permettent le maintien de la posture et le déplacement. Suite à une lésion, le muscle squelettique adulte est capable de se régénérer à partir des cellules satellites, des cellules souches localisées à la périphérie des fibres musculaires. Ce processus prend environ un mois à l'issue duquel les muscles sont régénérés et le pool de cellules satellites disponible pour une éventuelle nouvelle lésion est rétabli. Bien que les cellules satellites possèdent un grand potentiel en médecine régénérative, les mécanismes régulant leur prolifération et leur différentiation sont encore mal caractérisés. Les glucocorticoïdes, comme la prednisone, sont des anti-inflammatoires prescrits dans le cas de maladies chroniques telles que l’asthme ou l’arthrite rhumatoïde. Cependant, des traitements prolongés avec ces composés peuvent induire une perte de la masse musculaire, posant un sévère problème clinique, en particulier chez les personnes âgées. Les glucocorticoïdes exercent leurs actions via leur récepteur, le récepteur des glucocorticoïdes (GR), qui va contrôler l’expression de gènes cibles. Des études in vitro montrent que les glucocorticoïdes promeuvent la différenciation cellulaire. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels les glucocorticoïdes sont impliqués dans la régénération musculaire en jouant sur la différenciation des cellules satellites. Pour ce faire, nous invaliderons sélectivement GR dans les cellules satellites avant d'induire une lésion à la cardiotoxine, et nous déterminerons si un traitement avec un agoniste du récepteur des glucocorticoïdes permet une amélioration ou au contraire une aggravation des dommages musculaires.

Bénéfices attendus

L'ensemble de ces procédures permettra de déterminer le potentiel thérapeutique des glucocorticoïdes dans le processus de régénération musculaire.

Procédures

Les animaux issus des croisements sont identifiés par tatouage au doigt ou amputation de la première phalange. Cette procédure est réalisée entre 7 et 10 jours après la naissance. L'ensemble des animaux subiront 5 injections au tamoxifène pour induire la mutation par voie intra-péritonéale pendant 5 jours (30 sec / souris), ainsi qu'une injection de cardiotoxine pour induire une lésion musculaire (30 sec / souris). Le groupe 2 qui nous permettra de comprendre l'impact d'un traitement aigü aux glucocorticoïdes dans la régénération musculaire sera en plus injecté une seule fois par jour pendant 3 jours à la dexaméthasone ou avec un placebo par voie intra-péritonéale (30 sec/ souris). Le groupe 3 qui nous permettra de comprendre l'impact d'un traitement chronique aux glucocorticoïdes dans la régénération musculaire sera quant à lui traité à la prednisone ou avec un placebo par gavage (1 min/ souris) tous les jours pendant 2 fois 7 jours.

Impact sur les animaux

L’injection de tamoxifène peut très rarement causer des infections. Le site d'injection sera surveillé chaque jour, et désinfecté si besoin. L'injection de cardiotoxine engendrera une douleur au niveau du muscle lésé. Le gavage peut conduire à des fausses routes et les traitements aux glucocorticoïdes peuvent entrainer une fonte musculaire allant jusqu'à une perte de 20% du poids du muscle. Dans les deux cas, les animaux seront sortis de l'étude et mis à mort. La phalangectomie effectuée pour le génotypage peut engendrer une douleur légère et de courte durée.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure expérimentale pour des études moléculaires et histologiques.

Remplacement

Afin de déterminer le potentiel thérapeutique des molécules identifiées dans des systèmes cellulaires, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans la régénération fibrillaire. Ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte. A ce titre, la souris est un modèle de référence. En effet, l'histologie des muscles de la souris et la cinétique de régénération sont similaires à celles de l'Homme. Par ailleurs, le temps de gestation de la souris est relativement court (21 jours en moyenne) et permet la production de larges cohortes, contribuant à la production de résultats significatifs.

Réduction

De nombreuses études menées au laboratoire ont apporté une bonne connaissance du modèle CreERT2 et de la méthodologie à utiliser, permettant ainsi la mise en place d’expérimentations de qualité et raffinées sur un nombre limité de cohortes. Cela permettra l'utilisation d'un nombre d'animaux limité au strict minimum, tout en assurant une pertinence statistique et qualitative des résultats. Pour réaliser le type d’analyses envisagées, un faible nombre d’animaux est requis par groupe, à savoir 10 animaux par condition. En effet, pour une même souris une patte sera utilisée pour l'extraction d'ARN et l'autre patte pour les analyses histologiques, limitant ainsi le nombre d'animaux. De plus, les études montrent qu’il faut 10 animaux par condition pour détecter la différence escomptée à l’aide d’un test de Student ou d'une ANOVA au risque de se tromper de 5%.

Raffinement

Le risque d’infection sera pris en considération au niveau de la zone d’injection du tamoxifène, de cardiotoxine et des glucocorticoïdes. Les animaux utilisés pour ces expérimentations seront observés quotidiennement. L’état de chaque souris sera référencé dans un tableau comprenant des indicateurs comportementaux et physiologiques permettant de détecter la souffrance des animaux. Les paramètres utilisés seront le poids, la posture de l’animal, l’état de son pelage et son activité. Par exemple, si l'animal présente un dos vouté, un pelage hérissé ou est inactif après stimulation, ces observations seront référencées dans le tableau. Ces indicateurs nous permettront d’anticiper toute souffrance inutile, et d’intervenir au plus vite afin d’améliorer le bien-être de l’animal. Si l’un des animaux atteint le point limite, celui-ci sera immédiatement mis à mort. De plus, en cas de diminution de plus de 20% du poids corporel sur une semaine, l'animal sera sorti du lot et une euthanasie sera réalisée. L’injection de dexaméthasone et le gavage à la prednisone ne sont en général pas problématiques pour l'animal. Néanmoins, s’ils sont mal effectués et entrainent des souffrances pour l'animal pouvant éventuellement causer sa mort, celui-ci sera euthanasié afin d'éviter toute douleur inutile. Le risque de fausse route au moment du gavage sera également pris en compte. Les expérimentations prévues dans ce protocole seront exécutées sur l'animal vigile. Nous n'avons pas prévu d'anesthésier les souris, ni de leur administrer d'analgésiques.

Choix des espèces

Afin de déterminer le potentiel thérapeutique des molécules identifiées dans des systèmes cellulaires, le recours à un organisme entier est nécessaire. Par ailleurs, de nombreux facteurs et hormones interviennent dans la régénération fibrillaire. Ainsi il est nécessaire d’utiliser un modèle in vivo afin que tous les facteurs physiologiques pouvant intervenir dans ce processus soient pris en compte. Le projet s’intéresse au rôle de GR dans la régénération musculaire de l’organisme adulte. Les animaux seront donc traités au tamoxifène entre 7 et 11 semaines afin d'effectuer les expériences sur des animaux adultes. Ils seront ensuite analysés un mois ou un an après afin de déterminer le rôle des glucocorticoïdes chez les souris jeunes et âgées.

Contenues et pesées deux fois par semaine, les souris sont examinées à la recherche de ganglions hypertrophiés, d'une posture voûtée ou d'une perte de poids, signes que le lymphome se développe et qu'il faut les tuer avant leur mort "naturelle". 1 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes et leurs tumeurs. L'objectif est de constituer un stock de tumeurs à partir duquel une même tumeur sera réimplantée dans plusieurs souris receveuses, pour alimenter de futures études précliniques sur le lymphome diffus à grandes cellules B. Le porteur annonce que certaines souris recevront une injection d'une minute pour ce transfert de cellules tumorales, sans dire combien, et ne mentionne aucune analgésie.

Objectifs

Le lymphome est le cancer du sang le plus répandu et le sixième cancer le plus répandu dans le monde. Le lymphome diffus à grandes cellules B est une forme agressive de lymphome, représentant 30 à 40 % des cas. Le traitement actuel du lymphome diffus à grandes cellules B consiste en une chimiothérapie ou une greffe de moelle osseuse ; cependant, environ 40 % des patients cessent de répondre au traitement (maladie récidivante) ou ne répondent pas au traitement (maladie réfractaire), généralement avec des conséquences fatales. Il est donc urgent de trouver des traitements plus efficaces pour ces lymphomes. Actuellement, il y a un manque de modèles expérimentaux qui ressemblent avec précision au lymphome diffus à grandes cellules B. L'objectif de ce projet est de générer des lymphomes à l'aide d'un nouveau modèle de souris permettant de suivre l'initiation et la progression du lymphome. Ce modèle nous permettra d'étudier les causes du développement du lymphome ; et grâce à l'expansion de ces tumeurs chez des souris receveuses, nous générerons suffisamment de matériel pour des applications précliniques, y compris de futures études in vitro et in vivo.

Bénéfices attendus

À court terme (1-3 ans), nous générerons des informations importantes sur les gènes et les voies qui contribuent à l’apparition et à la progression du lymphome, qui sont actuellement inconnus. À long terme (3-5 ans), ces modèles permettront de réaliser des études précliniques pour identifier de nouvelles façons de tester de nouvelles thérapies afin de faire progresser les traitements contre les cancers du sang.

Procédures

Les souris qui développeront des lymphomes seront surveillées. Nous manipulerons (contention) les animaux deux fois par semaine pour les peser et les observer à la recherche de signes de formation de tumeurs : perte de poids, réduction des mouvements, posture voûtée, fourrure ébouriffée, hypertrophie des ganglions lymphatiques, changements de comportement pour mettre à mort les souris avant leur mort « naturelle ». Les tissus seront collectés pour déterminer les causes de la formation de tumeurs et générer un référentiel de tumeurs. Certaines souris recevront une injection pendant 1 minute pour transférer des cellules tumorales.

Impact sur les animaux

Les symptômes associés au lymphome comprennent : perte ou prise de poids, respiration rapide, pelage ébouriffé, posture voûtée et/ou de mouvements lents. En outre, la manipulation des souris pendant la surveillance du développement du lymphome peut induire du stress. Et il peut y avoir une inflammation au site d’injection. Des injections entrainent également du stress et des douleurs légères de courte durée.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux en fin de procédure nécessaire pour la récupération des organes et la récupération des tumeurs pour leur étude ultérieure.

Remplacement

Compte tenu de la complexité du processus impliqué dans la formation des lymphomes, résoudre ce problème uniquement par l’analyse in vitro n’est pas suffisant et l’utilisation de modèles animaux est essentielle. Par conséquent, pour l’instant, aucune méthode alternative ne permet de remplacer complètement le modèle murin dans notre étude. Cependant, les résultats obtenus à partir de nos expérimentations permettront de développer un protocole in vitro qui pourrait à terme remplacer partiellement les modèles animaux. De même, la même tumeur récoltée peut être utilisée pour implanter plusieurs souris receveuses, limitant ainsi la nécessité d’augmenter le nombre de souris donneuses.

Réduction

L'élevage sera géré en externe, et nous permettra de limiter le nombre de croisements au minimum afin d'obtenir le bon nombre de souris nécessaire à ce projet. Nous utiliserons des souris mâles et femelles puisque le lymphome affecte les deux sexes. Nous utiliserons des statistiques prédictives pour établir la constitution des groupes. De plus, les cellules tumorales excédentaires récoltées sur des souris mises à mort seront congelées pour créer une banque de tumeurs, afin de minimiser le nombre de souris nécessaires pour fournir du matériel pour de futures expériences.

Raffinement

Nous avons établi une grille d'évaluation avec des seuils précoces adaptés pour détecter les lymphomes suffisamment tôt afin de réduire au maximum la souffrance animale tout en conservant une rigueur scientifique. Cela comprend une surveillance accrue lors de l'observation de changements de poids, de mouvements, d'apparence physique et de comportement ; et arrêter l'expérience lorsque les symptômes du lymphome apparaissent. De plus, si les souris présentent des égratignures ou des blessures, nous utiliserons une solution d'iode pour désinfecter la zone.

Choix des espèces

Les souris sont les espèces les plus utilisées pour étudier la formation et le développement des lymphomes en raison de la flexibilité nécessaire pour effectuer des manipulations génétiques (souches avec des gènes désactivés) et de la possibilité de tester l'agressivité de la maladie par le transfert de cellules tumorales dans des souris réceptrices. Ils ont également un cycle de vie court et se reproduisent facilement. Pour les expériences de développement de lymphomes, les souris vieilliront jusqu'à 14 mois, puisque la latence de cette maladie, d'après nos études précédentes, se situe entre 8 et 14 mois. Pour les expériences impliquant le transfert de cellules de lymphome, des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines sont couramment utilisées comme souris receveuses.

Des injections quotidiennes d'immunoglobulines prélevées chez des patients, pendant sept à dix-sept jours, provoquent chez la souris une myopathie nécrosante avec perte de force musculaire. 154 souris, dont une partie immunodéficientes, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever les muscles gastrocnémiens. Elles subissent en plus deux à quatre microprélèvements sanguins sous anesthésie, jusqu'à cinq tests d'agrippement et une mesure de force in situ de dix minutes. Le porteur affirme que l'atteinte musculaire n'a pas de répercussion visible en termes de souffrance, tout en décrivant une échelle qui va de la queue traînante à la paralysie du train arrière et un protocole arrêté au score 2.

Objectifs

Au sein des myopathies inflammatoires, les myopathies nécrosantes auto-immunes (MNAI) sont définies histologiquement par la présence d'une importante nécrose des fibres musculaires sans infiltrat inflammatoire. La nature auto-immune des myopathies nécrosantes a été suggérée par leur association fréquente à la présence d'autoanticorps (aAc) ; dont l'aAc anti SRPP (anti-3-Hydroxy-3-MethylGlutaryl-Coenzyme A Réductase) avec une corrélation du titre avec la myolyse. Notre laboratoire a établi un modèle murin de MNAI par injection à des souris d'immunoglobulines G purifiées issues de patients porteurs cet d’aA anti-HMGCR. Ce transfert induit une myopathie clinique avec diminution de la force musculaire associée à un dépôt d’IgG et de molécules du sytéme du complément à la surface des fibres musculaires, démontrant le caractère directement pathogène des aAc et suggérant un rôle cytotoxique exclusif du complément. Nous avons déja démontré l'efficacité préventive d'un inhibiteur spécifique du complément. L'objectif général de notre programme est d'évaluer l'efficacité thérapeutique d'un nouvel inhibiteur spécifique du complément humain dans notre modèle murin de MNAI par transfert d'anticorps de malades et de la comparer à celle d'un autre inhibiteur commercialisé mais de spécificté différente et de la molécule antagoniste. Pour ne pas avoir de réponse xénogénique lors de la procédure évaluant le rôle curatif de cette molécule, nous aurons recours à des souris immunodéficientes. L’étude des animaux se fera par (i) une observation clinique (suivi du poids), (ii) une mesure de la force musculaire chez l’animal anesthésié et (iii) par une analyse sanguine et des tissus musculaires.

Bénéfices attendus

Lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal, nous avons pu démontré l'efficacité de molécules thérapeutiques dans (i) l'apparition et (ii) le traitement de la myopathie. Cela s'est traduit par respectivement (i) une absence d'atteinte histologique et de diminution de la force musculaire et (ii) par une réduction significative de l'atteinte histologique et une restauration de la force musculaire. Avec ce nouvel inhibiteur du fragment C2 du complément nous pouvons nous attendre à une restauration partielle ou complète de la fonction musculaire de l'animal ouvrant ainsi la porte à un essai clinique chez les patients atteints de MNAI.

Procédures

Les animaux seront soumis à des microprélèvements de sang (2 à 4 en fonctions des groupes d'animaux) de 75 microlitres, prélèvement sur souris anesthésiée, durée de l'acte 20 secondes. Les souris seront injectées quotidiennement avec du complément, par voie intra péritonéale (IP), durant 7 à 17 jours selon les groupes, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Injection des immunoglobulines G en IP, de 2 à 5 fois par souris selon les groupes, sur respectivement une période de 7 à 17 jours, injection d'une durée de moins de 10 secondes. Une mesure de la force musculaire par test d'agrippement (grip test) sera réalisée pour chacune des souris, durée moins de 10 secondes, jusqu'à 5 tests sur le temps de suivi des souris. Mesure de la force musculaire in situ-sur souris anesthésiée, 1 seule mesure par souris, en fin de procédure, durée 10 minutes.

Impact sur les animaux

L'injection d'anticorps de malades atteints de MNAI chez la souris entraine l'apparition d'une myopathie se traduisant par une diminution de la force musculaire. L’expérience acquise lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal dans l'évaluation de molécules thérapeutiques a montré que l'atteinte musculaire n'avait pas de répercussion visible chez l'animal en terme de souffrance ou de perte de poids.

Devenir

Le prélèvement des gastrocnémiens pour analyse histologique ne permettra pas de maintenir les animaux en vie.

Remplacement

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de moléculesinhibitrices du complément dans une perspective d’approche à visée thérapeutique. Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro pour une telle étude combinée de la réponse humorale et de la physiologie du muscle. Ce projet ne peut donc être réalisée que chez l'animal.

Réduction

Le nombre de souris utilisées a été réduit à son minimum grâce l'expérience acquise lors d'autre protocoles expériementaux utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'auto-anticorps chez la souris. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis de faire un calcul statistique excat des effectifs nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures de la force musculaire, ainsi que de la variabilité des réponses notamment immunologique obervées lors de ces protocoles.

Raffinement

L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées : température, hygrométrie, cycle jour/nuit, change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages enrichies avec un abri de celllose et des fibres de coton. De plus, en raison de leur sensibilité aux infections, les animaux seront maintenues en portoir ventilé. Les prélèvements sanguins, la mesure de la force musculaire et la mise à mort des animaux seront réalisés sous anesthésie gazeuse grâce à un matériel dédié. Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie et permet de déterminer un point limite dans l’ensemble des expériences. Cette échelle est définie de la façon suivante: Score 0 : condition physiologique (pas de signe clinique) ; Score 1 : faiblesse du train arrière, queue trainante ; Score 2 : diminution de l’activité locomotrice des pattes arrières, courbure du dos significative ; Score 3 : paralysie du train arrière. Elle permettra également d’évaluer la douleur des animaux et de mettre en place une procédure visant à la limiter. En effet, les animaux seront observés quotidiennement et l'apparition de signes cliniques, poils hirsutes, perte de poids visible (sans pesée) ou prostration, ou lorsque le score 1 de l’échelle de gravité des symptômes seront atteints entraineront la mise en place de dispositions pour réduire la douleur. Un traitement préventif quotidien de la douleur sera mis en place lors de la première injection des anticorps pour les animaux de tous les lots. Le protocole sera arrêté lorsque le score 2 ou le point limite qui a été défini seront atteints. Un analgésique sera administré en sous cutané 30 minutes avant la mesure de la force musculaire in situ. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement par un des tests adaptés.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivie des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Il permet également de n'utiliser que de faibles quantités d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de malades qui sont difficiles à obtenir. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.

Perte de poids d'au moins 20 %, hypothermie, anorexie prolongée, automutilation : les rongeurs qui présentent ces signes plus de 24 heures sont sortis des expériences et tués. 4 850 souris et 2 500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes et de sang. Ils reçoivent des psychostimulants jusqu'à trois fois par semaine pendant six semaines, développent hyperactivité et stéréotypies de léchage, de rognage et de reniflement, et passent jusqu'à dix-huit tests de locomotion d'une heure dix, plus sept passages en labyrinthe en T le même jour. L'objet réel est le criblage de molécules pour des formulations dissuasives, associant un stimulant prescrit et un composé censé en limiter l'abus, avant une éventuelle utilisation chez l'être humain.

Objectifs

Les psychostimulants prescrits sont aujourd’hui indiqués pour le traitement du trouble du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité (TDAH). Ces traitements vont réduire les symptômes liés à la maladie en augmentant l’attention et la vigilance et en réduisant l’hyperactivité. Ils sont généralement sans danger lorsqu’ils sont utilisés à des doses thérapeutiques via la voie d’administration autorisée. Cependant, ces stimulants présentent un potentiel addictif important et sont classés comme substance contrôlée par les organismes de réglementation. L’abus et le mésusage de psychostimulants est devenu un problème de santé majeur. Ces médicaments sont détournés de leur usage normal dans un but récréatif. En effet, le mésusage des médicaments prescrits sur ordonnance peut inclure : la prise d’une dose incorrecte, ou au mauvais moment, oublier de prendre une dose, arrêter le médicament trop tôt. L’abus est défini comme soit l’utilisation sans ordonnance, soit en plus grande quantité et/ou plus souvent, soit par une voie d’administration non autorisée telle que la voie intranasale ou intraveineuse.

Bénéfices attendus

Ce projet en général se focalise sur l’étude et la validation, dans un contexte physiopathologique pertinent, de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques ou de molécules déjà approuvées pour une autre indication pouvant avoir un effet dans la prévention de l’utilisation abusive, de la dépendance et de l’addiction aux stimulants prescrits. Les retombées attendues incluent le screening in vivo de molécules efficaces, l’étude de leur mécanisme d’action et l’évaluation des meilleurs candidats avant une éventuelle utilisation en clinique chez l’homme. Ainsi, nos études permettront de trouver et de développer potentiellement des formulations dissuasives par combinaison d’un stimulant et d’une molécule pour prévenir les abus, les mésusages et l’addiction associés à la prise de psychostimulants.

Procédures

Les animaux ne subiront pas de procédures chirurgicales. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animaux anesthésiés au cours et en fin de procédure (soit entre 1 et 3 prélèvements maximum par animal). Tous les animaux recevront une injection sous cutanée pour l’implantation de la puce d’identification RFID. Les animaux recevront les administrations des traitements soit par voie intrapéritonéale, orale ou intraveineuse. Pour la procédure 2, en cas d’administration par voie intrapéritonéale ou orale, les animaux recevront 3 injections par semaine pendant 6 semaines maximum. En cas d’administration par voie intraveineuse, la fréquence est adaptée et les animaux recevront 2 injections par semaine pendant 4 semaines maximum. Concernant les tests comportementaux, pour la procédure 1, les animaux seront soumis à 2 tests de locomotion sur 3 jours (pour une durée totale de 2 heures et 20 minutes). Pour la procédure 2, les animaux seront soumis à 18 tests maximum de locomotion sur une période de 6 semaines (3 tests/semaine) qui dure chacun 1 heure et 10 minutes. Pour la procédure 4, les animaux seront soumis à 7 tests au sein du labyrinthe en T qui auront lieu le même jour (soit 20 minutes de test maximum par animal le jour du test). Tous les animaux seront manipulés et observés plusieurs fois par semaine pour déterminer les scores des points limites.

Impact sur les animaux

Du fait de l’administration aigu ou chronique de psychostimulants, les animaux vont développer une hyperactivité et/ou des stéréotypies comportementales (mouvements anormaux et involontaires de type léchage, rognage, reniflement) lors des sessions expérimentales. Ces comportements sont transitoires et disparaissent au bout d’une ou deux heures pour l’hyperlocomotion ou au bout de plusieurs minutes pour la stéréotypie après l’administration du stimulant. Ces comportements seront surveillés lors de chaque expérimentation. L’administration aigue d'une molécule va induire des déficits cognitifs qui seront transitoires (24 heures). Une session d’acclimatation ou test d’essai seront réalisés afin de réduire le stress des animaux au nouvel environnement. Également, l’isolement et le changement de boisson intervenant dans certaines expérimentations peuvent induire du stress et de l’anxiété chez les animaux. Ces paramètres seront surveillés en observant le comportement de l’animal dans sa cage, en vérifiant la prise de nourriture et de boisson. De plus, le poids des animaux sera suivi entre 2 et 5 fois par semaine. Nous n’attendons pas de nuisance liée à l’administration des traitements (doses non toxiques).

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés. Certains organes seront récupérés et des prélèvements sanguins seront réalisés.

Remplacement

Ce projet se focalise sur des modèles expérimentaux d’hyperactivité, de sensibilisation comportementale et de TDAH nécessitant l’utilisation d’animaux. En effet, ce sont des modèles qui étudient principalement le comportement de l’animal et il n’existe pas de modèle cellulaire ou autre pouvant reproduire nos procédures expérimentales. Bien que des expériences in vitro seront réalisées en amont, l’espèce rat ou souris à travers nos différents modèles reproduisent au mieux la pathophysiologie humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.

Réduction

Pour les expérimentations, il a été prévu un nombre suffisant d’animaux en accord avec la littérature existante ou nos expériences précédentes pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats et pour avoir le nombre de contrôles internes suffisant, afin de pouvoir conclure sur l’efficacité de notre combinaison (stimulant/molécule). Ce protocole ne sera mis en place qu’avec des molécules thérapeutiques qui auront montré une efficacité lors d’études précédentes afin de limiter l’utilisation des animaux.

Raffinement

Toutes les procédures induisant une douleur seront réalisées sous anesthésie (implantation des puces d’identification) durant toute la procédure expérimentale afin de maîtriser et limiter la douleur et la souffrance des animaux. Les animaux seront sous surveillance rapprochée pendant toute la durée de l’étude. Les animaux trouvés dans des conditions moribondes et les animaux montrant une douleur sévère et montrant des signes de détresse seront mis à mort. Les points limites sont définis selon les Directives de l’OCDE (document ENV/JM/MONO(2000)7) et incluent notamment : une perte de poids supérieure ou égale à 20% par rapport au poids initial, une hypothermie, une absence prolongée de réponse volontaire à un stimulus externe comme le bruit, des problèmes ambulatoires empêchant l’animal d’accéder à la nourriture ou à l’eau/anorexie prolongée, difficulté à respirer, automutilation, blessure ou ulcération de la peau etc. Un tableau de suivi a été mis en place en adaptant les points limites au seuil le plus bas. Si les signes persistent au bout de 24h, l’animal sera sorti des procédures expérimentales et euthanasié. Afin de diminuer le stress des rongeurs, leur milieu sera enrichi avec du matériel de nidification afin que les animaux puissent se cacher et ronger. La sociabilisation avec l’expérimentateur sera plus importante pour les animaux isolés dans leur cage. Les procédures seront réalisées dans une pièce calme, différente de la pièce d’habitation. Pour limiter le stress, la peur et l’angoisse des animaux, ils seront manipulés avec délicatesse et sociabilisés (habitués à l’expérimentateur) avant le début de l’étude. Un tunnel sera utilisé pour limiter la contention des souris par la queue. Afin d’optimiser l'expérience, les animaux seront randomisés selon le poids des animaux ou leur locomotion, l’administration de psychostimulant induisant une hyperlocomotion. L’objectif est de préserver le bien-être des animaux. La satisfaction de leurs besoins physiologiques et comportementaux permettra d’éviter tout biais sur les résultats des expérimentations.

Choix des espèces

La souris et le rat sont des modèles d’étude très développés et caractérisés. Ces deux espèces sont appropriées pour les études comportementales. Ce sont des espèces communément utilisées pour les études en addictologie en accord avec les recommandations internationales et la littérature. Différentes souches pourront être utilisées en fonction des espèces. Afin de pouvoir étudier la période d’adolescence chez nos animaux, ils auront au moins 6 semaines au début de chaque procédure. En effet, l’adolescence se caractérise par un risque important de développer une addiction ou des troubles liées à l’utilisation de substances. Il est donc important d’étudier cette période chez les animaux et de la comparer aux animaux adultes. L’utilisation de l’espèce souris ou rat se fera en fonction de l’avancée scientifique du projet : continuité du modèle pour valider les résultats dans un contexte laboratoire indépendant ou au contraire changement d’espèce pour valider les résultats dans un modèle indépendant. Également, le choix de l’espèce dépendra de l’efficacité de la molécule dans une espèce donnée. En effet, si celle-ci s’avère efficace elle pourra être éventuellement testée dans l’autre espèce afin de montrer une efficacité espèce indépendante.

1 712 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune portant une tumeur greffée dont le volume est mesuré trois fois par semaine pendant soixante jours. Douze jours après la greffe, elles reçoivent une séance de radiothérapie d'environ quinze minutes, avec fatigue générale et irritation cutanée à la clé. Le porteur indique que la tumeur sous-cutanée peut provoquer une perte de poids, une plaie nécrosante, des douleurs et la mort, et que les souris non guéries seront tuées quand ces effets deviendront importants. Il écrit aussi que les anti-inflammatoires ne pourront pas être utilisés, la réponse immunitaire étudiée y étant trop sensible, et s'en remet à une grille de six items relevée trois fois par semaine.

Objectifs

Les traitements anti-cancéreux ont fait des progrès réguliers depuis des décennies. Pourtant, une grande partie des patients meurent encore de cette maladie. Depuis quelques années, une nouvelle sorte de traitement a montré une efficacité remarquable : l’immunothérapie. Ce traitement favorise une réponse anti-cancéreuse naturelle : la réponse immunitaire. Ces résultats ont conduit les chercheurs à ré-analyser d’anciens traitements, ce qui a permis de montrer que la radiothérapie, un traitement dont bénéficie plus de la moitié des patients, stimule aussi la réponse immunitaire. Malheureusement, on connait encore trop mal cet aspect de la radiothérapie pour pouvoir l’utiliser efficacement. Notre laboratoire a trouvé des conditions qui améliorent la réponse immunitaire induite par une radiothérapie. Nous avons identifié en partie les raisons de cette amélioration. Malheureusement, nous ne comprenons pas totalement les mécanismes mis en jeu. Ce projet vise à identifier et comprendre ces mécanismes, avec un double objectif. D’une part, la possibilité d’une application chez l’humain nécessite une excellente compréhension des effets d’un éventuel traitement. D’autre part, l’amélioration que nous obtenons n’est que partielle. La compréhension de ses mécanismes précis permettra d’améliorer encore l’efficacité de la radiothérapie en optimisant les conditions de traitement. Enfin, il est clair que notre objectif final est de développer un médicament utilisable chez l’humain. C’est pourquoi ce projet prévoit de mettre en place une stratégie thérapeutique faisant appel uniquement à des technologies utilisables chez les patients.

Bénéfices attendus

Les médecins fondent des espoirs importants sur l’utilisation d’une réponse anticancéreuse naturelle, la réponse immunitaire, pour soigner les patients. Ces espoirs sont le fruit de la découverte d’un type de médicaments nouveaux, montrant une grande efficacité : les immunothérapies. Les chercheurs essayent maintenant de trouver les conditions dans lesquelles cette réponse anticancéreuse naturelle peut être stimulée par des traitements classiques comme la chimiothérapie et la radiothérapie. Notre projet s’inscrit dans cette démarche, puisqu’il repose sur nos travaux qui ont identifié une méthode permettant d’améliorer la réponse immunitaire induite par la radiothérapie. Le premier bénéfice attendu est d’ordre fondamental : étudier comment on peut modifier la réponse immunitaire anticancéreuse par la radiothérapie permet de comprendre comme elle fonctionne. Or il s’agit d’un mécanisme extrêmement fin, mettant en jeu plusieurs types de cellules et de molécules. Le deuxième bénéfice attendu est orienté vers l’amélioration du traitement des patients. C’est en comprenant comment on a pu améliorer la radiothérapie qu’on pourra l’améliorer encore mieux. Enfin le troisième bénéfice est directement médical. Si nous parvenons à reproduire notre traitement en utilisant uniquement des technologies utilisables chez les patients, nous pourrons proposer aux cliniciens de traiter leurs patients avec ces technologies, dans des essais cliniques contôlés.

Procédures

Afin d’étudier la radiothérapie, nous utiliserons des modèles animaux dans lesquels ceux-ci seront d’abord greffés avec des cellules tumorales par injection (environ 2 minutes par animal) puis traités par radiothérapie 12 jours après. Nous utilisons un système d’irradiation préclinique spécialement conçu pour les petits animaux, dans lequel l’ensemble de la procédure prend environ 15 minutes. Nous pourrons alors suivre l’efficacité du traitement en mesurant le volume tumoral au cours du temps. Ces mesures seront réalisées 3 fois par semaine pendant une durée n’excédant pas 60 jours. Par ailleurs, dans certaines expériences, les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever les tumeurs 1 à 3 jours après radiothérapie, afin d’en étudier la composition, et notamment leur infiltration par des cellules du système immunitaire. D’autres tissus (sang, rate, ganglions lymphatiques drainants) pourront alors être prélevés en même temps.

Impact sur les animaux

La présence d’une tumeur peut induire chez l’animal qui la porte une série de conséquences indésirables. Dans le cas d’une tumeur sous-cutanée, les animaux peuvent subir une perte de poids, une plaie nécrosante, des douleurs, un stress, et finalement la mort. Pour une tumeur greffée dans un organe particulier, les conséquences peuvent comporter un dysfonctionnement de cet organe, induisant des pathologies dépendant de l’organe ciblé.. Enfin, la radiothérapie induit un certain nombre d’effets secondaires connus, comme une fatigue générale, ou une irritation de la peau au site d’irradiation. Les prélèvements et injections au sinus rétro-orbital provoquent un stress temporaire, et peuvent causer une irritation ou une infection oculaire.

Devenir

Dans les expériences de suivi de croissance tumorale, les animaux non-guéris devront être mis à mort lorsque la tumeur provoquera des effets délétères importants, définis à l’avance. L’ensemble des animaux sera mis à mort au bout de 60 jours. Dans certaines expériences, l’analyse de la réponse immunitaire nécessitera de déterminer les cellules immunitaires présentes dans la tumeur, et dans différents organes, ce qui ne pourra se faire qu’après avoir mis à mort les animaux.

Remplacement

Nous avons développé un système expérimental in vitro qui nous permet d’étudier le mécanisme moléculaire du contrôle de l’expression de l’interféron béta dans les cellules myéloïdes par la protéine TRIM33. Toutefois, la réponse immunitaire est un processus complexe, pluricellulaire et intégré, que l’on ne sait pas reproduire correctement in vitro. Son activation par la radiothérapie ne peut donc pas être étudiée in vitro.

Réduction

Afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux requis pour les expériences, nous avons utilisé un logiciel qui permet de calculer la taille minimale des groupes permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif pour les effets attendus dans les conditions expérimentales que nous utilisons. Les expériences seront analysées au fur et à mesure, et la mise en évidence d’un effet supérieur à l’effet attendu permettra de réduire la taille des lots.

Raffinement

Toutes les manipulations seront réalisées après anesthésie, afin de réduire le stress et/ou la souffrance liés à la manipulation. D’autre part, le fait de travailler sur des femelles nous permettra le cas échéant de regrouper les animaux afin de les maintenir dans des conditions de sociabilité satisfaisantes. Dans la mesure où nous travaillons sur la réponse immunitaire, qui est très sensible aux agents anti-inflammatoires, leur utilisation ne sera malheureusement pas possible. Nous avons défini une grille de score comportant 6 items qui seront analysés sur chaque animal trois fois par semaine, et un algorithme permettant de décider la poursuite ou non de l’expérience pour l’animal considéré.

Choix des espèces

Les questions que nous posons requièrent la possibilité d’étudier la réponse immunitaire dans un modèle préclinique de radiothérapie. Nous ne pouvons donc pas nous affranchir d’un modèle expérimental animal. Nous avons choisi la souris d’élevage, car elle donne la possibilité d’accéder à de nombreux outils expérimentaux qui permettront une plus grande efficacité dans les approches expérimentales, et donc une moindre utilisation des animaux. D’autre part, le développement d’un système immunitaire mature nécessitera d’attendre que les souris aient atteint l’âge adulte.