Rongeurs

1 415 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leur foie et de leurs tumeurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les groupes, elles reçoivent une injection de virus dans une veine, d'anti-œstrogènes ou d'un agent chimique qui fait apparaître des tumeurs du foie, ce dernier chez des souriceaux de 14 jours, puis en moyenne huit échographies sous anesthésie, des injections d'anticorps tous les trois jours pendant deux mois au plus, une toxine qui provoque une hépatite ou une chirurgie abdominale terminale. Ces tumeurs peuvent conduire, selon le porteur, à une encéphalopathie mortelle sans perte de poids. L'équipe veut comprendre pourquoi une même mutation donne deux types de tumeurs du foie, résistantes à l'immunothérapie, et en tirer des pistes de traitement. Le porteur affirme qu'il est "crucial de travailler sur des modèles murins pertinents", tout en prévoyant de mettre au point des cultures de tumeurs en trois dimensions pour tester de futurs médicaments.

Objectifs

Ce projet s’intéresse aux cancers du foie de l'adulte et de l'enfant qui reste un problème majeur de santé public. Chez l’adulte, il est la quatrième cause de morts liées au cancer dans le monde et son incidence ne cesse d’augmenter avec l’épidémie de diabète et d’obésité. Il touche plus particulièrement les hommes même si l’évolution des facteurs de risque modifie quelque peu les proportions homme/femme. Récemment, l’immunothérapie a donné des résultats intéressants mais une majorité des tumeurs ne répondent pas à ces traitements. L’objectif de ce projet est de comprendre comment une même mutation conduit au développement de deux types de tumeurs hépatiques. Notre projet consiste à caractériser ces deux types de tumeurs émergeant sur foie sain ou malades induits par des régimes riches en gras et en sucre afin de proposer de nouvelles pistes thérapeutiques et de comprendre pourquoi ces tumeurs sont résistantes aux immunothérapies. Notre objectif est aussi de développer des modèles de culture cellulaire tridimensionnelle pour tester de nouveaux médicaments tout en limitant le nombre de souris mais aussi de confirmer nos résultats chez la femelle, du fait du changement de proportions homme/femme touchés par la maladie.

Bénéfices attendus

En aidant à la compréhension des mécanismes moléculaires, métaboliques et immunitaires de développement et de réponse aux traitement des cancers du foie, ce projet permettra d'identifier de nouvelles pistes thérapeutiques administrées seules ou à coupler aux traitements d'immunothérapie émergeant ces dernières années et de proposer des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques pour ce cancer au pronostic toujours aussi sombre. Enfin, il permettra de disposer de nouveaux modèles in vitro qui pourront être utilisés pour prédire la réponse à ces nouvelles thérapies.

Procédures

1) En premier geste, les animaux pourront subir soit : a) une injection intraveineuse unique de virus sous anesthésie générale en 30s b) une injection intrapéritonéale unique d'anti-oestrogènes sur animaux vigiles sous contention en 30s c) une injection intrapéritonéale unique d'un agent chimique induisant des tumeurs du foie sur animaux vigiles sous contention en 30s 2) En second geste, les animaux pourront subir: a) une échographie hépatique sous anesthésie générale pendant 10-25min tous les 15 jours (8 échographies en moyenne) b) une chirurgie abdominale terminale sous anesthésie générale et analgésie pendant 15min c) une injection intrapéritonéale d’anticorps ciblant le système immunitaire sur animaux vigiles sous contention tous les 3 jours en 30s (pendant 2 mois maximum) d) une injection intrapéritonéale unique de toxine induisant une hépatite sur animaux vigiles sous contention en 30s 3) Le dernier geste étant un prélèvement sanguin suite à une injection intrapéritonéale unique d’anesthésique sous contention sur animaux vigiles en 30s.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de ce projet, la nuisance principale est liée au développement de tumeurs hépatiques pouvant conduire à une encéphalopathie létale sans perte de poids. Les injections intraveineuses de virus adéno-associés et les échographies réalisées sous anesthésie peuvent entraîner un stress thermique et un inconfort au réveil. Les injections intrapéritonéales peuvent entraîner un stress lors de la contention et une douleur de courte durée lors de l‘introduction de l’aiguille.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet sera euthanasié pour analyse de leurs tissus hépatiques et de leurs tumeurs

Remplacement

Le foie est un organe composé de plusieurs types cellulaires. La transformation hépatocytaire requiert des interactions complexes avec le microenvironnement cellulaire mais aussi l’environnement métabolique et les autres organes pathologiques en cas d’obésité. L’usage exclusif de lignées cellulaires ne permet donc pas d’appréhender cette problématique dans sa globalité. Les lignées immortalisées perdent d'ailleurs beaucoup de leurs caractéristiques phénotypiques et métaboliques in vitro. C'est pourquoi il est crucial de travailler sur des modèles murins pertinents.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux transgéniques, une technique innovante d'édition génique nous permet d'éviter la création de lignées et de n'injecter que les animaux d'expérimentation. 585 animaux sur les 1415 nécessaires nécessaires au projet suivront ce protocole. Nous suivrons le développement des tumeurs pour 200 animaux par échographie ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite d'euthanasier les animaux à l'aveugle. Les tests statistiques utilisés seront des tests permettant l’analyse d’échantillons de petites tailles. Le nombre d’animaux a été choisi grâce à notre expertise : le suivi échographique de 20 animaux par lot est nécessaire et suffisant pour générer des résultats statistiquement fiables. Pour les études à court terme, seuls 15 animaux par lot sont nécessaires. De plus, nous souhaitons mettre au point des cultures in vitro de tumeurs murines pertinentes pour les cancers du foie qui nous permettront à terme de tester de nouvelles drogues anti-tumorales et ainsi de ne tester chez l’animal que les molécules préalablement efficaces sur ces cultures. Récemment, nous avons développé un nouveau modèle de cancer basé sur l'édition génique qui permet de générer moins d'animaux.

Raffinement

Nous suivrons le développement des tumeurs en échographies, ce qui permet un suivi longitudinal du développement tumoral. Ce suivi évite la souffrance due à un développement tumoral important (raffinement). Nous connaissons les phases possiblement délétères après invalidation génique, et les procédures se dérouleront avec une surveillance adaptée. Les injections stressantes et échographie seront réalisées sous anesthésie générale et les animaux mis sur tapis chauffant après anesthésie. Pour réduire le stress au quotidien, le milieu est enrichi par des cotons compactés, des tunnels en carton et des maisonnettes suspendues et les animaux hébergés à raison de 5 animaux par cage au maximum. Dans la fenêtre de temps où le phénotype délétère lié à l'activation de la beta-caténine peut avoir lieu, un suivi accru sera mis en place. Au cours du suivi échographique, si les points limites sont atteints, les animaux seront immédiatement euthanasiés. Au cours de ce suivi, l'euthanasie des animaux ayant atteint le point limite peut conduire à des animaux isolés dans les cages pour lesquels un suivi accru sera mis en place et le milieu enrichi (nids, tunnels, bois à ronger).

Choix des espèces

Pour ce projet l’espèce animale choisie est la souris. Ce choix est lié : 1) A notre expertise pour l’étude, l’utilisation et le développement de modèles murins. 2) A la possibilité de réaliser des manipulations génétiques de façon aisée dans cette espèce pour reproduire les mutations observées dans les cancers du foie humains. Un modèle de carcinogenèse chimique nécessite des souriceaux de 14 jours puisque c'est en injectant à cet âge que les tumeurs se développent . Pour les autres modèles, des souris adultes âgées de deux mois seront utilisées afin que le cancer se développe à partir d'une cellule mature.

440 souris, en grande majorité des femelles de 5 semaines, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et chacune peut subir jusqu'à trois interventions en sept semaines. Éveillées, elles reçoivent d'abord cinq jours d'injections dans le ventre d'un inducteur qui désactive le gène d'une enzyme, Alox15, dans leurs vaisseaux lymphatiques. Viennent ensuite une injection de cellules tumorales, une chirurgie qui provoque un lymphœdème ou une procédure d'inflammation que le résumé ne décrit pas, puis, pour certaines, une lymphographie par injection dans les pattes, sous une anesthésie dont elles ne se réveillent pas. Le porteur annonce des douleurs modérées dues aux chirurgies et aux tumeurs, pour des retombées qu'il présente comme de "nouvelles pistes d'exploration" contre les métastases et le lymphœdème après un cancer du sein.

Objectifs

Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence l’absence de lipides spécialisés dans la résolution de l’inflammation générés par l’enzyme ALOX15. Dans cette étude, nous proposons de traiter les animaux avec ces lipides afin de déterminer lesquels sont responsables de l’inflammation chronique. En parallèle, nous étudierons si l’absence de ces lipides peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de la résolution de l’inflammation associés au système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra d’établir comment réduire l’apparition des lymphoedèmes post-cancer à l’aide des médiateurs de la résolution de l’inflammation.

Procédures

Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 interventions au total. Ensuite, l'inhibition de l'expression de la 15-lipoxygenase est effectuée par injection intraperitonéale d'un inducteur en vigil pendant 5 jours consécutifs. Après, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

L’inflammation chronique fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de cette molécule dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale fait intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du lymphoedème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car l'invalidation génique de l’enzyme Alox15 a été générée seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant à une invalidation de Alox15 de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.

Élevées sur place parce que ces lignées ne sont pas commercialisées ou coûtent cher à obtenir avec six mois de délai, 3 816 souris sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les femelles porteuses du transgène développent spontanément des tumeurs mammaires à partir de 16 semaines, laissées croître jusqu'à 17 millimètres de diamètre pour récupérer un maximum de tissu cancéreux, avec une gêne mécanique, une nécrose possible et des ulcères douloureux parmi les effets décrits. Chaque animal subit une biopsie de la queue pour le génotypage, à l'état vigile ou sous anesthésie "en fonction de l'aisance du personnel". Les mâles qui n'expriment pas le transgène sont tués, les autres gardés pour la reproduction, et le porteur avance que cet élevage réduit les coûts.

Objectifs

Maintien de lignées génétiquement altérées par insertion d’un transgène constitutif induisant la formation de tumeurs mammaires spontanées pour l’étude de la formation des métastases des cancers du sein triple négatifs et caractérisation génétique de ces dernières par une méthode invasive.

Bénéfices attendus

Les lignées génétiquement altérées utilisées ici sont: soit non commercialisées et l’élevage permet donc l’obtention de lignées uniques; soit disponibles commercialement mais seulement par revitalisation (pas d’animaux vivants disponibles, obtention des animaux couteuse avec un délai d’environ 6 mois). L’élevage permet donc de réduire les coûts et d’avoir des animaux vivants disponibles pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation des métastases des cancers du sein triples négatifs. Le génotypage permet la caractérisation génétique de ces lignées pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux. (pas d’animaux vivants disponibles, obtention des animaux couteuse avec un délai d’environ 6 mois). L’élevage permet donc d’avoir des animaux vivants disponibles qui seront utilisé pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation des métastases des cancers du sein triples négatifs. Le génotypage permet la caractérisation génétique de ces lignées pour optimiser la gestion des élevages.

Procédures

Prélèvement de la queue (1mm) pour biopsie 1 fois sous anesthésie générale à l’isoflurane, durée inférieur à 5 minutes.

Impact sur les animaux

La biopsie au niveau de la queue peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal. Les lignées génétiquement altérées utilisées ici développent des cancers mammaires montrant une croissance tumorale rapide mais rarement métastatique (moins de 15% des animaux développent des métastases). La croissance de la ou des tumeurs primaires peut provoquer des effets indésirables sur les animaux. Particulièrement, l’animal peut subir une nuisance mécanique de la tumeur par son volume pouvant compliquer sa mobilité et son activité. La tumeur primaire, par sa croissance rapide, peut montrer une nécrose (mort cellulaire) et être associée à la formation d’ulcère entraînant une douleur pour l’animal. De manière plus générale, l’animal peut être touché par des signes plus généraux de mauvais état général comme la perte de poids et d’appétit. Des observations et examens cliniques seront réalisés tous les jours afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques. Si des signes cliniques sont détectés, les animaux seront alors surveillés deux fois par jours afin de procéder à une mise à mort anticipée en cas d’atteinte de points limites.

Devenir

Les animaux de sexe masculin n'exprimant pas le transgène seront euthanasiés. Les animaux exprimant le transgène et les femelles sauvages seront gardés en vie pour le maintien des lignées (reproduction) et une utilisation continue.

Remplacement

Les souris générées dans ce projet permettront l’étude des mécanismes de la colonisation métastatique des cancers du sein triple négatifs. Il est très compliqué de mimer in vitro la formation de métastases. Une étape in vivo est donc nécessaire pour se rapprocher au plus près des conditions de clinique humaine, afin d’observer finement les mécanismes d’action des cellules tumorales au niveau de l’organe métastatique. De plus, il est compliqué de maintenir in vitro l’hétérogénéité des cellules cancéreuses observée in vivo. L’élevage de ces lignées génétiquement altérées permet de générer des tumeurs de cancer du sein triple négatif en conservant l’hétérogéinité des cellules cancéreuses et du stroma. Les cellules cancéreuses seront isolées et étudiées ex vivo avec des essais se rapprochant au plus près des conditions in vivo comme la culture en 3 dimensions de tumoroïdes. Notamment, afin d’étudier le rôle de gènes d’intérêts, l’effet de l’amplification ou de la délétion de ces gènes sera évalué ex vivo afin d’éliminer les gènes n’ayant pas d’effet sur les cellules cancéreuses. En ce qui concerne le prélèvement de tissu pour le génotypage nous ne disposons pas de méthodes de remplacement possible.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, un nombre minimum de deux à quatres cages de reproduction sera utilisé pour le maintien des lignées murines. Le schéma de reproduction de ces lignées génétiquement altérées permet d'obtenir seulement 50% des animaux avec le transgène. Parmis ces animaux, seule la moitié sera de sexe féminin et développera une tumeur mammaire utilisée pour notre étude. D’après notre expérience, ces souris génèrent 10-11 souriceaux toutes les 3 semaines ce qui correspond à 2 ou 3 souris femelles exprimant le transgène. Avec deux cages pour chaque lignée on estime obtenir 4 à 6 souris toutes les 3 semaines. Ces souris seront utilisées au laboratoire pour toutes nos expériences ex vivo (isolation de cellules tumorales primaires) mais aussi in vivo. Ce nombre de cages nous permettra de réaliser 4 à 6 expériences par mois par lignée. Le nombre de cage sera réduit si nos besoins diminuent.

Raffinement

Lors de la mise en accouplement, l’alimentation des mères est enrichie. Pour enrichir le nid, du Nestlet (coton) est ajouté en plus des frisottis. Afin de ne pas perturber les relations parents-petits, le change est décalé à minimum trois jours après la mise bas. De plus, pour limiter le stress, le nid parental est conservé pendant le change. Pour le génotypage, la biopsie de queue des animaux est réalisée lors du baguage soit en vigile soit sous anesthésie générale à l’isoflurane en fonction de l’aisance du personnel. Cette méthode est approuvée, précise, rapide et standardisée, ce qui limite les effets indésirables stress/douleurs. L’anesthésie permet de favoriser la bonne pose de la bague et le prélèvement de queue dans un environnement plus confortable pour le manipulateur et l’animal. Le prélèvement est ensuite stocké au congélateur jusqu’à utilisation pour le génotypage. Afin de faciliter l’accès à la nourriture aux petits lors des sevrages, des croquettes sont mises directement dans la cage. Pour le phénotype dommageable, les souris femelles développent des tumeurs mammaires à partir de 16 semaines. Le suivie tumoral se fera deux fois par semaine avec un pied à coulisse puis quotidiennement lorsque les tumeurs atteignent environ 10 mm de diamètre. Si des signes cliniques sont détectés, les animaux seront surveillés tous les jours afin de procéder à une mise à mort anticipée en cas d’atteinte de points limites.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour ces essais : - Concordance des lignée murines génétiquement modifiées avec les observations cliniques chez les femmes atteintes de cancer du sein triple négatif - Similitudes de la physiologie et de la taille du génome entre la souris et l'homme - L'organisme évolue rapidement (courte durée de vie) et permet des analyses compatibles avec les impératifs de progrès thérapeutiques à apporter en clinique humaine - Certaines souches sont génétiquement modifiées, permettant la création de modèles tumoraux particuliers (expression de marqueur fluorescent permettant la détection des cellules cancéreuses). Les animaux seront génotypé à 21 jours. Les souris génétiquement altérées développent des tumeurs spontanées à partir de 16 semaines avec des tumeurs d’environ 17 mm de diamètre (1500 mm3, point limite) aux alentours de 24 semaines. Afin de récupérer un maximum de tissu cancéreux, les souris seront utilisées lorsqu’elles présenteront une tumeur de 17 mm de diamètre (environ 1500 mm3), sauf si un point limite est atteint avant.

Les souris qui atteignent un point limite sont mises à mort aussitôt, les autres une à huit semaines après l'injection, pour prélever leurs poumons. 620 souris sont utilisées dans ce projet, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit un virus une seule fois, par inhalation nasale ou par intubation de la trachée sous anesthésie et analgésie profondes, puis passe au scanner une fois par semaine sous une anesthésie d'un quart d'heure. Le porteur écrit que le projet a été mené jusqu'ici entièrement en culture cellulaire et qu'il lui est désormais "indispensable" de passer à l'animal pour comparer la reprogrammation cellulaire et la formation de cancers du poumon.

Objectifs

Lors du développement de l’embryon, à partir de quelques cellules dites cellules souches, des milliards de cellules vont être produites et acquérir une spécialisation (cellules de poumon, de peau, etc.) lors d’un processus appelé différenciation. Ces dernières années, des travaux montrant qu’il est possible de reprogrammer une cellule différenciée en une cellule souche, ont apporté la preuve que la différenciation est un processus réversible. Le mécanisme de reprogrammation partage des similarités avec ceux qui aboutissent à l’apparition de cellules cancéreuses (tumorigenèse). Des études réalisées à partir de cultures de cellules de peau de souris nous ont déjà permis d’identifier certaines de ces similarités. Afin de nous rapprocher de ce qui se passe chez l’Homme, nous souhaitons maintenant étendre notre étude comparative de la reprogrammation et de la tumorigenèse au poumon, chez la souris.

Bénéfices attendus

On sait aujourd’hui que le développement tumoral n’est pas seulement lié à une prolifération anarchique des cellules. Les changements d’identité cellulaire (modification de la nature et de la fonction d’une cellule) constituent un domaine émergeant et on sait maintenant qu’ils sont à l’initiation de certains cancers. L’étude de ces mécanismes est donc cruciale pour faire émerger de nouvelles thérapies mais également pour approfondir nos connaissances sur la biologie du cancer. Grâce à des modèles cellulaires en culture, nous avons identifié des mécanismes et des acteurs importants pour l’identité cellulaire. Nous souhaitons cette fois approfondir notre analyse dans un modèle murin et plus proche de la pathologie humaine en étudiant ces mécanismes dans le poumon.

Procédures

Les animaux seront tout d’abord soumis à une anesthésie puis inhalation intra-nasale de virus ou à une anesthésie / analgésie profonde puis injection intra-trachéale de virus par intubation. Dans le premier cas, la procédure totale dure environ 5 minutes (2 minutes d’endormissement, 3 minutes injection + réveil) et dans le second 20 minutes. Dans les deux cas, cette procédure n’est réalisée qu’une seule fois. Une à 8 semaines après inhalation / injection, les animaux sont mis à mort pour prélèvement d’organes. Nous réaliserons un suivi des poumons des animaux par imagerie telle que du scanner une fois par semaine. Pour ceci, les souris seront anesthésiées environ 15 minutes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables liés à l’injection intra-nasale en elle-même sont très légers puisque l’anesthésie est très courte et la méthode d’injection n’est pas invasive. Les effets indésirables liés à l’injection intra-trachéale sont ceux pouvant résulter d’un acte opératoire classique sans chirurgie (il s’agit d’une intubation). Dans ce cas, une inflammation est possible due au passage du cathéter dans la trachée et une gêne est également envisageable due à l'injection d'un faible volume de liquide qui va descendre volontairement dans les poumons. Les effets indésirables liés à l’imagerie sont très légers puisque les animaux subissent seulement une courte anesthésie.

Devenir

Les animaux ne pouvant pas être réutilisés pour un autre projet, ils seront mis à mort à la fin de l’expérimentation, ou en cas d’atteinte d’un point limite conduisant à l’interruption de la procédure d’élevage.

Remplacement

Jusqu’à présent, le projet a complètement été mené grâce à des expériences in vitro, donc sans faire appel à aucun modèle animal. Dans un but de mener des études plus approfondies et pour se rapprocher de la biologie du cancer il nous est indispensable de passer à des modèles in vivo de manière complémentaire aux modèles in vitro que nous avons déjà.

Réduction

Les effectifs définis dans ce protocole ont été déterminés grâce au comportement connu de ces modèles expérimentaux et tiennent compte des exigences statistiques nécessaires à l’exploitation des résultats. Afin de limiter le nombre nécessaire de souris, nous avons réduit au maximum le nombre de souris utilisées (20/groupes) dans nos procédures sans en compromettre l’interprétation et la puissance statistique des analyses. D’autre part, le projet sera réalisé pas à pas ce qui permettra de ne pas inclure tous les animaux prévus s'il n'y a pas besoin.

Raffinement

Les procédures seront réalisées sous anesthésie / analgésie. Les animaux seront suivis 2 fois par jour sur les 48h suivant l’administration des adénovirus afin d’identifier toute complication liée au mode d’inoculation (gonflement de la trachée/région du cou). Les animaux seront par la suite observés 3 fois par semaine afin d’identifier tout signe potentiel de mal-être ou de souffrance. Nous avons défini une série de points limites conduisant à l’arrêt de nos protocoles et à la mise à mort immédiate des souris concernées.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études de cancérogénèse du fait de l’existence de nombreux modèles génétiquement modifiés bien caractérisés qui permettent de reproduire de manière fidèle la progression tumorale observée chez les patients. Les souris jeune adultes seront infectées entre l’âge de 6 et 8 semaines afin de standardiser nos groupes d’études.

Tous tués pour prélever leur sang, leur rate, leurs ganglions, leur moelle osseuse, leur foie, leurs intestins et leur thymus, 150 rats immunodéficients sont utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. À l'âge de deux à quatre jours, les ratons sont séparés de leur mère et irradiés quatre minutes, avec un risque qu'elle les rejette ensuite, puis reçoivent une injection de cellules humaines directement dans le foie. Trois prélèvements de sang derrière l'œil suivent, à douze, dix-huit et vingt-quatre semaines, en alternant œil droit et œil gauche. Le porteur présente ce rat "humanisé" comme une alternative aux souris humanisées, plus grande et plus proche de l'être humain, pour éprouver des médicaments agissant sur le système immunitaire.

Objectifs

A l'heure actuelle, l'étude de nouveaux médicaments permettant d'agir sur le système immunitaire ne peut pas être effectuer sans réaliser des expériences in vivo. Les résultats in vitro seuls ne peuvent présumés du potentiel réel et efficace d'une molécule. Afin de pouvoir répondre à ce type de problème, l'utilisation de modèle de souris dites "humanisés" (souris qui ne possèdent pas de système immunitaire propre mais on y trouve la présence de cellules humaines) permet de pallier la complexité de la réponse immunitaire. Suite à l'émergence de nouvelles procédures thérapeutiques, la mise à disposition d'un nouveau modèle d'animaux humanisés : le rat humanisé représentera une alternative intéressante aux souris humanisées. Principalement due à la taille du modèle, permettant de réaliser des modèles de greffes vasculaires mais également dû à la différence de pourcentage au niveau des cellules humaines. Ce projet expose donc la procédure utilisée afin de produire des rats dits humanisés à partir de rats immunodéficients (qui sont des animaux ne possédant pas de cellules au niveau du système immunitaire).

Bénéfices attendus

Sur le court terme, ce projet pourra montrer une meilleure compréhension du système immunitaire humain grâce à sa modélisation des rats humanisés immunodéficientes reconstitués avec un système immunitaire humain.

Procédures

Les différentes interventions sur les animaux sont : l'irradiation de ratons mâles et femelles âgés de 2 à 4 jours qui se déroule en seule fois et cela pendant 4 min, une seule injection intrahépatiques de cellules humaines sera effectuées sur des animaux anesthésiés (anesthésie rapide avec une durée de procédure n'éxcédant pas 5 min) ainsi que des prélèvements se déroulant à semaine 12, 18 et 24 post-injection d'une petite quantité de sang lors d'un prélèvement retro-orbitaire (10 min de procédure de l'endormissement au réveil).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendues sont: le stress du à la séparation de la mère pouvant également induire un risque de rejet des petits par celle-ci, de la douleur pouvant être générés par les différentes procédures expérimentales ( l'injection intrahépatique, des prélèvements de sang ou de la contention des animaux ...). Les signes de souffrance éventuelle seront observés quotidiennement au cours de l'étude.

Devenir

A l'issue de cette procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre d'effectuer les différents prélèvements (sang, rate, ganglions, moelle osseuse, foie, intestins et thymus) ainsi qu’une analyse immunologique par cytométrie en flux.

Remplacement

Le développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de maladies humaines nécessite une phase d'études pré-clinique réalisée chez l'animal. Ce modèle d'étude du mécanisme d'action d'anticorps et/ou médicaments chez le rat ayant un système immunitaire humain permettra de reproduire les mécanismes d'action susceptibles d'être mise en œuvre chez l'homme. Ces expérimentations in vivo sont les seules à pouvoir répondre à nos questions, le modèle des rats humanisées étant le seul à pouvoir juger dans des conditions physiologiques du rôle des molécules X et Y sur l'efficacité de la réponse immunitaire. Des résultats positifs in vitro seraient insuffisants pour être convaincu de la pertinence physiologique des observations et leur transposition à la clinique seraient freinés.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet a été déterminée de manière à pouvoir effectuer différents tests statistiques qui pourront permettre d'obtenir des résultats significatifs pour conclure sur le mécanisme d'action sur les T régulateurs.

Raffinement

Nous cherchons à raffiner au maximum nos protocoles pour limiter la souffrance. Les animaux seront surveillés quotidiennement par les animaliers et par les responsables des procédures. Au moment des injections du traitement, une application au préalable de Lidocaïne sous forme de gel sera effectuée comme analgésie . Afin de limiter au minimum l’impact de la séparation maternelle, celui-ci est réduit grâce à l'imprégnation des gants de l’expérimentateur et d’une boite de Petri (qui sera mise dans la cage d’irradiation) avec la sciure de la cage maternelle Les rats seront hébergés à plusieurs dans des cages dont la surface sera adaptée au nombre d'individu et disposeront en permanence d'enrichissement (igloo en PVC...). Lors du prélèvement de sang par des sinus rétro orbitaire (effectuée totes les 6 semaines avec alternance œil droit/gauche) sur des rats anesthésiés, l'utilisation de tétracaïne 1% en collyre permettra une anesthésie locale. Nous procédons à l’euthanasie des rats en cas d’atteinte des points de limite préétablis.

Choix des espèces

Le choix du rat repose essentiellement sur le fait que ces animaux présentent de plus fortes similitudes immunologiques et génétiques avec l'homme que la souris et que les études fonctionnelles seront plus faciles à réaliser. Il est également à prendre en compte que certains modèles de greffes vasculaires ou autres modèles (ex : implantation d'organoïdes humains) seront plus simples à effectuer chez le rat humanisé par rapport aux modèles de souris humanisés Nous utiliserons des ratons âgés de 2 à 4 jours afin de faciliter la reconstitution du système immunitaire par des cellules humaines.

Greffées d'une tumeur sous la peau à l'état vigile, 612 souris reçoivent ensuite trois gavages et trois injections dans l'abdomen, certaines une radiothérapie sous anesthésie générale. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses après la mort. Le porteur écrit que le développement de ces tumeurs n'entraînera "ni douleur ni gêne pour l'animal", tout en prévoyant une surveillance quotidienne, une grille de score et des points limites dont l'atteinte déclenche la mise à mort. Dix-huit souris par condition, six par expérience répétée trois fois, servent à éprouver in vivo une cible repérée en culture cellulaire.

Objectifs

L‘arsenal des traitements contre le cancer comprend la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie, c’est-à-dire la manipulation du système immunitaire du patient pour combattre la tumeur. Cependant, ces traitements ne sont pas efficaces contre tous les cancers ou seule une partie des patients répondent au traitement. L’efficacité du traitement dépend souvent de l’implication des cellules du système immunitaire. Ces dernières années, le rôle essentiel d’une population particulière de cellules immunitaires, appelées monocytes, a été mis en évidence. Le but de ce projet est de manipuler ces cellules afin de stimuler les réponses immunitaires contre les tumeurs, et de tester une stratégie thérapeutique permettant d’augmenter l’efficacité de la radiothérapie, la chimiothérapie et l’immunothérapie.

Bénéfices attendus

Nous avons identifié par des expériences in vitro une nouvelle cible thérapeutique potentielle qui pourrait stimuler les réponses immunitaires dans le contexte du cancer. Ce projet permettra d’apporter de nouvelles connaissances essentielles pour évaluer l’intérêt de cette nouvelle cible thérapeutique dans un système physiologique in vivo. Ce projet permettra également de mieux comprendre l’importance des cellules immunitaires appelées monocytes dans les réponses immunitaires anti-tumorales. Ces avancées seront communiquées à la communauté scientifique dès la fin du projet. A plus long terme, ce projet ouvrira la voie à de nouvelles applications thérapeutiques chez l’homme, en particulier de nouvelles stratégies pour optimiser l'efficacité des traitements anti-tumoraux.

Procédures

Des cellules tumorales seront injectées par voie sous-cutanée à tous les animaux de ce projet (injection sur animaux vigiles1 fois au cours de l’expérience – durée du geste inf à 10 sec). Puis les animaux seront ensuite divisés en 2 lots pour recevoir des traitements différents. Les animaux vigiles recevront un traitement par gavage à raison d’une administration par jour tous les 2 à 3 jours (3 administrations au total – durée du geste inf à 10 sec). En parallèle, ces animaux recevront un second traitement par voir intrapéritonéale (directement dans l’abdomen). Les injections seront réalisées sur animaux vigiles à raison d’une administration par jour tous les 2 jours (3 injections au total – durée du geste inf à 10 sec)

Impact sur les animaux

Les animaux greffés avec des cellules tumorales développeront des tumeurs sous-cutanées au niveau du flanc qui seront mesurées régulièrement. Le développement de ces tumeurs n’entrainera pas de douleur ni de gêne pour l’animal Les nuisances attendues lors de l’administration des traitements seront celles liées à l’injection de produits non irritants par voie intrapéritonéale (directement dans l’abdomen) (gêne de courte durée),celles liées au gavage oral (gêne de courte durée )

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin du suivi de croissance tumorale ou pour des analyses post-mortem.

Remplacement

Après des premières étapes d’analyse et de validation dans un modèle de culture in vitro, nous avons formulé l’hypothèse que notre cible d’intérêt pourrait stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. Cette hypothèse ne peut être testée que dans un modèle in vivo, dans un système physiologique représentant un organisme vivant intégré et autonome tel que la souris. Cette étape est indispensable à la compréhension du processus biologique et à l’évaluation du potentiel thérapeutique de l’approche proposée dans ce projet. Aussi, malgré le développement de méthodes alternatives auxquelles le laboratoire a eu recours, l’utilisation de modèle animal reste indispensable pour pouvoir aborder la phase d’application de nos découvertes en clinique.

Réduction

Le nombre de souris par condition est de 18 (6 par expérience, répétée 3 fois) afin que les résultats obtenus puissent présenter une puissance statistique suffisante, selon la différence que l’on souhaite mettre en évidence. Dans notre expérience préalable, ces effectifs sont suffisants pour mettre en évidence des différences significatives dans des modèles expérimentaux semblables. Dans certaines expériences, plusieurs organes seront prélevés post-mortem pour des analyses, ce qui optimise le nombre de souris utilisées.

Raffinement

Dans le cadre des greffes de tumeurs, les animaux sont surveillés quotidiennement par l'équipe pour l’état général (7j/7). La radiothérapie sera réalisée sous anesthésie générale et les éventuelles douleurs soulagées par des analgésiques. Une grille de score est mise en place pour évaluer de façon objective l’état des animaux. En cas d’atteinte des points-limite les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour les expériences menées en recherche thérapeutique du cancer, car la physiologie de la souris est proche de celle de l’homme. D’autre part les mécanismes immunitaires sont bien caractérisés chez la souris, ce qui en fait un modèle particulièrement adapté pour étudier les réponses immunitaires anti-tumorales. La connaissance complète du génome murin permet d’utiliser de nombreux outils bien caractérisés, ce qui sera particulièrement pertinent dans le cadre de ce projet. Les souris seront utilisées à l'âge adulte (de 5 à 7 semaines) afin que les souris aient fini leur croissance, et que les résultats ne soient pas affectés à cause de modifications dues à un âge trop avancé des animaux.

Jusqu'à huit sessions d'ultrasons et d'imagerie par animal, étalées sur un an pour les souris et deux ans pour les rats, la tête rasée puis épilée à la crème dépilatoire au risque d'une brûlure cutanée, 532 souris et 112 rats subissent ces procédures d'un niveau de souffrance modéré et sont tous tués pour prélever leurs organes. Le porteur décrit un risque d'œdème cérébral ou d'hémorragie en cas de surdose ultrasonore, des séances d'imagerie sous anesthésie allant jusqu'à une heure et demie, et des transports de quinze minutes entre deux sites d'expérimentation. L'objectif déclaré est d'optimiser l'ouverture de la barrière protégeant le cerveau, une approche déjà en essai clinique chez l'être humain depuis 2015. Les rats servent pour leur crâne plus épais et moins homogène, qui oblige à ajuster la dose individu par individu, comme chez les patients.

Objectifs

L’efficacité et l’émergence de traitements innovants contre les pathologies cérébrales sévères (tumeurs, maladie d’Alzheimer…) sont restreintes par la présence de la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui protége le cerveau mais bloque le passage de plus de 95% de médicaments du sang vers les cellules pathologiques. Les ultrasons (US) peuvent être utilisés à travers le crâne pour délivrer des molécules dans le cerveau. En effet, combinés à l’injection de microbulles par voie intraveineuse, les US peuvent induire une perméabilisation localisée, non invasive et réversible de la BHE. Depuis 2015, plusieurs essais cliniques portant sur l’évaluation de l’innocuité et la validation du bénéfice des US pour le traitement de tumeurs cérébrales ou de maladies neurodégénératives sont menés. De nombreuses interrogations demeurent néanmoins quant à l’optimisation des protocoles ultrasonores ainsi que leur impact sur le tissu cérébral. La mise en place de techniques spécifiques de neuroimagerie quantitative permettrait de répondre à ces iquestions. L’IRM est l’examen de référence pour s’assurer de l’efficacité et la sécurité de l’ouverture de la BHE. L’imagerie nucléaire (TEP) et l’échographie peuvent être exploitées pour évaluer l’intégrité de la BHE, quantifier la dose de médicaments délivrés et observer les micro changements vasculaires. Le projet consiste à utiliser les modalités d’imagerie IRM, TEP et échographie afin d’améliorer nos protocoles de délivrance de médicaments par ultrasons, et de comprendre et maîtriser leurs effets sur le cerveau de rongeurs. Ainsi, le projet répondra à trois objectifs qui sont : (i) l’optimisation et le contrôle des protocoles thérapeutiques, (ii) la compréhension des mécanismes et effets des US sur l’environnement cérébral, (iii) valider le passage de différents médicaments. Ce projet nécessite l’utilisation d’équipements présents sur plusieurs sites. Ainsi, 2 établissements sont concernés. Les tâches impliquant la TEP et l’échographie seront réalisées dans un établissement utilisateur et les tâches impliquant l’IRM seront réalisées dans le deuxième établissement. .

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de développer une méthodologie transférable au niveau clinique. Le bénéfice, à terme, sera de proposer une meilleure prise en charge des pathologies cérébrales. Une telle approche serait profitable pour le traitement de maladies aujourd’hui incurables telles que certaines tumeurs cérébrales agressives, les maladies neurodégénératives ou encore les maladies génétiques. Ce projet a comme but principal d’établir, optimiser et valider des protocoles de thérapie du cerveau par ultrasons en tirant profit des outils d’imagerie dont nous disposons. En particulier, nos approches de neuroimageries quantitatives permettront de développer les modèles prédictifs de délivrance de médicaments par ultrasons. Par ailleurs, les outils d’imagerie que nous développons au laboratoire seront exploités pour étudier l’influence des ultrasons sur l’environnement cérébral. Ainsi les bénéfices attendus peuvent se résumer aux cinq points suivants : 1/ Amélioration des protocoles thérapeutiques pour perméabiliser la BHE et délivrer des médicaments dans le cerveau de manière non invasive. 2/ Elaboration de protocoles personnalisés. Les doses ultrasonores et les volumes traités seront adaptés à la morphologie de l’animal et à la pathologie visée. 3/ Quantification de la dose de médicaments délivrés dans le cerveau par neuroimagerie. 4/ Compréhension de l’impact des ultrasons sur l’environnement cérébral. Nous établirons notamment la relation entre la dose ultrasonore et la réversibilité de l’approche (temps de passage des médicaments). 5/ Validation de nouveaux traceurs et de séquences d’imagerie cérébrale.

Procédures

Selon les lots, les animaux subiront les actes suivants : 1/ Thérapie par ultrasons : injection de microbulles gazeuses et applications des ultrasons (532 souris et 112 rats, durée du protocole 10 min) Lieu : les 2 Etablissements Utilisateurs possibles selon l’imagerie effectuée. 2/ Administration de médicaments : anesthésie et injection (140 souris, durée de l’acte 10 min) Lieu : les 2 Etablissements Utilisateurs possibles selon l’imagerie effectuée. 3/ IRM : anesthésie et injection de produits de contraste (427 souris et 70 rats, durée du protocole 45 min) Lieu : EU dédié à l’IRM. 4/ TEP : anesthésie et injection de produits de contraste (175 souris et 42 rats, durée du protocole 60 min) - Lieu : EU dédié à la TEP. 5/ Echographie : anesthésie et injection de produits de contraste (28 souris, durée de l’acte 20 min) Lieu : EU dédié à la TEP. 6/ Prélèvement des organes en fin de protocole (532 souris et 112 rats, durée de l’acte 20 min) Lieu : les 2 Etablissements Utilisateurs possibles selon l’imagerie effectuée Afin de limiter le nombre d’animaux, les animaux pourront répétés les actes 1, 3, 4 et 5 décrits ci-dessus jusqu’ à 8 sessions maximum avec un espacement minimum entre les sessions de 1 semaine entre les sessions. La durée maximum totale de cette procédure sera d’un an pour les souris et de deux ans pour les rats. Les animaux recevant l’administration de médicaments (acte 2) auront jusqu’à 6 traitements dans un intervalle de 3 semaines.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables prévus sur les animaux pourraient être : • Une surdose ultrasonore peut entraîner un risque d’œdème cérébral local ou d’hémorragie. • L’injection des microbulles et médicaments en intraveineux peut induire une courte douleur (moins de 5 min). • Les animaux seront endormis lors des sessions d’imagerie (1h30 maximum) par voie gazeuse. Lors du réveil, les animaux peuvent être désorientés et stressés. • Le transport des animaux entre les deux sites d’expérimentation (15 min de transport) peut induire un stress chez les animaux. • Les animaux seront rasés et épilés (application d’une crème dépilatoire) sur la tête pour permettre la transmission des ultrasons. Cet acte peut causer une légère brûlure cutanée. Selon la dose, les traitements (chimiothérapie, immunothérapie, nanoparticules et virus adéno-associés) peuvent avoir une toxicité pour l’organisme et induire des effets indésirables (comme par exemple : perte de poids, troubles digestifs). La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines. Cette toxicité sera limitée par l’utilisation de doses thérapeutiques décrites et validées dans la littérature.

Devenir

A la fin du protocole, les animaux sont euthanasiés afin de prélever leurs tissus et organes à des fins d'histologie et de dosages. Les objectifs sont de : 1/ s’assurer de l’innocuité de la méthode (pas de dommages dans le tissu cérébral causé par l’exposition aux ultrasons) 2/ vérifier la toxicité des composés injectés dans le cerveau et les organes d’élimination (e.g., foie, rein) 3/ quantifier la dose de médicaments présents dans le cerveau

Remplacement

En amont de ce projet, nous avons réalisé des études in vitro préliminaires (bancs de mesures et culture cellulaire) pour affiner les paramètres ultrasonores, caractériser les microbulles gazeuses utilisées pour ouvrir la BHE et limiter le nombre d’expériences in vivo. Cependant, la BHE et son microenvironnement cérébral ne sont pas reproductibles in vitro à ce jour. Ni la modélisation in silico, ni l’expérimentation in vitro ne permettent de prédire l’efficacité (délivrance de molécule intracérébrale) et l’impact du traitement ultrasonore sur le tissu cérébral (dynamique d’ouverture et de refermeture, neuroinflammation, perturbations vasculaires). Il est donc indispensable d’utiliser des modèles animaux. L’expérimentation animale permet également d’évaluer la variabilité inter-individus de l’approche thérapeutique en fonction de l’âge et du sexe de l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire pour chaque groupe a été déterminé pour qu’il soit le plus petit possible tout en étant statistiquement valide, en se basant sur des études antérieures similaires et sur des données de la littérature.

Raffinement

L’ensemble des actes effectués chez les animaux seront faits par des personnes formées. Chaque acte de la procédure sera réalisé sous anesthésie gazeuse et l’animal sera maintenu sous un dispositif chauffant (tapis, lumière ou flux d’air) pour assurer son bien-être lors des manipulations. L’apparition de tout signe de détresse respiratoire sera particulièrement surveillée durant la procédure. Lors des sessions de thérapie, les injections seront réalisées sous anesthésie gazeuse après avoir préalablement appliqué une anesthésie locale 10 min avant l’injection. Les souris seront hébergées en groupe de 4 ou 5 par cage avec un milieu enrichi. Les rats seront hébergés par groupe de 2 par cage avec un milieu enrichi. Le suivi quotidien par les zootechniciens assurera d’éviter toute souffrance. Les examens d’imagerie seront réalisés sur deux sites (distants de 15 min). Les transports des animaux seront anticipés afin de laisser une semaine complète d’acclimatation sur chacun des sites lorsque cela sera possible. Les animaux seront acheminés dans un véhicule dédié aux transports des animaux doté d’une climatisation à l’intérieur, de cages adaptées aux transports comportant de la litière et de la nourriture gélifiée. Le suivi régulier du poids permettra de favoriser leur manipulation pour les sessions d’imagerie et de thérapie et ainsi limiter tout stress. Une analgésie sera mise place après accord du vétérinaire si des signes de douleur sont mis en évidence. Des points limites seront définis en amont des interventions, ceux-ci auront vocation à limiter et surtout éviter une souffrance animale. Une grille de score basée sur ces points limites sera utilisée.

Choix des espèces

Dans une première approche, le choix du modèle souris se justifie par sa simplicité , sa forte reproductibilité inter-individus et la possibilité d’administrer de petits volumes de médicaments. Une majeure partie des expérimentations sera réalisée sur ce modèle. Toutefois, nous souhaitons également évaluer nos protocoles thérapeutiques sur un modèle rat plus complexe et proche de l’espèce humaine afin de tester notre approche de thérapie personnalisée. En effet, compte tenu de la forte atténuation du crâne chez le rat et de son inhomogénéité, la dose ultrasonore doit être ajustée selon l’individu, comme c’est le cas chez l’espère humaine. L’utilisation efficace de ce modèle requiert donc une maîtrise avancée du protocole ultrasonore qui sera évalué sur un nombre moins important d’animaux. Des animaux adultes seront utilisés dans ce projet. La présence du crâne joue un rôle prépondérant dans la transmission des ultrasons. Afin de passer outre un biais expérimental, il est nécessaire d’atteindre la maturité de l’animal (au-delà de 8 semaines) et la formation complète du crâne. Nous utiliserons des animaux adultes jeunes, les souris (18g à 25g au début de l’étude) pourront être étudiés sur une période de 1 an maximum après la première session du protocole. Nous utiliserons également des rats adultes jeunes ( 200g à 300g au début de l’étude). Les rats pourront être étudiés sur une période de 2 ans maximum après la première session du protocole. Cet âge a été choisi pour intégrer dans l’étude des animaux pour lesquels le vieillissement induit un effet sur le crâne (calcification osseuse) et la transmission des ultrasons. La validation de nos protocoles sur des animaux âgés est particulièrement pertinente en vue d’utilisation postérieure de modèles de maladies neurodégénératives (Alzheimer). Les résultats obtenus et les paramètres ultrasonores optimisés seront corrélés à l’âge des animaux.

210 rats subissent chacun une chirurgie de deux heures sous anesthésie générale pour se faire implanter un dispositif d'enregistrement cérébral, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin pour analyser leur cerveau. Cent vingt d'entre eux reçoivent en plus un cathéter veineux, vivent seuls en cage jusqu'au terme du projet, puis s'administrent de la cocaïne au cours de 25 sessions de six heures, suivies de deux mois d'abstinence. Le porteur indique que la prise chronique de drogue peut provoquer un état émotionnel négatif, visible au poil hérissé et à l'irritabilité, et que l'isolement peut causer un stress modéré. Le projet ne teste aucun traitement, il sert d'abord à mettre au point la technique d'enregistrement par fibre optique.

Objectifs

Le projet présenté ici s’inscrit dans un projet plus large visant à évaluer si le métabolisme du cholestérol cérébral représente une cible thérapeutique potentielle pour prévenir les rechutes et traiter l’addiction. En effet, quelques études ont montré que l’expression de protéines impliquées dans ce métabolisme était modifiée aussi bien chez l’homme, que dans des modèles animaux d’addiction, en réponse à la cocaïne ou à l’alcool. Pour cela, nous avons besoin dans un premier temps de mettre au point une technique d'enregistrement par fibre optique afin de déterminer les conditions optimales d’enregistrement de l'activité des neurones puis de valider ces conditions expérimentales avec l'étude de cette activité chez des rats en situation de rechute après une période d’addiction volontaire à la cocaïne puis une phase d'abstinence.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont la mise au point d’une technique innovante pour mesurer l’activité neuronale chez l’animal vigile. Cette technique, réalisée sur animal vigile, couplée à des mesures comportementales, nous permettra de mieux comprendre les processus neuronaux sous-tendant les phénomènes de rechute afin de mieux les combattre et promouvoir l’abstinence.

Procédures

Tous les rats (210) suivront une chirurgie sous anesthésie générale (durée : 2h00) afin d'implanter un dispositif pour mesurer l'activité neuronale. 120 rats seront soumis à une seconde procédure chirurgicale sous anesthésie générale (durée 15 min) pour implanter un cathéter veineux. Après leur chirurgie et jusqu'à la fin du projet, ces 120 rats seront hébergés seuls dans leur cage. L'auto-administration de drogue se fera avec ces 120 rats pendant 25 sessions, 1 session par jour (durée d'une session : 6 heures) en plaçant les animaux dans des cages spéciales dans lesquelles les animaux sont libres de leur mouvement. Les sessions d'auto-administration sont suivies d'une période d'abstinence d'une durée de 2 mois. Pour mesurer l'activité neuronale, tous les rats vigiles (210) seront placés pendant 1 heure dans une cage spéciale ; dans cette cage les rats sont libres de leur mouvement. 90 rats auront 3 sessions de mesure de l'activité neuronale (repartis sur 40 jours), 120 rats auront 1 seule session de mesure de l'activité neuronale. Tous les rats (210) seront pesés (2 fois par semaine, 15 semaines maximum, 10 secondes par pesée).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour cette procédure sont : -Chirurgies : douleurs soulagées par l'administration d'antalgiques et inconfort transitoire au réveil. - Dispositif de mesure de l'activité cérébrale : gène légère pendant la durée de l’expérience. - Cathéter intraveineux : gène légère pendant la durée de l’expérience. - Auto-administration : La prise de drogue chronique peut causer un stress modéré chez certains individus, ce qui est attendu car, comme chez l’Homme, un état « addict » chez le rat peut être associé à un état émotionnel négatif. Cet état peut se révéler par le poil hérissé, par une certaine irritabilité et agressivité envers l’expérimentateur mais pas envers ses congénères. Dans la plupart des cas, cet état est transitoire et l’état du pelage et les niveaux d’agressivité reviennent à la normale après quelques jours. - Période d’abstinence : peut causer un léger stress. - Isolement : peut causer un stress modéré.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’expérience afin de procéder à des analyses sur le cerveau.

Remplacement

Ce type de recherche, vise à mettre au point une technique d’enregistrement de l’activité des neurones in vivo chez l’animal vigile au cours de tests comportementaux, ce qui implique d’utiliser des animaux vivants. L’étude de ce processus nécessite la présence de réseaux neuronaux intacts et fonctionnels qui sont uniquement accessibles dans des animaux intègres et donc vivants. Après vérification, il n’a pas été trouvé de test in vitro ou in silico permettant d’effectuer cette recherche et il n’est donc pas envisageable d’utiliser des méthodes de substitution à l’animal entier.

Réduction

Dans la première phase du projet, pour réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous progresserons pas à pas avec des groupes de 3 animaux. Nous testerons une condition à la fois, jusqu’à l’obtention de résultats satisfaisants. Nous avons fixé une limite maximale de 30 animaux par lot pour trouver les conditions optimales pour la mise au point de la technique d’enregistrement des neurones, soit 10 conditions expérimentales maximum. Dans la seconde phase de mesure de l'activité cérébrale chez les rats addicts, nous estimons à 20 rats par lot le nombre d’animaux nécessaire pour pouvoir faire les analyses statistiques de nos résultats.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites et des critères d’intervention et d’arrêt. En effet, ces points limites gradés précis et spécifiques sont définis de façon suffisamment précoces sont définis dans une grille de suivi. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape, avec un recours à l’anesthésie générale, additionnée d’une anesthésie locale en présence d’antalgiques ainsi que d’un maintien de la température par un tapis chauffant et d’une hydratation régulière des tissus lors des procédures de chirurgie. Les expérimentateurs sont compétents en chirurgie. A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fourni par l’animalerie (stick ou pièce de bois à ronger pour assouvir leur besoin naturel de ronger) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les procédures débuteront après une période d’acclimatation de 10 jours minimum.

Choix des espèces

Le rat est l’animal le plus utilisé pour l’étude de l’addiction dans les modèles animaux. Les rats ont des réponses aux drogues qui sont similaires à celles de l’Homme et ils s’auto-administrent toutes les drogues abusées par l’Homme de façon spontanée, ce qui n’est pas aussi évident avec une autre espèce, pour laquelle la réalisation de tâches opérantes modélisant l’addiction est plus difficile à obtenir. Nous utiliserons des rats de la lignée « Sprague-Dawley ». Il s’agit de rats « outbred », c’est-à-dire avec un niveau de consanguinité limité ce qui permet une variabilité génétique majeure entre les individus pour un meilleur reflet de ce que l’on trouve chez l’Homme. Dans cette étude, nous utiliserons des rats « jeunes adultes » de 7-8 semaines au début du projet, pour faciliter l’apprentissage et pour pouvoir effectuer des expériences de longue durée sans facteur confondant de déclin cognitif lié au vieillissement.

Les souris de ce projet portent des modifications génétiques qui les font développer spontanément des lymphomes et des leucémies, avec réduction de l'activité, prostration, poil hérissé et abdomen gonflé parmi les signes attendus. 262 d'entre elles sont utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Cent soixante subissent cinq à sept injections sous la peau et cinq prises de sang à l'état vigile, un lot de quarante allant jusqu'à 43 prélèvements sanguins hebdomadaires, et 90 jeunes souris sont poinçonnées à l'oreille pour le génotypage. Le porteur écrit qu'il est "indispensable" de mettre à mort tous les animaux dès qu'un point limite est atteint, puisque toutes sont exposées au risque de développer un cancer.

Objectifs

L’immunosurveillance est la capacité du système immunitaire à lutter contre les cellules tumorales. Cette immunosurveillance peut être inhiber au cours de la vie, favorisant le développement de tumeur. Des travaux précédent ont montré que dans certaines circonstances des anticorps neutralisant cette immunosurveillance, favorisaient les maladies virales et par conséquent pourraient favoriser le développement de cancers tels que les cancers hématologiques. Ce projet consiste donc à immuniser des souris afin qu'elles produisent ces anticorps neutralisant l'immunosurveillance et de mesurer l'impact de ces anticorps sur le développement plus rapide des cancers hématologiques apparaissant dans les modèles murins utilisés.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra potentiellement de décrire un nouveau mécanisme favorisant l’immuno-évasion et le développement de cancers hématologiques et pourra ouvrir une nouvelle perspective de traitement pour les patients atteints de cette maladie. En effet, malgré l’essor récent des thérapies ciblées et de l’immunothérapie, la plupart des patients rechutent avec des tumeurs résistantes.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à de la contention. 160 souris subiront au minimum 5-7 injections sous la peau (qui dureront moins d'une minute sur animaux vigiles), ainsi que 5 prélèvements de sang sur animaux vigiles, qui dureront quelques secondes. Parmi ces 160 souris, 40 souris seront en plus d'abord anesthésiées puis auront une injection intraveineuse qui durera quelques secondes et un prélévement sanguin qui durera moins d'une minute. 40 autres souris auront aussi en plus un prélévement sang hebdomadaire (soit 43 max) qui durera moins d'une minute sur animaux vigiles. 40 autres souris vigiles auront en plus une injection dans la veine de la queue après avoir placer la queue de la souris quelques secondes sous une lampe chauffante. 90 jeunes souris (à J14 minimum) subiront un prélèvement d'oreille par poinçonnage pour le génotypage, à l'état vigile. Le prélèvement durera quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements seront sources de stress et de douleur (inflammation sur le site d'injection), cependant le volume injecté ou prélévé reste faible et l'acte est rapide (inférieur à une minute). Les effets indésirables attendus liés au développement des lymphomes (souffrance modérée) seront la réduction de l’activité, la prostration, le gonflement exacerbé de l'abdomen. Les effets indésirables attendus liés au développement de la leucémie (souffrance modérée) seront la réduction de l’activité, la prostration, le poil hérissé, les yeux plissés ou bridés et un envahissement du sang par les cellules leucémiques.

Devenir

l'ensemble des animaux seront à risque de développer des cancers, il est donc indispensable de mettre à mort l'ensemble des animaux de chacunes des procédures dès qu' un point limite est atteint ou au plus tard au moment définissant la fin des procédures.

Remplacement

Des études préliminaires sur des modèles celullaires ont été réalisées et ont permis à la fois de démontrer l'efficacité de l'immunisation permettant la production des anticorps neutralisant l'immuniosurveillance. En parallèle, des analyses complémentaires ont été et seront réalisées sur des prélèvements de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, les approches in vitro ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet.

Réduction

Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet (n=262) a été réduit au minimum nécessaire et suffisant pour obtenir des résultats statistiquement interprétables pour la cinétique de développement des différentes tumeurs hématologiques. De plus, un animal permettra d’obtenir des résultats dans plusieurs expériences (incidence des tumeurs, analyse phénotypique des tumeurs, analyse de marqueurs sanguins).

Raffinement

L'élevage des souris génétiquement modifiées pouvant développés des tumeurs spontanément sera adapté et limité dans le temps afin de limiter l'apparition de ces tumeurs. Les transfert de cellules seront précédés d'une anesthésie qui limitera la douleur des souris. La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux en générant le moins de stress possible par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 3x/semaine. Au fur et à mesure de l'apparition des tumeurs hématologiques et des mises à mort des animaux, des souris se retrouveront isolées dans les cages. Ces animaux recevront un enrichissement supplémentaire (coton et igloo pour nidification, morceau de bois)

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour les études de développement de cancers hématologiques car c'est un modèle proche de la pathologie humaine qui reproduit les caractéristiques histologiques. De plus, un modèle vivant est indispensable pour l’étude de de la répônse immunitaire sur le développement tumorale. Les souris utilisées seront toutes des souris adultes permettant ainsi un bon développement du système immunitaire. Nous disposons également d'outils, d'expériences et de compétences solides pour réaliser cette étude dans les meilleures conditions chez la souris.