Rongeurs

Des souris femelles gestantes respirent un insecticide pyréthrinoïde huit heures par jour, du douzième jour de gestation jusqu'à la naissance de leur portée, et jusqu'à sept jours au-delà. 258 souris, mères et petits, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leur cerveau. Le porteur attend chez les mères des troubles digestifs, une hyperventilation, des déficits moteurs et des symptômes de type parkinsonien ou épileptique, et chez la descendance une mortalité accrue à la naissance ou un syndrome de type autistique, qui constitue précisément l'hypothèse testée. Les petits passent ensuite l'open field, la croix surélevée et le test d'interaction sociale à trois chambres, et le porteur affirme que reproduire une exposition par inhalation impose l'"organisme entier".

Objectifs

La prévalence de l'autisme ne cesse d'augmenter à l'échelle mondiale, devenant un problème de santé publique non négligeable. Les composantes environnementales ont un plus fort impact que les facteurs génétiques dans l'apparition de troubles du spectre autistique (TSA). Parmi elles, on retrouve les pesticides, néfastes pour les nuisibles mais également pour l'Homme dans le stades précoces du développement. En effet, diverses études épidémiologiques (Etats-Unis, France, Royaume-Uni...)) montrent une utilisation durant la dernière décennie de pesticides mais plus précisément d'insecticides à usage domestique dans 70 à 95% des cas. Ces produits sont retrouvés majoritairement sous forme de pulvérisateurs avec pour la plupart, comme substance active : les Pyréthrinoïdes (insecticides). Ainsi, une exposition aux pyréthrinoïdes pendant la période périnatale augmente le risque d'apparition de TSA, au travers d'un contact entre le pesticide et le foetus par l'intermédiaire de la mère qui l'inhale. Les agences environnementales alertent également sur leur utilisation intensive en air intérieur, notamment par les femmes enceintes car dans la société actuelle, la majorité de la population passe plus de 80% de son temps dans un environnement clos, taux augmentant à 95% pour les femmes enceintes. Nous avons précédemment montré que les concentrations de pyréthrinoïdes domestiques dans l'atmosphère intérieure sont 1000 fois plus élevées qu'à l'extérieur et que l'application aiguë de pyréthrinoïdes modifie l'activité électrophysiologique (activité électrique) des neurones des mammifères. Nous supposons qu’une exposition prénatale aux pyréthrinoïdes perturbe la séquence de développement des réseaux neuronaux et la synaptogenèse (connexions nerveuses), entraînant une altération durable des comportements sociaux et cognitifs. Nous sommes un consortium de neurobiologistes et de chimistes de l'atmosphère qui modéliseront l'exposition environnementale aux pyréthroïdes humains chez la souris. Nous focaliserons notre étude sur la deltaméthrine, un pyréthrinoïde de type II car il est le plus fortement détecté dans l'air ambiant ; l'Agence Française ANSES le classe parmi les 32 substances prioritaires ; enfin, il cible les récepteurs GABA et l'altération de la neurotransmission GABAergique est un mécanisme physiopathologique des TSA.

Bénéfices attendus

Face à l'orientation pandémique actuelle des TSA, la recherche doit aller au-delà des facteurs génétiques, sachant que les produits chimiques industriels largement disséminés dans l'environnement sont des contributeurs importants à cette pandémie. La nature innovante du projet est de démontrer le lien neurobiologique avec les preuves émergentes d'une association entre l'exposition prénatale à la pollution par les pyréthrinoïdes et l'apparition des TSA. Dans ce contexte, l'utilisation croissante d'insecticides ménagers commerciaux dans les atmosphères intérieures soulève des questions en raison des propriétés potentiellement dangereuses des substances actives pour la progéniture, étant donné que le niveau et la durée d'exposition à ces produits chimiques sont susceptibles d'être significatifs. La modélisation de cette exposition subaigue sur un modèle animal apportera donc des avancées importantes quant à la neurotoxicité des pyréthrinoïdes sur le cerveau en développement.

Procédures

Aucune intervention invasive ou chirugicale ne sera conduite sur les animaux. Les femelles gestantes seront exposées 8h/ jour à minima 7 jours (du stade embryonnaire jour 12 (E12) de gestation à la naissance de la portée) et jusqu'à 14 jours (du stade E12 de gestation à la naissance de la portée + 7 jours de vie). Cette procédure sera conduite à deux doses; l'une représente une dose mesurée en air intérieur (1µg/m^3) et l'autre une dose mesurée en air extérieure (10 ng/m^3). Des tests comportementaux seront effectués, à savoir : Les milestones entre les âge 3 et 15 jours afin de percevoir la présence de déficits sensori-moteurs caractéristiques des troubles autistiques pour une durée de 30 minutes par jour et par portée. Les enregistrements de vocalisations seront réalisées pendant 5 minutes sur des animaux âgés de 8-10 jours. Les tests comportementaux suivants seront réalisés sur des animaux âgés de 21 à 48 jours : le test de l'Open Field (10 minutes); la croix surélevée (5 minutes) et enfin le test d'interaction sociale à trois chambres (40 minutes).

Impact sur les animaux

Des effets indésirables sur les mères gestantes pourront être observés suite à l'inhalation de pyréthrinoides de type 2 : troubles digestif, hyperventilation, déficits cognitifs et moteurs avec symptomes de type parkinson ou de C-S syndrome (épilepsies). Les effets indésirables liés à l'exposition subaigue de l'insecticide sur la descendance sont une augmentation de la mortalité à la naissance ou un syndrome de type autistique ce qui est l'hypothèse de notre étude. Les tests comportementaux seront une source de stress engendrée par la séparation maternelle et les manipulations que nous prendrons en compte.

Devenir

L'ensemble des animaux seront sacrifiés dans la dernière étape de la procédure pour récuperer leur cerveau et permettre les analyses electrophysiologiques ou biochimiques.

Remplacement

L'objectif du projet étant de mimer l'exposition humaine par inhalation des insecticides sur un modèle animal afin de mesurer la neurotoxicité sur le comportement ainsi que sur l'activité nerveuse, ce projet ne peut pas être envisagée hors du contexte intégré retrouvé au sein de l’organisme entier. En ce sens, ces connaissances de l'impact de l'environnement sur le développement cérébral ne peuvant pas être transposées sur des modèles ex-vivo ou organoïdes, le remplacement n’est donc pas possible.

Réduction

Un plan d’expérience sera systématiquement rédigé avant les expérimentations dans un souci permanent d’optimisation du nombre d’animaux. Aucune étude antérieure n’a été menée sur ce projet auparavant. Nous envisageons l'utilisation de tests statistiques non paramétriques (Wilcoxon-Mann-Whitney, ANOVA 1 facteur - Kruskal Wallis, ANOVA 2 facteurs ) afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Les expériences seront conduites sur un seul modèle animal et une seule souche : souris de type sauvage. Le bien-être des animaux, qu'il s'agisse des souris gestantes comme de leur progéniture exposée à l'insecticide, sera évalué régulièrement (croissance staturo-pondérale, aspect général, comportement). Les mères et leur nouveau-nés seront hébergés sous environnement contrôlé, dans une cage d'exposition aux insecticides avec un environnement enrichi d'igloos cartonnés et de mini-rouleaux de papier foisonnant permettant aux femelles de faire des nids, et avec la possibilité de boire et manger ad libitum. Afin de réduire la souffrance des expositions, celles-ci seront appliquées par inhalation et à des doses contrôlées par des mesures permanentes du taux d'insecticide (1µg/m^3 et 10ng/m^3). Les expériences de comportement sur la progéniture seront conduites uniquement en situations aigües et non chroniques. Afin de limiter leur stress, la salle de comportement est équipée d'un tapis chauffant, d'une lumière tamisée, d'un contrôle de la température. La pièce est silencieuse et ventilée. Le manipulateur frottera ses gants dans la sciure pour ne pas perturber les animaux par ses odeurs. Nous mettrons en place les points limites suivants: pour les femelles gestantes nous observerons la détérioration de l'apparence de l'animal, des difficultés respiratoires sévères et prolongées, la léthargie de l'animal (immobile, ne répondant pas aux stimuli), la perte de poids excessive (supérieure à 20% de son poids initial), diarrhée et température (suivi par caméra thermique). En fonction du score de l'animal (Annexe 3), les interventions seront : à surveiller (score de 3 à 5), demander un second avis et considérer l'euthanasie (score de 5 à 7) et souffrance sévère, prévoir l'euthanasie (score de 7 à 9). En ce qui concerne les descendants, les points limites seront l'apparition de troubles respiratoires (la cyanose), l'hypotonie néonatale, la perte de poids, et la prise de lait (visualisée au niveau de l'estomac).

Choix des espèces

Nous avons sélectionné la Souris pour plusieurs raisons: - L'objectif étant de reproduire l'exposition perinatale et par inhalation des femmes à un insecticide répandu, nous devons rester sur un modèle mammifère - Afin de pouvoir contrôler au mieux les concentrations d'expositions tout en considérant le bien être animal nous avons réalisé une chambre d'exposition dont le volume (30l) est approprié pour les rongeurs. - L'équipement que nous possédons sur notre plateforme comportementale afin de rechercher un phénotype autistique est adapté à la souris jeune et adulte et pas complètement au rat. - La période d'exposition (stade embryonnaire 12 à 7 jours post-natal) a été choisie car c'est une période critique pour le développement du système nerveux. Les expériences d'électrophysiologie sont réalisées au 7ème et 20ème jour post-natal afin d'observer la séquence développementale de l'activité excitatrice versus inhibitrice du GABA.

Pour tester si une molécule empêche la douleur du visage déclenchée par une inflammation, 130 rats Sprague-Dawley vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués ensuite pour le prélèvement de tissus nerveux. Chacun reçoit une injection intrapéritonéale par jour pendant cinq à huit jours sous anesthésie gazeuse, plus une injection sous-cutanée, puis passe chaque jour un test d'allodynie où un filament est appliqué sur sa face. Le porteur qualifie ces mesures de peu douloureuses au motif que l'animal peut se soustraire au filament, et attend de l'expérience qu'elle produise l'hypersensibilité douloureuse recherchée. Les rats qui perdent plus de 15 % de leur poids sont mis à mort.

Objectifs

Lorsque la douleur est chronique ou persistante, elle devient alors pathologique car elle n’offre plus aucun avantage mais provoque au contraire une extrême souffrance. C’est notamment le cas de douleurs inflammatoires qui apparaissent suite à une inflammation du système nerveux périphérique ou central. Parmi les symptômes douloureux, nous nous intéressons à l’allodynie qui correspond à une douleur provoquée par une stimulation normalement non douloureuse, qui peut être déclenchée suite à l’inflammation. Ce phénomène provoque l’activation de plusieurs populations neuronales, mais fait également intervenir les astrocytes, un sous-type de cellules gliales. Cependant, les mécanismes astrocytaires impliqués dans la génèse de l’allodynie en condition inflammatoire au niveau de la face sont peu connus.Nos résultats obtenus jusqu’à présent ont permis notamment de mettre en évidence que l’inflammation induisait une réactivité astrocytaire ainsi qu’une diminution d'un type de canaux astrocytaires. Cependant, la question de comment l’inflammation est capable d’entrainer cette dérégulation du canal astrocytaire, ainsi que la réactivité astrocytaire reste toujours en suspend. Le projet étudiera s’il est possible de prévenir les inflammations sur les canaux astrocytaires et par conséquent la douleur, à l’aide d'une molécule capable de moduler l’expression du gène correspondant à la protéine du canal astrocytaire. Il combinera des approches moléculaires et comportementales, et sera réalisé sur des rats adultes mâles, âgés entre 4 et 8 semaines.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes centraux induisant la dérégulation du canal astrocytaire, impliquée dans les phénomènes d’hypersensibilité douloureuse. Au travers des résultats attendus, ce travail pourrait avoir des répercussions positives sur la recherche pré-clinique s’intéressant aux douleurs chroniques, et pourrait à terme mettre en lumière de nouvelles pistes thérapeutiques.

Procédures

Les différents gestes techniques utilisés lors de ce projet sont au nombre de 2 : • Injections intra-péritonéales (

Impact sur les animaux

Utilisant un modèle de douleur infammatoire, nous nous attendons au développement d’une hypersensibilité douloureuse lors d'une stimulation tactile. Les résultats obtenus ne montrent pas d'effets indésirables sur les animaux mise à part le développement d'une allodynie faciale suite à une stimulation tactile. La douleur occasionnée à l’animal est estimée comme étant « modérée » (retrait de la face). Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles consistent en la mesure d’un seuil avec possibilité d’échappement et n'entrainent pas de réactions visibles autres que le retrait moteur de la zone stimulée. Afin de diminuer le stress lié aux tests de comportement et aux injections, les animaux ont une prériode d’adaptation suite à la livraision suivie d'une période d’habituation.

Devenir

A la fin des procédures, les animaux seront profondément anesthésiés et seront mis à mort pour prélever les tissus nerveux d'intérêts afin de réaliser une analyse protéique.

Remplacement

L’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique. D’après nos connaissances il n’existe à ce jour aucune méthode de remplacement capable d’intégrer tout ces éléments. C’est pourquoi il est nécessaire de réaliser notre étude sur animal entier.

Réduction

Le nombre de rats par groupe a été évalué sur la base des travaux précédents en tenant compte des divers problèmes que nous pourrons rencontrer au cours des différentes phases expérimentales (problème au moment de la dissection, mauvaise apprentissage lors de l’habituation aux tests comportementaux…). Le nombre de 6 rats /groupe pour les études comportementales est d’après nos données antérieures au sein du laboratoire le minimum requis pour discriminer un effet statistique significatif . Cependant, plusieurs étapes sont limitantes donc par il est préférable de prévoir un maximum de 10 animaux par groupe: habituation, injections systémiques,comportement, prélèvements. Pour chaque procédure, nous allons adapter notre approche statistique aux données obtenues afin d'obtenir des résultats statistiquement fiables et pertinents avec une puissance d’analyse d’au moins 70%. Si lors des procédures, 6 animaux sont suffisants, nous n'utiliserons pas plus d'animaux. Des tests statistiques seront utilisés pour déterminer le nombre d'animaux suffisant et nécessaire. Afin de limiter le nombre d'animaux, les études comportementales et moléculaires seront réalisées avec les mêmes groupes.

Raffinement

Les animaux seront stabulés dans des pièces ventilées, thermorégulées (22±1 °C) avec hygrométrie contrôlée. Le cycle de lumière est inversé (lumière de 19h à 7h). L’accès à la nourriture et à l’eau se fait ad libitum et le changement de la litière se fait 2 fois par semaine. Les rats sont placés 3 par cage de 800 cm2 (enrichissement social). Les animaux seront utilisés avant d'atteindre un poids supérieurs à 300g. Des rouleaux de cartons sont ajoutés pour pouvoir se cacher et grignoter. La surveillance des animaux se fera quotidiennement par les personnes compétentes du laboratoire conformément à la législation en vigueur. L’expérimentation sera réalisée à parti de 7 jours après réception (période d’adaptation) et après 5 jours d’habituation pour les expériences encomportement. Plusieurs critères seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures, et des points limites ont été établis par une grille de scores. Les animaux seront notamment surveillés quoditiennement lors des différentes procédures. Le poids est mesuré quotidiennement. Si la perte de poids excède 15% du poids initial, les animaux seront mis à mort. Nous regarderons également l’apparence et le comportement (poils ébouriffés, animal prostré, posture anormale, vocalisations, agitation, toilettage). S’il apparait un comportement correspondant aux points limites définis par la grille de scores, alors les animaux seront exclus de l'expérimentation.

Choix des espèces

La souche de rat Sprague-Dawley est couramment utilisée et est la plus adaptée pour les études comportementales dans le domaine de la douleur en santé humaine. Nous utiliserons des animaux entre 5 à 8 semaines (125 à 250 g), pour comparer avec les données du laboratoire.

200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune hébergée seule et en cycle inversé pendant les neuf semaines du protocole. Pendant sept semaines, elles ont le choix entre une bouteille d'eau et une bouteille d'alcool, accès que le porteur qualifie de volontaire et non forcé. Suivent un examen IRM de 56 minutes sous anesthésie et un prélèvement de 300 microlitres de sang, soit 15 % du volume sanguin total, puis la mise à mort et le prélèvement des organes. Le porteur reconnaît que l'isolement peut stresser les souris et qu'une consommation excessive d'alcool peut les déshydrater, et attend de l'étude une vue globale du connectome susceptible de servir à de futurs travaux translationnels.

Objectifs

Le trouble de consommation de l’alcool induit des modifications cérébrales complexes, se caractérisant par plusieurs stades associés à des adaptations spécifiques. En effet, une exposition prolongée et répétée à l’alcool peut être à l’origine d'altérations dans la communication entre les différentes régions du cerveau. Par ailleurs, des différences dans la vulnérabilité à la dépendance et à la toxicité de l'alcool entre les sexes ont déjà été mises en évidence à la fois chez l'Homme et dans des modèles de rongeurs. Ainsi l'objectif de cette étude est d'identifier par IRM dans quelle mesure les altérations de la communication cérébrale dépendent du sexe lors d'une consommation excessive et à long terme d'alcool. C'est pourquoi, après une consommation chronique de 7 semaines, des souris mâles et femelles sous exposition volontaire à l'alcool seront caractérisées par IRM multimodale afin de detecter les modification de la communication cérébrale. Ce projet tend donc à répondre aux questions suivantes ; quelles modifications cérébrales sont induites par la consommation d'alcool à long terme, quelles sont les différences d'altérations entre les sexes, et comment ces modifications peuvent être liées ou même prédire un comportement addictif ?

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude devraient contribuer à mieux comprendre les conséquences au niveau de la connectivité cérébrale dans l'addiction à l'alcool à long terme;, et l'influence du sexe dans les modifications observées. Ce projet devrait apporter une vue globale de la réorganisation du connectome chez les souris exposées à l’alcool, tout en permettant de cibler les aires cérébrales présentant des altérations spécifiques, et pouvant servir de cibles pour de futurs études translationnelles.

Procédures

Les animaux seront soumis à : 1) un protocole volontaire d'accès intermittent au choix entre 2 bouteilles : alcool versus eau pendant 7 semaines. 2) un examen IRM sous anesthésie incluant : un séquence d'IRM fonctionnel (16 minutes), une séquence d'IRM anatomique (10 minutes) et une séquence d'IRM de diffusion (30 minutes). 3) Un prélèvement sanguin de 300 µl maximum (15 % du volume sanguin total) réalisé sous anesthésie. Par ailleurs, les souris seront hébergées individuellement et en cycle inversé pour toute la durée du protocole, c'est-à-dire 9 semaines.

Impact sur les animaux

Le protocole de préférence de consommation de la solution d'alcool par rapport à l'eau par les souris est basée sur une action volontaire et non forcée. Des études précédentes chez la souris ont montré que le protocole induit une augmentation de la consommation après 2-3 semaines d’exposition. Cette consommation se stabilisent par la suite mais sa chronicité pendant 7 semaines reproduit le passage vers l’addiction à l’alcool, comme observées chez l’homme. Le protocole ne teste pas l’état de sevrage des souris car l’exposition à l’alcool n’est pas arrêté de manière prolongé, limitant ainsi les possibles nuisances. Les souris peuvent cependant présenter un état de déshydratation suite à la consommation excessive d’alcool. Ce protocole exige par ailleurs que les souris soient isolées ce qui peut induire un stress chez les animaux.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront mis à mort afin d’effectuer des prélèvements d’organes d’intérêts.

Remplacement

Le modèle animal est, pour le moment, le seul modèle qui permet d’étudier dans son ensemble les phénomènes complexes mis en oeuvre dans l'addiction à l'alcool au niveau cérébrales à l'échelle du connectome. En effet ces atteintes sont multifactorielles, nécessitant un grand nombre d’acteurs, et toutes les conditions ne sont pas reproductibles fidèlement dans un modèle de culture cellulaire. L'utilisation de modèles murins pour le dévéloppement du projet est crucial. L'alcoolisme est une pathologie hétérogène qui implique une grande variabilité des profils symptomatiques. L'étude chez l'animal permet un suivi au cours du temps (du développement du modèle à l'établissement du phénotype de consommation excessive d'alcool) et un contrôle de l'historique de consommation incluant les niveaux de consommation, ses caractéristiques temporelles, ainsi que de l'environnement de l'exposition. Ce suivi est crucial pour l'identification et la caractérisation des phénotypes de consommation d'alcool et pour identifier les facteurs déterminants dans le passage à la consommation compulsive. Ces informations phénotypiques seront corrélées aux informations sur la connectivité cérébrale, mais également aux analyses cellulaires et moléculaires du tissu cérébral, ce qui nous apportera des informations sur les mécanismes de pathologie liées à la consommation excessive d'alcool. Ces questions ne peuvent être évaluées de manière contrôlées que dans des études chez l'animal. Chez l'humain le suivi historique non biaisé est impossible, cette évaluation étant basée sur la consommation d'alcool auto-déclarée. De plus, les facteurs environnementaux (stress, début de la consommation, comorbidités) sont des facteurs difficilement intégrables dans les études chez l'homme. Il n'est pas non plus possible de réaliser des prélèvements tissulaires chez l'humain. Le lien, entre des variables spécifiques (comme la quantité de consommation d'alcool), les phénotypes (comme le comportement de consommation compulsive) et les caractéristiques de la connectivité, permet la découverte de médicaments pour cibler des caractéristiques temporelles et catégorielles spécifiques de l'alcoolisme, dans le but de diminuer la consommation et éviter le passage vers l'addiction. Les médicaments ciblant l'alcoolisme pourraient influencer les jours d'abstinence, les niveaux d'alcool ou les changements de profils, qui ne peuvent être évalués avec précision que dans un cadre longitudinal et contrôlé.

Réduction

Le nombre de souris est réduit au minimum d’animaux nécessaires afin d’assurer l’efficacité des tests et obtenir des résultats fiables en fonction des expériences réalisées. Le nombre d’animaux pour l’analyse des résultats a été calculé à l’aide de tests statistiques et notre expérience montrant une forte variabilité des phénotypes de consommation d’alcool, amenant à 50 souris par groupe nécessaires pour analyser les résultats d'expérience IRM, conduisant à un total de 200 animaux

Raffinement

Le stress potentiellement engendré par la pratique expérimentale sera limité au maximum. A leur arrivée à l’animalerie, les souris bénéficieront d’une phase d’acclimatation à leur nouvel environnement de 2 semaines. Dans les cages d'hébergement, l'environnement sera enrichi par des carrés de coton pour l’édification du nid, des morceaux de bois pour que les animaux usent leurs dents, et des tubes pour fournir un abri. Pour limiter l’impact lié à l’isolement des animaux, les cages seront placées l’une à côté de l’autre pour maintenir les contacts olfactifs et visuels. Afin d’habituer les souris à la consommation d’alcool, le protocole d’accès intermittent au choix entre deux bouteilles comprend d’abord un accès pendant la première semaine à des bouteilles contenant un pourcentage croissant d’alcool. Durant l'examen IRM, le raffinement sera respecté par l'usage d'un anesthésie afin de réduire au maximum le stress de l'animal. Les yeux des animaux seront protégés du dessèchement grâce à l’application d’un gel de protection. La température et la respiration des animaux seront en permanence surveillées par un système de monitorage. En cas de chute de la température et/ou de la respiration non gérable, l'acquisition en cours sera immédiatement interrompue et l'animal sorti de l'IRM. Il sera alors placé dans une cage mis sous une lumière chauffante jusqu'à son réveil, sous surveillance. Des points limites ont été établis afin de soustraire les animaux à la douleur.

Choix des espèces

Pour ce projet nous utiliserons des souris mâles et femelles. Cette souche de souris est la plus utilisée dans l'étude du comportement lié à l'alcool. Les souris seront âgées de 8 à 10 semaines, étant l'équivalent de l'âge adulte chez l'homme. A cet âge, les souris ont atteint leur taille et poids adulte, ce qui permet une meilleure reproductibilité des résultats.

Chaque rat reçoit un cathéter dans la veine jugulaire au cours d'une chirurgie sous anesthésie gazeuse pouvant durer une heure, avant onze prélèvements de sang étalés sur huit heures, un toutes les trente minutes. 48 rats Wistar mâles vont être utilisés ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour le prélèvement de leurs organes. Ils sont hébergés seuls jusqu'à cinq jours, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress. Il annonce qu'entre l'administration de la dose unique et la mise à mort aucun effet indésirable n'est attendu, tout en indiquant qu'un des deux pesticides testés est classé cancérogène, tératogène et susceptible de nuire à la fertilité.

Objectifs

Ce projet s’inscrit dans un projet plus large qui consistera à étudier les effets de l’exposition périnatale à un cocktail de 2 pesticides administrés par voie alimentaire. En effet, les études de toxicologie sur les pesticides sont le plus souvent réalisées sur chaque substance séparément. Or combinées, même à faible dose, certaines molécules peuvent conduire à l’apparition ou à l’amplification d’effets toxiques. De plus, ces études sont très largement menées en utilisant la voie orale en gavant l’animal. Le gavage pouvant être traumatique pour l’animal mais aussi pour l’expérimentateur, de plus en plus, les études de toxicologie sont réalisées en utilisant un vecteur alimentaire pour exposer les animaux (eau, croquette, pâte, gelée, etc). Nous souhaitons ainsi étudier la toxicité lors d’une administration par voie alimentaire d’un cocktail de 2 pesticides. Pour pouvoir valider notre méthode d’administration et déterminer les quantités de pesticides distribués dans différents organes, il est nécessaire de pouvoir comparer les concentrations sanguines à différents temps de chacune des 2 substances après leur entrée dans l'organisme, seules ou en association via l’alimentation avec les profils obtenus par gavage. Pour cela, 9 groupes de 5 rats mâles adultes Wistar seront répartis ainsi: un groupe contrôle sans exposition sans huile et sans pâte, un groupe contrôle gavage (gavé seulement à l'huile), un groupe contrôle alimentation (seulement la pâte), un groupe exposé au cocktail de pesticides par alimentation, un groupe exposé au cocktail par gavage, un groupe exposé au pesticide 1 par alimentation, un groupe exposé au pesticide 1 par gavage, un groupe exposé au pesticide 2 par alimentation et un groupe exposé au pesticide 2 par gavage. Une procédure préliminaire sera réalisée pour mettre au point la technique de prélèvement de sang sur deux rats qui pourront selon les résultats être intégrés au groupe contrôle sans exposition sans huile et sans pâte.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra faire progresser les connaissances scientifiques sur le comportement des substances étudiées dans l'organisme afin d’améliorer les modèles de modélisation basés sur la physiologie liée à une exposition aux mélanges de pesticides et l’évaluation des risques sanitaires associés. Il permettra aussi d’avoir des informations essentielles pour la mise en place de méthodes d’exposition plus représentatives de l’exposition humaine et tout aussi efficace que le gavage. Les résultats de ce projet pourront ainsi, être une base intéressante pour d’autres expérimentations réalisées sur des animaux plus sensibles au gavage comme les rates gestantes.

Procédures

Chaque animal sera tondu une fois au niveau de la nuque et une fois au niveau de la gorge (durée inférieure à 5 minutes). Des prélèvements de sang seront réalisés en utilisant un cathéter. Celui-ci sera installé dans la veine jugulaire dans le cadre d’une chirurgie (une fois par animal) effectuée sur les animaux anesthésiés par un gaz. Cette chirurgie durera au maximum 1h. Au maximum, 11 prélèvements de sang seront réalisés sur 8h (toutes les 30 minutes). Chaque prélèvement durera moins d'une minute. Les animaux exposés par gavage, recevront une seule fois de l'huile de colza avec ou sans pesticides directement dans l'oesophage. Le gavage durera moins d'une minute. Les animaux exposés par voie alimentaire, mangeront volontairement une seule pâte avec ou sans pesticides. L'ingestion durera au maximum 30 minutes (si l'animal mange une partie puis pose la pâte avant de la reprendre). Les animaux seront isolés à partir de l'installation du cathéter jusqu'à la fin de chaque procédure soit au maximum 5 jours.

Impact sur les animaux

Les animaux seront exposés à une dose unique de pesticides inférieure à la dose induisant la mort. De plus, un pesticide est de catégorie 2 pour la reproduction et le système nerveux et c'est un cancérogène/tératogène dû à la susceptibilité de nuire à la fertilité. Le deuxième pesticides de catégorie 3 est toxique en cas d'ingestion à de forte dose (supérieur à la dose induisant la mort). Les autres mentions de toxicité concerne les organismes aquatiques exposés chroniquement. Ainsi, entre le moment où les animaux recevront cette dose unique et leur mise à mort, aucun effet indésirable n'est attendu. Toutefois, les manipulations, comme la contention, et les manipulations lors des prélèvements sanguins peuvent provoquer du stress chez le rat. L’hébergement individuel des rats pourrait également être une nuisance causant du stress chez les animaux.

Devenir

Tous les rats seront mis à mort à la fin des prélèvements sanguins dans le but de prélever post mortem différents organes cibles pour effectuer des dosages afin de déterminer la pharmacocinétique.

Remplacement

Pour évaluer les temps de rétention de certaines substances chimiques dans l’organisme, des modèles mathématiques ont été mis en place à partir d'exposition chez l'animal (principalement chez le rat). Cependant, ces modèles n'existent pas pour les molécules étudiés dans ce projet, ni pour des mélanges de substances avec pour méthode d’exposition, le gavage et l'ingestion d'une alimentation contenant des pesticides. Une approche par des modèles physiologiques ne permettra pas de prendre en compte tous les organes impliqués dans la métabolisation y compris les compartiments éventuels de stockage tels que les tissus adipeux. L'espèce choisi sera le rat car les organes seront suffisamment gros pour effectuer tous les dosages nécessaires (il faudrait le double d'animaux si l'étude était réalisée chez la souris). La souche Wistar est une espèce docile et facile à apprivoiser ce qui facilitera les manipulations notamment lors du gavage et des prélèvements sanguins. Cette étude nécessite donc une approche in vivo.

Réduction

Pour ce type de test, au minimum 4 animaux sont nécessaires pour évaluer les différents temps de présence et l’imprégnation des organes à des substances chimiques (cf essai n° 417 de l'Organisation de coopération et de développement économiques). Dans ce projet, nous étudierons 4 animaux par groupe plus un animal supplémentaire afin de pallier au risque qu’un animal présenterait des effets pouvant impacter les résultats et devant alors être exclu de l’étude, soit 5 animaux par groupe pour l'étude la cinétique. Ainsi, le projet sera composé de 4 groupes exposés par gavage, un groupe contrôle non gavé et 4 groupes exposés par voie alimentaire. Trois animaux maximum permettront de mettre au point la méthode de prélèvement et pourront être inclus dans le groupe contrôle non gavé.

Raffinement

Les animaux seront quotidiennement observés selon différents critères établis dans une grille. Cette grille prendra en compte l’apparence, le comportement et certains signes cliniques permettant de déterminer un score. Selon le score obtenu, une action sera mise en place pour soulager au mieux l’animal. Les animaux seront hébergés plusieurs par cage et leur environnement sera enrichi (cylindres en carton, lanières de papier krafts, bâtons de bois à ronger) pour limiter le stress de l’animal tout le long de chaque procédure. Puis après la pose du cathéter, les animaux seront hébergés individuellement afin d'éviter toute blessure liée au cathéter entre congénères qui pourrait induire une infection et compromettre les résultats. Lors de la pose du cathéter, du sérum physiologique contenant de l’héparine sera injecté pour s'assurer du bon fonctionnement du cathéter et éviter la formation d'un caillot sanguin puis un bouchon sera placé pour éviter des possibles "fuites" de liquide biologique. L'extrémité du cathéter sera extériorisé pour réaliser des prélèvements de sang 3 jours plus tard. Pendant la période de récupération post-chirurgicale (3 jours), les animaux seront étroitement surveillés afin d'écarter toute douleur liée à l'installation du cathéter. Pour cela, en début et fin de journée, un examen clinique sera réalisé (selon les critères de la grille). En parallèle, afin de s'assurer du bon fonctionnement du cathéter, du sérum physiologique hépariné sera injecté dans le cathéter par un expérimentateur pendant que l'animal sera maintenu par un autre expérimentateur (contention classique). Une partie des animaux sera gavé avec une canule spécifique pour cette technique afin d'éviter tout dommage sur l'animal. Les prélèvements sanguins seront réalisés par le cathéter préalablement installé. Si l'animal est docile et apprivoisé, il sera seulement maintenu par un expérimentateur pendant d'un autre expérimentateur réalise le prélèvement.

Choix des espèces

Le modèle rat est une espèce de référence en toxicologie. En effet, il est un bon indicateur pour prédire les effets toxicologiques et le temps de présence dans le sang afin de définir des valeurs de référence pour éviter d’éventuels effets chez l’Homme. Les animaux étudiés seront des adultes (environ 2 mois pour un poids compris entre 300 et 400g) pour garantir un poids suffisant des organes d’intérêt et pouvoir comparer les résultats de l’étude avec les données disponibles dans la littérature qui sont majoritairement obtenues sur des adultes.

Dépilées sur le dos sous anesthésie puis exposées vingt minutes aux ultraviolets, 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leurs tissus. Le porteur indique que l'irradiation peut provoquer une inflammation de la peau du dos, une perte de poids et des modifications de comportement. L'objectif est de caractériser des candidats analgésiques non-opioïdes en suivant l'action des cellules immunitaires de la peau et des neurones sensoriels. Les 30 souris ajoutées aux 270 calculées le sont pour parer à une éventuelle mauvaise qualité des ARN extraits, et les tests de sensibilité mécanique pratiqués sur animaux vigiles ne sont pas nommés.

Objectifs

Les solutions actuelles pour soulager la douleur des patients ont une efficacité limitée (effet de tolérance) et des effets secondaires graves. Actuellement les traitements disponibles pour les douleurs modérées et sévères/persistantes comme les opioïdes présentent de nombreux inconvénients. Ainsi, le développement de nouveaux médicaments pouvant traiter les douleurs aiguës est donc très important et s'avère d'une utilité publique majeure. C’est dans ce contexte que nous développons plusieurs nouveaux composés pharmaceutiques qui combleraient une lacune sur le marché de la douleur. Le rôle de ces composés ont déjà été démontré dans la gestion de la douleur, ainsi que dans la réparation des tissus. Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour déterminer les mécanismes moléculaires mis en jeu par ces composés pour moduler l’action des cellules immunitaires dans la régulation des voies de la douleur. La peau représente la première barrière physique contre les menaces extérieures et son intégrité est orchestrée par des cellules immunitaires résidentes spécialisées réparties dans les différentes couches qui la composent. La peau contient également un réseau dense de neurones sensoriels impliqués dans la perception du touché léger et de la douleur. De récentes études montrent également que le système nerveux sensoriel peut influencer l’activité des cellules immunitaires et ainsi optimiser les défenses contre une agression extérieure. Ainsi, pour répondre a ces questions nous avons choisis le modèle de lésions cutanés induite par une exposition aux ultraviolets (UV). Nous étudierons l’activité des cellules immunitaires de la peau et des neurones du système sensoriel (DRG) dans ces souris après exposition aux UV, traités ou non avec les différents composés pour déterminer l’impact du traitement sur la réponse immunitaire et la sensibilité mécanique.

Bénéfices attendus

La douleur est un problème majeur de santé public. Mieux comprendre comment TAFA4 module le système immunitaire dans les processus de mise en place de la douleur est primordial pour améliorer à terme le confort des patients atteints de douleurs chroniques et approfondir la compréhension de son mécanisme d’action. A terme, cette étude permettra de développer de nouveaux médicaments pour le traitement de la douleur inflammatoire sans effet secondaire. Des études précliniques réglementaires de toxicologie et de sécurité ont déjà été réalisées avec un composé utilisant le même mode d’action sans mettre en évidence d’effets secondaires, ni de phénomène d’accoutumance : problèmes majeurs des analgésiques actuellement sur le marché (opioïdes, paracétamol, etc...).

Procédures

Toutes les souris subiront une anesthésie générale afin de subir une dépilation sur la peau du dos puis une exposition aux UV pendant 20 minutes de la zone dépilée, toujours sous anesthésie. Nous réaliserons également des études de comportement pour tester la sensibilité mécanique induite par l’exposition aux UV sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les animaux seront amenés à subir une irradiation aux UV qui pourraient induire une perte de poids, des modifications de comportement en plus d'une inflammation de la peau du dos. Toutes ces procédures seront réalisées par un personnel qualifié et expérimenté et tout sera mis en œuvre pour minimiser la nuisance provoquée. De plus une observation approfondie est effectuée quotidiennement à l’aide de la grille d’observation (Annexe) après la mise en place du modèle inflammatoire afin de prévenir toute complication.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés car le prélèvement des différents tissus est indispensable pour étudier le recrutement cellulaire de la réponse inflammatoire au niveau des tissus étudiés.

Remplacement

TAFA4 a déjà été testé pour son activité analgésique dans différents modèles de douleurs. Le recours à l’utilisation d’animaux est nécessaire pour appréhender l’effet analgésique sur ce modèle post-ultraviolets dans son contexte physiologique mettant en jeu le système immunitaire et le système nerveux sensoriel. De plus la douleur ne peut être dissociée du système biologique global de l’animal, ainsi l’expérimentation animale sur des souris est indispensable à l’étude des phénomènes physiologiques et à la réalisation de notre projet.

Réduction

Pour répondre convenablement aux réponses scientifiques soulevées, nous estimons le nombre minimal de souris nécessaires à 270 animaux, auquel nous ajoutons une marge de 30 animaux au cas où il serait nécessaire d’ajouter des animaux pour compléter l’étude (par exemple, si certains ARNs purifiés à partir des tissus prélevés n’étaient pas d’assez bonne qualité pour pouvoir réaliser l’analyse transcriptionnelle). Un total de 300 animaux est prévu pour cette étude. Ce chiffre a été déterminé après l’utilisation d’outils statistiques (logiciel GraphPad) permettant d’estimer au mieux le nombre d’animaux nécessaires avec une différence significative (p

Raffinement

Les souris utilisées dans ce projet sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements complexes pour leur permettre de se comporter normalement. Les animaux sont élevés en présence d’objets permettant le raffinement de l’environnement dans des cages standards à toit ouvert (couvercle à filtre) avec de la sciure de bois utilisée comme litière et un accès ad libitum à un bidon d’eau et à un régime alimentaire standard. Nous utilisons alternativement des carrés de ouates pour que les animaux puissent faire un nid, des dômes en cellulose ou des tunnels en carton, qui sont changés chaque semaine. Les élevages sont effectués au sein d’un établissement agréé où 5 personnes sont dédiées à l’organisation et l’entretien des élevages et ainsi tous les jours l’état sanitaire et environnemental des animaux est contrôlé. De plus, le week-end, la personne en charge du projet sera d’astreinte pour le suivi des animaux. D’autre part, le recours aux analgésiques est prévu dans le cas où l’état sanitaire des animaux le demandera (annexe grille de suivi). Nous avons recours à l’anesthésie/analgésie lors de l’exposition aux UV et des soins pré-, per- et post-opératoires adéquats sont administrés. Une planification fine des procédures expérimentale sera effectuée (disponibilité des locaux d’expérimentation, du matériel, période d’acclimatation des animaux aux pièces d’expérimentation et dans l’animalerie) permettant de diminuer le stress des animaux et favoriser la validité des expériences. Notamment lors du test de la sensibilité mécanique, les animaux seront acclimatés à l’enceinte 30 minutes avant d’effectuer les mesures afin de diminuer leur niveau de stress. Enfin l’établissement des points limites selon la grille en annexe avec un suivi quotidien consistera en une vérification du poids, de la vivacité et de l’état du pelage des animaux avant de continuer l’expérience ou non en fonction des signes vitaux des animaux. Une souris ayant perdu 20% de son poids initial sera systématiquement euthanasiée. Toutes ces stratégies d’optimisation seront mises en place dans le but de réduire voire supprimer la souffrance chez l’animal.

Choix des espèces

Le niveau de similarité entre la souris et l’homme justifie son utilisation. L’état des connaissances actuelles, les outils et les structures disponibles pour sa manipulation font de la souris le modèle idéal à l’étude des systèmes immunitaires et nerveux. En effet les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires entre la souris et l’Homme. Des souris de 8 à 12 semaines seront utilisées car à ce stade elles ont atteint leur maturité en termes de défenses immunitaires et une maturité développementale du système nerveux. Ainsi, les animaux auront été commandés à 7 semaines auprès du fournisseur agréé de manière à ce qu'ils s'acclimatent à notre animalerie pendant au moins une semaine

Capturés au piège dans leur milieu, 150 mulots sylvestres et mulots à collier sauvages sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis relâchés. Chacun subit sous anesthésie gazeuse une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire, geste que le porteur chiffre à trois minutes entre la sortie du piège et la fin du prélèvement. Le projet poursuit deux objectifs déclarés, former des étudiants de master aux métiers de la conservation et suivre les pathogènes des rongeurs sauvages. Le porteur admet un taux de mortalité de l'ordre de 3 % lié au piégeage, par arrêt cardiaque, rupture des cervicales ou refroidissement, et justifie le choix de ces deux espèces par leur abondance et leur "facilité de capture".

Objectifs

Le présent projet s’inscrit dans des objectifs de formation pédagogique et scientifique des étudiants de niveau Master ayant pour projet professionnel de travailler dans les métiers de l’environnement appliqués à la conservation d’animaux sauvages. Les objectifs sont i) de fournir un niveau de connaissance adapté à l’utilisation d’animaux de la faune sauvage à travers une approche éthique (présentation des comités d’étiques en expérimentation animale, règle des 3R,…) ; ii) initier les étudiants à la capture de Micromammifères (essentiellement le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus), le Mulot à collier (Apodemus flavicollis) et le Campagnol roussâtre (Myodes glareolus), potentiellement d’autres espèces sauvages moins abondantes ; le présent projet portera cependant uniquement sur les 2 espèces de Mulots, les autres espèces seront relâchées immédiatement, cf ci-dessous) ; iii) présenter les risques liés à la contention et les bonnes pratiques de terrain ; et iv) intégrer le bien-être animal en condition de captivité. Les échantillons récoltés avec les étudiants permettront ensuite de réaliser un suivi à long terme de l’état de santé des populations de rongeurs à l’échelle régionale et de maintenir une surveillance des pathogènes présents chez les rongeurs.

Bénéfices attendus

L’apport de connaissances nouvelles à des étudiants pouvant être amenés à manipuler des animaux sauvages dans leur cursus professionnel, et l’obtention de données nouvelles, remplissent un objectif à la fois pédagogique et scientifique à travers une approche non-létale. La formation à l’éthique et au bien-être animal répond ainsi aux enjeux sociétaux et de perfectionnement personnel d’une pratique encadrée par un context légal et qui s’inscrit directement dans les plans de carrière de certains étudiants. De plus, la formation à une démarche non létale sur des mesures hématologiques, immunologiques et hormonales est innovante et offrira un panel de compétences attractives auprès de leurs futurs employeurs. Sur le plan scientifique, le suivi de l’état de santé de rongeurs sauvages sur les sites d’études permettrait une meilleure compréhension des enjeux sociétaux actuels, mais aussi de définir des risques épidémioloques pour la présence de zoonoses dans l’environnement.

Procédures

Les animaux subiront une prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie. Cette procédure sera réalisée par un personnel formé et expérimenté. Le temps estimé d’une prise de sang (avec identification spécifique, sexage et mesures morphométriques) est de l’ordre de 3 minutes de la sortie du piège à la fin du prélèvement.

Impact sur les animaux

Au cours de la manipulation, les animaux peuvent ressentir un stress lié à la capture, la contention, et la manipulation. Les parties potentiellement douloureuses ou particulièrement stressantes (prise de sang notamment) se font cependant sous anesthéise gazeuse. L’anesthésie gazeuse évite une injection (intrapéritonéale), l’induction de l’anesthésie est rapide (de l’ordre de 30 secondes) et l’anesthésie elle-même est brève (de l’ordre de 3 min, permettant l’identification spécifique, le sexage, les mesures morphométriques et la prise de sang), évitant une hypothermie. A l’issue de la prise de sang dans le sinus rétro-orbitaire sous anesthésie, un lubrifiant oculaire et un anesthéisant local seront appliqués sur l’œil des individus. Par la suite, les animaux seront placés dans des boîtes dortoirs pour être remis en liberté après un temps de repos (minimum 1 heure) et la vérification préalable de leur bon état de santé (œil en bon état, comportement normal, cf § relatif aux points-limites ci-dessous). Cette méthode de prise de sang n’est pas substituable à un prélèvement dans la queue qui donne un volume trop faible ou dans le sillon mandibulaire . De précédents tests de prise de sang dans le sinus mandibulaire ont été effectués par des personnes qualifiées à ce type de prélèvement sur souris de laboratoire mais n’ont pas permis de réaliser des prises de sang. L’absence de ce sinus chez les Mulots est suspectée.

Devenir

Les animaux seront relâchés à l’issue de chaque procèdure en considérant qu’aucun traitement pouvant moduler leur réponse immunitaire ou affecter leur comportement ou fonction écologique ne pourrait affecter le devenir de ces animaux en condition naturelle. Cette remise à l’état sauvage prend en compte l’expérience des responsables du projet et le travail de la SBEA ayant statué à l’unhanimité sur la possibilité de réaliser un prélèvement sanguin comme indiqué dans chaque procédure suivi du relâcher des animaux.

Remplacement

Le double objectif du projet est (i) de former des étudiants aux méthodes éthiques et réglementaires d’utilisation d’animaux de la faune sauvage à des fins scientifiques et (ii) d’acquérir des données de long terme sur l’état de santé et les pathogènes de micromammifères sauvages. L’utilisation d’animaux est requise car, à notre connaissance, aucune approche de modélisation ne permettrait d’obtenir de telles données. Des études comparatives sur le système immunitaire de rongeurs ayant montré que la réponse immunitaire d’individus sauvages et d’animaux de laboratoire différait significativement (Abolins et al., 2017; Viney and Riley, 2017),l’utilisation d’animaux sauvages est également requise. L’étude pathogènes potentiellement zoonotiques ne peut par ailleurs se faire que sur animaux capturés dans l’environnement et non sur animaux-modèles de laboratoire.

Réduction

La variabilité inter-individuelle des réponses immunitaires est très forte en conditions naturelles et la reproduction de ces mêmes conditions n’est pas possible en laboratoire. De nombreuses études scientifiques commencent à intégrer les conditions environnementales comme effets modulateurs de la réponse immunitaire face aux infections (Flies and wild comparative immunology consortium, 2020). Parmi les agents infectieux susceptibles d’étre identifié, Borrelia burgdorferi, l’agent responsable de la maladie de Lyme présente des prévalences parfois très faibles au sein de populations de Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus) et de Mulot à collier (Apodemus flavicollis). Sur la base de ces informations, les effectifs prévus pour les procédures 1 and 2 ne peuvent être inférieurs à 30 rongeurs (Procédure 1) et 30 rongeurs (Procédure 2) par site d’étude et par an pour garantir une puissance statistique suffisante et la valorisation scientifique des résultats.

Raffinement

En ce qui concerne les captures, les pièges sont relevés au moins une fois par jour. Cependant, la littérature ainsi que l’expérience des personnels impliqués dans ce programme laissent envisager un taux de mortalité de l’ordre de 3%. Les causes de décès peuvent être un stress conduisant à un arrêt cardiaque, une rupture des cervicales ou un refroidissement en période froide (peu probable au printemps) et/ou pluvieuse dans les pièges). En dehors de l’arrêt des captures en cas de conditions météorologiques défavorables, ces mortalités indésirables sont difficilement totalement évitables. Les conditions de captivité des animaux seront conformes aux conditions des Rongeurs de laboratoires (Cages normalisées, nourriture et eau fournis ad libitum), sauf en ce qui concerne la captivité individuelle, mais avec un enrichissement aussi élaboré que possible (Dortoir et coton permettant la confection d’un nid, structures de carton, roue et balle pour le jeu). Les animaux seront hébergés sous tente avec un contrôle des conditions environnementales (Température, hygrométrie) et les anesthésies, mesures et prélèvements seront effectués dans le véhicule agréé pour expérimentation animale, donc en des lieux séparés. Les mesures et prélèvements seront effectués sous anesthésie par du personnel qualifié.

Choix des espèces

Les espèces choisies sont le Mulot sylvestre (Apodemus sylvaticus) et le Mulot à collier (Apodemus flavicollis). Le Mulot sylvestre et le Mulot à collier sont des Micromammifères abondants, ubiquistes, opportunistes avec un régime alimentaire varié. Leur positionnement trophique intermédiaire les place comme une source de nourriture de premier choix pour un grand nombre de prédateurs (Rapaces et Mammifères) incluant des espèces patrimoniales (Milan royal par exemple). Leur utilisation dans des travaux scientifiques en écologie, écotoxicologie, ou écoépidemiologie est fréquente, permettant une relation des résultats obtenus ici avec la littérature internationale, tant par les étudiants concernés que par l’équipe de recherche (Chrono-environnement). Leur facilité de capture et leur capacité à être maintenus en captivité en font un modèle biologique idéal par rapport aux objectifs scientifiques de cette étude. Seuls les Rongeurs d’âge adulte et les femelles non gestantes seront utilisés pour cette étude.