Rongeurs
Formations sur les gestes techniques chez le rat et la souris
- Formation professionnelle
Rats : 160
Ponctions de sang au sinus rétro-orbital, administrations par voies intraveineuse, intranasale, orale, vaginale et oculaire, puis mise à mort par dislocation cervicale : ce sont les gestes que des personnes en formation apprennent sur 160 souris et 160 rats, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, tous tués à l'issue. Un même animal peut subir jusqu'à trois gestes différents par jour, cinq jours de suite. Le porteur affirme que ces formations visent à limiter l'inconfort et l'anxiété des animaux non-humains pendant l'expérimentation, tout en reconnaissant qu'un geste réalisé par une personne peu expérimentée peut provoquer stress, inconfort et douleur locale. Ces séances sont des formations internes à une entreprise, initiales ou continues, adossées aux études de pharmacocinétique exigées par la réglementation du médicament.
Objectifs
Ce projet a pour but de décrire les formations du personnel avec des rats et souris, notamment les gestes techniques nécessaires pour faire des études pharmacocinétiques et les études mécanistiques de devenir du médicament dans l’organisme qui répondent aux exigences règlementaires. Les formations peuvent inclure : - la bonne contention - l’anesthésie d’un animal - les prélèvements de sang au sinus rétro-orbital, des organes ou des fluides chez le rat et la souris - l’administration par voie intraveineuse, intramusculaire, intranasale, per os, sous-cutanée, intra-vaginale, topique, intra-auriculaire et oculaire (topique) - la mise à mort d’un animal (dislocation cervicale). La formation est adaptée à la personne et à la fonction exercée. Pour une formation initiale dans l’entreprise, l’acquisition des notions théoriques et des gestes et techniques devant être réalisées seront évalués et, selon le degré de maitrise, seront validés ou nécessiteront une formation complémentaire. Pour la formation continue, les personnes concernées se forment uniquement aux nouveaux gestes nécessaires pour leur travail. Toute formation est faite en présence d’un formateur expérimenté qui maitrise la technique en question. La formation pour chaque geste est terminée quand le formateur juge que la technique est maitrisée.
Bénéfices attendus
Ces formations permettent aux expérimentateurs d’acquérir des gestes techniques parfaitement maîtrisés. Ceux-ci visent à limiter au maximum l’inconfort et l’anxiété de l’animal pendant l’expérimentation. De plus, la qualité des résultats expérimentaux obtenus pour le développement de médicaments à usage humain sera améliorée par la maîtrise de ces gestes et permettra de ne pas réaliser ces expérimentations sur un plus grand nombre d’animaux que nécessaire (réduction du nombre d’animaux utilisés).
Procédures
Le même animal sera utilisé pour plusieurs gestes si possible, par exemples, plusieurs types d'administration et prélèvement du sang. La durée des interventions sera comprise entre quelques secondes (par exemple pour les intraveineuse, Orales, Intrapéritoneale, Sous cutanée, occulaire et intra-auriculaire) et une minute (administration rectale, vaginale). La durée d’un prélevement rétro-orbital sera d’environ 10 secondes. Un maximum de 3 gestes (différents) par jour, par animal et sur un maximum de 5 jours ne sera pas dépassé. Administration par différentes voies, prélèvement du sang, mise à mort par dislocation cervicale sous anesthésie, prélèvement d’organes après mise à mort.
Impact sur les animaux
Les gestes ou actions expérimentales effectuées par une personne peu expérimentée peuvent générer du stress, un inconfort ou une douleur locale.
Devenir
Les mêmes animaux utilisés pour la formation de l’administration peuvent être également utilisés pour les formations de prélèvement. Dans la mesure de possible, les animaux sont utilisés pour collecter des organes ou du plasma nécessaire aux méthodes de dosages de bioanalyses) à la fin de l’ensemble des procédures.
Remplacement
La formation pour l’administration et le prélèvement ne peux pas être fait avec un autre modèle. La réglementation pour le développement de nouveau médicament exige les tests chez les rongeurs. Afin de pouvoir répondre à cette demande, une formation aux gestes techniques est obligatoire pour les études de pharmacocinétique.
Réduction
Avant l’utilisation des animaux, une formation théorique sera dispensée sur la bonne manipulation et la contention afin de réduire le stress et l’inconfort de l’animal. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés, les gestes sont montrés dans un premier temps pendant des études pharmacocinétiques liés à un autre projet autorisé (phase d’observation). La formation pratique sera ensuite faite sur les animaux. Aucun animal n’est spécifiquement commandé pour la formation.
Raffinement
La personne à former reçoit d’abord une formation théorique et une formation à la manipulation et contention de l’animal sans geste de prélèvement ou d’administration. Quand le formateur juge que la personne maitrise ces techniques, les autres formations peuvent commencer. L’animal sera anesthésié si la procédure le nécessite. De plus, lors de l’hébergement des animaux, l’enrichissement du milieu comprend l’utilisation de maisonnettes et boules de coton pour les souris, de tubes en carton et blocs de bois pour les rats. L’hébergement est réalisé en groupe stable.
Choix des espèces
Rat ou souris pour les essais règlementaires de pharmacocinétique nécessaires au développement de nouveaux médicaments à usage humain. Les animaux utilisés ont entre 6 et 12 semaines conformément à la règlementation.
Caractérisation du rôle du tronc cérébral dans le signal « glucose-portal »
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Tuées à l'issue pour que leur cerveau, leur foie et leurs tissus gras soient prélevés, 56 souris vont être utilisées dans des procédures dont 40 impliquent un niveau de souffrance sévère, 8 un niveau modéré et 8 se déroulent sous anesthésie sans réveil. Quarante d'entre elles subissent une injection dans le cerveau sous anesthésie, puis quinze jours plus tard la pose d'un cathéter dans la veine porte, avant une perfusion de 24 heures. Le porteur indique que ces chirurgies peuvent provoquer de la douleur, une hémorragie locale, des troubles neuro-musculaires et des difficultés respiratoires sous anesthésie gazeuse. Il précise que les souris utilisées pour la mise au point sont des animaux de réforme, de toute façon mis à mort en dehors du projet, et affirme que comprendre le dialogue entre l'intestin et le cerveau impose de travailler sur l'"organisme entier".
Objectifs
L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de la glycémie, notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Les études précédentes ont mis en évidence que la production de sucre (glucose) par l’intestin exerce des effets bénéfiques sur l’équilibre glucidique et énergétique. L’intestin est en effet capable de produire du glucose en dehors des repas dans une veine spécifique (veine porte), située entre l’intestin et le foie. La détection de glucose dans cette veine après un repas induit un signal nerveux qui cible le cerveau, et qui en retour, va diminuer la taille du repas suivant. Ainsi, lorsque nous imitons la production de sucre par l’intestin en perfusant du glucose directement dans la veine porte, nous observons une diminution de la prise alimentaire associée à une activation de 3 régions du cerveau, connues pour contrôler la faim. Cependant, les études réalisées jusqu’alors ne permettent pas de déterminer si l’activation de chacun de ces 3 noyaux est nécessaire ou si elle est redondante pour les effets coupe-faim de la production intestinale de glucose. Un des noyaux impliqué dans ces effets coupe faim, le noyau du tractus solitaire (ou NTS), est un centre important d’intégration des signaux provenant du système digestif et est connu pour moduler la prise alimentaire. Dans ce projet, notre objectif est de déterminer si l’activation de ce noyau est nécessaire à la mise en place de l’effet coupe-faim induit par la production intestinale de glucose. Pour cela, nous étudierons, sur une durée d’un an, si l’inactivation de ce noyau cérébral spécifique (par l’injection d’un virus directement dans le cerveau) annule les effets coupe-faim de la détection de glucose dans la veine porte.
Bénéfices attendus
Les mécanismes moléculaires par lesquels la production intestinale de glucose exerce ses effets anti-diabète et anti-obésité ne sont pas connus. Les résultats issus de ce projet nous permettrons d’identifier précisément quelles régions du cerveau sont indispensables à ces effets bénéfiques. Ils s’intègrent dans une étude plus globale qui cherche à comprendre comment le glucose est détecté dans la veine porte et comment le cerveau reçoit et intègre informations nutritionnelles envoyées par l’intestin. A plus long terme, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourraient permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre l’obésité et ses complications.
Procédures
A l’âge de 12 semaines, certaines souris subiront : - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris et sans réveil (8 souris). - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris avec un suivi post-opératoire de deux semaines (8 souris). - une injection cérébrale au cours d’une chirurgie sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes/souris, puis 15 jours après, une chirurgie sous anesthésie générale permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte d’une durée de 20 minutes/ souris (40 souris). Une semaine après, ces souris subiront une infusion (via le cathéter installé) d’une solution contrôle (20 souris) ou une solution de glucose (sucre) (20 souris) pendant 24h.
Impact sur les animaux
- Les interventions chirurgicales sont susceptibles de provoquer de la douleur. - L’injection du virus peut entrainer une faible réponse immunitaire localisée. - La chirurgie réalisée dans le cerveau peut entrainer des problèmes neuro-musculaires. - Au cours de la chirurgie, l’anesthésie gazeuse peut entrainer des difficultés respiratoires. - La chirurgie peut entrainer une hémorragie locale. - L’injection peut entrainer une légère douleur au niveau de l’abdomen ainsi qu’un stress. Une attention particulière sera portée lors de l’injection pour éviter au maximum toute inflammation du péritoine. Ces nuisances sont diminuées par la mise en place de raffinements spécifiques.
Devenir
Les animaux seront mis à mort pour prélèvements d’organes et analyses des tissus. Le cerveau, le foie et les tissus gras seront étudiés pour déterminer si l’inactivation du noyau cérébral annule les effets bénéfiques de la détection de glucose dans la veine porte préalablement observé sur ces tissus.
Remplacement
Cette étude ne peut pas être réalisée sur cellules ou organoïdes car la détection du glucose dans la veine porte a des impacts sur l’ensemble du métabolisme et implique des dialogues entre organes. En effet, le glucose produit par l’intestin est détecté dans les vaisseaux et active un signal nerveux vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux en périphérie qui ont des effets bénéfiques anti-obésité et anti-diabète. Pour comprendre comment la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques, il est donc nécessaire de l’étudier dans l’organisme entier.
Réduction
La totalité des animaux utilisés dans la procédure de mise au point sont des animaux de réforme, systématiquement mis à mort en dehors de ce projet. Ainsi, l’utilisation de ces animaux contribue à la réduction du nombre d’animaux, en évitant de produire des animaux spécifiquement pour cette expérience. Le nombre de souris utilisées pour l’expérience propre a été calculé au plus juste par des méthodes statistiques et à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept : Soit au maximum 10 souris par groupe. De plus, différents tissus (cerveau, foie, reins, tissus adipeux, pancréas, …) seront prélevés afin de déterminer si l’inactivation du noyau cérébral annule les effets bénéfiques à court terme induit par le signal glucose portal dans ces tissus. Ces tissus pourront constituer une banque de tissus commune au laboratoire pouvant être utilisés par la suite pour d’autres problématiques relatives à la production intestinale de glucose, notamment en évaluant la stéatose hépatique et le brunissement du tissu adipeux.
Raffinement
Les souris seront accueillies à l’âge de 5 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des procédures à l’âge de 12 semaines. Les souris seront hébergées en animalerie conventionnelle avec eau et nourriture ad libitum avec enrichissement. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisées et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Afin de limiter au maximum le risque d’hypothermie pendant la chirurgie, un module permettant de chauffer la boîte à induction de notre appareil à isoflurane va être ajouté. De plus, tout le suivi post-opératoire se fera dans une pièce dont la température sera réglée à 28°C afin de garder les souris à thermoneutralité. La mise en place de ces raffinements nous a permis d’observer une meilleure reprise de poids post-opératoire. Après les chirurgies, un suivi intensif est régulier sera réalisé tous les jours tout au long de l’expérience pour identifier et réduire d’éventuelles souffrances selon une grille de score spécifique. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points particuliers limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort.
Choix des espèces
Le rôle de l’intestin, organe capable de produire du sucre entre deux repas ou lors de jeûne, sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Ces études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine et la souris est un modèle dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kit biochimiques…). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte, entre 12 et 15 semaines. A cet âge, les individus présentent un meilleur rétablissement post-chirurgical.
Maintenance et reparation de la myéline centrale: role d’ADAM10
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
5 402 souris vont être utilisées dans des procédures allant de la souffrance légère à sévère, toutes tuées au plus tard deux mois après la chirurgie pour prélever leurs tissus. Chacune subit un prélèvement à la queue entre le septième et le dixième jour de vie, un traitement pharmacologique, des tests de mémorisation et de locomotion de dix minutes, et pour une partie d'entre elles une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie destinée à provoquer une lésion de la myéline. Le bénéfice annoncé tient en une phrase, faire émerger de nouvelles pistes pour le traitement des maladies démyélinisantes. Le porteur chiffre le lot expérimental entre 1 152 et 2 304 souris, sans expliquer d'où viennent les 5 402 déclarées.
Objectifs
La myéline est une substance qui entoure le prolongement des neurones et qui est responsable de la conduction nerveuse et donc de la transmission des commandes initiées par le système nerveux. La myéline est produite par des cellules appelées oligodendrocytes, localisés dans le cerveau et la moelle épinière. La perte de myéline ou d’oligodendrocytes peut survenir dans le cas de pathologies appelées maladies démyélinisantes (telle que la sclérose en plaques) ou lors de traumatismes (par ex. accidents de la route), et peuvent mener à de lourds handicaps. La formation de la myéline (myélinisation) et sa réparation (remyélinisation) sont des processus complexes qui font intervenir de nombreux mécanismes dans les oligodendrocytes. Le but de ce projet est de comprendre l’implication d’une protéine particulière en recherchant (1) son rôle dans la maintenance des gaines autour des prolongements neuronaux et (2) son rôle dans la réparation de la myéline chez la souris en mimant une lésion par perte myélinique. Ce projet s’appuie sur des études précédentes montrant que l’activation de ce type de molécule est capable de protéger la myéline. Pour étudier l’implication de cette protéine uniquement dans les oligodendrocytes, nous caractériserons les individus d’un point de vue macroscopique (locomotion, cognition) mais aussi microscopique (état des tissus, organes, cellules). Le projet proposé nous permettra de mieux comprendre le rôle de notre protéine dans ces maladies démyélinisantes et son potentiel régénératif. Ce projet permettra d’ouvrir la voie à de nouvelles pistes thérapeutique pour les maladies démyélinisantes, pour lesquelles il n’existe actuellement pas de traitements efficaces chez l’Homme.
Bénéfices attendus
Par ce projet, nous espérons faire émerger de nouvelles pistes pour le traitement des maladies démyélinisantes.
Procédures
- Un prélèvement à la queue sera réalisé à l’âge de P7-10 sur l’ensemble des souris afin de vérifier leur génotype (lien de leur parenté). - Les souris seront traitées par un composé pharmacologique afin de pouvoir étudier notre protéine d’intérêt dans le processus de réparation du système neveux. - Les souris réaliseront des expériences de comportement afin de vérifier leur capacités cognitives et motrices (mémorisation, locomotion). Ces expériences sont non-invasives et non douloureuses. Elles se feront sur animal vigile et dureront chacune maximum 10 min. - Une chirurgie sera réalisée sur des souris sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 20 min. L’ensemble des animaux sera mis à mort, 2 mois maximum après la chirurgie afin de récupérer les tissus d’intérêt pour les analyser.
Impact sur les animaux
- Stress de contention dû à la préhension de l’animal lors du traitement - Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie – Troubles moteurs suite à la chirurgie (de la nourriture humide sera placée dans la cage pour éviter les déplacements de l’animal).
Devenir
L’ensemble des animaux sera mis à mort à l’issue des expérimentations de chaque procédure afin de prélever les tissus d’intérêt.
Remplacement
Le modèle animal que nous utilisons permet de mimer certains aspects des pathologies que nous étudions (telle que la sclérose en plaques), et pour lesquelles il n’existe pas de traitement. Ce modèle est donc nécessaire pour mieux comprendre ces maladies. Les processus de myélinisation et de réparation de la myéline impliqués dans les maladies démyélinisantes que nous étudions induisent des processus biologiques et physiologiques complexes qui nécessitent l’intervention de multiples acteurs cellulaires. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet. Le modèle animal reste nécéssaire pour mesurer l’inflammation et la démyélinisation, ainsi que la récupération fonctionnelle de l’animal.
Réduction
Nous avons limité au minimum le nombre d'animaux pour atteindre la puissance statistique suffisante nécessaire à l’interprétation des résultats. Ce nombre a été évalué́ à partir d’études précédentes (les expériences histologiques et biochimiques nécessitent au moins 6 animaux et les expériences comportementales en nécessitent au moins 10). Ces précautions permettent de limiter les variations inter-individuelles et d’aboutir à des conclusions rigoureuses. Les animaux issus des études comportementales seront ensuite utilisés pour les études des tissus prélevés, nous évitant ainsi d’avoir recours à de nouveaux lots de souris dédiés à cette analyse. De plus, plusieurs tissus d’intérêt seront prélevés sur chaque souris, permettant encore de réduire le nombre d’animal utilisé. Dans le cas où nos premiers résultats ne montreraient pas d’effet d’OLA10 dans la réparation de la myéline, la procédure serait abandonnée. Nous envisageons donc de commencer par des expériences pilotes avec un nombre réduit de souris. Si les résultats sont concluants, les données seront complétées et approfondies en utilisant la totalité des groupes expérimentaux prévus. Ainsi, le lot expérimental serait constitué d’un minimum de 1152 souris, et d’un maximum de 2304. Les animaux contrôles utilisés dans nos procédures sont indispensables pour établir des comparaisons fiables et tirer des conclusions précises. Ces animaux nous permettront de contrôler les variables externes, d’éliminer les biais et de mesurer les effets de nos traitements en les comparant aux groupes expérimentaux. Ils renforcent ainsi la validité de nos conclusions.
Raffinement
Un suivi particulier du bien-être des animaux soumis à la chirurgie sera mis en place et une prise en charge de la douleur sera utilisée si nécessaire. Les procédures chirurgicales se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique post-chirurgical et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà̀ du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité́, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin de leur permettre aisément d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage tous les jours. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
Les souris sont des mammifères qui partagent de nombreuses similitudes biologiques avec l’Homme, en particulier au niveau génétique et neurologique. Elles constituent des modèles de choix pour (1) étudier les mécanismes des pathologies neurologiques humaines et (2) explorer des traitements potentiels de manière pertinente pour ces maladies. Les souris sont des organismes modèle bien établis en recherche biomédicale, et offrent une capacité élevée de reproduction et de cohérence dans les résultats expérimentaux, permettant des interprétations fiables et de tirer des conclusions robustes. De plus, les techniques d’analyse à notre disposition pour évaluer l’implication de notre molécule d’intérêt et l’état de la myéline (affectée dans la pathologie étudiée) sont très bien adaptées chez la souris. Les animaux sont utilisés à l’âge d’au moins 7 semaines car il est connu que le processus de myélinisation est terminé à cet âge, ce qui nous permet d’étudier la maintenance de la myéline une fois les gaines achevées autour des prolongements de neurones. De plus, la perte de myéline survient principalement chez le jeune adulte, que ce soit lors de maladies démyélinisantes telle que la sclérose en plaques, ou lors de traumatismes mécaniques type accident de la voie publique. L’âge choisi pour notre modèle permettra donc de mimer au mieux les lésions médullaires survenant chez l’Homme et d’en étudier le processus de réparation. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation de ce modèle animal, et ce à l’âge choisi.
Criblage des inhibiteurs intrinsèques aux lymphocytes T dans un microenvironnement tumoral et/ou allogénique
- Recherche appliquée
- Cancers
Deux à cinq injections sous anesthésie et une irradiation de dix minutes : 983 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour analyse post-mortem de leurs organes. Chacune porte une tumeur. Le projet cherche à identifier les molécules qui freinent les lymphocytes T dans un environnement tumoral, pour renforcer les thérapies cellulaires anticancéreuses. Les effets subis tiennent en trois fragments de phrase, effets liés aux tumeurs, aux injections et aux irradiations avec risque de maladie du greffon contre l'hôte, et aucun chiffre ne vient étayer l'effectif de 983 animaux.
Objectifs
Les lymphocytes T (ou cellules T) sont des acteurs clés de l'immunité contre le cancer. Le transfert de lymphocytes T dirigés contre les tumeurs représente une nouvelle thérapie majeure, permettant à la fois d’éradiquer directement la tumeur mais aussi de constituer une protection sur le long terme contre les rechutes. Cependant, leur prolifération (persistance et taux) peut être altérée dans un environnement immunosuppresseur, tel que le site tumoral lui-même ou par le système immunitaire de l’individu receveur. Nous proposons ici d’identifier de manière non biaisée et systématique les inhibiteurs spécifiques de ces cellules T dans ces environnements immunosuppresseurs dans le but de potentialiser de nouvelles générations de thérapies cellulaires. Nous cherchons à identifier des inhibiteurs de l’infiltration tumorale de cellules T mémoires pour améliorer l’efficacité des thérapies anti-tumorales. De plus, nous explorons la résistance des cellules T à la destruction par le système immunitaire du receveur dans le but de générer des thérapies cellulaires universelles à partir de donneurs sains de lymphocytes T.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal de ce projet est l'identification de nouvelles cibles therapeutiques optimisant l'efficacité des thérapies cellulaires T. Ce projet va aussi permettre de répondre à des questions fondamentales pour mieux comprendre et comparer le comportement des cellules T CD4 et CD8 in vivo. Au final, les résultats attendus pourraient permettre d'améliorer la prise en charge de certains cancers humains.
Procédures
Deux à cinq injections (5 minutes) sur animaux anesthésiés. Irradiations (10 minutes): une par animal, pour certains animaux.
Impact sur les animaux
Effets indésirables liés à la présence de tumeurs (une par animal). Effets liés à des injections. Effets liés aux irradiations (risque de maladie du greffon contre l'hôte).
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés pour faire des analyses post-mortem sur les organes d'intérêt.
Remplacement
Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire l’environnement immunosuppresseur auquel est soumis le système immunitaire in vivo. En effet, le système immunitaire est très compartimenté entre les organes lymphoïdes et les tissus avec une régulation des flux de cellules et des signaux (cytokines, chimiokines) très précise entre ces différents compartiments. De plus, l’utilisation d’un mode de sélection puissant in vivo nous permet d’identifier les inhibiteurs majeurs et non-redondants des cellules T, avec une relevance clinique immédiate.
Réduction
Nous pratiquerons le minimum d'expériences permettant à la fois d'être certain de la reproductibilité des phénomènes observés en assurant la puissance statistique nécessaire en tenant compte de la variabilité expérimentale du modèle employé. Nous allons effectuer des tests statistiques pour analyser la croissance tumorale et le suivi des souris.
Raffinement
Le milieu sera enrichi afin de réduire le stress des animaux. Les animaux seront maintenus en groupes et logés dans des cages appropriées de taille adaptée au nombre d’individus. Les souris sont anesthésiées pour les injections et l'imagerie. Les animaux seront suivis quotidiennement afin d’assurer leur bien-être et pour suivre les éventuels signes de douleur, de souffrance ou de stress. Des points-limites ont été établis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
La souris est un modèle de choix en immunologie du fait de la forte similitude des systèmes immunitaires humains et murins et de la disponibilité de souches congéniques et transgéniques parfaitement définies. Nous utiliserons des souris adultes car elles possèdent un système immunitaire mature.
Etude de l’impact d’une exposition fœto-maternelle au chlordécone sur le système nerveux nigro-strié de la souris et lien avec les syndromes Parkinsoniens – EU 1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Seize heures sans nourriture avant un test d'olfaction de dix minutes : 96 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance légère, toutes tuées par perfusion intracardiaque pour prélever leur système nerveux central. Quarante-huit subissent trois tests comportementaux nommés, motricité fine, olfaction, anxiété et motricité générale, le premier répété jusqu'à six fois. Les quarante-huit autres partent vers un second établissement pour une heure d'imagerie cérébrale sous anesthésie, dont six minutes de stimulation visuelle et trente-cinq minutes de stimulation pharmacologique. Le projet cherche à savoir si le chlordécone, insecticide interdit dans les années 90 mais toujours présent aux Antilles, favorise les syndromes parkinsoniens, le porteur écartant les organoïdes qu'il juge "prometteurs mais pas encore développés au laboratoire".
Objectifs
Le chlordécone est un insecticide organochloré utilisé aux Antilles pour lutter contre le charançon noir, un insecte ravageant les bananeraies. Compte tenu notamment de sa neurotoxicité à des doses élevées cet insecticide a été interdit dans les années 90. Malheureusement, cet insecticide est très persistant et a contaminé durablement l’environnement, les animaux et la population Antillaise. Pour l’heure les effets neurologiques éventuels d’une exposition à long terme sont mal connus. Toutefois, plusieurs éléments suggérant un effet délétère existent, notamment sur le neuro-développement chez les jeunes garçons nés de mères exposées. De plus, l’heptachlore, un autre insecticide organochloré à l’origine d’une contamination environnementale et humaine à Hawaï a un effet délétère chez la souris dans les régions du cerveau atteintes lors de la maladie de Parkinson et a été associé à des lésions cérébrales chez l’homme. L’objectif scientifique du projet est l’étude de l’effet sur la viabilité et la physiologie des neurones du système nerveux central chez des souris après une exposition au chlordécone par voie alimentaire chez la souris adulte d’une part et d’autre part après une exposition au chlordécone au cours de la période foeto-maternelle. Il s’agit d’un projet multisite qui se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
La finalité de ces approches est d’évaluer un lien potentiel entre une exposition au chlordécone et le déclenchement ou l’accélération de la maladie de Parkinson et de documenter les évènements physiopathologiques associés à ce mode d’exposition.
Procédures
Dans l’établissement utilisateur 2 : l’Imagerie cérébrale est réalisée une fois sur 48 animaux : elle est réalisée sous anestésie générale. La procédure complète dure environ 1 heure et comprends 6 minutes de stimulation visuelle et 35 minutes de stimulation pharmacologique via une injection intra-péritonélae. Dans l’établissement utilisateur 1 : les 48 autres animaux sont soumis à trois tests comportementaux : le premier test mesurant la motricité fine dure 10 minutes et est répété 6 fois (3 habituations et 3 tests) ou 2 fois (1 habituation et 1 test) selon le groupe d’étude, le second test évaluant les capacités d’olfaction dure 10 minutes (après une privation de nourriture de 16 heures) et est répété 2 fois ou 1 fois selon le groupe d’étude et le dernier test mesurant l’anxiété et la motricité générale dure 15 minutes et est répété 3 fois ou 1 fois selon le groupe d’étude.
Impact sur les animaux
Une procédure expérimentale similaire a déjà été mise en oeuvre au laboratoire sur une durée de 4 mois mais à l’aide d’une exposition par injection intrapéritonéale et aucun signe de souffrance n’a été détecté, pas de perte de poids ni de décès chez les souris mâles exposées. Les modalités d’exposition sont présumées ne pas induir d’effets indésirables. L’ensemble des interventions sont susceptibles d’engendrer des nuisances de classes légères aux animaux : -Les tests comportementaux peuvent potentiellement induir un stress pour les animaux -Les perfusions intra-cardiaque représentent un risque de souffrance lors de l’injection des produits anésthésiants -Le transport des animaux vers le second etablissement utilisateur peut induir un stress -L’anesthésie, la contention et la stimulation chimique lors de la réalisation de l’imagerie cérébrale peuvent induir à la fois un stress de l’animal et de la souffrance
Devenir
L'objectif de ce projet est l'étude de l'effet neurotoxique du chlordécone, pour ce faire il est nécessaire d'euthanasier les animaux afin de disposer du système nerveux central.
Remplacement
A ce jour, le remplacement complet de ce modèle d’étude n’est pas envisageable. Il existe des modèles d’étude utilisant des lignées de cellules neuronales mais ces derniers ne permettent pas d’étudier l’effet d’une exposition sur les interconnexions neurales ou l’impact sur les cellules gliales. Des travaux plus récent proposent l’utilisation d’organoïdes, ces approches sont prometteuses mais pas encore dévelopées au laboratoire.
Réduction
Le nombre de souris est réduit jusqu’au nombre d’animaux minimal permettant d’attendre des résultats statistiquement significatifs dans les différentes approches proposées.
Raffinement
Conformément aux exigences de raffinement, les expérimentations ont été optimisées afin de réduire la douleur au minimum, les animaux sont suivis quotidiennement et hébergés dans un environnement enrichi. En début de procédure, à la réception des animaux au laboratoire, un temps d’acclimatation d’environ 2 semaines est respecter. Un temps d’acclimatation est également respecté lors du transfert des animaux dans le second établissement utilisateur. Pour les animaux soumis aux tests comportementaux une étape d’habituation est également prévue. De plus, le personnel est attentif à la planification de ces tests afin de ne pas soliciter plus de 3 fois les animaux dans la même semaine. Cette alimentation supplémentée en Chlordécone n’a jamais été utilisée dans notre laboratoire en conséquence la quantité de nourriture ingérée par cage chaque semaine sera monitorée en plus du suivi du poids des animaux afin d’identifier le plus tôt possible un défaut d’appétence des croquettes
Choix des espèces
Les souris utilisées sont des souris conventionnelles C57Bl/6, cette lignée de souris est fréquemment utilisée dans les études du système dopaminergique. En effet, la physiologie de cette population neuronale est proche de celle de l’espèce humaine et la taille de sa population autorise des dénombrements précis. Par ailleurs cette lignée a déjà été utilisée dans notre laboratoire, nous pourrons ainsi comparer les résultats obtenus avec nos premiers résultats après deux et quatre mois d’exposition par injection intra-péritonéale. Le projet prévoit d’utiliser des souris adultes à l’âge de 2 mois au début du protocole d’exposition, ceci nous permettra de comparer les résultats de cette voie d'exposition avec notre projet précédent dans lequel les souris avaient subi une exposition similaire mais par voie intrapéritonéale. Le deuxième groupe d'animaux est constitué de souris exposées tout au long de la période de gestation et maintenues soit jusqu’à la fin de la période de sevrage soit jusqu'à l'âge de 2 mois. Cette partie du projet permettra d'obtenir des données quant à l'effet d'une exposition au chlordécone au cours de cette période du dévellopement.
Etude de la mitophagie dans un modèle murin de SLA/DFT
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Baguées à l'oreille et biopsiées à la queue dès le plus jeune âge, 1 122 souris porteuses d'une mutation de sclérose latérale amyotrophique avec démence frontotemporale sont ensuite laissées vieillir sans autre intervention, dans des procédures allant de la souffrance légère à sévère. Leur prise de poids décroche dès trois mois. Entre dix et quatorze mois apparaissent la perte de poids, la baisse de mobilité et les tremblements, jusqu'au stade que le porteur retient comme final. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes, le seuil déclenchant la mise à mort étant une perte de poids supérieure à 15 % ou l'incapacité à se retourner sur soi en moins de quinze secondes.
Objectifs
La maladie de Charcot (ou sclérose latérale amyotrophique) et la démence frontotemporale sont des maladies neurodégénératives conduisant à la mort des motoneurones (= neurones situés dans la moelle épinière, innervant et commandant les fibres musculaires). Ces deux pathologies présentent un spectre clinique commun, 50% des patients atteints de sclérose latérale amyotrophique développent une démence frontotemporale, 15% des patients atteints de démence frontotemporale présentent des signes de sclérose latérale amyotrophique. Précédemment, une mutation sur le gène d'une protéine de la mitochondrie (= petit organite qui a un rôle essentiel dans les processus énergétiques cellulaires) a été identifiée chez des patients souffrant d'une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale. Parmi tous les facteurs impliqués dans le processus conduisant à la sclérose latérale amyotrophique, un dysfonctionnement des mitochondries a toujours été envisagé comme un acteur majeur de cette pathologie. Mais, l'identification d'une mutation dans un gène codant pour une protéine de la mitochondrie fut la 1ère preuve génétique démontrant le rôle primaire des mitochondries dans des atteintes du motoneurone. L'objectif général de notre projet de recherche est de comprendre comment la mutation de ce gène codant pour une protéine de la mitochondrie conduit à la mort des motoneurones. Pour cela, nous devons caractériser la séquence des évènements reliant l'atteinte des mitochondries à la mort des motoneurones. L'étude du modèle murin présentant une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale suggérait une implication du processus de mitophagie (processus de mort permettant l'élimination des mitochondries anormales) dans différents organes. Ces souris ont été croisées avec des souris permettant de quantifier la mitophagie (la mitophagie est visualisée sous forme de points rouges en microscopie). Nous avons ainsi pu observer une augmentation de la mitophagie dans différents organes chez ces souris comparées à leurs souris contrôles. La poursuite de ce projet aura pour objectifs de 1/ caractériser le rôle de la mitophagie dans l'atteinte du motoneurone et 2/ établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans la séquence des évènements conduisant à la mort des motoneurones.
Bénéfices attendus
Actuellement, la maladie de Charcot et la démence frontotemporale ne présentent pas d'option thérapeutique, il est donc important de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Notre travail permettra de déterminer si le ciblage du processus de mitophagie peut être une piste thérapeutique intéressante dans le traitement des atteintes du motoneurone associées à un dysfonctionnement mitochondrial.
Procédures
Pour l'ensemble des procédures, l'identification des animaux nécessitera la pose d'une bague à l'oreille et d'une biopsie au niveau de la queue ou de l'oreille. Pour les procédures 1 et 2, les animaux seront élevés dans le cadre d’un protocole de vieillissement et ne seront soumis à aucune autre intervention avant la mise à mort des animaux. Pour la procédure 3 (240 animaux), les animaux seront également élevés dans le cadre d’un protocole de vieillissement. Au moment de la mise à mort des animaux, une injection intrapéritonéale d'une solution analgésique sera effectuée, suivie 15 minutes plus tard d'une deuxième injection intrapéritonéale d'une solution anesthésique. Deux injections en intrapéritonéales seront donc réalisées pendant la durée de vie de la souris.
Impact sur les animaux
Les souris présentant une sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale présenteront un phénotype dommageable conduisant à la mort des animaux. Les animaux présenteront : - une prise de poids diminée par rapport aux souris contrôles dès l'âge de 3 mois, - une diminution du poids et/ou une diminution de la mobilité des animaux et/ou la présence de tremblements à un stade plus avancé de la vie de l'animal (autour de 10 à 14 mois). L'identification des animaux (pose d'une bague et biopsie) entrainera une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Les animaux étudiés présentent un phénotype de maladie neurodégénérative (sclérose latérale amyotrophique et démence frontotemporale) nécessitant la mise à mort des animaux afin de prélever les organes pour les analyser.
Remplacement
Dans un but de remplacement, des expériences in vitro ont été réalisées précédemment sur des cellules en culture à partir de fibroblastes primaires issus des patients porteurs de la mutation d'intérêt et à partir de motoneurones différenciés à partir de cellules souches induites exprimant la mutation d'intérêt. Des expériences sur les motoneurones continueront à être menées. Néanmoins, bien que ces modèles cellulaires issus des patients présentent un potentiel important pour rempacer et réduire l'utilisation de l'animal, ils ne permettent pas de reproduire les interactions physiologiques et les mécanismes physiopathologiques intégrés à l'ensemble de l'organisme. La sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale étant une pathologie touchant plusieurs organes, seul un modèle animal permettra d'étudier les conséquences multiples du processus de mitophagie dans les différents organes et surtout d'établir une cinétique (à des âges différents) permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones.
Réduction
Dans un but de réduction, nous utiliserons des modèles cellulaires (notamment des motoneurones différenciés à partir de cellules souches induites) pour étudier le rôle de la mitophagie dans la mort des motoneurones. Ces expériences nous permettront de répondre à certaines questions scientifiques et ainsi de diminuer le nombre d'animaux utilisés. Des statistiques prédictives ont également été réalisées dans le but d'utiliser le minimum d'animaux nécessaires à ce projet. Afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs, nous aurons besoin de 15 animaux par expérience et par génotype.
Raffinement
Dans un but de raffinement, un suivi hebdomadaire du poids sera réalisé et une fiche de score sera utilisée pour assurer un suivi optimal de chaque animal. Cette fiche de score a été établit en lien avec le phénotype attendu de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale et a été précédemment utilisée pour le suivi de ces souris. Les animaux seront observés hebdomadairement, ce qui permettra d'identifier précocement tout signe clinique, de stress ou de douleur. Le phénotype de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale étant associé à une perte de poids, les animaux seront pesés une fois par semaine. Lorsqu'une perte de poids sera observée, une surveillance accrue de l'animal sera réalisée (2 fois par semaine ou tous les jours suivant le pourcentage de perte de poids), de l'eau et de la nourriture gélifiée seront également ajoutés dans la cage. Lors de cette surveillance hebdomadaire, une attention particulière sera portée sur la mobilité (affaiblissement des membres inférieurs ou tremblements) et sur le comportement des animaux. L'environnement de l'animal sera enrichi par ajout d'un igloo en papier mâché et de carrés de ouate ou de tissu compressé (pour permettre à l'animal de se faire un nid à l'abri de la lumière), ainsi que de batonnets en bois (pour permettre à l'animal de ronger) dans chaque cage.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) présente des similarités génétiques et physiologiques avec l'homme, permettant dans la mesure du possible d'extrapoler les résultats et d'en tirer des conclusions valables pour l'homme. De plus, elle présente un cycle de vie court et un cycle de reproduction avec une natalité importante. La souris est un modèle qui nous permet d'obtenir assez de matériel biologique pour réaliser les analyses protéique, génomique et histologique nécessaires au déroulé de ce projet de recherche. De plus, les modèles murins utilisés sont des modèles spécifiques déjà établis et caractérisés (modèle de sclérose latérale amyotrophique associée à une démence frontotemporale et modèle permettant de quantifier la mitophagie in vivo). Aucun autre modèle ne peut donc être utilisé. Les animaux seront utilisés à 4 stades de développement : - stade correspondant à l'atteinte finale de la maladie (= soit perte de poids supérieure à 15% par rapport à la pesée précédent la 1ère diminution de poids, soit un affaiblissement partiel de l'extension des pattes ou tremblements, associé à une incapacité pour la souris de se retourner sur elle-même lorsqu'elle est sur le flanc en moins de 15 secondes) - stade d'apparition des 1ers signes cliniques = 3 mois de vie - stade intermédiaire = 6 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones) - stade intermédiaire = 9 mois de vie (stade nécessaire pour établir une cinétique permettant de déterminer le rôle de la mitophagie dans le processus conduisant à la mort des motoneurones)
Mise au point d’un modèle de greffe de cellules souches hématopoïétiques dans des souris immunodéficientes BRGS dans le but d’étudier le développement des lymphocytes B
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système immunitaire
Dépourvues de lymphocytes T, de lymphocytes B et de cellules NK par construction génétique, donc incapables de combattre le moindre pathogène, une partie des 540 souris du projet vit en confinement sanitaire strict. Toutes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une irradiation qui détruit leurs cellules souches sanguines, une greffe de cellules par injection dans la queue préalablement chauffée, puis un prélèvement sanguin toutes les quatre semaines, l'irradiation à forte dose pouvant provoquer perte de poids, léthargie et dos courbé faute de reprise de l'hématopoïèse. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever la rate, les ganglions et les autres organes de l'immunité, exploration que le porteur juge "indispensable" pour conclure sur la reconstitution immunitaire.
Objectifs
Le but de ce projet est double. Tout d'abord un objectif fondamental qui sera d'évaluer le rôle de différentes mutations dans le développement et la maturation des lymphocytes B, qui sont les cellules productrices des anticorps. Pour cela, nous allons induire in vitro des mutations précises sur des cellules souches hématopoïétiques murines et injecter ces cellules mutées à des souris receveuses n'ayant plus de cellules souches hématopoïétiques. Les cellules souches hématopoïétiques ayant la capacité de reconstituer tous les composants du système hématopoïétique et immunologique, nous pourrons alors suivre dans les souris l'effet des mutations sur le comportement des lymphocytes B. L'objectif étant de repérer les mutations impliquées dans l'hyperprolifération des lymphocytes B, afin de mieux comprendre les mécanismes ayant lieu dans les lymphomes. Ensuite un objectif plus translationnel avec la mise au point d’une stratégie permettant de faire produire aux lymphocytes B un anticorps choisi, ciblant spécifiquement une protéine exprimée par les cellules tumorales. Ce système permettra alors d’induire une réponse immunitaire spécifique contre les tumeurs. Nous allons donc modifier génétiquement les lymphocytes B ou les cellules souches hématopoïétiques humaines puis injecter ces cellules à des souris immunodéficientes, souris qui ne pourront pas rejeter les cellules humaines. Nous quantifierons alors la production des anticorps dans les souris et implanteront les tumeurs spécifiques des anticorps induits pour évaluer leur capacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Concernant le projet sur les cellules souches hématopoïétiques murines, de nombreux résultats seront attendus sur le rôle des différentes mutations induisant des syndromes lymphoprolifératifs (prolifération excessive des lymphocytes), ceci permettant une meilleure compréhension de la physiologie des lymphomes. Pour le projet sur la production d'anticorps humains, nous testons la faisabilité d'une nouvelle stratégie thérapeutique consistant à faire produire par des lymphocytes B des anticorps thérapeutiques. Ce projet pourra ensuite être valorisé et potentiellement ouvrir une autre voie dans les traitements d'immunothérapie.
Procédures
Les cellules souches hématopoïétiques murines mutées seront greffées dans des souris ayant reçues une forte dose d'irradiation, ceci afin d'éliminer toutes les cellules souches hématopoïétiques présentes et permettre uniquement à celles injectées de se développer. Dans le cas de la greffe des cellules humaines, l’irradiation sera plus légère car il faut garder des cellules souches hématopoïétiques murines mais juste faire de la place pour les cellules humaines. La greffe des cellules se fera ensuite par injection intraveineuse dans la veine de la queue. Des prélèvements sanguins itératifs (toutes les 4 semaines) seront ensuite réalisés sur tous les animaux et dans toutes les procédures afin d'évaluer et de suivre la reconstitution immunologique au cours du temps. Enfin des immunisations pourront être appliquées sur les animaux en post-greffe si la reconstitution a été jugé optimale.
Impact sur les animaux
Peu de nuisances ou d'effets indésirables sont à attendre à la suite d'injection intraveineuse des cellules dans la veine de la queue. Pour cela, les souris seront placées dans un tube de contention afin de chauffer leur queue avant l'injection. Un léger inconfort pourra être ressenti à cause de la chaleur et une douleur pourra être ressentie lors de la piqure dans la queue au moment de l'injection. Les souris seront suivies de façon hebdomadaire afin de repérer tout signe indiquant un inconfort ou une douleur. Des nuisances plus importantes viendront de l'irradiation à forte dose. Le développement d'une immunodépression complète induite par l'irradiation à forte dose peut engendrer un affaiblissement notable de l'animal, c'est pourquoi les souris expérimentées seront observées très régulièrement pour détecter une potentielle absence de reprise de l'hématopoïèse (qui devrait être obtenues suite à la greffe des cellules souches hématopoïétiques murines) avec l'apparition de signes de l'immunodépression (perte de poids, léthargie, dos courbé...). L'irradiation à faible dose ne provoque en général aucune nuisance.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêts (organes de l'immunité, ganglions, rate notamment). L'exploration de ces organes est indispensable afin d'apporter des conclusions fiables sur la reconstitution hématopoïètique et immunologique ainsi que sur développement de la réponse immunitaire.
Remplacement
Le projet est basé sur le pouvoir de reconstitution des cellules souches hématopoïétiques (CSH). Ces dernières sont en effet capables de se différencier en de nombreux précurseurs hématopoïétiques dans la moelle osseuse. Ces précurseurs vont ensuite continuer de se différencier soit dans la moelle osseuse soit dans d’autre organes du système immunitaire et ainsi reconstituer un système immunitaire entier et compétent. Il est actuellement possible de différencier des CSH in vitro mais uniquement vers une voie donnée, ce qui permet d’obtenir qu’un type de cellules immunitaires. Aucun modèle ne permet une différenciation complète des CSH. Seul un environnement complet (moelle osseuse, facteurs de croissance, signaux de survie, organes du système immunitaire…) permettra d’obtenir les conditions idéales pour reconstituer un système immunitaire compétent. C’est pourquoi l’utilisation de souris immunodéficientes ou de souris immunocompétentes irradiées à forte dose reste l’unique modèle utilisable aujourd’hui.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires, les expérimentations ont été mises en place de manière à utiliser le moins de souris possible tout en extrayant le plus d’informations, notamment en utilisant plusieurs organes (moelle osseuse, rate et sang) pour réaliser les différentes analyses sur un même animal. Avant d’aborder les greffes de cellules, le maximum de validation aura été fait in vitro et optimisé en préalable à toute injection chez l’animal (notamment vérification in vitro des mutations). Lors de chaque expérimentation, des groupes de 5 souris seront formés afin de comparer les différentes conditions utilisées ou de comparer l'effet des mutations réalisées sur les CSH avant l'injection. Si une différence apparaît mais qu'elle n'est pas significative, l'expérimentation sera répétée afin d'obtenir une significativité.
Raffinement
Les animaux sont élevés dans des conditions adaptées à savoir des locaux confinés, des portoirs ventilés, de l'eau et de la nourriture ad libitum, ainsi qu'un maximum de 5 animaux/cage. Aucun animal ne sera maintenu seul dans sa cage. Également, afin de raffiner les conditions de vie des souris, des soins adaptés sont mis en place afin de permettre une bonne récupération des animaux et un suivi optimal est instauré afin de soulager voire supprimer l'inconfort, mais aussi la détresse ou l'angoisse qu'ils pourraient éprouver. Le raffinement est aussi obtenu par la mise au point de procédures rigoureuses et la formation du personnel. Toutes les procédures ne seront réalisées que par des personnes ayant une excellente maîtrise des gestes. Les animaux seront suivis quotidiennement selon une surveillance de l’état général des animaux (posture et comportement) par le personnel de l’établissement ou le responsable du projet. De plus, une surveillance hebdomadaire sera réalisée par le responsable du projet selon les mêmes critères généraux cités précédemment en plus de critères spécifiques: suivi du poids et mesure du score grimace permettant d’évaluer l’état de santé des animaux. Le « score de grimace » correspond a une échelle permettant d’évaluer la douleur chez l’animal, en particulier chez la souris. Si ce score excède 1.5 sur 2, les animaux seront alors euthanasiés. Également si la perte de poids excède 20% du poids de référence alors les animaux seront alors euthanasiés. Si des effets secondaires ou signes d'inconfort non soulagés par l’administration d'analgésiques ainsi que des changements perceptibles (aspect, comportement, poids, isolement dans la cage, déplacements limités) sont observés, les animaux seront alors euthanasiés.
Choix des espèces
Les souris immunodéficientes choisies pour le projet des cellules humaines sont complètement dépourvues de lymphocytes T, B et de cellules NK, ce qui permet donc d'éviter le rejet de la xénogreffe de cellules humaines. Ces souris permettent la croissance de nombreuse lignées lymphoïdes humaines et l'utilisation d'effecteurs d'origine humaine. Elles sont donc parfaitement adaptées à la nature de ce projet de par leur taux élevé́ de prise de xénogreffes. Cependant, l’utilisation d’animaux immunodéprimés exposent au risque de l’expression d’un phénotype dommageable car les souris ne sont plus capables de combattre les pathogènes environnementaux. Ce risque sera parfaitement maîtrisé par la mise en place de précautions sanitaires adaptées. Le maintien de ces souris en hébergement protégé de type A2 permettra de prévenir tout risque d’infection. Les utilisateurs se muniront d'une combinaison recouvrant tout le corps ainsi que d'un masque chirurgical et d'une 2eme pair de gant. Enfin, les souris seront manipulées sous hotte à flux laminaire. L’expérimentation sera commencée chez des animaux de 5 semaines à 3 mois. La durée de l’expérimentation chez ces animaux n’excèdera pas 6 mois.
Exploration de la physiopathologie des syndromes d’hypercroissance dans un contexte de modulation de la sénescence chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
96 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour exploration anatomique et histologique. Chacune reçoit quinze gavages quotidiens de tamoxifène ou d'huile de maïs à partir de la sixième semaine de vie, puis cinq injections intrapéritonéales étalées sur deux mois. Elles portent une mutation qui provoque des lésions vasculaires vers quatre à six mois et des saignements vers douze, le porteur prévoyant de les tuer avant huit mois pour rester en deçà du phénotype dommageable. Il qualifie pourtant ce protocole de "peu invasif" et écrit que le gavage "ne devrait pas induire de douleur", tout en reconnaissant un risque de fausse route.
Objectifs
1)Meilleur compréhension de la fonction d'un gène et de de l'arrêt de la croissance cellulaire irreversible dans les cellules graisseuses dans un contexte de la maladie des syndromes d'hypercroissance dysharmonieuse. 2)Tester l’efficacité d'une thérapie génique en surexprimant une molécule d'interrêt.
Bénéfices attendus
Trouver une nouvelle cible thérapeutique dans ce syndrome.
Procédures
Un gavage au tamoxifene ou à l'huile de maïs sera réalisé à 6 semaines de vie. Des injections intra-péritonéales seront effectuées par un technicien expérimenté. Les injections débuteront à la semaine 6 de vie toutes les 2 semaines pendant 2 mois. Les animaux seront injectés soit par le véhicule (AAV9-GFP) soit par AAV9-G3PP. Un gavage oral sur souris vigiles sera réalisé à 6 semaines de vie et répété quotidiennement pendant 2 semaines soit au total 15 gavage par souris (1 minute par gavage). Des injections intrapéritonéales sur souris vigiles seront effectuées à la semaine 6 de vie toutes les 2 semaines pendant 2 mois soit 5 injections/souris d'une durée de 30 secondes par souris/injection
Impact sur les animaux
Une injection intra-péritonéale peut engendrer des irritations. Elles nécessitent une contention et induisent une douleur légère de courte durée peu invasives. Le gavage quotidien peut engendrer des risques de fausse route. Le geste ne devrait pas induire de douleur car le geste est parfaitement maîtrisé et les sondes de gavage utilisées sont flexibles et adaptées à la morphologie de l'animal. Les souris développent des lésions vasculaires non dommageables à 4-6 mois puis un phénotype métabolique à 12 mois avec l'apparition de saignements, cependant nous étudierons les souris jusqu'à 8 mois maximum avant l'apparition du phénotype dommageable.
Devenir
Procédure 1: animaux mis à mort pour exploration anatomique et histologique.
Remplacement
Dans un contexte de recherche physiopathologique sur les syndromes d'hypercroissance, les expérimentations in vivo ne peuvent en aucun cas être remplacées par des expériences in vitro, où les cellules sont sorties de leur environnement. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas utilisables dans ce contexte car trop de paramètres physiopathologiques entrent en jeu. Les résultats obtenus in vitro nous ont permis d'identifier un gène d'interrêt que nous allons tester in vivo.
Réduction
La taille des groupes utilisés (n=16), minimum nécessaire et suffisante pour l’obtention de résultats significatifs, en utilisant des tests statistiques adaptés, qui satisfait à l’objectif de réduction du nombre d’animaux exposés dans ce projet.
Raffinement
Ce protocole est peu invasif puisque les injections intra-péritonéales seront réalisées sur des souris mises dans des conditons de calme, par un technicien expérimenté. Les injections débuteront à la semaine 6 de vie pendant 2 mois. Les animaux seront injectés soit par le véhicule soit par un outil moléculaire. Aucun prélevement ne sera effectué chez les souris. A priori la surexpression de notre molécule devrait améliorer le phénotype des souris qui seront surveillées quotidiennement.
Choix des espèces
La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de faciliter d’élevage et de reproduction. Ces souris sont particulièrement intéressantes pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. De nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines d'interrêt). La souris est le seul animal pour lequel la protéine d'interrêt a été mutée. Les jeunes souris de 6 semaines sont utilisées car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée.
Evaluation de prothèses vasculaires chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Les rats dont le pontage se bouche sont tués dès le premier ou le septième jour, les autres au quatorzième. 27 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, tous tués pour prélever la prothèse et l'analyser. Chacun subit une chirurgie abdominale de quarante à soixante minutes au cours de laquelle un segment de son aorte est remplacé par une prothèse synthétique, avec un risque de paralysie des pattes arrière si la circulation reste interrompue trop longtemps. Le porteur présente l'essai comme une preuve de concept pour la "chirurgie en situation de catastrophe", préalable à une étude de confirmation sur "gros animal".
Objectifs
Les maladies cardiovasculaires, notamment les pathologies touchant les vaisseaux sanguins, demeurent encore aujourd’hui un problème majeur de santé publique. Malgré le développement de nouvelles techniques chirurgicales et peu invasives, la réparation des artères pose encore problème. Il existe une importante demande clinique en nouvelles prothèses vasculaires synthétiques et durables. Les prothèses synthétiques sont performantes pour la réparation des artères de moyen et gros diamètres, mais donnent des résultats médiocres lorsqu'il s'agit de réparer des artères de petit diamètre (< 6 mm). L’objectif de cette étude est d'évaluer des biomatériaux comme prothèses vasculaires pour le remplacement de vaisseaux malades ou blessés de petit diamètre. La prothèse vasculaire doit supporter la chirurgie ainsi que la pression du sang qui s’exerce sur la paroi. Les propriétés mécaniques de la prothèse doivent être proches de celles du vaisseau receveur afin de limiter les perturbations dues à la circulation du sang. Nous souhaitons déterminer le devenir de ces prothèses dans un modèle de remplacement vasculaire chez le rat, au cours du temps : vérifier l’intégration, la dégradation et la colonisation par les cellules du receveur. L’intervention sur des rats sera réalisée sous anesthésie. Un segment de l'aorte sera alors remplacé par une prothèse vasculaire. Nous allons suivre la circulation du sang dans les prothèses (vérifier que les prothèses ne sont pas bouchées) à 1 jour, 7 jours et 14 jours après implantation, par imagerie.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de montrer que l’utilisation qu’une de nos formulations de substitut vasculaire est acceptable en termes de circulation du sang sur 14 jours, en regard des solutions actuelles insatisfaisantes, en particulier pour la chirurgie en situation de catastrophe. Cette preuve de concept sera un préalable à une étude de confirmation sur gros animal.
Procédures
Sur 6 rats de chaque groupe testé (soit 27 rats en tout pour 4 formulations testées), une chirurgie abdominale sera réalisée. Le temps de chirurgie est estimé à 40-60 min par animal. A cela, ajoutera le temps d’anesthésie et de réveil de l’animal (variable selon les individus). Les rats seront l’objet de 4 injections en tout de buprénorphine : pré/post op (J0 et J1) et euthanasie, par un geste de quelques secondes réalisé par un technicien compétent. Un suivi par imagerie de la circulation du sang sera réalisé à J1, J7 et J14: cet examen n'est pas douloureux en soi et dure 40 à 60 minutes.
Impact sur les animaux
L’expérimentation implique la réalisation d’une chirurgie abdominale et l’exposition de l’aorte. Les conséquences de la chirurgie peuvent être une paralysie des pattes arrière si l’arrêt de ma circulation sanguine est prolongé.
Devenir
Les rats seront euthanasiés après 14 jours d’implantation, ou plus tôt à J1 ou J7 si au moment du contrôle par imagerie, le pontage s’avère bouché. Les pontages seront prélevés pour analyse histologique
Remplacement
Devant la complexité de la formation des bouchons sanguins, l'évaluation de la circulation du sang dans les prothèses ne peut s’apprécier que sur modèle animal. Actuellement aucun autre modèle ne peut simuler cet évènement.
Réduction
Le nombre minimum d’animaux à utiliser a été déterminer d’après un test statistique prenant en compte la variabilité biologique entre individus et les risques dus à la chirurgie. Un nombre de 6 animaux par groupe est nécessaire pour assurer des résultats statistiquement pertinents. Ne seront implantées que les prothèses qui répondent aux bonnes propriétés mécaniques (supporter une pression, résister à la suture ...) après des tests en laboratoire. Au total, 27 prothèses seront implantées (soit 1 par animal).
Raffinement
Les rats seront hébergés dans une animalerie conventionnée, avec eau et alimentation ad libitum, dans des conditions de température et d’hygrométrie contrôlées, avec un cycle jour/nuit de 12h. Les animaux seront hébergés en cage collective, dans un milieu enrichi avec des maisonnettes, de la paille, du coton et des bois à ronger. Différents enrichissements seront proposés en alternance pour introduire de la nouveauté. L’acquisition des images n’étant pas douloureuse, l’animal est maintenu sous anesthésie gazeuse légère uniquement pour limiter ses mouvements et son stress. Après l'intervention chirurgicale, les animaux sont surveillés jusqu’à la phase de réveil puis tous les jours par du personnel bien formé. Une injection sous cutanée d'un analgésique sera réalisée pour réduire la douleur. Une grille d’évaluation de la douleur (points limites sont stricts, adaptés et précoces), tout au long de l'étude, a été mise en place et si l’animal atteint un certain score, il recevra une injection sous cutanée d'un analgésique, au-delà, l’animal sera euthanasié.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est de tester de nouvelles prothèses vasculaire pour le remplacement vasculaire. Les prothèses sont de petit calibre inférieur à 6mm de diamètre, ce qui correspond à la taille de l'aorte abdominale chez le rat Wistar adulte (1.5-2mm de diamètre). Les animaux seront des rats Wistar adulte (au moins 400 gr) afin d’avoir des animaux de bonne taille et poids pour le remplacement vasculaire.
Sensibilité ghréline chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
652 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever tissus et sang, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère. Cent douze d'entre eux subissent une immobilisation forcée quatre heures par jour pendant six jours consécutifs pour reproduire un syndrome dépressif, cent douze autres reçoivent des injections répétées d'une substance psychoactive pour reproduire une addiction, quatre cent quarante-huit sont saignés à l'état vigile et quatre-vingts passent sur la table d'opération. Le porteur qualifie le modèle animal d'"incontournable" pour étudier l'exposome, au motif que le comportement et la physiologie intégrée ne s'observent pas in vitro. Le bénéfice avancé se limite à la possibilité de proposer un jour une stratégie thérapeutique agissant sur la ghréline.
Objectifs
La ghréline est une hormone produite par l’estomac capable d’influencer notre métabolisme ou le fonctionnement de notre cerveau. En particulier, cette hormone semble jouer un rôle prépondérant suite à l’expositions chronique à différents types de stress de notre environnement (stress, physiques, sociaux, chimiques ou nutritionnels), notre « exposome ». Or l’exposome est connu pour favoriser le développement de nombreuses maladies communes de cerveau ou du métabolisme. Ainsi, modifier génétiquement les effets de la ghréline chez l’animal pourrait être un moyen de tester la vulnérabilité des animaux à différents types de stress chroniques. Notre stratégie qui s’appuie sur des approches génétiques et pharmacologiques vise à raffiner les connaissances sur les moyens de moduler les effets de la ghréline sur le cerveau et à tester les liens entre effets ghréline et vulnérabilité de l’organisme à différents types d’exposomes.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra de clarifier les mécanismes mis en jeu par une hormone, la ghréline, au cours de l’exposition d’un organisme à différents types de stress chroniques. Enfin, ce travail pourrait permettre de proposer une stratégie thérapeutique pour moduler les effets de la ghréline au bénéfice de la santé mentale.
Procédures
80 rats auront une procédure chirurgicale de 20-30 mins sous une anesthésie générale de 45 mins. 448 rats recevront des prélèvements de sang à l’état vigile. 112 rats seront soumis à un protocole de d’injections répétées par substance psychoactive (4 injections sur 8 jours). 112 rats seront soumis à un protocole de stress répété (4h par jour pendant 6 jours consécutifs). Enfin 320 rats recevront des injections répétées d’analogues de la ghréline sur deux semaines et 108 rats recevront des injections répétées pour évaluer leur homéostasie glucidique.
Impact sur les animaux
Tous les rats de l’étude subiront l’inconfort et des douleurs légères liés à des injections et des prélèvements de gouttes de sang. De plus, un groupe de rats sera soumis à une approche chirurgicale, les possibles douleurs post-opératoires seront pris en charge par un protocole adapté : injections d'anti-inflammatoire et une récupération post-chirurgicale sous surveillance pour détecter toute perte de poids ou d'autres problèmes de santé ou de bien-être. Un groupe de rats développera une souffrance psychique suite à l’injection répétée d’une substance psychoactive pour mimer une addiction. Enfin, un dernier groupe de rats subira un stress d’immobilisation forcée répété plusieurs jours pour mimer un syndrome dépressif.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l’issue des procédures pour des prélèvements de tissus et de sang pour mener des études moléculaires et hormonales.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet, qui vise à modéliser l’émergence de pathologies humaines en lien avec l’Exposome, l’usage d’un modèle animal est incontournable. En effet, ce type de projet ne peut en aucun cas être remplacé par des expériences in vitro puisque nous avons besoin d’examiner des paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. A cet égard, l’allèle muté utilisé chez le rat remplit tout les critères requis pour le projet.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Lorsque cela a été possible, des protocoles croisés d’injections de composés/doses ou des injections séquentielles ont été prévus, ce qui a permis de réduire considérablement le nombre d’animaux requis. Enfin, nos résultats non publiés décrivent des réponses ghréline exagérées chez les rats mutants des deux sexes. En conséquence, les groupes expérimentaux de notre projet comportent des lots d’expérimentaux d’effectifs plus petits car composés de rats des deux sexes.
Raffinement
Notre projet d’étude porte sur la vulnérabilité aux stress environnementaux de tout type à travers le prisme de la signalisation ghréline. En conséquence le soin apporté aux animaux, requis éthiquement l’est également au plan scientifique. En conséquence, le bien être animal de l’élevage à la constitution des lots expérimentaux jusqu’à l’exécution des protocoles expérimentaux est déterminant. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par un tunnel et la vie en communauté. Le contrôle de l’approvisionnement en eau et nourriture et assuré par les zootechniciens agréés. Lorsque le protocole expérimental est lancé, l’équipe de recherche prend le relais et le suivi de chaque rat se fait plus intense selon le protocole (manipulation régulières, suivi du poids corporel) qui permettent d’individualiser le suivi de chaque animal tout au long du protocole jusqu’à la mise à mort. Ainsi, toute altération de l’état d’un animal attendue (post-chirurgical) ou inopinée est prise en charge selon les point limites établis pour discriminer un évènement transitoire d’un évènement plus rare qui s’aggrave et qui conduira à une sortie du protocole et à l’euthanasie. Au total, ce type de suivi permet de combiner bien-être animal avec résultats scientifiques valides.
Choix des espèces
L’ensemble des procédures seront basées sur ce modèle unique de gain de fonction dans le récepteur ghréline chez le rat. Le rat possède une organisation anatomique et structurelle du cerveau comparable à celle de l’Homme. Il est idéal pour les études physiologiques du fait de sa volémie plus élevée que celle de la souris (prélèvement sanguins répétés). Enfin, le rat est capable d’apprendre des tâches complexes et peut réaliser des comportements élaborés et ainsi modéliser des maladies du cerveau. Les animaux utilisés seront des rats adolescents ou de jeunes adultes (6-10 semaines).
OBTENTION DE MATERIEL BIOLOGIQUE POUR LE DIAGNOSTIC IMMUNOLOGIQUE DE LA TOXOPLASMOSE CHEZ LA SOURIS
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Fabriquer un réactif de diagnostic sérologique : 3 900 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour récolter les parasites de leur cavité abdominale. Elles reçoivent une inoculation intrapéritonéale de toxoplasmes et une inoculation de cellules tumorales qui déclenche une ascite. L'infection se manifeste par des poils hérissés et un dos courbé, signes que le porteur décrit comme la preuve que l'inoculation a fonctionné. La culture cellulaire est écartée au motif du rendement : il faut environ 80 milliards de parasites par production, quantité que le porteur affirme ne pas pouvoir obtenir in vitro.
Objectifs
En France, la surveillance sérologique mensuelle (recherche d’anticorps dans le sang) de la toxoplasmose durant toute la durée de la grossesse chez les femmes enceintes séronégatives pour la toxoplasmose, est nécessaire en vue du dépistage de séroconversion en cours de grossesse pour la mise en place précoce d’un traitement adapté et limiter les complications pour le foetus. Le diagnostic sérologique est également utile pour les immunodéprimés, les patients susceptibles d'être greffés, les donneurs d'organes. L’utilisation d’antigènes est nécessaire pour la recherche d’anticorps. En l'absence d'antigène de toxoplasme seul commercialisé, la fabrication de l'antigènes de toxoplasma est donc une activité nécessaire pour les contrôles sérologiques faits en dehors de tests commerciaux.
Bénéfices attendus
Le projet est d’avoir des tests fiables permettant le diagnostic de la toxoplasmose, pathologie potentiellement grave puisque, elle peut entraîner des malformations congénitales mais aussi le décès de patients immunodéprimés chez l'Homme.
Procédures
Inoculation intrapéritonéale de parasites et de cellules effectuées pour créer une infection parasitaire qui se traduit par l'apparition de signes cliniques, preuve de l’infection.: 1 inoculation/souris, 1 minute. Inoculation intrapéritonéale de cellules TG180 induisant une ascite: 1 injection, 1 minute. Anesthésie flash à l'isoflurane: 1 seule, 1 min
Impact sur les animaux
L’inoculation intrapéritonéale de parasites chez la souris provoque une infection parasitaire. Les souris présentent des symptômes cliniques d'infection (poils hérissées, dos coubés), rentrant dans la grille de score et nous permettant de déterminer les points limites.
Devenir
Pour chaque procédure, tous les animaux sont euthanasiés pour le recueil des parasites de la cavité abdominale.
Remplacement
L’alternative à l’utilisation d’animaux serait de produire l’antigène par culture cellulaire. Cependant plusieurs problèmes se posent et nous empêchent de basculer sur une technique de culture : - la reproductibilité de la méthode qui n'est pas fiable. En effet, nous savons par expérience que la multiplication des parasites in vitro est incertaine, avec un nombre de parasites variables d’une boîte de culture à l'autre ne permettant pas d'assurer un antigène reproductible entre les différents lots contrairement à la multiplication in vivo. - la qualité de l'antigène est différente entre une production d'antigène in vivo et une production in vitro. Les deux préparations de parasites sont différentes jouant sur la sensibilité de chaque méthode. - la quantité de parasites. Il faut pour la fabrication de cet antigène, la production d'un nombre très élevé de toxoplasmes. Cette énorme quantité de parasites (environ 80 milliards de parasites) ne peut pas être obtenue en culture cellulaire. La production en cultures cellulaires nécessiterait une grande quantité de boîte de culture pour obtenir la même quantité de parasites. A notre connaissance, aucune autre alternative n’a été développée pour obtenir une si grande quantité de parasites. Il y a quelques années, nous avons travaillé (pour la multiplication parasitaire) avec des cellules en suspension qui ne permettaient pas d’avoir un nombre suffisant de parasites. Nous avons donc changé de type cellulaire pour travailler avec des cellules adhérentes. Nous avons ainsi amélioré notre rendement de parasites en le multipliant par 5. Cependant, ce type cellulaire bien que facilitant l’invasion et la multiplication cellulaire n’est pas suffisant pour obtenir la grande quantité de parasites exigée pour la production d’antigène. Les approches in silico ne peuvent pas être envisagées car le diagnostic de la toxoplasmose se fait biologiquement avec les sérums des patients mis au contact de l’antigène.
Réduction
La standardisation de cette technique (concentration de parasites, cellules, réactifs, …) réalisée par notre laboratoire depuis plus de 30 ans permet de prévoir un nombre minimum de souris nécessaire à la fabrication d'antigène. Pour la fabrication de cet antigène, un nombre d'animaux a été estimé : en dessous de ce nombre de souris, le rendement pour l’obtention du nombre de parasites est trop faible pour assurer la fabrication d’un volume d’antigène suffisant. De plus, le protocole de fabrication a été optimisé pour minimiser le nombre de souris au maximum. Ainsi, historiquement la souche de parasite et la lignée cellulaire (nécessaire pour la multiplication des parasites) étaient entretenues sur souris (passages successifs) toute l’année de façon continue consommant un nombre important de souris. Actuellement, les parasites et la lignée cellulaire sont stockés congelés et décongelés en prévision de la production de l’antigène. C’est donc une approche expérimentale validée au cours du temps qui nous a permis de déterminer le nombre d’animaux nécessaire avec une variabilité du volume obtenu. Nous ne pouvons prévoir la quantité d’antigène que par les volumes antérieurs utilisés annuellement.
Raffinement
Une surveillance accrue des souris (2 fois/ jour) est effectuée dans les 72 heures après leur inoculation par des personnels formés et expérimentés afin de garantir leur bien-être et détecter d’éventuels signes de douleur ou de stress. Après l’inoculation parasitaire, une attention particulière est portée sur 5 critères : l’apparence physique de l’animal (aspect du poil), son comportement (réponse aux stimuli externes, mobilité) et la présence de signes cliniques (respiration). L’utilisation d’un analgésique permettra de prévenir toute douleur éventuelle. Il sera administré aux souris (5mg/kg) per os (dans un biberon) après inoculation de la souche parasitaire. Un soin sera apporté aux conditions d’hébergement permettant de limiter le stress (enrichissement du milieu de vie, respect de leur vie en groupe, surveillance quotidienne).
Choix des espèces
Le modèle souris décrit dans les publications sont des souris (femelles) âgées de 8 semaines (20g) qui présentent un système immunitaire fonctionnel.
Effet de l’exercice physique sur la neurodégénérescence chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Biopsie de la queue sur tous les souriceaux, six à huit injections intrapéritonéales, deux injections sous-cutanées, une à deux chirurgies intracrâniennes de quarante minutes à une heure trente, et la coupe des moustaches pendant les périodes d'enregistrement : 1 656 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour prélever leur cerveau. Une partie l'est plus tôt, faute de porter le génotype recherché. Le projet cherche à comprendre comment l'activité neuronale et l'exercice physique, volontaire ou avec apprentissage moteur, favorisent la production de myéline. Sur la réduction, le porteur écrit limiter le nombre d'animaux "au strict minimum" sans donner de calcul, et l'effectif de 1 656 ne reçoit aucune justification chiffrée.
Objectifs
La myéline est une substance isolante qui entoure les prolongements des neurones du cerveau. Dans certaines maladies, la myéline peut être attaquée et détruite par les cellules du système immunitaire. A terme, les prolongements des neurones dénudés de myéline finissent par mourir. Cependant, bien que la capacité régénérative du cerveau soit limitée, une régénération de la myéline est possible dans certaines maladies comme la sclérose en plaques. Malheureusement, cette régénération est incomplète. Le but de ce projet est de déterminer comment l'activité neuronale et l’exercice physique favorisent la production de myéline quand celle-ci est diminuée dans le cerveau. Nous étudierons la capacité à produire de la myéline en réponse à une augmentation de l'activité neuronale et à un type d'entrainement physique qu'il soit simple (exercice volontaire) ou complexe (apprentissage moteur) sur des modèles présentant une baisse de myéline.
Bénéfices attendus
A terme, l’identification des mécanismes biologiques sous-tendant une meilleure production de la myéline peut être très important pour développer des thérapies non-invasives dans des maladies comma la sclérose en plaques.
Procédures
Tous les souriceaux sont soumis à une biopsie caudale afin d'effectuer un génotypage. Nous prévoyons sur un premier groupe d'animaux un traitement alimentaire spécifique, 6 injections intrapéritonéales, 2 injections sous-cutanées et deux chirurgies. Celles-ci durent entre 40 min et 1h30. Ces animaux seront imagés lors d'un exercice physique simple, un exercice impliquant un apprentissage moteur ou en contrôle. Leurs moustaches seront coupées pendant la période d'enregistrement. Un autre groupe de souris recevra le même traitement alimentaire et seront injectées 8 fois. Dans un troisième groupe d'animaux, nous prévoyons le même traitement alimentaire spécifique, 6 injections intrapéritonéales, 2 injections sous-cutanées et une chirurgie. Leur moustachese seront coupées pendant la période d'enregistrement lors d'un exercice physique simple, un exercice impliquant un apprentissage moteur ou en contrôle. Enfin, les animaux restants recevront 7 injections intrapéritonéales, 2 injections sous-cutanées et deux chirurgies.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales et sous-cutanées (nuisance légère), la coupe des vibrisses (nuisance légère), les anesthésies (nuisance légère) et les chirurgies intracrâniennes (nuissances modérées) vont induire un stress et une possible douleur. Les nouveaux-nés subiront un stress léger lié à la contention et une douleur légère liée à la biopsie de la queue.
Devenir
Certains animaux sont mise à mort car ils sont sans génotype d’intérêt pour le projet. Tous les autres animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de pouvoir collecter leur cerveau.
Remplacement
Notre compréhension des mécanismes impliqués dans les maladies telles que la sclérose en plaques sera toujours insuffisante si ces mécanismes ne sont pas induits et analysés dans leur milieu naturel complexe. En étudiant les différentes composantes de façon isolée, de nombreux effets émergents de l'activité neuronale et des interactions cellulaires seront obligatoirement négligées. L’utilisation de l’animal est donc primordiale pour obtenir des résultats qui puissent avoir un véritable impact dans le développement de nouvelles thérapies chez l’homme. Les souris sont le seul modèle permettant d'étudier l'effet du comportement animal sur la myéline en temps réel.
Réduction
Une réduction du nombre d’animaux sera réalisée en limitant ce nombre au strict minimum nécessaire pour obtenir un résultat scientifiquement fiable. Les expériences seront arrêtées si des analyses intermédiaires permettent d’atteindre la significativité statistique. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés, pour comparaisons multiples ou données suivies selon les cas.
Raffinement
Lors des actes chirurgicaux, les animaux sont anesthésiés et reçoivent des analgésiques en pré- et post-opératoires par voie locale et sous-cutanée. Après l’opération, un apport de fluide est effectué pour réhydrater l’animal, puis celui-ci est placé dans une enceinte chauffée jusqu’à son réveil complet. De la nourriture est placée dans la cage d’hébergement afin de faciliter la récupération; la surveillance des animaux est renforcée afin d’éviter toute souffrance; les animaux sont observés régulièrement et une grille précise d’évaluation des points limites est utilisée. Tout signe de douleur est soulagé avec des analgésiques.
Choix des espèces
Les expériences seront réalisées chez des souris génétiquement modifiées. La souris a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux. Les souris présentent un système nerveux suffisamment développé pour permettre une extrapolation des résultats à l’espèce humaine. Une autre raison pour utiliser la souris est la possibilité de manipuler de types précis de cellules chez des animaux transgéniques. Pour le génotypage et les biopsies, les souriceaux ont entre 5 et 10 jours, âge a quel il est possible de tatouer les coussinets des phalanges. L'expérimentation est menée sur des animaux adultes entre 2 à 5 mois ce qui nous permet de faire nos protocoles et traitements.